A Punt Es Medicina Molecular 2011

UNIVERSIDAD DE CONCEPCIN
FACULTAD DE MEDICINA
Laboratorio de Diagnostico Clnico MolecularMolecular-UDEC

MEDICINA INTERNA 2 ROTACION EN MEDICINA MOLECULAR 1er SEMESTRE 2011
UBICACIN Laboratorio de Diagnstico Clnico Molecular-UDEC, Edifcio de Anatomia, 20 Piso, Campus UDEC. FUNDAMENTO El avance de la biologia molecular que culmino con el secuenciamiento del genoma humano el ano 2000 determino un avance considerable en la medicina molecular particularmente en investigacion aplicada de cancer. Tambien ha permitido una mejor comprension de los procesos celulares y de la informacion genetica facilitando su aplicacin principalmente en el area del diagnostico. La complejidad del diagnostico asociado al concepto de Medicina basada en evidencia prioriza la necesidad de actualizar los conocimientos sobre los que se basan las nuevas tecnicas moleculares de diagnostico. OBJETIVO La rotacin en Medicina Molecular Aplicada para alumnos del 4 Ao de Medicina tiene por objeto refrescar los conocimientos esenciales de biologa molecular a fin que los alumnos puedan entender las tcnicas de ltima generacin para la deteccin de enfermedades infecciosas y oncolgicas. Ser un curso dinmico y participativo en el que se discutirn los usos, ventajas y limitaciones del diagnstico molecular. CARACTERISTICAS DE LA ROTACION Tendr un componente terico en el que se explicarn los requerimientos, caracteristicas, control de calidad y funcionamiento de un laboratorio de diagnostico molecular y habra tambien un componente prctico de observacion de las diversas actividades del laboratorio conducente al diagnstico. Observaran las principales etapas del diagnostico molecular , preparacion de reactivos, extraccin de cidos nucleicos a partir de muestras clinicas, amplificacion del DNA extraido mediante PCR, evaluacion e informe de de resultados. La rotacion estar concentrada en los aspectos mas esenciales del diagnostico molecular de enfermedades infecciosas y oncologicas y requerir activa participacin de los alumnos y un conocimiento previo del material didctico. SESIONES Cada grupo de alumnos (5-6 alumnos por grupo) recibira 4 (cuatro) sesiones de aproximadamente 2 horas de duracion cada una, durante las dos semanas que dura la rotacion, siendo la ultima una evaluacion escrita y una discusion de la rotacion en la que se les pedir a los alumnos sugerencias y comentarios. La primera sesin consistir en una breve clase magistral, donde se explicaran los conceptos basicos de medicina molecular y sus herramientas diagnosticas, se aclararan conceptos y se evaluaran los conocimientos previos de los alumnos.Luego cada grupo se subdividira en dos para la observacion directa de los diversos procedimientos del diagnostico en la que los alumnos se insertaran en las actividades de rutina de diagnostico molecular del laboratorio. PERSONAL DOCENTE Docente responsable del contenido de la rotacin en Medicina Molecular es la Dra. Sonia Montenegro DVM, MSc, PhD, MB (ASCP)CM, Profesora Titular y Directora del Laboratorio de Diagnostico Molecular-UDEC, con amplia experiencia en investigacin traslacional en medicina y con especializacin en diagnstico molecular de enfermedades infecciosas y tropicales. El personal docente de apoyo esta constituido por la BQ y Magster en Microbiologa Susana Pineda y la TM. Daniela Guiez, Instructor Acadmico, ambas entrenadas en diagnstico molecular por la Dra. Montenegro.
