IDENTIFICACIN Y MONTAJE EN PLACA DE COLLETOTRICHUM SPP EN FRUTOS DE PAPAYA

RESUMN

En el proceso de identificacin del genero Colletotrichum spp partimos de recolectar la muestra de fruto infectada, llevarla al laboratorio para proceder a la realizacin de cortes del tejido afectado. Posteriormente se realiz montajes en el estereoscopio para identificar caractersticas preliminares, luego se realiz una tincin con el colorante azul de lactofenol para observar estructuras reproductivas, acrvulos Finalmente se llev a cabo el sellado de la lmina utilizando un barniz transparente y se conserv el fruto en formol al 50%.Como resultados generales se observ manchas hundidas, con masas de esporas con un color opaco( marrn- Negro) con un patrn de anillo, microscpicamente se observ conidias fusiformes, hialinas dentro de las estructuras llamadas acrvulos, con un micelio ramificado. Palabras Clave: Colletotrichum spp, azul de lactofenol, acrvulos
ABSTRACT

In the identification process the genus Colletotrichum spp we start from collect the sample of fruit infected, transport to the laboratory to proceed to the realization of cuts the affected tissue. Subsequently was performed montages in the stereoscope to identify preliminary characteristics, then followed a staining with the blue dye lactophenol to observe reproductive structures, acervuli Finally was conducted sealing the sheet using a varnish transparent and was conserved the fruit in formal to 50%. As general results staining was observed sunken, with masses of spores with an opaque color (brown-Black) with a pattern of ring, microscopically was observed conidias fusiform, hyaline within structures called acervuli, with a mycelium branched. Key words: Colletotrichum spp, blue lactophenol, acervuli

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INTRODUCCION La papaya es tambin llamada comnmente "lechosa" en Venezuela, "fruta bomba" en Cuba y "Mamao" en Brasil1 entre otros. Es una de las frutas tropicales ms deseadas por su suave y agradable sabor adems de propiedades nutritivas (cien (100) gramos de pulpa, suministran los requerimientos mnimos diarios de vitamina C y la mitad de la vitamina A. Adems posee, vitaminas del complejo B (B1, B6 y B12))2, adems de propiedades digestivas y medicinales que se le atribuyen3.Su cultivo es atractivo para el agricultor ya que tiene ventajas sobre otros frutales, en especial su corto perodo entre siembra y cosecha, su alto rendimiento, una produccin continua y el bajo desarrollo de la planta, que le permite ser intercalada con otros rboles frutales. En un marco industrial hemos de considerar la importancias de la papaya, ya que en la industria textil se usa la papana para suavizar la lana y la seda; en la industria de pieles, para la batiente de cueros; en la industria del caucho, para el envejecimiento artificial del ltex; tambin es usada para la fabricacin de chicles y en la industria cervecera, donde no puede faltar, para mejorar las maltas.4 Definiendo la taxonoma del fruto del cultivo aludimos que la familia Cariccea solamente incluye cuatro gneros, tres de los cuales son de Amrica tropical (Carica, Jacorotia y Jarilla) y uno de frica ecuatorial (Cylicomorpha).El gnero Carica agrupa unas 21 especies de plantas, dentro de las cuales Carica papaya es la ms importante por su utilizacin en la alimentacin humana, la clasificacin taxonmica se detalla a continuacin:
Tabla. 1 Clasificacin Taxonmica REINO Tronco Divisin Subdivisin Clase Subclase Segundo grado evolutivo Orden Familia Gnero VEGETAL Cormophyta Antophyta Angiosperma Dicotilednea Chrisoptala Dialiptala Parietales Caricacea Carica

Para estos cultivos podemos considerar a nivel territorial que se destina un rea plantada considerable, pero las perdidas por fitopatogenos ha dejado que los niveles de rendimiento de produccin sean bajos, como lo reporto el DANE.(Tabla 2 ,tabla 3) Para lo cual se establece que enfermedades por hongos, bacterias, nematodos y virus atacan mltiples frutales ocasionando prdidas considerables en los cultivos. En el cultivo de papaya existen variados fitopatogenos, pero hay uno que ha venido causando prdidas econmicas irremediables, hasta el punto que ha llevado al descenso de la produccin de

