Instituto Tecnolgico de Los Mochis

OPCION DE TITULACION I
TESIS PROFESIONAL

Identificacin y patogenicidad del agente causal de la mancha angular de calabaza tipo Kabocha (Cucurbita moschata Dutch ex Lam)
Que presenta:

Ruiz Guzmn Anael Guadalupe

Para obtener el ttulo de: LICENCIADO EN BIOLOGIA

Los Mochis, Sinaloa, Enero 2013

Instituto Tecnolgico de Los Mochis

TEMA:

Identificacin y patogenicidad del agente causal de la mancha angular de calabaza tipo Kabocha (Cucurbita moschata Dutch ex Lam) Los Mochis, Sinaloa 2012

REALIZADO EN:

Junta Local de Sanidad Vegetal del Valle de Fuerte

Director de tesis Dr. Rubn Flix Gastlum Asesor interno M.C. Mara Ochoa Hernndez

DEDICATORIAS

AGRADECIMIENTOS

NDICE NDICE DE TABLAS..................................................................................... NDICE DE FIGURAS....................................................................................... Pg. VII VIII

RESUMEN............................................................................................................. IX . I. INTRODUCCION............................................................................................. 2 II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.. 3 III. JUSTIFICACION.. IV. OBJETIVOS............................................................................................... 4 5

4.1. Objetivo general.................................................................................... 5 4.2. Objetivos especficos........................................................................... V. ANTECEDENTES.......................................................................................... 5.1. Generalidades de las Cucurbitceas...................................................... 5.2. Origen......................................................................................... 5.3. Importancia de las Cucurbitceas.......................................................... 5 6 6 7 7

5.4. Mtodos utilizados para controlar las enfermedades y daos por 8 patgenos 5.5. Uso de herramientas moleculares para el estudio de las comunidades 9 fngicas y bacterianas. 5.5.1. Reaccin de Cadena Polimerasa (PCR).............. 10 5.5.2. DNA Polimerasa...................................................................... 5.5.3. Concentraciones de Cloruro de magnesio.... 5.5.4. Desoxirribonuclesidos trifosfatados (dNTPs)......................... 10 11 11

5.5.5. Primers........... 12 5.6. Pasos bsicos de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa(PCR).... 5.6.1. Desnaturalizacin. ................................................................... 13 13

Pag. 5.6.2. Hibridacin................................................................................ 13 5.6.3. Extensin.................................................................................. 5.7. Electroforesis... 5.8. Enfermedades de las Cucurbitceas. 13 14 14

5.8.1. Sntomas........................................................... 15 5.8.2. Comentarios sobre la enfermedad.. VI. MATERIALES Y MTODOS 6.1. Aislamiento de la batera a partir del gen infectado... 6.2. Postulados de Koch... 6.3. Pruebas fisiolgicas y bioqumicas.. 6.3.1. Produccin de Levana.. 16 17 17 18 19 19

6.3.2. Oxidasa 19 6.3.3. Pudricin en papa 19 6.3.4. Dihidrolasa de arginina.. 20

6.3.5. Reaccin de hipersensibilidad 20 6.3.6. Tincin Gram. 6.3.7. Difusin de pigmentos.. 20 21

6.3.8. Prueba de KOH al 3%............................................................... 21 6.3.9. Prueba de catalasa.. 6.3.10. Utilizacin de fuentes de carbono 21 21

6.4. Identificacin molecular de los aislados por medio de Reaccin en 23 cadena de la polimerasa (PCR)... 6.4.1. Cuantificacin del DNAS.. 24 6.4.2. Electroforesis de los productos amplificados. 25

VI

Pag. VII. RESULTADOS. 7.1. Patogenicidad.. 7.2. Pruebas bioqumicas y fisiolgicas 26 26 28

7.3. Pruebas moleculares para la identificacin de la bacteria asociada a la enfermedad. 31 VIII. DISCUSIN IX. CONCLUSIONES.. X. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.. XI. ANEXOS. 34 36 37 41

VII

NDICE DE TABLAS Pg. Tabla 1. Porcentaje del rea foliar daada por seis aislados de Pseudomonas syringae pv. Lachrymans en Calabaza Kabocha, Pepino, Calabaza zucchini Tabla 2a. Morfologa colonial de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans agente causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome, Sinaloa, Mxico.. Tabla 2b. Aplicacin de las prueba LOPAT para la identificacin de la bacteria Pseudomonas syringae pv. Lacrymans, agente causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome, Sinaloa, Mxico Tabla 2c. Aplicacin de las pruebas bioqumicas y fisiolgicas para la identificacin de la bacteria Pseudomonas syringae pv. Lacrymans agente causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome, Sinaloa, Mxico.. 29 28 27 26

Tabla 3. Pureza de los DNAS a una absorbencia de A260/A280..

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NDICE DE FIGURAS VIII

Pg. Figura 1.- Planta y flores de Cucurbitceas tipificadas por un meln honeydew (Cucumis melo). Las flores perfectas (P), que tienen partes masculinas y femeninas y las flores estaminadas (S), que tienen solamente partes masculinas, son portadas individualmente en pednculos delgados. El ovario se desarrolla en un fruto maduro que lleva semillas despus de una polinizacin y una fertilizacin satisfactoria... 3 Figura 2.- Bases nitrogenadas. Estos componentes de los nucletidos son la clave de la especificidad del apareo de las cadenas del ADN, aparendose siempre una purina con una pirimidina Figura 3.- Amplificacin exponencial del DNA molde, a travs de la tcnica de PCR. 11 Figura 4.- Pasos bsicos de un ciclo de PCR Figura 5.- Mancha angular en calabaza Kabocha. Figura 6.- Ubicacin de los oligonucletidos F2C y C en la regin 16S del DNA ribosomal de procariotes. ISR= Regin de secuencia intergnica por sus siglas en ingls: intergenic sequence regin Figura 7.Procedimiento para cargar cada muestra en 22 11 14 9

el 23

espectrofotmetro NanoDrop Figura 8.- Lesiones bacterianas causadas despus de 14 das de la inoculacin, a) calabaza zucchini, b) pepino, c) calabaza Kabocha, d) planta enferma de calabaza Kabocha. Similares a los observado en campos comerciales de calabaza kabocha 26

Pag. Figura 9.- a) prueba de levana positiva, b) prueba de oxidasa negativa, c) pudricin en papa negativa, d) dihidrolasa de arginina tubo izquierdo IX

positivo tuvo derecho negativo, e) reaccin de hipersensibilidad en tabaco... Figura 10.- Corrida en electroforesis para determinar estabilidad de los DNAS carriles del 3 al 12.. Figura 11.- Amplificacin del ADN ribosomal a partir del ADN genmico de los aislados de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans a 1.4 pb. Carriles del 3-12 muestras, carril 13 control negativo, carril 14 marcador de peso molecular 1kb, carril 15 control positivo Pseudomona aeruginosa . 33 32 30

RESUMEN. La calabaza Kabocha (Cucurbita moschata Dutch ex Lam) es atacada por enfermedades foliares de origen fungoso y bacteriano. En ciclos agrcolas X

recientes se ha observado una enfermedad de aparente origen bacteriano; las plantas presentan una severa mancha angular limitada por las nervaduras la cual puede destruir follaje exponiendo los frutos al sol disminuyendo su calidad en el mercado de exportacin. Las siembras de calabaza Kabocha en el norte de Sinaloa coinciden con siembras de otras Cucurbitceas y existe el temor de que esta enfermedad pueda atacar a otros cultivos miembros de la familia de Cucurbitceas. Por lo anterior se desarrollaron los siguientes objetivos a) Identificar la bacteria mediante pruebas fisiolgicas y bioqumicas. b) Identificar mediante la secuenciacin de ADN ribosomal. c) Determinar la patogenicidad de los aislados. En el presente estudio se identific la bacteria Pseudomonas syringae pv. Lacrymans como el agente causal de mancha angular en calabaza tipo Kabocha segn pruebas fisiolgicas, bioqumicas y moleculares, donde se observaron sus caractersticas fenotpicas y genotpicas de esta bacteria, las cuales se determino los rangos de hospedante, en otras Cucurbitceas tales como pepino, calabaza zucchini y calabaza Kabocha. Palabras claves: Identificacin, Cucurbitceas, Sntomas, Tizn foliar.

