Microscpios e Tcnicas em Biologia Celular

Prof. Luiz Henrique Garcia Pereira

Revisando

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Partes mecnicas:
Base ou p: o suporte do microscpio, pea que sustenta todas as outras partes do aparelho.

Brao ou coluna: pea que liga o p parte superior do microscpio.

Mesa ou platina: pea de apoio da lmina contendo o material para estudo, no centro da mesa existe um orifcio para a passagem da luz.

Charriot: pea ligada platina que permite movimentar a lmina no plano horizontal da esquerda para a direita e vice-versa, e de trs para frente e vice-versa.

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Partes mecnicas:
Parafuso macromtrico: localiza-se em ambos os lados do brao, serve para ajustar o foco grosseiramente atravs de avano ou recuo da mesa em relao objetiva. Parafuso micromtrico: ajusta o foco finamente atravs de pequenos avanos ou recuos da mesa. Tubo ou canho: parte superior do microscpio constituda por um tubo contendo um prisma. Sustenta lentes objetivas e oculares, e serve para focalizao do material. Revolver: pea onde se encaixam as lentes objetivas. composto por um disco de ranhuras que permite a mudana das objetivas.

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Partes mecnicas:
Tubo ou canho

Brao ou coluna Presilha Mesa ou platina Parafuso macromtrico Parafuso micromtrico Base ou p

Revolver

Charriot

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Partes pticas:

Condensador: conjunto de lentes situado abaixo da platina que concentra a luz e fornece iluminao uniforme preparao biolgica.

Objetivas: conjunto de 4 ou mais lentes superpostas que proporcionam aumentos diferentes para observao do material. O valor do aumento est gravado na objetiva

Oculares: possui 2 lentes convergentes que ampliam e corrigem os defeitos da imagem. O valor do aumento proporcionado est gravado na ocular

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Partes pticas:
Boto do condensador: permite a movimentao do condensador

Diafragma: regula a intensidade de luz que atinge a preparao atravs de uma alavanca para sua abertura ou fechamento

Fonte luminosa atualmente utiliza-se luz artificial emitida por uma lmpada includa no prprio microscpio com um interruptor e algumas vezes com um restato que permite regular a intensidade da luz. Os modelos antigos tinham um espelho de duas faces: a face plana para refletir luz natural e a face cncava para refletir luz artificial

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Partes pticas:
Oculares

Objetivas

Boto do condensador

Condensador Diafragma Fonte luminosa

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Que diferenas voc observou entre a posio da letra a olho nu e no MO?

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Que diferenas voc observou entre a posio da letra a olho nu e no MO? Nas objetivas de diferentes aumentos, o que voc notou quanto ao tamanho da imagem e quanto rea do campo de observao?

Revisando
Qual o aumento final do microscpio?

Lentes Oculares

Lentes Obejtivas

Aumento Final

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Qual o aumento final do microscpio?

Lentes Oculares 10X

Lentes Obejtivas

Aumento Final

Revisando
Qual o aumento final do microscpio?

Lentes Oculares 10X

Lentes Obejtivas 4X 10X 40X 100X

Aumento Final

Revisando
Qual o aumento final do microscpio?

Lentes Oculares 10X

Lentes Obejtivas 4X 10X 40X 100X

Aumento Final 40X

Revisando
Qual o aumento final do microscpio?

Lentes Oculares 10X

Lentes Obejtivas 4X 10X 40X 100X

Aumento Final 40X 100X

Revisando
Qual o aumento final do microscpio?

Lentes Oculares 10X

Lentes Obejtivas 4X 10X 40X 100X

Aumento Final 40X 100X 400X

Revisando
Qual o aumento final do microscpio?

Lentes Oculares 10X

Lentes Obejtivas 4X 10X 40X 100X

Aumento Final 40X 100X 400X 1000X

Como funciona o Microscpio?

