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TEMA 7. INTRODUCCIN A LAS TCNICAS CROMATOGRFICAS Definicin: La cromatografa es una tcnica de separacin basada diferente velocidad de desplazamiento l de los componentes de una mezcla al ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser lquida o slida. La denominada fase mvil fluye a travs de la denominada fases estacionaria, que permanece inmvil y ambas estn en un equilibrio dinmico. Ests tcnicas permiten adems de la separacin de de un gran nde compuestos en mezclas extremadamente complejas, la determinacin cualitativa y cuantitativa de estos. Por ello los mtodos cromatogrficos tienen una gran importancia y son de los ms usados en Qumica Analtica (especialmente en el anlisis de compuestos orgnicos) La fase estacionaria y mvil han de ser inmiscibles y se eligen de tal forma que los componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad, as aquellos componentes que son retenidos con fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil, y los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad los componentes se separan en bandas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. CLASIFICACIN Para clasificar globalmente los procesos cromatogrficaos vamos a establecer 3 criterios: 1.-segn el estado fsico de la fase mvil y la fase estacionaria, 2.-segn el mtodo de contacto entre las dos fases, 3.- segn los mecanismos fsicos y/o qumicos responsables de la separacin de los componentes de la muestra. 1 Criterio : La principal distincin se hace en funcin de la naturaleza de la fase mvil, y los distintos tipos se denominan frecuentemente enunciando el tipo de fase mvil seguido del tipo de fase estacionaria (si slo se indica una fase esta se refiere a la mvil). Siguiendo este criterio se establece la siguiente clasificacin 1.1.- Cromatografa de lquidos, la fase mvil es un lquido 1.1.1.- Cromatografa lquido-lquido, en la que ambas fases son lquidas (la fase estacionaria lquida est sobre un soporte slido adecuado) 1.1.2.- Cromatografa lquido-slido, en la que la fase estacionaria es slida.

1.2.- Cromatografa de gases, si la fase mvil es un gas, distinguiendo: 1.2.1.- Cromatografa gas-lquido, la fase estacionaria es un lquido, siendo un tipo de cromatografa de particin. 000000001.2.2.- Cromatografa gas-slido, la fase estacionaria es un slido, es un tipo de cromatogafa de adsorcin. 1.3.-Cromatografa de fluidos supercrticos, la fase mvil es un fluido supercrtico (fluido supercrtico, es un fluido calentado a una temperatura superior a su temperatura crtica, y simultneamente comprimido a una presin mayor que su presin crtica), puede ser de particin y de adsorcin. 2 Criterio : Para poner en contacto las fases mvil y estacionaria se utilizan dos mtodos y segn esto se establece la siguiente clasificacin 2.1.-. Cromatografa en columna: Se utiliza un tubo cilndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su travs se hace pasar la fase mvil. El flujo de la fase mvil (liquido o gas) a travs de la estacionaria se consigue por presin, capilaridad y gravedad. 2.2-. Cromatografa plana: la fase estacionaria est colocada en una superficie plana Se divide en: 2.2.1.- Cromatografa en papel: en la que el papel acta como soporte de la fase estacionaria (cromatografa de particin) 2.2.2.- Cromatografa en capa fina: se extiende una capa delgada de fase sestacionaria sobre una placa, generalmente de vidrio, aluminio, la fase estacionaria puede ser un slido (adsorbente, cambiador) o un lquido (cromatografa de particin),. En la cromatografa plana, el flujo de la fase mvil puede conseguirse de dos formas:- por capilaridad (cromatografa horizontal y ascendente) o por capilaridad y gravedad (cromatografa descendente) En la cromatografa plana queda excluido el uso de un gas como fase mvil, por lo que sta es siempre lquida. 3 Criterio: El mecanismo por el que los solutos se separan leva a establecer la siguiente clasificacin 3.1-Cromatografa de particin o reparto, una fina pelcula de lquido que reviste un soporte slido acta como fase estacionaria, los distintos componentes de la mezcla se separan en funcin del reparto o distinta solubilidad existente entre la fase mvil y la fase estacionaria, 3.2.-Cromatografa de adsorcin: la fase estacionaria es un slido adsorbente, y los solutos se separan

en funcin de su capacidad de adsorberse (Fuerzas de Van der Waals). 3.3.-Cromatografa de intercambio inico: la fase estacionaria es una resina cambiadora de iones (fuerzas electrostticas) 3.4.-.Cromatografa de exclusin (o de geles): la fase estacionaria es un gel formador por polmeros porosos no inicos que retienen a las molculas de soluto segn su tamao .

