2imebe 190 PDF

Environmental Biotechnology and Engineering. Proceedings of the Second International Meeting on Environmental Biotechnology and Engineering (2IMEBE).
26-29 September, 2006. Mxico City, Mxico. Edited by: Hctor Mario Poggi-Varaldo, Elvira Ros-Leal, Jaime Garca-Mena, Fernando Esparza-Garca, Ma. Teresa Ponce-Noyola, Ireri Robles-Gonzlez, Isabel Sastre-Conde, Herv Macarie, Jos Luis Sanz, Irene Watson-Craik, Eugenio Foresti, Danny Reible, and Claudio Garibay-Orijel
ESTUDIO COMPARATIVO DEL EFECTO DE QUINONAS Y POTENCIALES ELECTRICOS EN LA OXIDACIN DE COMPUESTOS FENLICOS POR CULTIVOS DESNITRIFICANTES Arturo Cadena (1); Anne-Claire Texier (1); Flor de Maria Cuervo-Lopez (1); Ignacio Gonzlez (2); Jorge Gmez (1). UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA, (1) Dept. de Biotecnologa y (2) Dept. de Qumica - Iztapalapa, Tel. 5255-5804-4600 ext 2657. Mxico DF, Mxico. E-mail: acr_bios@yahoo.com.mx RESUMEN La adicin de tres tipos diferentes de quinonas (2,6-disulfonato de antraquinona, alizarina, y menadiona) en cultivos desnitrificantes con p-cresol, provoc en unos casos la inhibicin del proceso desnitrificante, probablemente porque se afect el transporte de sustratos y en otros, porque se desacopl la respiracin. O bien, no mostr efecto alguno. El efecto observado en cultivos desnitrificantes estuvo asociado principalmente a la naturaleza estructural de cada quinona, dejando atrs el papel como oxido-reductor ampliamente discutido en la literatura. Adicionalmente, se evalu el potencial reductor de cada quinona sin la contribucin de su molcula, aplicando los potenciales de oxidoreduccin directamente en los cultivos por medio de electrodos, encontrndose que para el potencial de la alizarina (-428 mV vs SCE) slo se increment la fase de retardo de la desnitrificacin. Mientras que para el potencial de la menadiona (-136 mV vs SCE) y de la AQDS (-520 mV vs SCE) se modificaron a diferente nivel las actividades de las enzimas desnitrificantes. En ambos potenciales la oxidacin del p-cresol fue promovida principalmente por el metabolismo endgeno, desacoplando la desnitrificacin organotrfica. En el presente trabajo se presenta evidencia de que el potencial de cada quinona puede provocar efectos significativos en el metabolismo desnitrificante independientemente de su estructura molecular, ya que esta ultima puede provocar cambios no asociados al potencial redox. Se observ tambin que el potencial directamente aplicado en los cultivos desnitrificantes ofrece una alternativa para mejorar los procesos de eliminacin de compuestos de inters ecolgico, como son los compuestos fenlicos en aguas residuales. INTRODUCCION Existen en la actualidad mltiples evidencias acerca del papel que juegan las quinonas en la eliminacin de compuestos contaminantes. Adems, es ampliamente conocido que pueden participar como donadores, aceptores finales y transportadores de electrones en procesos microbianos anaerobios (Lovley y col. 1996a, Field y col., 2000: Rau y col., 2002). Compuestos como el benceno, tolueno, y compuestos fenlicos han sido oxidados a CO2 mediante procesos respiratorios, con la ayuda de las sustancias hmicas (compuestos que contienen grupos de quinona) as como quinonas, funcionando como aceptores finales de electrones (Lovley y col. 1996b; Cervantes y col., 2000). Estos compuestos pueden mejorar la velocidad de reduccin de metales, compuestos azo, nitroaromticos y clorados de forma abitica, acoplndose a procesos
Environmental Biotechnology and Engineering. Proceedings of the Second International Meeting on Environmental Biotechnology and Engineering (2IMEBE). 26-29 September, 2006. Mxico City, Mxico. Edited by: Hctor Mario Poggi-Varaldo, Elvira Ros-Leal, Jaime Garca-Mena, Fernando Esparza-Garca, Ma. Teresa Ponce-Noyola, Ireri Robles-Gonzlez, Isabel Sastre-Conde, Herv Macarie, Jos Luis Sanz, Irene Watson-Craik, Eugenio Foresti, Danny Reible, and Claudio Garibay-Orijel