XI

I. INTRODUCCIN En el estado de Sinaloa, Mxico, se siembra un promedio de 7,055 has de Cucurbitceas anualmente (CAADES, 2004), que incluyen dos especies de calabaza (Cucrbita pepo L. y Cucrbita moschata Duch.), pepino (Cucumis sativus L.), meln (Cucumis melo L.) y sanda (Citrullus lanatus Thumb). Estos cultivos son atacados por enfermedades foliares de origen fungoso y bacterial (Cebreros et al., 1991; Len, 1988; Ramrez, 1991); dentro de las primeras resaltan por su importancia el mildi (Pseudoperonospora cubensis Berk. y Curt.) Rost., la mancha angular por Alternaria cucumerina (Ellis y Everhart) Elliot, la mancha foliar inducida por Corynespora cassiicola (Berk. Y Curt.) Wei y la cenicilla atribuida a Erysiphe cichoraceaum DC (Cebreros et al., 1991) actualmente conocida como Golovinomyces cichoracearum (DC.) V.P. Gelyuta; sin embargo, en aos recientes se demostr que esta enfermedad es causada por Podosphaera xanthii (FlixGastelum et al., 2005) este grupo de enfermedades se han visto ampliadas por la presencia de una enfermedad cuyos sntomas eran desconocidos por productores y tcnicos de campo en el norte de Sinaloa. Del mismo modo, se desconoce el agente etiolgico de la enfermedad; as como su ecologa, epidemiologia y medidas adecuadas para su control en campo. Por lo anterior y por solicitud de los productores de Cucurbitceas en el norte de Sinaloa (en particular los productores de calabaza Kabocha) se realiz el presente estudio con el propsito de identificar al agente causal, lo cual servir de base para estudios futuros relativos a la ecologa, epidemiologia y manejo de la enfermedad.

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En ciclos agrcolas recientes, los productores de calabaza Kabocha (Cucurbita moschata) del Valle del Fuerte han observado un severa mancha angular en dicho cultivo. El agente etiolgico de esta enfermedad se desconoce y por lo tanto se desconocen tambin las estrategias adecuadas para su control. En este sentido los productores y tcnicos de campo han expresado su inters para que se lleven a cabo estudios relativos a la identificacin y el rango de hospedantes del patgeno. Los sntomas en plantas de calabaza Kabocha se manifiestan mediante un severa mancha angular en las hojas, lo cual reduce el rea foliar y expone los frutos al sol reducindose as su calidad en el mercado de exportacin. Los agricultores y tcnicos de campo mencionan que tambin se han ocurrido sntomas consistentes en lecciones acuosas en los frutos, y lo relacionan con el mismo organismo que causa el tizn foliar. En vista de que en el Valle del Fuerte se produce un amplio grupo de cucurbitceas como sandias, meln, pepino, y varios tipos de calabazas, los productores no descartan la posibilidad que el patgeno pueda atacar a estos cultivos adems de la calabaza Kabocha. Estudios preliminares indican a las plantas sintomticas se encuentra asociada una bacteria en forma de bacilo Gram negativa. El presente estudio aportar conocimiento para el control de la enfermedad en campo, esto se sustentar en la cabal identificacin del agente causal de la enfermedad y el rango de hospedantes del patgeno, lo cual contribuir en la implementacin de estrategias de manejo en calabaza Kabocha y otras Cucurbitceas.

III. JUSTIFICACIN La calabaza Kabocha es atacada por enfermedades foliares de origen fungoso y bacteriano (Cebreros et al., 1991; Len, 1988; Ramrez, 1991); dentro de las primeras resaltan por su importancia el mildi (Pseudoperonospora cubensis) el tizn foliar por Alternaria cucumerina (Ellis y Everhart) Elliot, la mancha foliar inducida por Corynespora cassiicola (Berk. Y Curt.) Wei y la cenicilla atribuida a Erysiphe cichoraceaum DC (Cebreros et al., 1991) actualmente conocida como Golovinomyces cichoracearum (DC.) V.P. Gelyuta. La Golovinomyces cichoracearum (DC.) V.P. Gelyuta. En ciclos agrcolas recientes se ha observado una enfermedad de aparente origen bacteriano. Las plantas presentan un severa mancha angular limitada por las nervaduras el cual puede destruir follaje exponiendo los frutos al sol disminuyendo su calidad en el mercado de exportacin. Esta enfermedad ha sido motivo de preocupacin por parte de los productores que desconocen con precisin el agente etiolgico y sus formas adecuadas de control; adems, esta enfermedad viene a ampliar el grupo de patgenos que atacan a esta cucurbitcea en la regin. Las siembras de calabaza Kabocha en el norte de Sinaloa coinciden con siembras de otras cucurbitceas y existe el temor de que esta enfermedad pueda atacar a otros cultivos miembros de las familias Cucurbitceas. Por lo anterior se desarrollo un estudio que defina la causa de la enfermedad as como el rango de hospedante del patgeno con el propsito de implementar medidas de control adecuadas en el futuro.

IV. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general. Identificar la bacteria asociada a sntomas de mancha angular en calabaza Kabocha y determinar su patogenicidad en Cucurbitceas. el cultivo y en otras

4.2. Objetivos especficos a) Determinar la patogenicidad en calabaza Kabocha de 6 aislados de la bacteria en condiciones de invernadero. b) Determinar la patogenicidad en Cucurbitceas (Calabaza zucchini y Pepino) de 6 aislados de la bacteria en invernadero. c) Identificar la bacteria asociada a la mancha angular de calabaza Kabocha mediante pruebas fisiolgicas y bioqumicas. d) Identificar molecularmente los microorganismos asociados a la enfermedad mediante la secuenciacin de ADN ribosomal.

V. ANTECEDENTES 5.1. Generalidades de las Cucurbitceas. Las Cucurbitceas (Cucurbitcea) son una familia de plantas oriundas en su mayor parte del Nuevo Mundo, normalmente herbceas, de las cuales muchas poseen gran importancia etnobotnica; incluye calabazas ( Cucurbita spp), el meln (Cucumis melo), el pepino (Cucumis sativus), la sanda (Citrullus lanatus) y la calabaza bule (Lagenaria siceraria)(Watson y Dallwitz, 1992). Son caractersticamente hierbas rastreras o trepadoras mediante zarcillos en los tallos (caulinares); muestran hojas alternas, en general simples, ms o menos lobadas, carnosas. Las flores son unisexuales, las masculinas con traza de gineceo, generalmente monoicas (Figura 1) ( Bryonia craetica excepcionalmente es diica), regulares, gamoptalas, pentmeras, con periantio doble y estambres atpicos: filamento sigmoide rematado por una antera con una nica teca, estambres libres o soldados en tres grupos: (2)+ (2)+1. En las formas primitivas se muestran los ptalos libres, y el ovario nfero; algunas presentan inflorescencias. Los frutos son muy variables; casi siempre son bayas (italicas) o bayas modificadas (pepnides), pero a veces se presentan como cpsulas (italicas), a veces en elaterio (Watson y Dallwitz, 1992).

Figura 1.- Planta y flores de Cucurbitceas tipificadas por un meln honeydew (Cucumis melo). Las flores perfectas (P), que tienen partes masculinas y femeninas

y las flores estaminadas (S), que tienen solamente partes masculinas, son portadas individualmente en pednculos delgados. El ovario se desarrolla en un fruto maduro que lleva semillas despus de una polinizacin y una fertilizacin satisfactoria. 5.2. Origen. Existe suficiente evidencia arqueolgica para considerar que las Cucurbitceas comenzaron a cultivarse por primera vez, de manera sistemtica, en los estados de Puebla, Oaxaca y el Estado de Mxico. Su cultivo tambin se practic en pocas prehispnicas en prcticamente toda Mesoamrica, en la triloga milpera, junto con el maz y el frijol. Tambin se conoci y se cultivo en otras culturas americanas, como en el caso del Per, donde se ha encontrado cermica Mochica con representacin del zapallo. Ms tarde, a partir del siglo XVI, se llev a Europa, Asia y frica (Zitter et al.,1996). 5.3. Importancia de las Cucurbitceas. Las Cucurbitceas (familia Cucurbitcea) forman un grupo diverso de especies cultivadas en todo el mundo en condiciones muy diferentes y para fines muy distintos. Las principales tipos cultivados son el pepino, el meln (cantalupo o meln bordado, honeydew Etc.), sanda, calabaza ( Cucurbita spp). Los tipos menores cultivados incluyen chayote, cidra, pepinillo, pepino cornudo y pepino silvestre (Zitter et al.,1996). Todas las Cucurbitceas son sensibles a las heladas, pero difieren en su capacidad para resistir el fro y el calor; Se cultivan en tierras bajas y en montaas, en campo abierto y en invernaderos, as como en regiones tropicales, desrticas y templadas. La mayora son plantas trepadoras, pero algunos cultivares modernos de Cucurbita spp. y de pepino producen plantas compactas y tipo mata (Zitter et al., 1996). El fruto inmaduro o maduro se consume en fresco o cocinado. Como grupo, los frutos son relativamente bajos en valor nutritivo; los componentes ms notables son las vitaminas y los minerales. Las semillas de muchas Cucurbitceas son importantes fuentes de aceite y protenas en algunas partes de frica, Asia y Amrica Latina. La calabaza bfalo produce una gran raz con fculas y semillas con alto contenido en protenas y aceite. Los brotes, hojas y flores de algunas