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estas frutas, La antracnosis es la enfermedad causada por el gnero Colletotrichum spp que es un hongo que ataca diversas partes de los cultivos, pero es ms severo cuando infecta los frutos , donde inicialmente se presentan manchas pequeas, hundidas de color rojizo que crecen y son acuosas y de color caf, con uh borde amarillento, hasta que se da la necrosis de la fruta4 La infeccin inicial puede ser causada por esporas y micelio que infecten las semillas, las plantas que se desarrollan a partir de estas semillas desarrollan lesiones en el hipocotleo y en el cotiledn, cuando maduran estas plantas producen una abundancia de esporas. Los primeros estadios para el desarrollo de la enfermedad son esencialmente los mismos para todas las especies de Colletotrichum. Los restos de hojas, tallos y frutos dentro del dosel constituyen tambin fuentes de inoculo para el comienzo de brotes de enfermedades estacionales, lo cual enfatiza la importancia de las habilidades saprofitas de muchas especies de Colletotrichum. La existencia de patgenos que hacen parte de la poblacin microbiana del filoplano o como infecciones latentes de tejidos aparentemente sanos en el hospedero, tambin son fuentes de inoculo desde las cules las enfermedades epidmicas pueden desarrollarse, aun cuando las fuentes ms obvias de sobrevivencia saprofita se han removido. Cuando el patgeno se encuentra fuera del hospedero, el desarrollo de las enfermedades est restringido por el requerimiento de agua durante todas las fases del ciclo de la enfermedad ya que las esporas de la antracnosis necesitan una pelcula de humedad en la superficie de la planta para su germinacin y penetracin a la epidermis, una vez desarrollada la infeccin las lesiones se amplan y se producen esporas nuevas que son ligadas por una sustancia gelatinosa a la lesin de tal forma que no puede ser separada por el viento.
Las condiciones ambientales que favorecen la infeccin involucran un rango de temperatura entre 22 C y 32 C y una humedad relativa mayor al 92%. As mismo, las lluvias frecuentes facilitan la diseminacin de las conidias en el campo. El hongo presenta una alta variabilidad gentica la cual se manifiesta en la existencia de muchas razas fisiolgicas del patgeno que difieren en su grado de patogenicidad.

Los residuos de cosecha infectados son las fuentes principales de inoculo para causar epidemias, el hongo puede sobrevivir como espora o como micelio en residuos de estas hasta por dos aos. Esta capacidad que tiene Colletotrichum para sobrevivir en estado latente como

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apresorios en la superficie hospedera, o como infeccin oportunista en los tejidos hospederos cuando las condiciones medio ambientales o fisiolgicas del hospedero impiden su continuo desarrollo, es una caracterstica nica que permite que el patgeno rehya vacos epidemiolgicos que ocurren entre diferentes estados de susceptibilidad del cultivo, permitindole cumplir tambin el papel de oportunista. Una vez Colletotrichum deja su fase latente e inicia su fase activa en los tejidos jvenes susceptibles, permite un ciclo epidmico rpido, de tal forma que los niveles de enfermedad crecen aceleradamente durante los breves periodos cuando las fases susceptibles del cultivo coinciden con las condiciones de humedad. (Prusky et al.,2000). Para definir un concepto claro del fitopatogenos, nos ubicamos dentro de un marco taxonmico del hongo(Agrios, 1996) REINO DIVISION II SUBDIVISION 4 CLASE I ORDEN GENERO ESPECIES FUNGY EUMICOTA DEUTEROMICOTINA COELOMICETES MELANCONIALES CLLETOTRICHUM VARIAS MATERIALES Y METODOS 1. Obtencin de la muestra Para llevar a cabo la recoleccin de la fruta infectada nos dirigimos a un establecimiento dedicado a la venta de frutas y hortalizas ubicado en Los patios, Norte de Santader.Dicho establecimiento se provee de las poblaciones agrcolas ms cercanas como lo son chincota,Durania entre otros. 2. Montaje en el Estereoscopio Para llevar a cabo la observacin en el estereoscopio, partimos de llevar la muestra al laboratorio del semillero SIBAA (Semillero de investigacin de biotecnologia para la agricultura y la alimentacin) ubicado a la Universidad Francisco de Paula Santander. Iniciamos realizando un corte con un bistur para obtener una muestra del tejido afectado con antracnosis, luego se llev a una caja Petri para posterior observacin. 3. Preparacin en placa Luego de observar las estructuras preliminares, se lleva a cabo una tincin con el colorante azul de lactofenol ,para ello tomamos el inoculo de la muestra observado en el estereoscopio y la llevamos a un portaobjetos, l cual se le ha aplicado una gota pequea del colorante, se cubre con la laminilla y se lleva a observacin. Se usa objetivos de 10X Y 40X.

El propsito de nuestro trabajo es realizar el diagnstico de la antracnosis en la papaya, estableciendo el gnero del fitopatogenos.

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4.Sellado de la Placa y conservacin del Fruto. El sellado de la placa implico la utilizacin de un barniz transparente, l cual se le aplico por los filos de la recipiente donde cubriera por completo el fruto, se sell y por ltimo se rotulo. RESULTADOS
Tabla. 2 rea plantada de cultivo de papaya y nmero de unidades productoras segn departamento.

laminilla para as prolongar el uso de la placa para observacin microscpica. Ademas se realiz la rotulacin de la placa.La conservacin del fruto se realiz con un compuesto qumico, aldehdo altamente voltil (formol)5 al 50% en un

Tabla. 3 rea en edad productiva, produccin y rendimiento del cultivo de papaya, segn departamentos

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1. Obtencin de la muestra Se recolecto una fruta con sntomas macroscpicos de la enfermedad, como lo muestra la figura 1. Se observ una fructificacin en forma de almohadilla, cerrada excepto por una abertura, compuesta por hifas empaquetadas que originan conidiforos, caracterstico de los acrvulos en Colletotricum. 3. Preparacin en placa

Fig. 1 Fruto de papaya con antracnosis

2. Montaje en el Estereoscopio

Fig. 4 Toma del inoculo y montaje en placa

Fig. 2. Corte al fruto de papaya con antracnosis

Fig. 3. Observacin del corte en el estereoscopio

Fig. 5 Observacin del montaje en placa

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Se observ las estructuras caractersticas, como son las setas que sobresalen, los conidiforos y las conidias con aspecto fusiforme. 4. Sellado de la Placa y conservacin del Fruto.