respiratorios (Lovley y col., 1998; Lovley y Blunt-Harris, 1999; Van Der Zee y col., 2003). Como donadores de electrones pueden participar en la reduccin biolgica de fumarato, as como la del nitrato a N2 y NH4+ (Coates y col., 2002). Sin embargo, existe poca informacin acerca de si pueden participar solo como transportadores de electrones en procesos microbianos como la desnitrificacin organotrfica, sin contribuciones abiticas. Adems, poco se sabe del papel que puede jugar la estructura qumica de las quinonas en este tipo de procesos, ya que su papel txico ha sido ampliamente estudiado en otro campos (Monks y col., 1992; Bolton y col., 2000). Adems, la mayora de los estudios de procesos microbianos con quinonas, se han centrado en el papel oxido-reductor de este tipo de compuestos. En el presente trabajo para poder entender el efecto de las quinonas y de su potencial de xido-reduccin, en la desnitrificacin biolgica con un compuesto fenlico (p-cresol, p-cr), primero se estudiaron la adicin de tres tipos de quinonas (2,6-disulfonato de anthraquinona, menadiona y alizarina), a tres concentraciones diferentes cada una. Posteriormente, se aplicaron tres potenciales elctricos por medio de electrodos. Estos potenciales aplicados corresponden al potencial de oxido-reductor caracterstico de cada quinona. La comparacin de los resultados de ambos estudios (con quinonas y potencial elctrico), genera informacin til sobre la contribucin bioqumica-fisiolgica del potencial y de las quinonas en el proceso microbiano desnitrificante con compuestos de tipo fenlico. METODOLOGIA Inculo y Medio de Cultivo. El lodo desnitrificante utilizado para inocular los cultivos en lote, fue producido en un reactor continuo desnitrificante en estado estacionario bajo condiciones de heterotrofa con acetato. Antes de cada inoculacin el lodo fue lavado con una solucin fisiolgica de NaCl (9.0 g/l). La composicin del medio basal fue (g/L): KH2PO4, 2; CaCl(2H2O), 0.6; NaMoO4(2H2O), 0.12; MgSO4(7H2O), 0.4; FeCl3(6H2O), 0.1; CuSO4(5H2O), 0.02. Las quinonas utilizadas (2,6-disulfonato de anthraquinona (AQDS), menadiona (MEN) y alizarina (ALZ), SigmaAldrich) se adicionaron a tres concentraciones iniciales diferentes: 0.2 mM, 1.0 mM y 2.0 mM. La concentracin inicial de p-cr (C-p-cr) fue de 50 mg C/l y el nitrato (N-NO3-) se adicion para tener una relacin C/N de 0.98 en todos los casos. Para los controles estriles, el lodo fue esterilizado a 120C por 20 min y el medio de cultivo fue filtrado con un filtro estril de 0.45 m. Todo fue preparado en agua destilada. El pH inicial se ajust a 7. Ensayos en lote. Los ensayos con quinonas fueron conducidos en cultivo en lote por duplicado en botellas serolgicas de 60 ml. El volumen de trabajo fue de 40 ml con un espacio de cabeza de 20 ml. El medio fue transferido a las botellas y burbujeado con helio por 15 min. Posteriormente se agreg el p-cr y por ltimo el lodo para tener una concentracin final de 1 g de slidos suspendidos voltiles (SSV) por litro. Las botellas fueron selladas con tapones de hule y sellos de aluminio bajo condiciones anaerobias. Se corrieron controles sin la fuente reductora (p-cr), otros sin NO3- y otros sin las quinonas. Tambin se incluyeron controles estriles, los cuales contenan el donador de electrones y la quinona con el inculo. Todos los ensayos fueron incubados a 30 C en oscuridad bajo una agitacin de 150 rpm.
Ensayos de recuperabilidad de la actividad del lodo: Bajo las mismas condiciones de cultivo mencionadas anteriormente, cultivos desnitrificantes con dos fuentes de electrones diferentes: p-cr (C/N 0.98) y acetato (C/N 1.2), fueron sometidos a tres concentraciones diferentes de MEN (0.0 mM, 0.2 mM, 1.0 mM y 2.0 mM) e incubadas por 22 h. Transcurrido el tiempo se retiraron de la incubacin, se lav el inculo y de nuevo se volvieron a incubar por 48 h con medio basal, NO3- y p-cr o acetato, pero sin la quinona. Ensayos con aplicacin de potencial: Los ensayos con aplicacin de potencial elctrico fueron realizados en lote en un slo reactor. El volumen de trabajo fue de 1.4 l con un espacio de cabeza de 0.5 l. Las condiciones de cultivo, as como el procedimiento de adicin del medio y