Funcionamento do microscpio ptico Lentes

Funcionamento do microscpio ptico Lentes

Imagem Real

Imagem Virtual

Funcionamento do microscpio ptico Comportamento da Luz

Funcionamento do microscpio ptico Comportamento da Luz

Funcionamento do microscpio ptico Formao da Imagem no MO

Animao

Funcionamento do microscpio ptico Poder de Resoluo do Microscpio

Capacidade de fornecer imagens diferentes entre 2 pontos prximos

Limite de resoluo Distncia mnima entre dois pontos para que possam ser discriminados

Funcionamento do microscpio ptico Limite de Resoluo do Microscpio 0,2 m

Limite de Resoluo do Olho Humano

100 m

Funcionamento do microscpio ptico Limite de Resoluo do Microscpio

Nenhum objeto pode ser distinguido com o uso de um comprimento de onda maior que ele prprio

Comprimento de onda da luz Visvel

Funcionamento do microscpio ptico Limite de Resoluo do Microscpio

Comprimento de onda =

Abertura numrica = AN Propriedade especfica das lentes relacionadas com ndice de refrao do meio e o ngulo de incidncia dos raios luminosos (coletar Luz)

Luz Branca = 0,4 0,7 m

Funcionamento do microscpio ptico Limite de Resoluo do Microscpio

Luz branca

refrao vidro

~ 0,59 m

LR = 0,61 . AN

LR = 0,61 . 0,59 m = 0,36 m 1,0

LR = 0,61 . 0,59 m = 0,25 m 1,4

Funcionamento do microscpio ptico Limite de Resoluo do Microscpio

Por que s nos aumentos maiores conseguimos enxergar as falhas na letra ( = mais detalhes)?

Funcionamento do microscpio ptico

Preparao do material para anlise no microscpio

1 - Clulas so muito frgeis e muitos dos seus componentes perdem a estrutura aps a morte da clula

Preparao do material para anlise no microscpio

1 - Clulas so muito frgeis e muitos dos seus componentes perdem a estrutura aps a morte da clula

2 - Material deve permitir a passagem da luz Maioria dos tecidos so compostos camadas de clulas de diversas

Preparao do material para anlise no microscpio

1 - Clulas so muito frgeis e muitos dos seus componentes perdem a estrutura aps a morte da clula

2 - Material deve permitir a passagem da luz Maioria dos tecidos so compostos camadas de clulas de diversas

3 - Clulas e seus componentes so transparentes (excees = presena de pigmentos coloridos)

Preparao do material para anlise no microscpio

1 Fragilidade das Clulas

FIXAO DO MATERIAL

Consiste no uso de substncias (fixadores) que provocam a morte das clulas propiciando a preservao da estrutura que tinham em vida) Diversos fixadores cidos, formaldedo, acetonas, etc)

Formam ligaes qumicas fortes entre as molculas proteicas sustenta sua estrutura

Preparao do material para anlise no microscpio

1 Fragilidade das Clulas

FIXAO DO MATERIAL Mtodos fsicos Congelamento - dessecamento Congelamento rpido Dessecamento vcuo -160 a -190 C (Nitrognio lquido) -30 a -60 C

Preparao do material para anlise no microscpio

2 Passagem da Luz

Maioria dos tecidos so compostos diversas camadas de clulas

CORTE DO MATERIAL

Camadas Finas Problemas = tecidos moles

Preparao do material para anlise no microscpio

2 Passagem da Luz

Incluso do tecido em material rgido Blocos de parafina ou resina

Preparao do material para anlise no microscpio

2 Passagem da Luz

Lminas de ao ou vidro Cortes de 1 a 10 m

Preparao do material para anlise no microscpio

3 Transparncia das Clulas (excees = presena de pigmentos coloridos)

COLORAO

Substncias qumicas orgnicas Tem afinidade por molculas ou parte de molculas das estruturas celulares

Preparao do material para anlise no microscpio

3 Transparncia das Clulas 2 grupos principais de corantes: Bsicos cidos grupo cromforo uma base grupo cromforo um cido Corantes basfilos Corantes acidfilos

Preparao do material para anlise no microscpio

3 Transparncia das Clulas 2 grupos principais de corantes: Bsicos cidos grupo cromforo uma base grupo cromforo um cido Corantes basfilos Corantes acidfilos

Estruturas celulares Com caractersticas cidas (basofilia) Protenas Ncleo Retculo Endoplasmtico cidos Nuclicos (DNA e RNA)

