Diagrama de trabajo experimental para realizar la extraccio n de DNA: identificacio n de bacterias productoras de acido lactico y la extraccio n de DNA.

Las muestras de 10 g de cualquier queso

INICIO

Asilamiento de bacterias productoras de acido lctico

se cortaron aspticamente y se homogenizaron en 90 ml de PBS [NaCl (8.0 g L1), KCl (0.2 g L1),Na2HPO4 (1.15 g L1), K2HPO4 (0.2 g L1), agua destilada estril a 1 L, pH = 7.3 0.2 a 25 C].

con una jeringa estril se adicionaron 5 mL de caldo de cultivo MRS estril al frasco para hidratar el liofilizado

La pureza e identicacin de posibles cepas BAL

Las bacterias son aisladas mediante resiembras sucesivas por el mtodo de estra cruzada y se forma una coleccin de cepas de BAL segun sea la muestra .

Las diluciones son sembradas por duplicado en medio de cultivo Man, Rogosa, Sharpe (MRS) con la tcnica de vaciado en placas, incubadas a 30 C durante 48 h.

De las cepas

se dejo reposar por 10 min y se homogeneiz por agitacin suave durante un minuto

rehidratadas se tom una alcuota de 1 mL que se inocul en un tubo con 10 mL de caldo de cultivo MRS posteriormente se incub a 35-37C durante 24 h.

Del cultivo anterior se tomaron 500 L de inoculo que se agregaron a un tubo con 10 mL de caldo de cultivo MRS y se incub a 35-37C durante 12 h.

Con un asa bacteriolgica estril se tom una muestra del cultivo anterior y se sembr por estra en una caja petri con 15 mL de agar MRS que se incub a 35-37C durante 24 h.

se adicion una gota de H2O2 al 3%

Sobre el centro de un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloc una muestra del cultivo fresco

prueba de catalasa

prueba bioquimicas para la identificacion de BAL

La prueba es positiva cuando se pone en contacto la muestra con el H2O2y se produce una reaccin inmediata liberando burbujas de oxgeno La prueba positiva se da cuando el reactivo se oxida rpidamente en presencia del

En una caja petri se coloc un cuadro de papel filtro de aproximadamente 9 cm2

prueba deoxidasa

impregnado con solucin de clorhidrato de tetrametil-pfenilendiamina al 1% (Reactivo de Gordon y Mcleod).

FIN

citocromo cproduciendo coloracin azul marino purpreo lo que se toma como prueba positiva; s la prueba es negativa no habr viraje

Con un asa se tomaron algunas colonias aisladas en placa y se mezclaron con el reactivo

INICIO

las muestras fueron centrifugadas a 13000 rpm durante 4 min

En un tubo Eppendorf se colocaron 1.5 mL del cultivo el sobrenadante fue descartado

Al tubo con las clulas se le adicionaron 500 L de buffer TE y fue agitado manualmente para despus ser centrifugado.

Despus se adicion el acetato de amonio (Anexo 9.1), se agit y nuevamente fue colocada en hielo

Al terminar el periodo de incubacin se adicionaron 500 l de solucin GES (Anexo 9.1), se agit suavemente hasta observar que la mezcla se clarific completamente y la muestra fue colocada en hielo

la mezcla se agit manualmente e incub a 37C durante 1.5 h, a fin de romper la pared celular
Para

Despus de la centrifugacin se elimin el sobrenadante, se adicionaron 100 L de la solucin con buffer TE, lisozima (Sigma-Aldrich) y mutanolisina (SigmaAldrich) Finalmente el ADN fue recogido con la punta de una micropipeta y colocado en un tubo Eppendorf con buffer TE.