la inoculacin fueron los mismos que en los ensayos con quinonas. La eliminacin del oxgeno del medio de cultivo se realiz burbujeando helio hasta tener un valor de potencial de oxido reduccin (ORP) constante. Se adicion el p-cr al ltimo y se desplaz el espacio de cabeza con helio para conservar las condiciones anaerobias y se sello el reactor. La agitacin fue de 300 rpm. Se aplicaron en el cultivo diferentes potenciales elctricos: -136 mV, -428 mV y 520 mV con respecto al electrodo estndar de calomel (SCE). El muestreo se realiz a diferentes tiempos tomando 6 ml cada vez, de tal modo que el volumen de trabajo del reactor no cambi ms del 10% al final de la cintica. En todos los ensayos se determin p-cr, p-HO-benzoato (pHOBTO), p-HO-benzilalcohol (pHOBCOL), p-HObenzaldehdo (pHOBDO), HCO3-, CO2, CH4, NO3-, NO2-, NO, N2O, N2 y SSV. Para los ensayos con aplicacin de un potencial elctrico, se establecieron tambin cinticas del pH, del potencial de xido-reduccin (ORP) y de la corriente elctrica. Aplicacin de potencial elctrico: El reactor de 2 L utilizado fue agitado con un motor de velocidad variable Heidolph RZR-1. La aplicacin del potencial se realiz con un Potenciostato/Galvanostato EG&E Princeton Applied Reseach modelo 173, mediante tres electrodos. El electrodo de trabajo fue un cilindro de acero inoxidable de (13.1 cm x 3.8 cm) el cual se utiliz tambin como agitador. Como electrodo de referencia se utiliz un electrodo estndar de calomel (SCE) XR 100 (Radiometer analytical) acoplado a un capilar de Luigin dentro del reactor, y como contra-electrodo un cilindro de acero inoxidable pegado a la pared del reactor. El pH y el ORP se midieron en lnea con electrodos acoplados al reactor. Mtodos analticos: El p-cr, pHOBTO, pHOBCOL, pHOBDO, benzoato, fenol, tolueno, NO3- y NO2- fueron determinados por HPLC (Waters, 600) con un detector de arreglo de diodos (Waters, 2996). Para los compuestos orgnicos, se utiliz como fase mvil a un amortiguador de acetato (50 mM, pH 4.5) y acetonitrilo a una proporcin de 70:30 (V:V), con un flujo de 1.2 ml/min, a 25 C. El volumen de inyeccin fue de 20 l. La columna de separacin fue una phemomenex C18 Bondoclone (300 x 3.9 mm, 10m). Para los iones, se utiliz una fase de borato/gluconato a un flujo de 2 ml/min con una columna de intercambio inico IC-Pak Anion HC (4.6 x 150 mm) (Waters) con un volumen de inyeccin de 20 l. La determinacin se llev a cabo a 280 nm para los compuestos orgnicos y 214 nm para los iones. El carbono orgnico total, as como el inorgnico (HCO3-), se determinaron en un analizador de carbono orgnico total (Shimadzu, TOC5000). El anlisis de gases: CO2, CH4, NO, N2O y N2 se realiz por cromatografa de gases acorde a Pea-Calva y col. 2004. Los SSV se determinaron de acuerdo a APHA.
Resultados y discusin Efecto de la 2,6-disulfonato de anthraquinona (AQDS). En el cultivo control sin quinona, la eficiencia de consumo de p-cr (Epcr) fue de 88.8 1.4 % despus de 27 h de cultivo. El p-cr consumido se recuper como HCO3- a las 27 h con un rendimiento (YHCO3) de 1.0 0.03. Todo el nitrato consumido (eficiencia de consumo de nitrato, ENO3 = 100 %) se recuper como nitrgeno molecular (YN2 = 1.0 0.08) a las 27 h. Estos resultados indican que la oxidacin total del p-cr a HCO3- por el lodo desnitrificante fue responsabilidad directa del proceso desnitrificante (Figura 1A). De acuerdo a los altos rendimientos de producto obtenidos el proceso desnitrificante con p-cr fue netamente desasimilativo. En lo que respecta a los intermediarios de oxidacin del p-cr, slo se detectaron pHOBTO y pHOBDO a concentraciones muy bajas y no se detectaron pHOBCOL, benzoato, fenol o tolueno. Esto sugiere que el p-cr sigui la ruta de oxidacin propuesta por Bossert y Young para cultivos desnitrificantes (1986), a travs de la formacin secuencial de pHOBCOL, pHOBDO y pHOBTO (Figura 1B). Se presume que de este ltimo compuesto se forma benzoil coenzima-A, el cual se lleva a la mineralizacin completa (Schink y col, 2000). En el proceso desnitrificante slo se detect NO2- de manera transitoria.