Cucurbitceas se comen y son fuentes ricas en vitaminas y minerales. A pesar de las grandes diferencias entre las especies de Cucurbitceas y dentro de ellas, morfolgicamente son muy similares en apariencia (Zitter et al., 1996). 5.4. Mtodos utilizados para controlar las enfermedades y daos por patgenos. En la actualidad, se sabe que las plantas poseen un amplio rango de sofisticados mecanismos de defensa. En general, las plantas contrarrestan el ataque de los patgenos ya sea mediante caractersticas estructurales que actan como barreras fsicas e impiden que el patgeno penetre y se propague en ellas; tales como las ceras en la superficie de las hojas y frutos, el grosor de la cutcula, grosor y dureza de la pared externa de las clulas epidrmicas. En su caso, cuando ya ha penetrado el hongo, se forman estructuras como las capas de corcho, capas de abscisin, formacin de tlides, sustancias gomosas, cambios en las estructuras celulares, reacciones de defensa citoplsmica, o la reaccin de defensa necrtica tambin llamada defensa mediante hipersensibilidad o bien por medio de reacciones bioqumicas que tienen lugar en sus clulas y tejidos, las cuales producen sustancias txicas para el patgeno o crean condiciones que inhiben su desarrollo (Agrios, 2006). En la agricultura moderna, se intenta lograr la sostenibilidad de la productividad agrcola. El uso de agroqumicos ha permitido obtener incrementos substanciales en la produccin; no obstante, sus efectos adversos impactan significativamente la sostenibilidad de la agricultura. La prctica del monocultivo y la contaminacin por el uso indiscriminado de agroqumicos han reducido la biodiversidad de los agroecosistemas, causando la inestabilidad de los mismos, la cual se manifiesta, entre otros efectos nocivos, en una mayor incidencia de plagas y enfermedades en los cultivos. Esto y los problemas de seguridad y salud pblica inherentes a la fabricacin y uso de agroqumicos han conducido a la bsqueda y establecimiento de alternativas de manejo de plagas y enfermedades (Zavaleta, 1999). Los mtodos de lucha preventiva frente a las bacterias fitopatgenas son mltiples, pero se basan esencialmente en: a) la aplicacin de tcnicas de diagnstico sensibles y especficas que permitan detectar las bacterias en el material vegetal; b)

el anlisis de las caractersticas de las cepas de cada especie y su comparacin molecular con las de otros orgenes; c) el conocimiento de las fuentes de inculo y los reservorios de cada bacteriosis en nuestras condiciones; d) el estudio de las estrategias de supervivencia de las bacterias fitopatgenas en distintos hbitats; y e) el uso de tratamientos preventivos, entre los que destaca el control biolgico (Pealver, et al.2009). As como Programas de saneamiento, solarizacin, rotacin de cultivos y uso de cultivares resistentes, este ltimo mtodo de control ha sido muy utilizado para el control de varios patgenos (Zitter et al., 1996). 5.5. Pruebas fisiolgicas y bioqumicas para la identificacin de bacterias fitopatgenas. Existen diferentes sistemas de clasificacin de bacterias, pero el ms comnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn segn una clasificacin dada. Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificacin. A continuacin se propone un esquema de trabajo para la identificacin de una cepa bacteriana desde el punto de vista bioqumico (Biotipo): 1) Obtener un cultivo puro. 2) Examen microscpico de clulas vivas y de frotis teido por coloracin Gram. Se determina as la forma y el Gram del microorganismo en estudio. Tambin es importante determinar la agrupacin y la presencia de esporas y otras caractersticas morfolgicas de inters. 3) Determinar las caractersticas nutricionales (en general se desprenden de los mtodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoauttrofos, fotohetertrofos, quimioauttrofos, quimiohetertrofos. 4) Realizacin de pruebas primarias: En la siguiente tabla, modificada del Cowan & Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el gnero, grupo de gneros o en algn caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las

pruebas primarias son: Gram, morfologa, catalasa, oxidasa, OF, fermentacin de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosisy movilidad. 5) Realizacin de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependern del gnero o familia determinado. (ej: produccin de pigmentos, produccin de indol a partir de triptofano, produccin de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.) 5.5.1. Ensayos bioqumicos. La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano (Sosa-Moss et al., 1996). Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. A la

determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin, comerciales, etc.) (Sosa-Moss et al., 1996). 5.5.2. Mtodo para la realizacin de pruebas fisiolgicas y bioqumicas Para la realizacin de de las pruebas fisiolgicas y bioqumicas existen tcnica ya predeterminadas para la identificacin de organismos bacterianos en base a su composicin bioqumica como los siguientes: 1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin. 2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtica. En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubacin) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica, atmsfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test. Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente, agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente. (Sosa-Moss et al., 1996) 1) Enzimas vinculadas con la respiracin a) oxidasa b) catalasa 2) Descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros 2.1) Requerimientos de oxgeno OF (xido-fermentacin) Crecimiento en caldo tioglicolato 2.2) Produccin de cido, o cido y gas

Fermentacin de carbohidratos 2.3) Deteccin de enzimas y vas metablicas a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer) b) Gluconato c) O.N.P.G. (orto nitro -D-galactopiransico) d) Esculina e) Hipurato 3) Fuente nica de carbono a) citrato b) malonato c) hipurato para coliformes 4) Utilizacin de compuestos nitrogenados 4.1) Reduccin de nitrato a) asimilacin b) denitrificacin 4.2) Descomposicin de carbohidratos aminocidos y otros a) indol b) H2S c) Fenilalanina d) Lisina, arginina, ornitina e) Urea 5) Ensayos combinados a) TSI (Triple Azcar Hierro) b) LIA (Agar Hierro Lisina) c) Bilis esculina 6) Deteccin de exoenzimas a) lecitinasa b) proteasas, coagulasa c) amilasas d) celulasas e) desoxirribonucleasas f) accin de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas) 7) Miscelneos

a) KCN b) Bilis c) produccin de pigmentos 8) Test de crecimiento o inhibicin a) Temperatura b) NaCl c) Antibiticos (Sosa-Moss et al., 1996) 5.6. Uso de herramientas moleculares para el estudio de las comunidades bacterianas. Dados los problemas inherentes que presentan los sistemas de identificacin fenotpicos (no todas las cepas de una misma especie muestran caractersticas homogneas, una misma cepa puede generar diferentes patrones en ensayos repetidos y tambin las limitaciones en las bases de datos, entre otros), los mtodos moleculares se han erigido como procedimientos complementarios, alternativos o incluso de referencia a los fenotpicos. En la dcada de los 80, comenz la bsqueda de candidatos que, siendo genes estables, permitieran establecer relaciones filogenticas entre las bacterias, como los genes que codifican para las subunidades ribosmicas 5S, 16S, 23S y sus espacios intergnicos. En la taxonoma bacteriana, el anlisis de la secuencia gnica del ARNr 16S es la herramienta ms ampliamente utilizada. Este marcador housekeeping est presente en todas las bacterias. Se presenta como una familia de multigenes u operones cuya funcin no se modifica con el tiempo y acta como un marcador eficiente de evolucin. Adems, tiene un tamao adecuado para realizar el anlisis. El ARNr 16S adems de ser til para la deteccin de bacterias, proporciona informacin til y rpida sobre su identificacin y filogenia mediante la comparacin con bases de datos pblicas que contienen un amplio nmero de de secuencias bacterianas. As pues, la identificacin mediante el ARNr 16S se fundamenta en su secuencia. (Bosshard et al., 2003). Posteriormente, y de forma simultnea a los avances tecnolgicos en las tcnicas de secuenciacin, se han utilizando genes cuya secuencia permite una mayor precisin o una diferenciacin intraespecie en grupos, biovariedades, genovaridades o similar.

