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PROTOCOLO PREPARACIN GEL DE AGAROSA.

Preparar cuba de electroforesis y cuna del gel. A los extremos abiertos de la cuna cubrirlos con cinta de enmascarar 3M Rocket, cuidando de un trozo a lo largo de la cinta sobresalga de la base de la cuna (0,5 cm). Frotar la base y el costado de la cuna en contacto con la cinta para asegurar que toda la superficie este pegada. Colocar el peine en la parte superior de la cuna. Colocar la cuna as preparada dentro de la cuba. PREPARACIN DE LA AGAROSA. Pesar agarosa suficiente para un volumen de 150 mL y una concentracin de 0,8 %. (unos 1,2 g). Colocar la agarosa en un erle de 250 mL, agregar los 150 mL de buffer de corrida 1X (TBE), marcar hasta donde llega el buffer. Llevar al microondas y fundir la agarosa. Controlar el nivel de lquido, si est por debajo de la marca realizada, completar hasta all con H2O demonizada. Dejar enfriar. Agregar antes de volcar 75 uL de Bromuro de etidio, agitar suavemente para mezclar. A partir de aqu la manipulacin del gel debe hacerse con guantes, ya que el BrEt es mutagnico. Volcar dentro de la cuna y dejar gelificar. Una vez gelificado, sacar con cuidado las cintas de los bordes. Llenar la cuba con el buffer de corrida 1X, colocar all la cuna con el gel, recin entonces con cuidado sacarle el peine.

PREPARACIN DE LA MUESTRA Resuspender las muestras de ADN con 50 uL de buffer Tris 0,01M pH 7,5. pipetear bien sobre las paredes, darles un spin down en la microcentrifuga. Preparar un eppendorf nuevo para cada muestra, rotular. Colocar en el 15 uL de muestra resuspendida, agregar 3 uL de buffer de carga 6X (15 uL + 3 uL = 18 uL tot.) para que as quede el buffer 1X de concentracin. Nuevo spin down. Sembrar en orden los 18 uL de muestra en la ltima calle sembrar marcador supercoiled. Colocar la tapa de la cuba, controlando que los bornes negativo y positivo coinciden (rojo/rojo y negro/negro). Conectar la cuba a la fuente de poder. Voltaje de corrida, se calcula segn una formula emprica. Para evitar que la resistencia del gel eleve la temperatura y termine fundiendo la agarosa, el lmite de voltaje estar dado por la formula: Voltaje total= 5Volts/cm x distancia lineal entre los bornes de la cuba. (por ejemplo, si esa longitud es de 28 cm, entonces el voltaje mximo ser de ~140-150 voltios, esta cifra es indicativa, no debe correrse a ms de ese voltaje, pero puede correrse a voltajes menores). Activar la corrida y dejar correr una hora. Sacar el gel de la cuba llevarlo al transiluminador, colocarlo all y prender la luz UV despus de bajar la tapa acrlica, identificar las bandas que pudieran aparecer.

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