A
NO3NAR
NO2-
NO
NIR NOR
N2O
NOS
N2
B
CH3 CH2OH CHO COOH
HCO3PCMH PCMH DBZ
OH p-cresol
OH pHOBCOL
OH pHOBDO
OH pHOBTO
Figura 1: A) Ruta desnitrificante: NAR, nitrato reductasa; NIR, nitrito reductasa; NOR, oxido ntrico reductasa; NOS, oxido nitroso reductasa. B) Ruta de oxidacin del pcresol: PCMH, p-cresol metil-hidroxilasa; DBZ, pHOBDO deshidrogenaza. Las cinticas de oxidacin de p-cr a HCO3- y de reduccin de NO3- a N2 en presencia de diferentes concentraciones de AQDS fueron similares a las obtenidas en el ensayo control sin AQDS. Para ninguno de los componentes determinados: p-cr, pHOBTO, HCO3-, NO3-, NO2- y N2 hubo diferencias significativas con respecto al control, tampoco en las velocidades especficas de consumo y de produccin. En general el proceso desnitrificante no se vio afectado por la presencia de la AQDS. Por lo cual, bajo las condiciones utilizadas para este ensayo, la AQDS no present ningn efecto en el proceso desnitrificante con p-cr. Los controles para la quinona AQDS: nitrato-inculo, pcr-inculo, nitrato-inculo-AQDS, p-cr-inculo-AQDS y con lodo estril no presentaron consumo significativo de los compuestos de inters a las 63 h de cultivo. En todos los ensayos las diferentes concentraciones iniciales de la quinona fueron recuperadas completamente al final de los cultivos.
Se ha reportado en literatura que la AQDS se oxida o se reduce por medio del transporte extracelular de electrones. En recientes trabajos se ha encontrado que las bacterias pueden respirar utilizando minerales insolubles as como quinonas y sustancias hmicas como aceptores finales de electrones (Newman y Kolter., 2000; Nevin y Lovley, 2002). Esta propiedad respiratoria se ha atribuido a protenas extracelulares unidas a la membrana externa (Beliaev y Saffarini, 1998; Leang y col. 2003). Actualmente es amplia la variedad de gneros microbianos que se conocen como capaces de transportar electrones extracelularmente (Coates y col., 2002; Bond y Lovley, 2002). Sin embargo, el inculo desnitrificante utilizado en el presente trabajo no fue capaz de oxidar o reducir a la AQDS, aun en ausencia de NO3-, lo que lleva a suponer que el inculo utilizado no present sistemas de transporte extracelular de electrones, por lo que la AQDS bajo ninguna de las condiciones ensayadas pudo ser utilizada. Efecto de la menadiona. Cuando la MEN fue adicionada a concentraciones de 1.0 mM y 2.0 mM no se observ consumo significativo de p-cr, slo se dio un consumo del 21 2.1 % a 0.2 mM de MEN. El p-cr consumido fue totalmente oxidado a HCO3- con un YHCO3 cercano a 1 (Figuras 2A y 2B). Si se compara con el control sin quinona, se puede ver que el proceso se vio afectado por la presencia de la MEN, ya que la Epcr cay un 76 % y las velocidades de oxidacin de p-cr y de reduccin de NO3- un 92 %. Estos resultados sugieren que la MEN inhibi el consumo del p-cr, sin embargo la ruta oxidativa no se vio afectada ya que se detectaron los mismos intermediarios que en el cultivo control sin quinona (pHOBTO y pHOBDO) y se obtuvo un YHCO3 alto. Al igual que el p-cr el consumo de nitrato se vio afectado por la MEN, ya que a 1 y 2 mM de MEN las ENO3 disminuyeron igual que con el p-cr (Figura 2C). A la concentracin de 0.2 mM hubo un consumo de nitrato del 18.8 0.2 %, el cual se recuper casi en su totalidad como N2, (YN2 1). La cantidad de nitrato reducido coincide con el p-cr oxidado a la misma concentracin de MEN. No se observ una produccin significativa de intermediarios en ninguno de los ensayos. Aunque la ENO3 disminuy, los altos rendimientos de formacin de N2 muestran que la ruta desnitrificante tampoco se vio afectada. Los controles con nitrato-inculo-MEN, p-cr-inculo-MEN y los estriles no presentaron consumo significativo de los compuestos de inters a las 63 h de cultivo. De acuerdo con la informacin obtenida, el efecto de la MEN en el proceso desnitrificante organotrfico podra ser inhibitorio, txico o se afect el transporte de sustratos (p-cr y NO3-). En general para las quinonas, la expresin de su toxicidad se ha asociado principalmente a dos tipos de procesos qumicos. El primero, reacciones de adicin de Michael con funciones nuclefilicas, alquilando grupos funcionales de protenas, tales como los grupos thiol. El segundo, es la reduccin cataltica de oxgeno con electrones que podran ser utilizados para otros propsitos. Lo cual, genera radicales perxido que pueden provocar dao celular si no se tiene un sistema que lo amortige (O`Brien, 1991; Monks y col., 1992). Estos efectos de toxicidad, se pueden descartar para la MEN en el proceso desnitrificante. En principio, porque su estructura qumica la hace un electrfilo pobre, que le impide llevar a cabo reacciones de adicin de Michael. Por ltimo, La MEN slo puede generar radicales perxido si esta presente el oxgeno (Rodrguez y col; 2004), y el proceso desnitrificante es de naturaleza anaerobia. Quedando as, slo la hiptesis de que el efecto de la MEN es sobre el trasporte de los sustratos.