Inicialmente, la identificacin bacteriana basada en el anlisis de las secuencias se hallaba limitada a determinados centros o laboratorios. En la actualidad y como consecuencia de la automatizacin, simplificacin del proceso y de la reduccin de su costo, estas tcnicas se han introducido en un mayor nmero de laboratorios. Este avance ha supuesto que en agosto de 2010 en las listas aprobadas de nomenclatura bacteriana el nmero de descripciones de nuevas especies alcance la cifra de 10.000 (http://www.bacterio.cict.fr/number.html#total). Unas de las tcnicas ms utilizadas en la identificacin molecular de algn organismo es la Reaccin en Cadena de la Polimerasa conocida como PCR, por su nomenclatura en ingles (Polymorase Chain Reaction). 5.6.1. Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). La Reaccin en Cadena de la Polimerasa PCR, es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis (Bartlett & Stirling 2003), cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica es considerada la ms revolucionaria del ltimo cuarto del siglo XX. Con sta se consigue copiar millones de veces, en un par de horas, una secuencia predeterminada, dentro de una mezcla de ADN tan compleja como el propio genoma humano, donde la secuencia de inters representa tan solo una diez millonsima parte (Rodrguez-Snchez y Barrera-Saldaa, 2004). 5.6.2. DNA Polimerasa. La polimerasa Taq es un tipo de ADN polimerasa termoestable, nombrada de esta forma debido a que es producida por la bacteria Thermus aquaticus (T-aq) y a partir de la cual fue aislada en el ao 1968 por Thomas D. Brock. A menudo suele abreviarse como "Taq Pol" (o simplemente como "Taq"), y es frecuentemente utilizada en las tcnicas de PCR, un mtodo que se utiliza para amplificar secuencias cortas de ADN. T. aquaticus es una bacteria que vive en manantiales calientes y fuentes hidrotermales, y la polimerasa Taq que de ella se extrae ha sido caracterizada como

una extremoenzima capaz de soportar las condiciones de alta temperatura requeridas durante el proceso de PCR sin desnaturalizarse. Por esta razn ha reemplazado a la ADN polimerasa proveniente de E. coli (Eco pol) que era la que originalmente se utilizaba en esta tcnica, pero que requera ser reemplazada luego de cada ciclo de calentamiento aumentando las probabilidades de contaminacin y prolongando los tiempos. La temperatura ptima de funcionamiento de la Taq es de 7580C, con una semivida mayor a las dos horas a 92,5C, 40 minutos a 95C y 9 minutos a 97,5C. Esta enzima puede replicar una cadena de ADN de 1000 pares de bases en menos de 10 segundos funcionando a 72C de temperatura. Habitualmente, se suele utilizar de 2 a 3 unidades de DNA polimerasa en una reaccin de volumen 100l. (Invitrogen 2004). 5.6.3. Concentraciones de Cloruro de magnesio. Tanto el in magnesio como el manganeso tienen una funcin crtica en la reaccin, requirindose a una concentracin que oscila regularmente entre 0.5 y 2.5 mM. La concentracin de MgCl2 debe optimizarse para cada ensayo en particular, ya que puede tener efecto tanto en la especificidad como en el rendimiento de la reaccin. En general, concentraciones insuficientes de Mg+ 2 dan lugar a bajo rendimiento, mientras que en exceso se obtienen amplificaciones inespecficas. 5.6.4. Desoxirribonuclesidos trifosfatados (dNTPs) Los cuatro dNTPs (dATP, dTTP, dCTP y dGTP; distinguibles por sus bases nitrogenadas) son los ladrillos con los que se construyen las nuevas cadenas de ADN (figura 2).

Figura 2.- Nucletidos. Estos componentes de los nucletidos son la clave de la especificidad del apareo de las cadenas del ADN, aparendose siempre una purina con una pirimidina. La variacin en su concentracin afecta la especificidad y fidelidad de la reaccin. Concentraciones altas de los mismos hacen disminuir la fidelidad con la que la polimerasa efecta su trabajo, e incluso pueden llegar a inhibir su actividad. Tambin afecta a la fidelidad de la reaccin el uso de concentraciones desbalanceadas de estos cuatro ingredientes, siendo las concentraciones usuales, en la mayora de los casos, entre 0.2 a 1 mM. Los dNTPs pueden captar iones de magnesio por lo que las concentraciones de ambos componentes deben guardar siempre la misma relacin, aconsejndose que la concentracin de Mg+ 2 sea 0.5 a 1mM superior a la concentracin de los dNTPs (Rodrguez-Snchez y Barrera-Saldaa, 2004). 5.6.5. Primers. Los Primers o iniciadores son el componente ms sensible que determina el xito de un ensayo de PCR. Su longitud suele estar entre 18 y 30 nucletidos, y su contenido en G+C entre 40-75%. La concentracin a la que suelen emplearse en una PCR est en el intervalo de 0.1-0.5 M. Los iniciadores normalmente se disean para ser exactamente complementarios al molde de ADN (Rodrguez-Snchez y Barrera-Saldaa, 2004). 5.7. Pasos bsicos de la Reaccin en Cadena de la Polimerasaa(PCR).

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa se lleva a cabo en tres pasos en un termociclador: desnaturalizacin, hibridacin y extensin. A continuacin se describirn. 5.7.1. Desnaturalizacin. El sustrato de la enzima de la PCR es el ADN de cadena simple que acta como molde para la sntesis de su nueva cadena complementaria. Mediante un calentamiento a 94C, (figura 3) el ADN de doble cadena logra que sus cadenas se separen o desnaturalicen, esto se logra debido a que los puentes de hidrgeno se rompen dejando al DNA en forma de cadena sencilla, permitiendo as exponer las diferentes bases nitrogenadas para la hibridacin con los primers o iniciadores (Rodrguez-Snchez y Barrera-Saldaa, 2004).

Figura 3.- Amplificacin exponencial del DNA molde, a travs de la tcnica de PCR. 5.7.2. Hibridacin. El alineamiento especfico de ambos iniciadores (cebadores) se produce a una temperatura determinada por composicin de bases y oscila entre 40 y 72C. Ambas cadenas originales del ADN sirven simultneamente como moldes para sintetizar sus respectivas cadenas complementarias nuevas. Un aumento de temperatura

favorece la especificidad, ya que disminuye las uniones incorrectas de los cebadores con sitios apcrifos del ADN molde (Rodrguez-Snchez y Barrera-Saldaa, 2004). 5.7.3. Extensin. Esta etapa debe realizarse a una temperatura alta, que es la que coincide con la mxima actividad de la polimerasa (72C) (figura 4) para evitar alineamientos inespecficos de los iniciadores. Con el DNA molde la cadena sencilla, excepto en sitios donde los indicadores se aparean, la polimerasa empieza a copiar la hebra, incorporando desoxirribonuclesidos monofosfatos en direccin 3-5. El tiempo de extensin depende del tamao de la amplificacin, debiendo estimar 1 min. para alargar 1000 nucletidos. Es comn que al finalizar todos los ciclos se realice un ltimo alargamiento de 5 min. a 72C, para asegurarse que todos los productos de amplificacin estn completamente terminados y tengan, exactamente la misma longitud (Rodrguez-Snchez y Barrera-Saldaa, 2004).

Figura 4.- Pasos bsicos de un ciclo de PCR. 5.8. Electroforesis

La electroforesis en gel es un mtodo que se emplea para separar macromolculas en funcin del tamao, la carga elctrica y otras propiedades fsicas. El trmino electroforesis describe la migracin de las partculas cargadas bajo la influencia de un campo elctrico. Electro se refiere a la electricidad y foresis, del griego phoros, significa trasladar. As pues, la electroforesis en gel es una tcnica consistente en aplicar corriente elctrica a las molculas para que atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensin elctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. un medio gelatinoso. Muchas macromolculas biolgicas importantes (por ejemplo, los aminocidos, los pptidos, las protenas, los nucletidos y los cidos nucleicos) poseen grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solucin como especies cargadas elctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Segn la naturaleza de la carga neta, las partculas cargadas migrarn hacia el ctodo o hacia el nodo. As, por ejemplo, cuando se aplica un campo elctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo harn migrar hacia el nodo (Westermeier, 1997). 5.9. Enfermedades de las Cucurbitceas Existen ms de 200 enfermedades conocidas de las Cucurbitceas de diversas etiologas. El control eficaz de las enfermedades de las Cucurbitceas requiere de una identificacin acertada de los agentes causales la cual conduce a una reduccin de riegos de prdida en la produccin. Las estrategias de control se basan en la prevencin de las enfermedades y en mtodos que limiten la propagacin de dichas enfermedades. El uso de cultivares resistentes a enfermedades ha mejorado considerablemente el control de las enfermedades en pepino, en meln, sandia y ms recientemente calabaza. La semilla libre de enfermedades est recibiendo mayor atencin por parte de las empresas productoras de semilla. La prctica de la rotacin de cultivo para prevenir enfermedades se ha convertido en un pilar de la produccin sustentable de Cucurbitceas. Las propiedades de una molcula determinan la velocidad con que un campo elctrico puede desplazarla a travs de