A continuacin se realiz una extraccin con cloroformo/2pentanol (24:1), agitando fuertemente

La mezcla se centrifug, obteniendo tres fases dentro del tubo Eppendorf, del que se tom la fase superior donde se encuentra el ADN; el resto es descartadodebido a que la fase intermedia esta compuesta de la pared celular y la fase inferior es el cloroformo junto con las protenas celulares

precipitar el ADN, la muestra fue transferida a un nuevo tubo Eppendorf con isopropanol; se centrifug y el sobrenadante fue descartado, el precipitado se lav con etanol al 70%, este proceso se realiz dos veces. Para eliminar el disolvente de la muestra se dej secar al aire libre.

se tomaron 15 l La cuantificacin fue realizada en un espectrofotmetro de luz UV midiendo la absorbancia bajo longitudes de onda de 300, 280, 260 y 230 nm para obtener los valores correspondientes a la cantidad y pureza del ADN. del tubo y se colocaron en un nuevo tubo Eppendorf (Eppendorf) con agua bidestilada, para homogeneizar se agit

El tubo Eppendorf fue agitado suavemente para solubilizar el ADN

CUANTIFICACION DEL ADN

El estimado de la cantidad de ADN fue calculado teniendo que el cociente entre la lectura a 260/280 es de 1.8-1.9 (en general es 2 para el ARN), valores inferiores a 1.7 indican contaminacin por protenas

cociente entre 260/230 generalmente es superior a 2 y valores inferiores a sta absorbancia indican contaminacin por carbohidratos.

La concentracin de ADN (mg/mL) en la muestra original se obtuvo de la resta de la absorbancia a 300 nm de la absorbancia a 260 nm en las muestras diluidas.

Fin

las bacterias del acido lctico (BAL).

las bacterias del acido lctico (BAL) estn distribuidas extensamente en la naturaleza y estn aun mas presentes en algunos gran variedad de alimentos ya que son un tipo de bacterias fermentadoras de los cuales se han descubierto demasiados grupos los cuales incluyen los gneros Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Vagococcus, Carnobacterium, Tetragenococcus, Weisella, Aerococcus y Oenococcus. las BAL se identifican como cocos o bacilos Gram positivas, no esporuladas, que presentan en su ADN un porcentaje de G-C menor del 55 mol%, fermentan los hidratos de carbono dando cido lctico como producto nico (homofermentadoras) o mayoritario (heterofermentadoras), tolerantes a los cidos, catalasa y oxidasa negativas y microaeroflicos (Jay, 1992; Muoz, 2006). Los mtodos modernos de taxonoma incluyen anlisis fenotpicos y genotpicos, lo que ha mejorado los resultados obtenidos disminuyendo el tiempo de anlisis, ms importante an, aumentando la precisin en la clasificacin taxonmica. La identificacin clsica a nivel de bacterias lcticas depende principalmente de mtodos fenotpicos, que son el conjunto de caractersticas celulares observables o cuantificables, como su morfologa, propiedades fisiolgicas, bioqumicas y por la estructura de sus componentes celulares. La identificacin a nivel especie, sin embargo, con lleva un exceso de tiempo y grado de incertidumbre en los resultados al existir cepas atpicas o nuevas que no comparten ciertas caractersticas con el resto del grupo. Las bacterias cido lcticas constituyen un grupo de bacterias Gram positivas, generalmente inmviles, no esporuladas, con forma de cocos o bacilos. Son microorganismos fermentadores de carbohidratos con produccin de cido lctico como producto principal o nico del metabolismo de las hexosas (Stiles y Holzapfel, 1997). Si bien son mesfilas, algunas son capaces de crecer a temperaturas inferiores a 5C y otras a temperaturas tan altas como 45C. Con respecto al pH de crecimiento, la mayora desarrollan en una escala comprendida entre 4 y 4.5 aunque un grupo de ellas son capaces de crecer a pH tan bajo como 3.2 y otras a pH tan alto como 9.6; en cuanto a sus exigencias nutricionales, adems de una fuente de energa como carbohidratos, las BAL necesitan aminocidos preformados, vitaminas del grupo B, bases pricas y pirimidnicas (Stamer, 1976).