Estruturas celulares Com caractersticas bsicas (acidofilia) Citoplasma Fibras de Colgeno

Preparao do material para anlise no microscpio

3 Transparncia das Clulas Exemplos de corantes
Hematoxilina corante basfilo Eosina corante acidfilo

Protenas Ncleo Retculo Endoplasmtico cidos Nuclicos (DNA e RNA)

Citoplasma Fibras de Colgeno

AZUL / ROXO

ROSA / VERMELHO

Colorao HE

Preparao do material para anlise no microscpio

Preparao do material para anlise no microscpio

Preparao do material para anlise no microscpio

Corantes Basfilos

Corantes Acidfilos

Azul de Toluidina Azul de metileno Azul de alcian Hematoxilina

Xylidine ponceau Sirius red Fast Green Eosina Orcena

Preparao do material para anlise no microscpio

FIXAO CORTE COLORAO

Preparao do material para anlise no microscpio Tipos de Lminas

Lminas Frescas Lminas Permanentes

Simples montagem Esmagamento Esfregao

Trabalhando com Clulas Vivas

Mtodos de fixao, corte e colorao matam as clulas

Transparentes

Trabalhando com Clulas Vivas

Novos microscpios

Trabalhando com Clulas Vivas

Microscpio de campo escuro Luz incide obliquamente Diferente densidades = refraes distintas Somente luz que passa pelo objeto chega a objetiva Imagem clara com fundo escuro

Trabalhando com Clulas Vivas

Microscpio de Fase

Diferente densidades = refraes distintas

Caminho da luz varia com a densidade

Sistema capta diferenas

Trabalhando com Clulas Vivas

Microscpio de Fase Gerao de imagem com contraste

Trabalhando com Clulas Vivas

Microscpio de Interferncia

Diferente densidades = refraes distintas Caminho da luz varia com a densidade Sistema capta diferenas Gerao de imagem com grande contraste

Trabalhando com Clulas Vivas

Evoluo da Microscopia e Anlise das Clulas

Microscopia de Fluorescncia

Uso de substncias fluorescentes para marcao de alvosespecficos Deteco da luminosidade por cmera CCD Tratamento imagem por computador Visualizao de estruturas menores que 0,2 m

Evoluo da Microscopia e Anlise das Clulas

Microscopia de Fluorescncia

Evoluo da Microscopia e Anlise das Clulas

Microscopia de Fluorescncia

Evoluo da Microscopia e Anlise das Clulas

Microscopia de Fluorescncia

Evoluo da Microscopia e Anlise das Clulas

Microscopia de Fluorescncia

Citoqumica

Imunocitoqumica

Evoluo da Microscopia e Anlise das Clulas

Microscopia Confocal

Foco de um nico ponto de luz sobre um ponto especfico da amostra, com profundidade especfica Deteco de diferentes pontos/camadas por vez (escaneamento) Montagem imagem por computador Visualizao de estruturas em 3D

Evoluo da Microscopia e Anlise das Clulas

Microscopia Confocal

Evoluo da Microscopia e Anlise das Clulas

Microscopia Confocal

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Microscpio Eletrnico

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Microscpio Eletrnico

Nenhum objeto pode ser distinguido com o uso de um comprimento de onda maior que ele prprio
Animao

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Microscpio ptico Microscpio Eletrnico

Fonte Luminosa

Fonte de Eltrons

Refrao da Luz

Disperso dos eltrons

Imagem formada pelos raios luminosos

Imagem formada pela ausncia de eltrons

Limite de resoluo = 0,2 m (200 nm) Limite de resoluo = 0,000005 m (0,005nm)

1.000 1.500.X

1.000.000 X

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Cortes de 20 nm de espessura

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Preparo das amostras

Imagem baseada na disperso do eltrons Muitos tomos com baixo peso molecular Soluo eltrons aumentar peso molecular maior disperso dos

Cobertura do material com metais pesados smio, urnio, chumbo, platina e ouro

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Aumentando o Poder de Resoluo dos Microscpios

Cinza vulcnica

Velcro