Figura 2: Perfiles de consumo y produccin de los compuestos carbonados nitrogenados en cultivos desnitrificantes con p-cr (50 mg C/L), en presencia de diferentes concentraciones iniciales de menadiona (0 mM, 0.2 mM, 1 mM y 2 mM). Para poder explorar la hiptesis, se realiz un ensayo de recuperabilidad de la actividad del cultivo desnitrificante con dos fuentes de electrones diferentes. De las cuales se conoce que se transportan de manera diferente en la membrana: el p-cr y el acetato. Los resultados con el p-cr se presentan en la Figura 3 (). En todos los cultivos expuestos a la MEN, las Epcr fueron bajas (5.42% con respecto al control sin MEN). En ninguno de los cultivos se observ HCO3-, a excepcin del que estuvo expuesto a 0.2 mM de MEN, con una YHCO3 de 0.8 0.02 (Figura 7C). El poco p-cr oxidado en 0.2 mM de MEN, no corresponde al proceso desnitrificante ya que el nitrato consumido bajo esas condiciones de cultivo fue nulo (ENO3 = 0). El consumo de p-cr podra estar asociado al metabolismo endgeno. La poca recuperacin del consumo de p-cr cuando se expuso a bajas concentraciones de MEN, puede deberse a que se esta afectando el transporte de los sustratos. Aparentemente se afecta mas el transporte de NO3- que el del p-cr, y dicho efecto fue ms visible conforme se increment la concentracin de exposicin de MEN.
Figura 3: Ensayos de recuperabilidad de la actividad del lodo desnitrificante con acetato ({) y p-cr (), despus de una exposicin del lodo de 22h con MEN. Eficiencias de consumo de sustratos (A, B) y rendimientos de los productos (C, D) obtenidas bajo condiciones desnitrificantes sin MEN. Despus se ensay el acetato como fuente de electrones (Figura 3{). El acetato es un compuesto de fcil oxidacin, que difunde libremente a travs de la membrana de las bacterias ya que no necesita un sistema especifico de transporte como el del p-cr (Kihara and Macnab, 1981; Croning y col., 1999). Conforme se increment la concentracin de exposicin de MEN la eficiencia de consumo de acetato decreci hasta un 85%. En todos los casos la mineralizacin del acetato fue alta (Figura 3C), sin embargo la nica que se puede atribuir al proceso desnitrificante, es la de 0.2 mM de MEN (Figuras 3B y D). A las concentraciones de 1.0 mM y 2.0 mM de quinona, el consumo y reduccin de nitrato fue nulo. Se afect el consumo de acetato, pero no su oxidacin. De nuevo se observan problemas en el transporte de sustratos, siendo ms acentuado con el NO3- que con el acetato. Existe evidencia el la literatura que la MEN se difunde libremente en la bicapa lipdica de las membranas de las bacterias ya que es muy lipoflica (coeficiente octanol/agua log KOW = 3.3) (Mauzeroll y Bard, 2003). Si se acumula, puede provocar cambios en la estructura y fluidez de la membrana, que puede resultar en la hinchazn de la bicapa. Estas modificaciones en la membrana pueden modificar los anillos que rodean a las protenas encargadas del transporte de sustratos inactivndolas (Sikkema y col, 1995). Esto sera una posible explicacin a lo observado en el proceso desnitrificante con el pcr, ya que tanto este como el NO3- necesitan de un sistema de transporte especfico (Croning y col., 1999; Jia y Cole, 2004). El acetato al no necesitar un transportador, pudo difundirse mas que el p-cr, por esto la diferencia de consumo presentada entre los dos. Respaldndose as la hiptesis de que la MEN afecta los sistemas de transporte
de sustratos en el proceso desnitrificante, posiblemente por la modificacin de la estructura de la membrana celular. Efecto de la alizarina. Cuando la ALZ estuvo presente (Figuras 4A y C) a concentraciones de 0.2 mM y 1 mM, se increment la fase de retardo de consumo de pcr y la velocidad especfica de consumo disminuy un 38%. La velocidad de consumo de p-cr (VEpcr) a 2 mM no present gran diferencia a las otras dos concentraciones menores de ALZ, aunque a diferencia de ellas, no present fase de retardo. El proceso de oxidacin de p-cr no se vio afectado ya que en todos los casos el HCO3- fue alto (YHCO3 = 0.91 0.06). A 1 mM de ALZ el YHCO3 disminuy un 15% con respecto al control sin quinona, y el carbono restante quedo en forma de pHOBTO, lo cual no sucedi a 0.2 mM ya que hubo una acumulacin mxima a las 42 h de cultivo, pero fue transitoria. A 2.0 mM de ALZ el pHOBTO tuvo el mismo comportamiento que el control sin quinona (Figura 4B). En todos los cultivos se detect pHOBDO, pero en cantidades traza. En las concentraciones ensayadas de ALZ parece haber un efecto en la oxidacin del pHOBTO. En las tres concentraciones de ALZ todo el NO3- consumido se recuper como N2 (YN2 1) y no hubo acumulacin significativa de nitrito u otros intermediarios de la desnitrificacin (Figuras 4D y E), por lo cual el proceso desnitrificante tampoco se vio afectado.