Investiga cul es la secuencia de DNA que te permitira identificar el gnero y especie del organismo asignado, es decir qu tipo de fragmento suele utilizarse para amplificarlo por PCR, justifica tu respuesta: bacteria productora de acido lctico.
DETERMINACIN DEL PORCENTAJE DE GUANINA-CITOSINA (% G-C) La Tcnica empleada para la clasificacin taxonmica basada en el anlisis de ADN, determinando el porcentaje de G-C con respecto a las bases totales. Normalmente en BAL el contenido de G-C es menor de 50%, aunque algunas especies de Lactobacillus tienen contenidos mayores a 55% (Axelsson, 2004); generalmente la variacin del contenido de G-C es de 5% entre especies y de 10% entre gneros (Schleifer y Stackebrandt, 1983). El mtodo ms empleado para determinar este parmetro se basa en la caracterstica del ADN de desnaturalizarse bajo el efecto de calor. La separacin de las hebras se traduce en un incremento de la absorbancia a 260 nm, este fenmeno puede seguirse espectrofotomtricamente. Cuanto mayor sea el contenido en G-C se necesitara aplicar ms calor para conseguir la separacin de las hebras. El punto medio de desnaturalizacin trmica (Tm) es un parmetro importante al depender directamente del contenido de guanina y citosina (Xu et al., 2000).el contenido de G+C existente en el ADN nuclear (ADNn) en Comparacin con el del ADN mitocondrial, el ADNn tiene aproximadamente un 40% de contenido de G+C

mientras que el ADNmt tiene solamente el 20 % por lo tanto, si se utilizan enzimas de corte especfico para regiones ricas en G+C puede separarse debido a que el ADNn sera cortado en pequeos fragmentos no detectables en el gel de agarosa mientras que el ADNmt producira fragmentos de mayor tamao detectables en el gel de agarosa.

Una pareja de iniciadores se utiliz para detectar el grupo bacterias totales (BT), otra para el grupo bacterias acidolcticas (BAL), una pareja gnero-especfica para evaluar Lactobacillus y otra para el gnero Bifidobacterium.

La especificidad de los iniciadores se verificA con la tcnica de PCR convencional empleando un termociclador PTC-100 (MJ Research, Inc. Minnesota, Estados Unidos). Los iniciadores se evaluaN en un rango de temperatura de alineamiento de 58 a 62C, estableciendo las condiciones de reaccin adecuadas.

Para el fragmento seleccionado investiga el nombre y secuencia del juego de primers que deberan mandar a sintetizar.
Diseo de primers: uno de los parmetros ms importantes para tener xito en la amplificacin por PCR es el diseo de los oligonucletidos cebadores o primers. Si estos no estn bien diseados la PCR puede no funcionar bien; el resultado es nula amplificacin del producto debido a la amplificacin no especfica. Se debe de tener en cuenta las variables como: tamao del oligonucletido, temperatura de fusin, especificidad, secuencia complementarias, contenido en G/C y tractos de polipirimidinas (T, C) opolipurinas (A, G), secuencia 3terminal, secuencia 5terminal y regiones centrales. La secuencia del oligonucletidos debera elegirse de manera que

no contenga zonas de poliG o poliC que puedan llevar a hibridacin no especfica (GEN 2009).

investiga y reporta tu propuesta de mezcla de reaccin para realizar la amplificacin del fragmento seleccionado (por pcr), el volumen final de la reaccin t lo decides, solo toma en cuenta que adems de tu muestra debers incluir los controles correspondientes. Propuesta de mezcla de reaccin para amplificacin de fragmento BAL. Mezcla de pcr para la amplificacin de ADN de (BAL) Reactivo And molde Buffer 10x MgCl2 50 mM DNTPs 10 mM* 1Primers enterococcus ssp. 5 mM c/u control positivo+ DNA polimerasa 50 U/L Control negativo- agua esteril H2O final Volumen total de la mezcla PCR concentracin final 500 ng 1x 3mM 0.20 mM 0.5 1U Volumen (L/reaccin) 5.00 10.00 3.00 0.5 1.5 0.30 1.5 33.00 50.00

Mezcla de pcr para la amplificacin de ADN de (BAL) Reactivo And molde Buffer 10x MgCl2 50 mM DNTPs 10 mM* DNA enterococcus sGsp. PCR concentracin final 500 ng 1x 3mM 0.20 mM 0.5 Volumen (L/reaccin) 5.00 10.00 3.00 0.5 1.5

5 mM c/u control positivo+ DNA polimerasa 50 U/L Control negativo- agua esteril H2O final Volumen total de la mezcla 1U 0.30 1.5 33.00 50.00