Dentro de los agentes causales de enfermedades bacterianas se encuentra el gnero "Pseudomonas" el cual se ha generalizado en un bacilo Gram negativo con flagelacin polar. En la familia Pseudomonadaceae se incluyen los bacilos rectos o ligeramente curvados, incapaces de formar esporas y que crecen aerbicamente. La ganancia energtica tiene lugar por respiracin aerbica, en algunas especies por respiracin anaerbica (desnitrificacin), pero no por fermentacin. Desde el punto de vista fisiolgico y metablico las Pseudomonas se caracterizan por el amplio espectro de sustratos orgnicos utilizables. Tambin utilizan un gran nmero de compuestos heterocclicos y aromticos, que no son atacados por otras bacterias. Algunas especies de Pseudomonas oxidan los azcares de forma incompleta y excretan los cidos correspondientes (gluconato, 2-oxogluconato). (Frazier y westhoff, 1978; Chen, 2010). Algunos miembros del gnero son psicrfilos, mientras que otros sintetizan siderforos fluorescentes de color amarillo-verdoso con gran valor taxonmico. Es comn la presencia de plsmidos (Esnard, 1996; Michel, 2004). Pseudomonas puede crecer a las temperaturas normales de refrigeracin, pero la temperatura ptima de crecimiento, est comprendida entre 25-30 C (Frazier y westhoff, 1978). Es tolerante a una amplia variedad de condiciones fsicas, incluyendo la temperatura. Es resistente a las altas concentraciones de sales y colorantes, antispticos dbiles, y muchos antibiticos de uso comn. Pseudomonas tiene predileccin por el crecimiento en ambientes hmedos, que es probablemente un reflejo de su existencia natural en el suelo y el agua. Estas propiedades naturales de la bacteria, sin duda, pueden contribuir a su xito ecolgico como un patgeno oportunista (Todar, 2008). Dentro del gnero Pseudomonas existe la especie Pseudomona syringae el cual es un agente fitopatgeno que puede infectar un amplio rango de especies de plantas, existiendo ms de 50 diferentes patovares (Young et al., 1996). Muchos de estos patovares fueron en su momento consideradas especies individuales dentro del gnero Pseudomonas, pero las tcnicas de biologa molecular tales como hibridacin de ADN han mostrado que todos son parte de P. syringae (Kreig y Holt, 1984).

Dentro de los hospedantes susceptibles a Pseudomona syringae se incluyen a las Cucurbitceas como la calabaza, Cucurbita pepo, la sanda, Citrullus lanatus; el meln, Cucumis melo; y el pepinillo, Cucumis sativus en las cuales ocasiona una disminucin en la produccin y calidad en los cultivos. En la incidencia y severidad de la enfermedad influyen, la susceptibilidad de la planta y el medio ambiente (Almodvar, 2005). Dentro de las enfermedades causada por Pseudomona syringae pv. Lachrymans est la Mancha angular que afecta gravemente a pepino, meln, sanda, calabaza. 5.9.1. Sntomas de la mancha angular. La Mancha angular de la hoja ocurre ms comnmente en el pepino, pero tambin se le encuentra en melones. Las lesiones sobre el follaje empiezan como manchas acuosas que cambian de color gris a marrn. Las manchas pueden inicialmente desarrollar un halo de amarillo a verde plido. Conforme el tejido afectado se seca, el tejido interno puede desprenderse, dando a la hoja la apariencia hilachosa. Las lesiones son delimitadas por las venas, dndole a ellas una forma angular, aunque en condiciones altamente favorables para la enfermedad, las lesiones pueden coalescer y formar una severa mancha angular (Figura 5). Las lesiones en los frutos son generalmente superficiales, y se acompaa de un exudado lechoso claro que se colecta en la parte ms baja de la lesin como una lgrima. Al secarse forma una delgada costra blanca sobre o adyacente a la lesin (Zitter, et al.1996).

Figura 5.- Mancha angular en calabaza Kabocha. 5.9.2. Mtodos de dispersin de la enfermedad.

La bacteria que causa la mancha angular de la hoja sobrevive sobre residuos del hospedante, en el suelo y dentro de la semilla. Durante las lluvias, las bacterias se dispersan desde el suelo a los tallos, a las hojas y ms tarde a los frutos. Una vez que la infeccin toma lugar, el organismo se dispersa en el campo a travs de las manos de los trabajadores. Condiciones hmedas favorecen el desarrollo de la enfermedad. La lluvia o el riego por aspersin conducen a una rpida dispersin de la enfermedad. La enfermedad tambin es dispersada por la maquinaria que se mueve a travs de los campos. La mancha angular es ms severa durante periodos lluviosos prolongados con temperaturas que oscilen entre los 16 a 27C (Zitter et al., 1996).

VI. MATERIALES Y MTODOS.

6.1. Aislamiento de la batera asociada a la mancha angular de la Calabaza kabocha. Se recolectaron hojas de calabaza Kabocha con sntomas de mancha angular en diez lotes comerciales en el municipio de Ahome y se llevaron al Laboratorio de Diagnstico Fitosanitario de la Junta Local de Sanidad Vegetal del Valle del Fuerte (JLSVV). De cada muestra se realizaron preparaciones para ser observadas al microscopio compuesto, de los tejidos adyacentes a las areas infectadas. Se aislaron cepas de las bacterias mediante el mtodo de inmersin del tejido en agua deionizada esterilizada (Rodrguez-Mejia, 1994); para ello, se hicieron pequeos cortes de material enfermo de 1-2 mm de longitud. Los trozos se lavaron con agua destilada y se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 1 minuto. Despus se lavaron en tres ocasiones consecutivas con agua deionizada estril. Finalmente, con la ayuda de una aguja de diseccin esterilizada a la flama, los trozos se introdujeron en tubos de ensayo con 5ml de agua deionizada estril. El material se dej en reposo durante 5 minutos. Con una asa bacteriolgica (100/1) estril, Se tom parte de la suspensin y se sembr mediante estra cruzada en cajas Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) cortes de 0.5 de longitud del margen de las lesiones y se colocaron en un tubo de ensayo con agua destilada estril. El tejido se agit durante 25-30 segundos; conseguido se tom una asada y se desliz en forma de estra en agar nutritivo (AN). Tambin se depositaron trozos de tejido enfermo en placas con PDA. Las siembras se incubaron a 28C durante 24 a 48 horas. Despus de este tiempo y al detectar el desarrollo de las colonias bacterianas y de hongos a partir del material enfermo, se procedi a obtener cultivos puros. Para ello, se observaron las colonias con la ayuda del microscopio estereoscpico con luz oblicua (Olympus SZX7), procediendo a separar las colonias basndose en sus caractersticas morfolgicas. Se trasfirieron a nuevas placas Petri con PDA. Finalmente las colonias puras de bacterias se pasaron a tubos de ensayo con agua deionizada estril. Los tubos se taparon hermticamente, se etiquetaron y (Rodrguez-Meja, 1994). se conservaron a temperatura de 4 C.

6.2. Determinacin de la patogenicidad de seis aislados de la bacteria asociada a la mancha angular de calabaza Kabocha. La patogenicidad de la bacteria asociada a la mancha angular se determin en calabaza Kabocha; adicionalmente se incluyeron pepino y calabaza zucchini. Las semillas de las Cucurbitceas se trataron con hipoclorito de sodio 0.5%. Se sembr en vasos de poliuretano de un litro y cuando las plantas tenan 40 das de edad se inocularon en forma separada con los aislamientos de la bacteria. Los cultivos se ajustaron 3x 108 ufc/ ml (unidades formadoras de colonias) de acuerdo con la escala propuesta por McFarland citado por (Kiraly, et al. 1974). Se utilizaron cuatro plantas de cada especie por aislamiento las plantas inoculadas y las plantas testigo sin inocular se distribuyeron en un arreglo completamente al azar se cubrieron con polietileno, previa colocacin de papel peridico saturado con agua potable para inducir un 100% de humedad. Las plantas se incubaron por 48 horas, la temperatura vari de 8 a 21C durante este periodo. Enseguida, las plantas se sometieron a humedad relativa del 100% slo durante 12 horas (durante la noche) durante 5 noches consecutivas.