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GESTIN DE CALIDAD EN LABORATORIOS DE DIAGNOSTICO MOLECULAR Existen actualmente pruebas diagnostica para ms de 300 enfermedades de base gentica, numerosas pruebas diagnsticas de organismos patognos y numerosos biomarcadores diagnsticos, pronsticos o predictivos de enfermedades neoplsicas. Para los laboratorios que realizan estas actividades, esta tecnologa, involucra regulaciones de espacio, equipo, personal y muy importante, lo de gestin de calidad. Adems existen responsabilidades de tipo tico y legal. El uso clnico de la tcnica del PCR y otras asociadas, requiere la implementacin y cumplimiento de numerosos procedimientos de laboratorio para evitar errores, como la contaminacin de amplicones y presencia de inhibidores lo que trae como consecuencia la obtencin de resultados falsos positivos y negativos, respectivamente. OBJETIVO GESTION DE CALIDAD. El objetivo de la gestin de calidad es ofrecer resultados reproducibles y confiables con cualquier tipo de muestras, tales como tejidos frescos o fijados y con diversos fluidos orgnicos. Lo mas bsico en un programa de la gestin de calidad es que el laboratorio cuente con personal calificado y entrenado y con un Director del Laboratorio cuya responsabilidad es velar por la calidad de los resultados obtenidos segn la normativa de calidad vigente para laboratorios clnicos de la ISO 9000 y del College of American Pathologists (CAP). CONTROL DE CALIDAD. Es el conjunto de los procedimientos realizados en un laboratorio, destinados a asegurar la reproducibilidad de los mtodos empleados en el mismo. MEJORAMIENTO DE LA CALIDAD Es el conjunto de reglas y procedimientos necesarios para asegurar que los resultados que el laboratorio ofrece son confiables. CONTENIDO DE UN PROGRAMA DE GESTION (CONTROL) DE CALIDAD El laboratorio de Diagnostico Molecular debe ejecutar y mantener un programa de mejora de la calidad que debe contener normas que regulen los siguientes aspectos: 1. Calidad de los resultados. Mediante monitoreo y evaluacin de la documentacin del control de la calidad, con detallada informacin de cada paso del proceso diagnostico hasta llegar al resultado. 2. Informe de los resultados rpido, claro y preciso. 3. Capacitacin y evaluacin constante del personal. 4. Identificacin y resolucin expedita de problemas. 5. Laboratorio acreditado bajo la responsabilidad de un director calificado 6. Programa de Gestin de calidad con directores o responsables para cada laboratorio a fin de establecer y ejecutar los planes del programa de control/mejora de la calidad. El laboratorio debe realizar reuniones peridicas con el personal para revisar las normas y reglas que afectan a la calidad del trabajo realizado. 7. Documentacin. La fuente de informacin para generar los informes de control/mejora de la calidad, van desde los informes de biopsia, la solicitud de ensayo bien completa, informacin clnica pertinente al paciente, y toda la cadena de procedimientos que llevan al diagnstico. Todo deber estar registrado en los libros de laboratorio destinados para cada prctica realizada. 8. Personal. El laboratorio debe establecer un sistema de proficiencia para evaluar la competencia profesional del staff. Esto incluye supervisin directa de la realizacin de las pruebas de rutina, incluyendo la recepcin, manejo, procesamiento de muestras, realizacin de pruebas diagnsticas, resultados, informes y ejecucin del programa de control de calidad. Esta evaluacin debera llevarse a cabo de manera peridica y tambin sin previo aviso (Auditoria Interna). El director del laboratorio, manager y supervisores debern participar en las actividades de mejora de la calidad, y esta participacin debe constar por escrito. Hay que asegurarse que todo el staff del laboratorio, incluidos aquellos que estn slo de manera temporal (becarios, estudiantes de pre- y postgrado, visitantes) conocen y obedecen los planes de control y mejora de la calidad del laboratorio. . Edificio de Anatoma 2 Piso. Barrio Universitario . Concepcin Fono: (41) 2203211 FAX: (41)2203702 labpatologiamolecular@gmail.com

COMO SELECCIONAR UN ENSAYO MOLECULAR. PASOS PREVIOS. 1. Consideraciones de costo/beneficio. El director del laboratorio debe considerar: necesidad clnica, costo, facilidades, y los beneficios esperados del ensayo antes de invertir tiempo y dinero en establecerlo. Por ejemplo, reemplazar un mtodo antiguo, laborioso, caro, complicado o menos efectivo como la sustitucin del Southern blot por PCR para analizar los reordenamientos del gen de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas o para anlisis de la clonalidad de una poblacin linfoide. Determinar el impacto favorable en el manejo clnico de un paciente, la deteccin por PCR de microorganismos difciles o muy demorados de detectar por mtodos convencionales.(ej. MTB, HIV-1, CMV, HSV entre otros). 2. Seleccin de la tcnica. Escoger la que ms se ajuste a la alteracin molecular que se quiere estudiar. Cada tcnica proporciona una informacin diferente. Algunas detectan alteraciones que afectan a cromosomas enteros (p.ej el FISH, Southern blot), mientras que otras resultan mejores para analizar mutaciones puntuales (p.ej secuenciamiento). Es importante considerar el nivel de laboriosidad, como el Northern blot, comparado con la PCR, que es mas fcil y rpida de realizar. Algunas tcnicas preservan la morfologa, como la hibridacin in situ, parcialmente como el FISH, o no la preservan, como la PCR. Otras tcnicas moleculares cuantifican la expresin de un gen, como la PCR cuantitativa a tiempo real, otras son slo cualitativas, como la PCR y RT-PCR convencional. Es importante considerar el volumen de muestras para determinar el costo/beneficio. Evaluar costo de reactivos, equipos, materiales, personal, espacio de laboratorio etc. 3. Controles y Calibraciones. Debe contar con controles positivos y negativos conocidos, muestras bien colectadas, reactivos de calidad, calibracin/programacin de equipos; entrenamiento del personal. 