Figura 4: Perfiles de consumo y produccin de los compuestos carbonados nitrogenados en cultivos desnitrificantes con p-cr (50 mg C/L), en presencia de diferentes concentraciones iniciales de alizarina (0 mM, 0.2 mM, 1 mM y 2 mM). La oxidacin de materia orgnica esta directamente acoplada al proceso desnitrificante, lo cual indica que la ALZ no desacopl los dos procesos. Sin embargo, se estn disminuyendo las velocidades especficas de consumo y hay acumulacin de pHOBTO. La ALZ a pesar de que tiene un coeficiente octanol/agua alto (log KOW 5.84), se a ha reportado que puede difundir muy poco a travs de la membrana de las bacterias. El
tamao de su estructura dificulta su transporte, por lo cual podra influir muy poco en el transporte de los sustratos (Bressler y Gray, 2003). Existe evidencia de que la ALZ inhibe la sulfato reduccin ya que puede desacoplar la produccin de ATP a nivel respiratorio (Cooling y col., 1996). Posiblemente, lo poco que difunde de la ALZ hacia dentro de las clulas pudo haber desacoplado la produccin de ATP, provocando la disminucin de las velocidades especficas en el proceso desnitrificante e influenciar en el proceso de oxidativo a nivel del pHOBTO. Adicionalmente, la ALZ tiene la capacidad de quelar metales, como el molibdeno (Alkan y col., 2003). Este ltimo es un cofactor importante de la nitrato reductasa (Figura 1A, NAR) (Magalon y col., 1998). Y se ha reportado que su ausencia afecta el consumo de nitrato (Cervantes y col., 1998). Esto podra ser un efecto adicional en la disminucin de la velocidad especifica de consumo de nitrato (Figura 4D). Los controles con nitrato-inculo-ALZ, pcr-inculo-ALZ, ni los estriles presentaron consumo significativo de los compuestos de inters a las 63 h de cultivo, por lo cual se descarta que la ALZ funcione con donador o aceptor final de electrones. De acuerdo a los resultados la ALZ parece tener un efecto inhibitorio a nivel respiratorio del proceso desnitrificante con p-cr. Efecto del potencial de oxido reduccin. Como las quinonas han mostrado que puede tener contribuciones debido a su estructura qumica, ms que a sus propiedades xido-reductivas en el proceso desnitrificante. Se impuso el potencial de oxidoreduccin caracterstico de cada una de las quinonas (AQDS, MEN, alizarina) en el cultivo, mediante la aplicacin de diferentes potenciales elctricos (PE) por medio de electrodos. Eliminando as, las contribuciones propias de la estructura qumica de cada quinona. Previamente se determinaron los potenciales de oxido-reduccin de cada quinona por voltamperometra cclica. Los potenciales determinados son para AQDS, 520 mV; MEN, -136 mV y ALZ, -428 mV vs SCE. La aplicacin de los diferentes potenciales tuvo un efecto significativo sobre el metabolismo oxidativo (Figura 5A), ya que disminuyeron las velocidades de consumo de p-cr conforme el potencial fue mas reductor (Figuras 6A, VEpcr). Este comportamiento se vio reflejado en el consumo de pHOBTO pero no entre los pasos de oxidacin del pcr (Epcr = 100%, Figura 6) al pHOBTO (Figura 5B). El pHOBTO present una acumulacin mxima a las 40 h a un PE de -136 mV, mientras el mximo de pHOBTO para el control y a un PE de -428 mV fue el mismo, pero a diferentes tiempos, 38 h y 50 h respectivamente. La acumulacin de pHOBTO para el PE de -520 mV, fue menor con respecto a los otros potenciales.
Figura 5: Perfiles de consumo y produccin de los compuestos carbonados y nitrogenados en cultivos desnitrificantes con p-cr (50 mg C/L), bajo diferentes potenciales aplicados con electrodos (Control sin potencial, -136 mV, -428 mV y -520 mV vs. SCE). El principal efecto a nivel oxidativo de los PE aplicados parece estar centrado entre el consumo de pHOBTO y en la produccin de HCO3- (Figura 6B y C). Esto se respalda con los resultados de los rendimientos de HCO3- (Figura 6C , YHCO3). Donde se alcanz la mayor acumulacin de pHOBTO (PE -136 mV), se present el menor rendimiento (YHCO3 = 0.7). El que tuvo el mximo de pHOBTO, parecido al control (PE -428 mV), present una produccin de HCO3- cercana (YHCO3 = 0.95). Por ltimo, a un potencial de -520 mV present la menor velocidad de consumo de p-cr (Figura 6A) y la acumulacin de pHOBTO no fue tan significativa como en los otros potenciales y el rendimiento fue mayor que a -136 mV.