Clasificacin global de la cromatografa Reparto adsorcn Exclusin por tamao Reparto Adsorcin Intercambio inico Exclusin por tamao

Papel Plana Cromatografa de lquidos Capa fina

Columna

Cromatografa de gases

Columna

Reparto Adsorcin Intercambio inico Exclusin por tamao Adsorcin Reparto

Cromatografa de fluidos supercrticos

Adsorcin Columna Reparto

CONCEPTOS BSICOS DE LA CROMATOGRAFA EN COLUMNA De los dos mtodos de poner en contacto las fases mvil y estacionaria, el ms importante es la cromatografa en columna La muestra se introduce en la entrada de una columna en forma de banda estrecha y se hace avanzar a lo largo de la columna mediante el paso continuado de fase mvil. (En la figura se muestra la eluccin de dos componestes de una mezla (A Y B) por el paso continuado de una fase mvil lquida a travs de una columna que contiene la fase estacionaria).

Y como vemos (en la figura ) a medida que la muestra se desplaza los solutos comienzan a separarse, y a medida que avanzan las bandas individuales de los solutos se ensanchan y desarrollan un perfil gaussiano. El proceso de separacin cromatogrfica se controla a travs de un detector adecuado situado al final de la columna. La grfica de la seal del detector en funcin del tiempo o del volumen de la fase mvil se denomina cromatograma. El tiempo a que eluye cada compuesto se denomina tiempo de retencin (tr) y es una constante para cada compuesto siempre y cuando trabajemos en las mismas condiciones (mismo cromatografo, misma columna, misma fase mvil, mismo flujo, etc.) y por eso ese parmetro ,tr,es lo que se usa en cromatotografa para identificar cada compuesto (anlisis cualitativo), y el area del os pico es proporcinal a su concentracin , por lo tanto la usamos para cuantificar (anlisis cuantitativo)

Parmetros que definen el comportamiento cromatogrfico de un soluto en un sistema cromatogrfico de elucin en columna:

1.- Relaciones de tiempo: . Se denomina tiempo muerto (to) al intervalo de tiempo que transcurre desde que el trazador ( sustancia no retenida) es insertado al principio del lecho cromatogrfico hasta que sale del mismo. Este tiempo puede calcularse si se conoce la velocidad media de la fase mvil ( v) y la longitud de la columna (L), pues: to = L/v El tiempo de retencin absoluto (tr) de un nalito es el que transcurre desde la insercin de la muestra hasta su salida y es siempre mayor que to. El tiempo de retencin corregido (tr) que es el incremento de tiempo que transcurre desde que aparece el pico del trazador y el del analito: tr = t'r + to Estos tiempos se toman a partir de los mximos de los picos, que al no ser puntiagudos, se determinan por extrapolacin. W= anchura de la base del pico

Resolucin. Eficacia de separacin de una columna

En cromatografa interesa que los picos de los compuestos estn completamente separados para poder medir las reas de los mismos con exactitud y no cometer errores en la cuantificacin. Como podemos ver en la figura en la separacin de los picos no influye solo su tr sino tambin la anchura de estos, por eso tb nos interesa que los picos nos salgan estrechos as logramos una mayor eficacia en la separcin La resolucin Rs de una columna constituye una medida cuantitativa de su capacidad para separar los analitos (Medida cuantitativa de la eficiencia de la separacin) En la figura se muestran los cromatogramas que ilustran la separacin de las especies A y B en tres columnas diferentes.
Rs = 2(TrB TrA ) WA + WB

Concepto de plato terico en una columna La teora de los platos tericos en cromatografa fue desarrolada por Martin y Singe (1941) y considera que una columna o se divide en N segmentos en cada uno de los cuales se establece un equilibrio del soluto entre la fase mvil y estacionaria; cada uno de estos segmentos imaginarios se