4. Validacin del test. Utilizar muestras de pacientes con caractersticas conocidas respecto al parmetro que se va a medir. Ej. un test para TBC incluir biopsias informadas como tuberculosis con granulomas y presencia de bacilos; biopsias con granulomas y sin bacilos visibles por tincin e informadas como compatible con tuberculosis y muestras conocidas en las que no hay tuberculosis. Para cada mtodo nuevo determinar su reproducibilidad y la sensibilidad y especificidad analticas. 4. Protocolo de trabajo Cada test debe tener un protocolo siguiendo las normas establecidas en forma extensa y resumida el que debe estar accesible al personal que va a realizar el test. MTODOS DIAGNSTICOS VALIDADOS. 1. El laboratorio debe establecer un chequeo de las variaciones entre preparaciones de un producto( variacin entre lotes) ej. master mix, reactivo, kit, calibrador o control. 2. Establecer criterios para determinar si las diferencias son aceptables. 3. Establecer mtodos para identificar y evaluar los resultados de pruebas discordantes (ej PCR(+) y test convencional (-)), como analizar parmetros clnico-patolgicos relevantes, demogrficos (edad, sexo) entre otros. 4. Tener un registro de casos difciles o instructivos. 5. Registrar los resultados realizando la misma prueba con diferentes mtodos o instrumentos. Ej. deteccin de reordenamientos de cadenas pesadas de inmunoglobulina con Southern blot vs PCR, o en tipos de muestras diferentes ej. material congelado vs en parafina, sangre perifrica vs tejido. 6. Evaluar y analizar en forma peridica si se presentan discrepancias en los resultados . 7. En las pruebas cualitativas el laboratorio debe documentar sobre qu base ( gen, secuencia) se informan los resultados como positivos, negativos, y cul es el nivel de sensibilidad analtica a partir del cual una muestra se informa como positiva o negativa. 8.. Establecer el tiempo requerido de un test para ser informada, sea definitivo escrito, o como informe provisional. 9. El laboratorio debe tener un libro de protocolos, escrito en un formato estndar. Debe contener referencias cientficas relevantes y estar accesible en las reas de trabajo. 10. Los manuales de instrucciones de los equipos pertinentes o de los kits deben estar incluidos en el libro de protocolos de la descripcin de cada mtodo. 11. Tener libros o artculos cientficos que suplementen cada protocolo. Toda la documentacin de be estar en copia impresa y tambin con respaldo electrnico. . Edificio de Anatoma 2 Piso. Barrio Universitario . Concepcin Fono: (41) 2203211 FAX: (41)2203702 labpatologiamolecular@gmail.com

CONTROL DE CALIDAD DE EQUIPOS Realizar y documentar una inspeccin peridica de equipos e instrumentos: 1. Con la frecuencia que recomienda el fabricante. 2. Cada vez que sospeche que funciona mal, o porque ocurri un accidente. 3. Realizar mantenimiento preventivo de los equipos para asegurar su ptimo funcionamiento. 4. Tener instructivos SOP (Standard Operating Procedures) para el mantenimiento de todos los equipos. 5. Las reas y equipos de ambiente controlado: estufas, cabinas, freezers, refrigeradores, termobloques, etc. deben tener registrados los parmetros de temperatura, humedad, calidad del agua, proteccin de fluctuaciones de la corriente elctrica, etc. Todas estas acciones deben registrarse y documentarse de manera peridica. Solo debe usarse agua de calidad adecuada. Registrar el pH, contenido en bacterias, silicatos, materia orgnica o particulada. CONTROLES PARA PROCESOS MOLECULARES Los controles y calibradores deben usarse como lo especifica el fabricante para validar los resultados, monitorizar los reactivos y las caractersticas de los instrumentos o kits. Los controles y calibradores deben usarse en paralelo y de la misma manera que con las muestras de los pacientes. Cuando un laboratorio recibe resultados de un laboratorio de referencia, stos deben incluirse en el informe original. 1. En las pruebas cualitativas deben incluirse al menos un control positivo y dos negativos. Control negativo 1. Agua. Control de contaminacin de reactivos Control negativo 2. DNA genmico humano normal, de preferencia del mismo tipo de tejido o fluido que la muestra. Control positivo. Se necesita para asegurar que una muestra que contenga una mnima cantidad del ADN esperado, dar un resultado positivo. El tamao del fragmento que se amplifica en el control debe ser igual al del fragmento amplificable en la muestra problema. Esto porque, malas condiciones de amplificacin pueden causar ausencia de amplificacin de fragmentos grandes, mientras que los pequeos an se pueden amplificar. 2. Control sin transcriptasa inversa para la RT-PCR. Un resultado positivo en una RT-PCR cuando no se aade transcriptasa inversa indica que hay contaminacin de reactivos o de la muestra. Cuando el control blanco/agua es negativo, un resultado positivo en el control sin transcriptasa inversa indica: 1. Que no son los reactivos de PCR los que estn contaminados, sino los reactivos empleados en la extraccin de RNA o durante la extraccin.2. La muestra de RNA est contaminada con DNA genmico, que es el que se amplifica.