6.3. Pruebas fisiolgicas y bioqumicas. A diez aislados, incluyendo los seis que resultaron patognicos se les realiz las pruebas de (LOPAT), siglas que hacen alusin a: levana, oxidasa, pudricin en papa, dihidrolasa de arginina, hipersensibilidad en tabaco. Tambin se determinaron caractersticas fisiolgicas como tincin Gram, difusin de pigmentos fluorescentes, crecimiento a 41C, prueba de KOH y catalasa y por ltimo la utilizacin de fuentes de carbono tales como: D- manitol, Adonitol, Insitol, D-Sorbitol, Celobisa, Trehalosa, D-Arabinosa, L- Rhamnosa, Maltosa, Lactosa, Sacarosa. Todas las pruebas se realizaron a partir de aislados puros de 48 horas de edad siguiendo procedimientos previamente descritos (Manovsky, 1982; Fahy y Persley, 1983; Schaad, 1980 y Rodrguez-Meja, 1994). 6.3.1. Produccin de Levana. Se utiliz el medio para produccin de Levana (Anexo 1.4). La bacteria se sembr en cuatro partes de la caja de petri con una asa bacteriolgica y se mantuvo a 28C durante 24-48 hrs. con la caja sin invertirse. Las colonias pulvinadas y mucoides se consideran positivas, y las colonias planas o ligeramente convexas y hmedas negativas. 6.3.2. Prueba de Oxidasa. Para la prueba de oxidasa se esteriliz papel filtro (Whatman # 1), sobre el papel se coloc con un pica diente estril una colonia del aislado y se le agreg una gota del reactivo (Oxidase Reagent REF 55 635); despus de un minuto en el papel filtro se muestra con un color lila a azul significa positivo; sin color negativo. 6.3.3. Pudricin en papa Tubrculos de papa sana variedad Fianna se sumergieron en una solucin de hipoclorito de sodio al 0.5 % durante 4 minutos; enseguida se cortaron con un bistur rodajas de aproximadamente 5 mm de grosor y con el mismo bistur se realiz una incisin en el centro de las rodajas, cerca de mechero de bunsen, se tom una

asada del aislamiento para pasarse por la incisin tres veces. Las rodajas as inoculadas se pasaron a una cmara hmeda por 72 hrs. Se consider positivo si en la incisin se presentaba pudricin, negativo si no se observ sntoma. 6.3.4. Prueba de Dihidrolasa de arginina. Se utiliz el medio de arginina (Anexo 1.5) el cual se prepar en tubos de ensay de 16 x 150 mm con tapn de rosca. A partir del cultivo bacteriano se inocularon por picadura dos tubos del medio con una asa bacteriolgica previamente flameada y se les adicion 1 ml de aceite mineral estril y se incubaron a 28C durante 72 hr. La prueba se consider positiva cuando los tubos inoculados presentaron cambio de color de rosa plido a prpura o violeta; La prueba es negativa cuando no hay cambio de color en el medio de cultivo. 6.3.5. Reaccin de hipersensibilidad. Se utiliz una planta de tabaco var. Xanthi, con cada aislamiento se llen una jeringa de 3 ml esterilizada con una suspensin bacteriana de 10 7 clulas/ ml; Se tom una de las hojas del tabaco entre los dedos y se infiltr en el envs de la hoja, ejerciendo una pequea presin, sin traspasar la hoja y se empuj el embolo para infiltrar. Los resultados se observaron a las 24 horas despus de la infiltracin. La prueba es positiva si la zona infiltrada presenta necrosis o flacidez; La prueba es negativa cuando se observ clorosis despus de las 72hrs. 6.3.6. Tincin Gram. Se marc un portaobjetos con el nombre del aislamiento y se tom una asada del inoculo el cual se sembr en espiral en el centro del portaobjeto y se fij en el mechero bunsen, se le aadieron 1 2 gotas de cristal violeta a la preparacin, hasta que se cubri por completo 1 minuto. Una vez transcurrido el tiempo, la preparacin se lav con agua destilada utilizando una piseta; se agregaron 1 2 gotas de solucin lugol a la preparacin por 1 minuto, transcurrido el tiempo, se lav, con cuidado se le aadi gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparacin durante 10 segundos; Se aadi el colorante de contraste, safranina (1 2 gotas)

durante 30 segundos y se lav con la piseta; Se sec al aire y se observ bajo el microscopio compuesto con el objetivo de inmersin. 6.3.7. Difusin de pigmentos Se utiliz el medio de B de King (Anexo 1.2). Sobre el medio de cultivo en caja petri se sembraron los asilamientos por estra cruzada. Los resultados se observaron a las 24 hrs despus de la siembra; para ello los cultivos se expusieron a luz ultravioleta en obscuridad. Se considera prueba positiva si se observa fluorescencia, la prueba es negativa cuando las colonias no fluorescen. 6.3.8. Prueba de KOH al 3% En un portaobjetos se coloc una gota de KOH al 3% (Anexo 3); una asada del cultivo bacteriano se mezcl con el KOH mediante movimientos giratorios durante un minuto. Si al separar el asa del portaobjetos se forma una hebra viscosa, esto indica que se trata de bacterias Gram negativas, si la hebra no se forma se trata de bacterias Gram positivas. 6.3.9. Prueba de catalasa. Con el asa estril se tom una colonia del asilamiento y se coloc en un portaobjetos, con una pipeta Pasteur se adicion una gota de H 2O2 al 30% (Anexo 3). La prueba es positiva si de inmediato se observarn burbujas. La prueba se considera negativa cuando no se observan burbujas. 6.3.10. Utilizacin de fuentes de carbono Para esta prueba bioqumica se utiliz el medio base de Ayers (Anexo 1.3) el cual se prepar en matraces erlenmeyer de 500 ml. a cada matraz se le agreg uno de los siguientes azcares: D- manitol, Adonitol, Insitol, D-Sorbitol, Celobisa, Trehalosa, DArabinosa, L- Rhamnosa, Maltosa, Lactosa, Sacarosa (Shaad, 1980). Los medios de cultivo se esterilizaron en autoclave a 118C por 15 min. y se dispensaron en cajas petri. Se utilizaron dos cajas de petri con cada fuente de carbono para cada aislado,

las cuales se sembraron por estra y se incubaron a 28C por 7 das. La prueba es positiva si la bacteria utiliza la fuente de carbono y crece en el medio, y es negativa si la bacteria no crece en el medio de cultivo.

6.4. Identificacin molecular de los aislados mediante Reaccin en Cadena de la Polimerasaa(PCR). Los aislados identificados mediante las pruebas bioqumicas y fisiolgicas, se crecieron en placas de LB (Luria Broth), por 24 horas a 37 C; de las placas se colect una asada de cada aislado por separado y se deposit en un tubo Eppendorf de 1.5 ml el cual contena 2 ml de medio LB. Los cultivos se sometieron a agitacin de 200 revoluciones durante 16 horas a 37 C. El ADN genmico fue empleado para la identificacin molecular posterior, mediante la tcnica de la Reaccin en Cadena de la Polimerasaa(PCR). Para la identificacin molecular de los posibles microorganismos de origen procaritico, se tom 1 l del DNA eludo y se combin con 24 l de la mezcla de reaccin para PCR conteniendo H 2O destilada estril, 0.5 M de cada uno de los oligonucletidos; 1X de buffer para PCR; 1mM de MgCl 2; 500 M de cada uno de los dNTPs; 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Cat. No. 10966-030. Lote TPKB1d, Invitrogen EUA). Se emplearon oligonucletidos dirigidos a la amplificacin de la regin 16S del ADN ribosomal (Figura 6). Para lograr este objetivo, se utilizaron los oligonucletidos F2C (5- AGAGTTTGATCATGGCTC -3) y C (5- ACGGGCGGTGTGTAC -3) (Shi et al., 1997) los cuales se ubican respectivamente en las posiciones 8 a 25 y 1392 a 1406 de la secuencia del 16S rDNA de Escherichia coli (Brosius et al.,1987).

F2C 16S C

ISR

23S

Figura 6.- Ubicacin de los oligonucletidos F2C y C en la regin 16S del DNA ribosomal de procariotes. Regin de secuencia intergnica por sus siglas en ingls: ISR= intergenic sequence regin. Las condiciones del programa de PCR para amplificar el ADNr de procariotes fueron las siguientes: para la desnaturalizacin 4 min a 95 C, 1 min a 95 C; anillamiento 1 min a 55 C; elongacin 2 min a 72 C, por 32 ciclos; y un paso final de elongacin de 5 min a 72 C. Una vez terminados los programas de amplificacin, se procedi a su visualizacin por medio de la tcnica de electroforesis. Los tubos Eppendorff

conteniendo las mezclas de reaccin se colocaron en un termociclador (BioRad, Cat. No. 580BR-2592, CA, EUA). 6.4.1. Cuantificacin del DNAS. De los tubos Eppendorff conteniendo los productos de PCR se utiliz una fraccin mnima de la cantidad de muestra (0.5-2 l). Este sistema de medicin emplea la tensin superficial para mantener la muestra esttica entre dos fibras pticas, lo que permite la medicin de muestras altamente concentradas sin la necesidad de utilizar diluciones. Antes de empezar se realiz la calibracin del equipo: se limpi el pedestal (punto de medicin) con agua mili-q y papel secante suave. Se cargaron 2 l de agua mili-q en el pedestal y se inici la lectura. Procedimiento: 1. Se cuantific el blanco, es decir, el buffer donde se encuentra el ADN, para identificar cualquier tipo de contaminacin. Se cargaron 2 l de buffer de elucin y se inicio la lectura. 2. Para medir cada muestra, se ingres primero el cdigo de cada muestra en la ventana del software y se cargaron 2 l de la misma en el pedestal del espectrofotmetro. Se inici la lectura y se repiti el procedimiento para cada muestra (Figura 7).