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Figura 6: Parmetros cinticos del proceso desnitrificante bajo diferentes potenciales elctricos aplicados con electrodos: A) Velocidades especficas, B) Eficiencias de consumo de p-cr y nitrato y C) Rendimientos de produccin de HCO3- y N2. 50 mg C-pcr/l con una C/N de 0.98. SP = control sin potencial. Solo el control sin PE y el PE a -428 mV presentaron oxidacin completa de p-cr, con un desfase de tiempo entre los dos (15 h). La reduccin de nitrato, a diferencia del consumo de p-cr, no disminuy con PEs mas negativos (Figura 6A, VENO3). A potenciales menos reductores (-136 mV) se obtuvo la menor velocidad de consumo. Entre el control y PE -428 mV se present un desfase de tiempo en la desnitrificacin (Figura 5D), ya que el mximo de nitrito fue el mismo en ambos casos con una diferencia de 20 h (Figura 5E), y a pesar de que el ensayo se detuvo a las 63 h, la produccin de N2 iba creciendo este desfase concuerda con el presentado por la acumulacin de pHOBTO y la produccin de HCO3- entre el control y PE -428 mV. Estos resultados parecen indicar que a un PE de -428 mV solo se esta incrementando la fase de retardo, afectando principalmente el transporte de sustratos, mas que modificar el metabolismo. Para los PE -136 mV y -520 mV el proceso desnitrificante se ve afectado significativamente con respecto al control, en ambos casos la produccin mxima de nitrgeno fue la misma ( 11 mg N2/l) (Figura 5F), aunque los rendimientos no (Figura 6C, YN2). Esto es el reflejo de la disminucin en el consumo de NO3- (Figura 6B, ENO3) que se dio al PE -136 mV pero no a -520 mV, mientras que la acumulacin de nitrito fue inversa. Al tiempo en que se detuvo el cultivo (63 h), la acumulacin de NO2- en los PE 520 mV y -136 mV fue de 36 mg N-NO2-/l y de 20 mg N-NO2-/l respectivamente. Como la produccin de nitrgeno fue prcticamente la misma, la diferencia de consumo de NO3- que se dio entre los PE, se debi a que se acumul NO2- (Figuras 5E). La evidencia apunta a que en estos dos PEs se esta afectando la nitrito reductasa (Figura 1A, NIR) en diferente magnitud, esta propuesta se refuerza en parte porque no se detectaron otros intermediarios de la desnitrificacin, como son el NO y el N2O. De acuerdo con evidencia experimental, hay un desacoplamiento del metabolismo oxidativo, con respecto al desnitrificante en los PEs de -136 mV y -520 mV. En el control sin PE se present un exceso de oxidacin de p-cr del 10.9 %. La C/N estequiomtrica, para la reduccin completa de NO3 a N2 con p-cr es de 0.88 y la utilizada en todos los ensayos fue de 0.98. La eficiencia de consumo de p-cr fue del
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100% con un YHCO3 = 1, por lo cual el exceso de p-cr oxidado no esta asociado al proceso desnitrificante. Posiblemente podra estar asociado al metabolismo endgeno, ya que no hay ningn otro aceptor de electrones en el medio. Mientras que en el control se present un exceso de p-cr oxidado del 10 %, a los PE de -136 mV y -520 mV aplicados, hubo un exceso de oxidacin de p-cr del 52.5 % y 46.8 % respectivamente que no corresponden al N2 producido ni el NO2- acumulado. El proceso de oxidacin del p-cr no esta totalmente acoplado a la desnitrificacin, provocado por la aplicacin de los PE mencionados. Esto podra explicar tambin la acumulacin de nitrito y la baja produccin de N2, de alguna forma la aplicacin de esos niveles de potencial esta desviando la oxidacin del p-cr al metabolismo endgeno, restando poder reductor a la desnitrificacin. La electrolisis del nitrato o el p-cr en los electrodos del reactor se puede descartar ya que la corriente mxima que se mantuvo entre los electrodos fue de 10 A, por lo cual no pudo haber ni oxidacin o reduccin electroqumica significativa. La aplicacin de los potenciales -136 mV y -520 mV, tiene efectos en diferentes niveles de las rutas metablicas (la reductiva, como la oxidativa), los cuales parecen caractersticos de cada potencial. La VEpcr en mas rpida para -136 mV que para -520 mV, mientras que es inverso para la VENO3, la cual es menor para -136 mV que a -520 mV (Figura 6A). Podra ser que tambin se este afectando la nitrato reductasa, ya que al final los rendimientos (YHCO3 y YN2) siguen la misma tendencia (Figura 6C). Este efecto a nivel metablico no sucedi a -420 mV, ya que como se discuti anteriormente parece estar asociado al transporte de sustratos.