ASPECTOS GENERALES DEL DIAGNOSTICO MOLECULAR Chequear y controlar cada fase del proceso de diagnostico molecular, incluyendo el procesamiento de los especimenes, extraccin de cidos nucleicos, amplificacin y deteccin a travs de los controles apropiados. Se recomienda el anlisis peridico de un caso control de cada tcnica. Si una tcnica se realiza con poca frecuencia (seis veces al ao o menos), el control debera realizarse cada vez que se realice la tcnica. Todos los reactivos deben alicuotarse cuando se reciben. As, se pueden eliminar las alcuotas sospechosas en caso que el resultado de una muestra de contaminado, y se deber repetir con alcuotas nuevas. 1. Precauciones para PCR eficiente. Es importante disear los primers de manera que hibriden en exones adyacentes, separados por intrones ; asi el amplicn a nivel de cDNA, donde no hay intrones, es mas corto, mientras que el del DNA genmico incluye el intrn y es mas grande. 2. PCR Cuantitativa. Para realizarlo se debe co-amplificar un gen de expresin constitutiva (in-house-keeping gene). La evaluacin cuantitativa de la cantidad de producto de PCR debera caer dentro de un rango de amplificacin lineal. Hay que incluir al menos 5 controles conocidos en duplicado con una cantidad decreciente (controles de dilucin). . Edificio de Anatoma 2 Piso. Barrio Universitario . Concepcin Fono: (41) 2203211 FAX: (41)2203702 labpatologiamolecular@gmail.com

3. Materiales. Cada reactivo empleado debe estar rotulado para indicar el nombre, concentracin, condiciones de almacenamiento, fecha de preparacin/apertura, fecha de caducidad. Informacin de la toxicidad, volatilidad, inflamabilidad del reactivo. Los reactivos, especialmente los inflamables, deben almacenarse en un lugar separado, adecuadamente ventilado y/o en container especiales. No se deben intercambiar los componentes de los kits. Hay que revisar los reactivos para descartar los que estn expirados o contaminados. 4. Resultados. Los resultados deben guardarse en un tipo de sistema informtico protegido del acceso indebido de personal no autorizado. Esto requiere la adopcin de medidas tales como la redaccin de documentos de seguridad, funciones y obligaciones del personal, registros de incidencias, control de acceso, o medidas para el control de acceso fsico al laboratorio, etc. 5. tica. Toda la informacin generada en el laboratorio debe ser considerada confidencial, y debe estar en conocimiento del staff que tenga acceso a dicha informacin. Ese personal debera firmar un convenio de confidencialidad. 6. Seguridad. Observar precauciones universales con las muestras recibidas, especialmente con muestras de sangre y otros fluidos que deben manejarse como potencialmente conteniendo HIV, HBV, HCV y otros patgenos de la va sangunea. Est prohibido comer, fumar, beber, llevar lentes de contacto o aplicarse cosmticos en las reas de trabajo que presentan un riesgo razonable de exposicin a agentes dainos o infecciosos No se debe nunca pipetear con la boca. Hay que emplear dispositivos mecnicos. Debe haber espacio suficiente para que todas las actividades del laboratorio puedan realizarse con seguridad, especialmente en lo que concierne al espacio de trabajo en extraccin, preparacin y almacenamiento de reactivos. Hay que emplear guantes siempre que va a haber contacto con sangre, otros especimenes potencialmente infecciosos, o cuando se toquen superficies u objetos contaminados. Debe haber una campana de gases o una unidad de filtracin qumica disponible para todos los procesos que utilizan productos qumicos voltiles.