Figura 7.- Procedimiento para cargar cada muestra en el espectrofotmetro NanoDrop

6.4.2. Electroforesis de los productos amplificados.

Para la visualizacin de los productos de PCR se prepararon geles de agarosa al 1%. La agarosa se disolvi en 50 ml de TAE 0.5 X (40 mM Tris-HCl, cido actico pH 8.0, 1 mM EDTA) aplicando calor mediante un horno de microondas por un perodo de 45 segundos, y se dej enfriar a aproximadamente 50 C y posteriormente se agreg 1.5 l de bromuro de etidio (10 mg/ml) (Sambrook et al., 1989); se verti en la base de la cmara de electroforesis con un peine para formar los pozos. Una vez que la agarosa gelific, se coloc en la cmara buffer TAE 0.5 X hasta cubrir el gel. En cada pozo se cargaron 2 l de buffer de carga (glicerol 30%, 25 mM EDTA pH 8.0, 0.025% colorante azul de bromofenol y xilen-cianol) por cada 10 l de muestra (producto de PCR). Se emple como marcador de peso molecular el marcador de 1 Kb ADN Ladder Plus (Invitrogen, EUA, Cat. No. 15628 019). El proceso de electroforesis se realiz con un voltaje de 80 V por un tiempo de 40 min. El gel de agarosa fue visualizado mediante la aplicacin de luz ultravioleta en un fotodocumentador (CHEMIDOC Universal Hood II de Biorad, Cat. No. 765/07032, CA, EUA).

VII. RESULTADOS. 7.1. Patogenicidad de los seis aislados de Pseudomonas syringae pv. Lachrymans en Calabaza Kabocha y otras Cucurbitceas. Sesenta y dos horas despus de la inoculacin se observaron los primeros sntomas en la hojas de calabaza Kabocha (Cucurbita moschata Dutch ex Lam) as como en pepino, calabaza zucchini variedad (gray), en las hojas se presentaron lesiones irregulares de color pardo oscuro; Las lesiones se incrementaron en tamao hasta cubrir gran rea foliar, llegando a causar el atizonamiento; El cual estuvo delimitado por la nervadura principal en las hojas (figura 8).

Figura 8.- Lesiones bacterianas causadas despus de 14 das de la inoculacin, a) calabaza zucchini, b) pepino, c) calabaza Kabocha, d) planta enferma de calabaza Kabocha. Similares a los observado en campos comerciales de calabaza kabocha.

Tabla 1. Porcentaje del rea foliar daada por seis aislados de Pseudomonas syringae pv. Lachrymans en Calabaza Kabocha, Pepino, Calabaza zucchini.

Hospedante Pepino Aislamientos Ps 3 30 30 40 40 15 15 15 15 15 15 15 15 75 75 75 75 35 35 35 35 15 15 15 15 0

Dao en porcentaje por planta Calabaza zuchini Calabaza Kabocha

Ps 4

Ps 6

Ps 8

Ps 9

Ps 12

Testigo sin inocular

80 80 80 80 12 12 12 13 35 35 35 35 80 80 80 80 50 50 50 50 50 50 70 70 0

80 75 80 75 35 35 40 35 40 40 40 40 80 80 80 80 30 30 30 30 15 12 15 15 0

7.2. Pruebas bioqumicas y fisiolgicas. Los aislados bacterianos asociados a la mancha angular de calabaza Kabocha (Cucurbita moschata Dutch ex Lam) caracterizadas fuern Gram negativo, las colonias fueron circulares, puntiformes, convexas, suaves y de un color blanco a crema (Tabla 2a). Todos los aislamientos indujeron a reaccin de hipersensiblilidad en tabaco. Tambin produjeron pigmento fluorescente en el medio B de King. Fueron positivas para las pruebas de catalasa y levana, pero fueron negativas en caso de oxidasa y Dehydrolasa arginina (figura 9). Los aislamientos no utilizaron Celobiosa, Trehalosa, D-arabinosa, L-ramnosa, Lactosa, Sacarosa, Adonitol, Maltosa, pero utilizarn Manitol, Sorbitol, Inositol. Ningn aislamiento creci a 41C (Tablas 2b y 2c). Los resultados arriba indicados sugieren que los dez aislamientos en el municipio de Ahome, Sinaloa corresponden a Pseudomonas syringae pv. Lacrymans lo cual concuerda con estudios previos (Schaad., 1980; Rodrguez-Meja 1994). Tabla 2a. Morfologa colonial de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans agente causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome, Sinaloa, Mxico. Esperado segn (Schaad., 1980) Morfologa Resultado

colonial Circular, Forma Bordes Elevacin Color Superficie Puntiforme Uniforme Convexa Blanco a Crema Lisa Circular, Puntiforme Uniforme Convexa Blanco a Crema Lisa para la identificacin de la bacteria

Tabla 2b. Aplicacin de las prueba LOPAT

Pseudomonas syringae pv. Lacrymans , agente causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome, Sinaloa, Mxico.

Aislamientos Prueba PS 10 PS 11 + + fisiolgica Levana Oxidasa Pudricin en papa Dihidrolasa de arginina Reaccin de hipersensibilidad 1980) + + PS 12 + + PS 3 PS 4 PS 5 PS 6 PS 7 PS 8 + + PS 9 + + bioqumica y (Schaad.,

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

Figura 9.-

a) prueba de Levana positiva, b) prueba de Oxidasa negativa, c)

pudricin en papa negativa, d) Dihidrolasa de arginina tubo izquierdo positivo tubo derecho negativo, e) reaccin de hipersensibilidad en tabaco.

Tabla 2c. Aplicacin de las pruebas bioqumicas y fisiolgicas para la identificacin de la bacteria Pseudomonas syringae pv. Lacrymans agente causal de la mancha angular de calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome, Sinaloa, Mxico.

Aislamientos Ps 10 Ps 11 + + + + + + y fisiolgica* Caracteristicas fisiologcas Tincin Gram Difusin de pigmentos fluorescente Crecimiento a 41C Prueba de KOH Catalasa Utilizacin de fuentes de carbono Maltosa Adonitol Sacarosa Lactosa Inositol Ramnosa Arabinosa Sorbitol Trehalosa Celobiosa Manitol + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 1980) Ps 12 Ps 3 Ps 4 Ps 5 Ps 6 Ps 7 Ps 8 Ps 9 Prueba bioqumica (Schaad.,

*Los resultados se registraron de 4-5 das despus de la siembra de los 10 aislamientos de la bacteria en los medios de cultivos respectivos.

5.3. Pruebas moleculares para la idenficiacin de la bacteria asociada a la enfermedad.

Para llevar a cabo las pruebas moleculares se realiz la extraccin y cuantificacin de ADN; y enseguida se corri en electroforesis para su estabilidad antes de ser sometida a la reaccin de PCR (Figura 10).

Figura 10.-

Corrida en electroforesis para determinar estabilidad de los DNAS

carriles del 3 al 12. En el protocolo del espectrofotmetro NanoDrop a una relacin de A260/280 la pureza de los DNA debe estar entre 1.8 y 2.1, ocho de las muestras tiene pureza absoluta y solo dos tiene residuos de protenas, polisacridos, polifenoles, entre otros elementos considerados como contaminantes en el proceso de extraccin (Tabla 3).

Tabla 3. Pureza de los DNAS a una absorbencia de A260/A280

Concentracin de cidos Muestras 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 nucledos 18.8 3.3 18.6 77.7 30.5 95.4 41.7 25 26.5 72.2 Unidad ng/l ng/l ng/l ng/l ng/l ng/l ng/l ng/l ng/l ng/l A260 A280 A260/A280 0.375 0.166 2.26 0.066 0.03 2.2 0.372 0.188 1.98 1.555 0.78 1.99 0.61 0.298 2.05 1.908 0.914 2.09 0.833 0.405 2.06 0.5 0.244 2.05 0.53 0.269 1.97 1.445 0.703 2.06

El anlisis molecular de ADN obtenido de diez asilados de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans causante de la mancha angular de calabaza Kabocha, y sometido a PCR, permiti la amplificacin para lograr un producto de 1400 a 1500 pares de bases (pb), los cuales fueron iguales en tamao al control positivo Pseudomona aeruginosa (figura 11).

Figura 11.- Amplificacin del ADN ribosomal a partir del ADN genmico de los aislados de Pseudomonas syringae pv. Lacrymans a 1.4 pb. Carriles del 3-12 muestras, carril 13 control negativo, carril 14 marcador de peso molecular 1kb, carril 15 control positivo Pseudomona aeruginosa. A continuacin, la secuencia consenso se introdujo en bases de datos de acceso pblico (NCBI), con el objetivo de identificar los 10 aislados mediante la comparacin con las otras secuencias depositadas, en estas bases. Actualmente, la base de

datos que presenta mayor nmero de consultas por su mayor versatilidad en organismos, orgenes, genes, y tipo y nmero de secuencias depositadas es la base pblica GenBank NCBI (National con Center for Biotechnology como Information, BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov) programas

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) para el alineamiento de secuencias. Adems, GenBank contiene una seccin de taxonoma (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy que incluye informacin y secuencias sobre ms de 160.000 organismos. En esta base de datos se identifico de los diez aislado un solo gnero Pseudomonas syringae pv. Lacrymans.