Figura 7: Perfiles de comportamiento del pH y el ORP durante el proceso desnitrificante, bajo los diferentes potenciales aplicados. Durante el desarrollo de los cultivos con y sin aplicacin de potencial, se sigui el comportamiento del pH como del ORP (potencial de oxido-reduccin del medio de cultivo) (Figura 7). El ORP es diferente al PE impuesto por medio de los electrodos. Dicho ORP nos da una lectura general del comportamiento de las especies oxidantes y reductoras en el medio, y se ha reportado como una variable caracterstica del proceso
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desnitrificante (Chang y col. 2004). En el control sin PE se puede observar que el ORP (Figura 7B), disminuy de las 0 h a las 10 h unos 90 mV y se mantuvo constante hasta las 30 h, a dicho tiempo empieza de nuevo a disminuir hasta -160 mV. Esta fase de decaimiento del ORP corresponde a cuando el nitrito acumulado se redujo a nitrgeno molecular (Figura 5E y F). En ese mismo periodo, aument el valor de pH, los cual es razonable si se conoce que durante en proceso respiratorio desnitrificante se liberan HO-. Cuando se impuso el PE a -428 mV, se present un desfase en la desnitrificacin, esta hiptesis se puede respaldar con el comportamiento del ORP, ya que el proceso empez a reducir en NO2- acumulado a N2 a las 50 h, que es el tiempo al cual el ORP empez a disminuir y el pH a incrementar. Para los PEs de -136 mV y -520 mV, en el tiempo que duro el ensayo (63 h), el ORP se mantuvo prcticamente constante en un nivel oxidativo (Figura 7B) y el pH solo disminuy (Figura 7A). Al haberse mantenido en un ORP oxidativo durante todo el ensayo pudo haber afectado el proceso desnitrificante, dado que es de naturaleza reductiva, y de este modo haberse favorecido la oxidacin del p-cr por el metabolismo endgeno. CONCLUSIONES La evidencia presentada muestra que la presencia de las diferentes quinonas, cada una con un potencial de xido-reduccin caracterstico, provoca efectos metablicos distintos y en algunos casos (MEN y ALZ) varan su efecto con la concentracin. Adems, al tiempo que duro cada uno de los ensayos en los controles sin nitrato, no se observ que las quinonas pudieran participar como aceptores nicos de electrones en la oxidacin de p-cr. El principal efecto de este tipo de compuestos, como lo muestran los resultados, bajo las condiciones ensayadas, parece deberse principalmente a su estructura mas que a su potencial de oxido-reduccin. Diversos autores han reportado que este tipo de compuestos pueden funcionar como coadyuvantes en la eliminacin de compuestos de importancia ecolgica, sin embargo su aplicacin mas que sistemtica, vendra a ser al azar. Los resultados en el presente trabajo, como varios reportados en literatura (Kappler y col., 2004), presentan evidencia de que no todos los cultivos microbianos presentan una misma respuesta a las quinonas, ya que estas pueden ser txicas o benficas. Mucho menos pueden presentar la misma respuesta a las sustancias hmicas, de las cuales se ha tomado como base el estudio de quinonas modelo. La respuesta depender directamente del tipo de cultivo involucrado, tipo de sustrato y el potencial xido-reduccin que presenten, as como la estructura qumica de las quinonas o de las sustancias hmicas. El comportamiento del proceso desnitrificante, por la aplicacin de los potenciales de oxido-reduccin de las quinonas (AQDS, ALZ, MEN), fue diferente a cuando estas fueron adicionadas a diferentes concentraciones. Esto respalda lo anterior discutido acerca de que el efecto de la quinonas se debi primariamente, a su estructura qumica mas que a su potencial de oxido-reduccin. La evidencia presentada muestra que es posible desacoplar el metabolismo, a travs de la aplicacin un potencial elctrico en el medio de cultivo. Entendiendo la forma y el nivel bioqumico al que actan los potenciales elctricos en el proceso desnitrificante, es posible inferir que tipo de potenciales podran mejorar el proceso. Sin embargo, se necesita mas trabajo acerca del tema, ya que a los niveles de potencial trabajados, se favoreci mas la oxidacin de materia orgnica que la reduccin de nitrato.
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AGRADECIMIENTOS Agradecemos al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) por el financiamiento del presente estudio (SEP-2003-CO2-43144/A-1) y por la beca de doctorado otorgada a uno de los autores (172718). Tambin un especial agradecimiento al Dr. Jos Lus Nava y al grupo de Ingeniera en electroqumica de la UAM-Iztapalapa por la asesora en la construccin del bioreactor electroqumico. REFERENCIAS
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NOTACION C-pHBTO C-pcr C-HCO3Epr , ENO3 N-NO2p-Cresol, pHOBTO y HCO3- expresados en trminos de carbono mg de sustrato consumido/mg sustrato adicionado * 100 Nitrato y nitrito expresados en trminos de nitrgeno
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N-NO3YHCO3, YN2
mg de producto/mg de sustrato consumido
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