Fig. 6 Acervulo muestra 1, se distinguen las setas con algunas conidias.

Fig. 7. Conidias con forma fusiforme.

DISCUSIONES La observacin en el estereoscopio nos muestra claramente los acrvulos, lo que nos infiere la estructura reproductiva del fitopatogenos, dicha masa se observa que se encuentra subcuticular,

Fig. 8. Acrvulos muestra 2, se aprecian las conidias fusiforme, con algunas setas

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Formando tonos castaos, con una pared relativamente gruesa.6 En la identificacin del gnero podemos asegurar que se trata de Colletotrichum spp , ya que cuando hablamos de antracnosis se acostumbra a designar a las enfermedades cuya caracterstica es presentar en los tallos, hojas y frutos de las plantas afectadas, lesiones tpicas necrticas (tejidos muertos), est enfermedad la causan los hongos pertenecientes a los gneros Colletotrichum, Glomerella, Gnomia, Marzzonia, Mycospharella, Neofabre y Pseudopezzia que afectan numerosos cultivos (Garca, 1988) citado por Banquero (Et al., 2002) y si tenemos como criterio de seleccin las estructuras como acrvulos, conidias, setas, conidiforos nos define el gnero del fitopatogenos observado. En la identificacin de los posibles gneros podemos inferir que Colletotrichum se diferencia de Gloeosporium ya que este ltimo no produce setas en los acrvulos lo cual me afirma que mi gnero de fitopatogenos aislado es Colletotrichum7, En la observacin microscpica al identificar las conidias alrededor del acervulo, las cuales presentan una forma fusiforme diferimos que de las especies de Colletotrichum que no las presentan, las cuales son; C. coccodes; C. crassipes; C. gloeosporioides; C. dematium (Cano et al, 2004).. La identificacin de la especie conlleva estudios posteriores, pero segn estudios Colletotrichum gloeosporioides es la causa principal , sin embargo Simmonds (1965), citado por Duran et al.,1987) establece la existencia de cuatro especies capaces de causar la antracnosis en los frutos de papaya, siendo ellas: Glomerella cingulata, G. cingulata var. Minor , Colletotrichum acutatum y Colletotrichum dematium. Segn Simonds (1965) citado por Duran et al.,1987) las lesiones provocadas por Colletotrichum gloeosporioides y Colletotrichum dematium pueden llegar a ser color gris negruzco o negras, mientras que aquellas producidas por G. cingulata var. Minor y Colletotrichum acutatum desarrollan masas de esporas rosadas sobre la superficie. Referencias que nos permiten definir ms aun nuestros para metros para poder proponer una especie. Podemos sugerir que de acuerdo a las estructuras de acrvulos con abundantes setas y masas de conidias visto en estereoscopio y a las conidias hialinas, fusiformes a falcadas vistas en microscopios que la especie del fitopatogenos es Colletotrichum dematium. Mostrado en la ficha tcnica del fitopatogeno9. CONCLUSIONES La identificacin simple basada en caractersticas morfolgicas del hongo es posible en algunas especies, debido a la

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asociacin con el hospedante, y caractersticas de los conidios, apresorios y esclerocios. Si queremos profundizar o ser mucho ms precisos ya requerimos tcnicas de PCR, claves taxonmicas entre otros.

Se logra realizar el diagnstico de la antracnosis en la papaya, ocasionada por el fitopatogenos correspondiente al gnero Colletotrichum spp. REFERENCIAS
1-2-4

Cultivo de la papaya en los Llanos Orientales de Colombia. Manual de Asistencia Tcnica No. 04
http://www.agronet.gov.co/www/docs_si2/ Cultivo%20de%20la%20papaya.pdf
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http://alimentos.org.es/papaya

Nicasio F. Olivan. Industria practica de las conservas alimenticias.

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Banquero Jos Maria,Perez Castro Libia Maria.Identificacion y caracterizacin de Colletotrichum spp como agente causal de la antracnosis en Dioscrea spp .
7-8.

http://agrociencia-panama.blogspot.com/

9.

http://www.senasa.gob.pe/RepositorioAPS/ 0/2/JER/-1/Forestales/Fichas/4Colletotrichum%20dematianum.pdf
Bailey, J. A., and M. J. Jegger. 1992. Colletotrichum: biology, pathology and control. CAB International, Wallingford, United Kingdom