llama plato terico, siendo N el n total de platos tericos

Como hemos podido obserbar en el ejemplo de la eficiencia en la separacin de dos compuestos no depende solo del tr de los mismos, ya que en gran medida depende de la anchura de los picos o bandas correspondientes. De esta forma ,un aspecto fundamental del cromatograma que define la eficacia separativa es el denominado "ensanchamiento de banda" que puede definirse como el rea (mancha o zona) o el ancho de pico cromatogrfico. Una separacin es ms eficaz cuanto menores son los ensanchamientos de banda que se originan. Cuanto mayor es el tiempo de permanencia del soluto en la columna mayor ser la anchura de banda. En general se asume que las bandas o picos cromatogrficos tienen una forma gaussiana. Y desde el punto de visa estadstico est directamente relacionada con la varianza ( 2) o con la desviacin estndar de una serie de medidas (). De esta forma la altura de plato terico se puede definir como AEPT o H=2/L H,(AEPT) se expresa en unidades de longitud, y su valor depende del analito, de las

condiciones de operacin y de las caractersticas de la columna. La eficacia de la separacin cromatogrfica ser mayor cuanto menor sea H. Una mediada adimensional de la eficacia de la separacin es el denominado nmero de platos tericos, N: N=L/H. La eficacia de la separacin aumenta cuanto mayor es el nmero de platos. N y H se determinan fcilmente a partir del cromatograma empleando el tiempo de retencin y el ancho de pico y conociendo la longitud de la columna. N = 4 (tr/wi)2 = 5,54 (tr/wh)2 = 16 (tr/wb)2 wi: anchura del pico en el punto de inflexin; wh ancho del pico amedia altura; Wb: anchura en la base del pico FACTORES QUE INFLUYEN EN EL ENSANCHAMIENTO DE BANDA: Los factores que influyen en el ensanchamiento de banda y por tanto en la altura de plato terico AEPT son 3: 1.-difusin de remolino, 2.-difusin longitudinal 3.-resistencia a la transferencia de masa

- Difusin de remolino (A):

En las columnas empaquetadas, En su camino a travs del relleno de la columna, las molculas de cada componente que se desplazan a travs de la columna pueden encontrar una gran variedad de trayectos de distinta longitud, tardando ms o menos tiempo en recorrerlos segn la trayectoria elegida.

Cuanto menores y ms iguales sean las partculas del relleno y ms empaquetadas se encuentren menor es el ensanchamiento de las bandas causado por la difusin en remolino. Este factor es independiente de la velocidad de la fase mvil. En columnas capilares no existe la difusin en remolino

Difusin longitudinal (B): - Es debida a la tendencia de los analitos que avanzan con la fase mvil a difundir desde la

zona ms concentrada en el centro de la banda hacia zonas ms diluidas por delante y detrs del centro de la banda es decir en el mismo sentido y en el opuesto a la direccin del flujo de la fase mvil. Este contribucin de estea factor al ensanchamiento de banda disminuye al aumentar el flujo de fase mvil, ya que al aumentar la velocidad de la fase mvil ms corto ser el periodo de tiempo que el analito reside en la columna, y la difusin desde el centro de la banda hacia los extremos tiene menos tiempo para poder producirse Este efecto de difusin longitudinal es mucho menos pronunciado en la cromatografa de lquidos que en la cromatografa de gases, debido a que las constantes de difusin en lquidos son menores que en los gases correspondientes.

Velocidad de fase mvil

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- Resistencia a la transferencia de materia (C): Este es el factor que ms contribuye a ensanchamiento de banda y en consecuencia al incremento H. Es debida a que el equilibrio del soluto entre la fase mvil y la fase estacionaria tarda un tiempo en producirse y la fase mvil que est en continuo movimiento avanza tan rpido que no da tiempo a que se alcance el verdadero equilibrio, retardndose el paso de los analitos de una fase a otra Este efecto se hace menor a medida que disminuye la velocidad de flujo, pues entonces hay ms tiempo disponible para que se alcance el equilibrio. Tambin se favorece el equilibrio si el si usan fases estacionarias de menor viscosidad y pelculas ms finas de esta, ya que as el soluto necesita menos tiempo para difundir de una fase a otra .

Velocidad de fase mvil

La dependencia de estos 3 factores con la velocidad de flujo de la fase mvil V, se muestra en la FIGURA****.

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Donde se observa que la difusin en remolino es independiente de la velocidad de la fase mvil. La longitudinal, disminuye al aumentar la velocidad de fase mvil y la resistencia la transferencia de materia aumenta linealmente con la velocidad de fase mvil. Los tres factores estn relacionados entre s por la ecuacin de Van Deemter (representada en la Figura**) y cuya expresin matemtica es H= A + B/V + CV El efecto neto de los procesos de ensanchamiento estn representado en la FIGURA**. Es evidente que la eficiencia ptima se obtiene con la velocidad del flujo correspondiente al mnimo en la curva del efecto neto.