VIII. DISCUSIN La mancha angular de la calabaza Kabocha se ha presentado en condiciones epidmicas en sitios agrcolas recientes en el Municipio de Ahome; estudios previos mencionan a esta enfermedad de las Cucurbitceas causando prdidas considerables en otras zonas productoras en este tipo de hortalizas (Zitter et al.,

1996) los sntomas observados en calabaza Kabocha en el Municipio de Ahome se asemeja a los previamente reportados (Zitter et al., 1996). Sin embargo, en esta regin se manifiestan como lesiones pequeas y acuosas a partir de los bordes de las hojas, stas se incrementan en tamao e invaden hasta una tercera parte de la lmina foliar sin delimitarse su avance por las nervaduras. En la induccin de la mancha angular de las Cucurbitceas se ha implicado a la bacteria Pseudomonas syringae pv. lacrymans (Young, 1996; Kritzman y Zutra, 1983a). Pruebas en condiciones de invernadero en el presente estudio, demostraron la patogenicidad de seis aislados bacterianos obtenidos de calabaza Kabocha con sntomas de mancha angular en campo en el municipio de Ahome. Estos aislados resultaron patognicos en la propia calabaza Kabocha as como en calabaza zucchini y pepino. La severidad de la enfermedad en hojas inoculadas coincide con estudios previos (Elwakil et al., 2001) donde se ha demostrado que en inoculaciones artificiales la bacteria en ms severa en estos rganos que en yemas y tallos. La susceptibilidad de estas dos ltimas especies ha sido consignada en trabajos en otras partes del mundo (Fatmi et al., 2008). Los resultados indican que bajo las condiciones del norte de Sinaloa, la mancha angular puede diseminarse hacia plantaciones comerciales de pepino y calabaza zucchini los cuales cubren una superficie de 3,066.98 y 5217.90 ha, respectivamente, en el norte de Sinaloa durante el otoo e invierno (SIAP, 2012). Las pruebas fisiolgicas y bioqumicas indicaron que la bacteria asociada a la mancha angular en calabaza Kabocha y cuya patogenicidad se demostr en el mismo cultivo as como en pepino y calabaza zucchini es P. syringae pv. lacrymans (Smith y Bryan) Yong et al. Dichas pruebas levana, oxidasa, pudricin en papa, deshidrolasa de arginina e hipersensibilidad en tabaco (LOPAT), as como la capacidad de los aislados para la asimilacin de fuentes de carbono como son: Dmanitol, Adonitol, Insitol, D-Sorbitol, Celobisa, Trehalosa, Rhamnosa, Maltosa, Lactosa, Sacarosa (Shaad, 1980). Las pruebas moleculares ubicaron a diez de los aislados como P. syringae, pero slo uno de ellos se identific como P. syringae pv. lacrymans. Estudios adicionales deber desarrollarse para la cabal identificacin de todos los aislados obtenidos en el ciclo agrcola 2011-2012, as como los obtenidos del ciclo 2012-2013. Enseguida D-Arabinosa, L-

se debern desarrollar investigacin sobre el estudio de la diversidad gentica del patgeno donde se aborden tcnicas moleculares de Reaccin en Cadena de la Polimerasaaen combinacin con Polimorfismos de Pongitud de Fragmentos de Restriccin (PCR-RFLP, por sus siglas en ingls) tal como se ha realizado en algunos pases Europeos (Olczak-Woltman et al., 2007). Estudios adicionales sobre P. syringae pv. lacrymans debern considerar la sobrevivencia de este patgeno en residuos de la cosecha incorporados al suelo en de norte de Sinaloa; en este sentido, an cuando este tema ha sido abordado en otras partes del mundo (Kritzman y Zutra, 1983a), los resultados no son aplicables a esta regin, pues las Cucurbitceas se siembran durante la temporada de otooinvierno y el patgeno debe sobrevivir el verano, lo cual contrasta con otros estudios donde las Cucurbitceas se cultivan en verano y el patgeno sobrevive durante el invierno. Estudios previos tambin indican que P. syringae pv. lacrymans se transmite a travs de semilla de Cucurbitceas (Kritzman y Zutra, 1983b; Gomah,1997; Gustafson y Gustafson, 1980); este tema deber considerarse en futuras investigaciones con el fin de eliminar el patgeno de la simiente, pues esto contribuir de manera significativa al manejo de la enfermedad. Finalmente, el presente estudio contribuye al conocimiento de una enfermedad de origen bacteria en calabaza Kabocha y establece las bases para estudios futuros. Dichos estudios tendrn aplicacin prctica en el manejo de la enfermedad y de esta forma se minimizar el impacto de la enfermedad en la produccin de Cucurbitceas en el norte de Sinaloa.

IX. CONCLUSIONES Seis aislados de la bacteria asociada la mancha angular de calabaza Kabocha indujeron sntomas similares observados en campo al realizar pruebas de

patogenicidad en condiciones de invernadero. Los mismos aislados causaron enfermedades en otras Cucurbitceas tales como pepino y calabaza zucchini. Las pruebas fisiolgicas y bioqumicas indican que 10 aislamientos de la bacteria causante de la mancha angular de calabaza kabocha en el municipio de Ahome corresponden a Pseudomonas syringae pv. Lacrymans. Pruebas moleculares de los 10 aislados indican que la bacteria causante de la mancha angular de la calabaza Kabocha y otras Cucurbitceas en el municipio de Ahome corresponde a Pseudomonas syringae. Estudios moleculares adicionales son necesarios para determinar la identidad a nivel patovar.

X. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Almodvar, M.S, Especialista en Fitopatologa 2005 Publicado para la promocin del trabajo cooperativo de Extensin segn lo dispuesto por las

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XI. ANEXOS

FRMULAS DE MEDIOS DE CULTIVO I. MEDIOS DE AISAMIENTO

I.1 MEDIO PAPA DEXTROSA AGAR (PDA)

Infusin de Papa Dextrosa Agar Bacteriolgico Agua pH 5.6 0.2 Mtodo:

200.0 g 20.0 g 15.0 1000.0 ml

Suspender 39 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completadisolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15minutos. Enfriar a una temperatura entre 45-50 C y vaciar en placas de Petri estriles. I.2 MEDIO B DE KING (B. K.) Triptena Peptona de carne Fosfato dipotsico Agar Agua pH final: 7.2 0.2 Mtodo: Suspender 38 g del polvo en un litro de agua destilada. Agregar 10 ml de glicerina. Calentar con agitacin constante para homogeneizar el producto. Llevar a ebullicin para que se disuelva por completo. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 121 C. 10.0 g 10.0 g 1.5 g 1.5 g 15.0 1000.0 ml

Sulfato de magnesio* 7H2O

II.

MEDIOS PARA CARACTERIZACIN

1.3 MEDIO AYERS UTILIZACIN DE FUENTES DE CARBONO Fosfato monobsico de Amonio Cloruro de potasio Sulfato de magnesio * 7 H2O Azul de bromotimol Agar Agua pH final: 7.2 0.2 Mtodo: Se le agrega a la concentracin final 0.1 % (w/v) de la fuente de carbono y se esteriliza en autoclave por 15 min. a 15 lb de presin. 1.4 MEDIO PARA PRODUCCIN DE LEVANA Extracto de carne Peptona Sacarosa Agar Agua Mtodo: Calentar con agitacin constante para homogeneizar el producto. Llevar a ebullicin para que se disuelva por completo. Distribuir y esterilizar 15 minutos a 121 C. 1.5 MEDIO DE ARGININA Peptona Cloruro de sodio Difosfato de potasio Agar 1g 5g 0.3 g 3g 3g 10 g 50g 20g 1000.0 ml 1.0 g 0.2 g 0.2 g 0.03 g 12 g 1000.0 ml

Rojo de fenol Agua Mtodo:

1.0 mg 1000.0 ml

L (+) hidrocloruro de arginina 10 g

Disolver los ingredientes en agua destilada y ajustar el pH a 7.2; distribuir en tubos y esterilizar a 121 C. durante 15 min. III. REACTIVOS

3.1. KOH Hidrxido de potasio qumicamente puro.......................... 40 g Creatina............................................................................. 0.3 g Agua destilada........................................................... cbp 100 mL Preparacin: - Agregar el hidrxido de potasio a 75 ml de agua destilada, agitando y enfriando constantemente. - Cuando la solucin est ms menos a temperatura ambiente (25 C) agregar la creatina y suficiente agua destilada para obtener un volumen final de 100 ml. 3.2. REACTIVO PARA LA PRUEBA DE LA CATALASA. Solucin acuosa de Perxido de Hidrgeno de 10 volmenes %