Referencias 1. Am. J Clin. Pathol. 1999;111:449-463 2. Clinical Laboratory Evaluation Program. http://www.wadsworth.org/labcert/blood_tissue/index.htm. New York 3. College of American Pathologists. Laboratory Accreditation Program checklists. http://www.cap.org/apps/docs/laboratory_accreditation/checklists/checklistftp.html 4. Quality Assessment Plan. Laboratory of Molecular Pathology. Department of Pathology. Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. New York, USA .

I. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) La PCR es un mtodo in vitro de amplificacin de cidos nucleicos, que permite la amplificacin selectiva de una regin particular del DNA al imitar el fenmeno de replicacin del DNA in vivo. Especficamente, la reaccin ocurre siguiendo la siguiente secuencia: - FASE DE DENATURACION: es crtico que la denaturacin se lleve a cabo de manera completa para que las cadenas del molde de DNA sean completamente separadas. Se utiliza una temperatura de 92 a 95C durante 20 a 30 s - ALINEAMIENTO DE PRIMERS: pequeos oligonucleotidos conocidos como partidores (primers) se unen a regiones especficas del DNA molde (2 partidores, uno para cada hebra de la secuencia molde) a una temperatura ms baja. Las posiciones donde los partidores o primers se alinean al molde se definen como el DNA blanco. El tiempo de alineamiento es usualmente entre 20 a 60 seg. Solamente en casos donde la proporcin del numero de copias blanco y el DNA heterologo es muy bajo, como por ejemplo DNA retroviral en sangre perifrica, un tiempo de alineamiento mas largo (por ejemplo 2 minutos) en los primeros ciclos podra ser ventajoso al proceso de screening genmico. - EXTENSION DE LOS PRIMERS: El ciclo se concluye cuando se acoplan enzimaticamente los nucletidos al extremos 3 de los partidores, a una temperatura intermedia, produciendo as otra cadena de DNA, que corresponde a una copia de la hebra de DNA original. La Taq DNA polimerasa debe realizar la elongacin de la hebra molde. Dependiendo del tamao de amplificacin cada ciclo de PCR tiene un tiempo y temperatura controlados que se esquematiza en la Figura 1.
Figura 1: Pasos del PCR (Denaturacion, Alineamiento y Extensin) Estos tres pasos se repite de 20 a 40 veces dependiendo del tamao del fragmento. En un PCR analtico, el nmero de ciclos no debera exceder los 40 ciclos, siendo la cantidad de ciclos ms apropiada es de 25 a 35. . Edificio de Anatoma 2 Piso. Barrio Universitario . Concepcin Fono: (41) 2203211 FAX: (41)2203702 labpatologiamolecular@gmail.com

En cada ciclo se produce el doble del nmero de copias de la secuencia original, ya que el producto de un ciclo de PCR ser sustrato para el siguiente ciclo. Entonces, repetidos ciclos de amplificacin tericamente llevaran a la sntesis exponencial de un fragmento de DNA con una longitud definida, con ello, se produciran millones de copias de la secuencia blanco, permitiendo que cantidades muy pequeas de DNA sean detectadas (Figura 2).
Figura 2: Amplificacin exponencial de un segmento de DNA.
Usualmente despus del ltimo ciclo, se realiza una extensin final de 5 a 15 min a 72C para terminar la extensin de los productos parcialmente extendidos y completar el alineamiento de los productos complementarios de cadena simple. El componente mas critico para la optimizacin de la especificidad de un ensayo de PCR, es la eleccin de la temperatura de alineamiento. Si la temperatura es demasiado alta, no se producen alineamientos, pero si la temperatura es demasiado baja, podra incrementarse el alineamiento no especifico. El PCR tiene amplias reas de aplicacin que incluyen: biologa molecular bsica, secuenciamiento de DNA, estudios de evolucin, investigacin forense, anlisis gentico, gentica de poblacin, diagnostico medico, diagnostico veterinario, inmunolgica clnica, biotecnologa agrcola, entre otros.
II. REACTIVOS CONTENIDOS DE LA MEZCLA DE REACCION PARA EL PCR Para la realizacin de un PCR existen componentes esenciales que no pueden faltar en la reaccin: 1. DNA molde: El contenido ptimo de DNA de una muestra para el anlisis por PCR, depende de su pureza y del propsito del ensayo. Para la deteccin de un nmero de copias desconocido de DNA blanco, como por ejemplo agentes infecciosos, la cantidad mxima de muestra de DNA o clulas que no inhiban la PCR, debe ser determinada empricamente. 2. Buffer de PCR: La composicin optima del buffer varia de acuerdo a la enzima y a la aplicacin del PCR. Compuestos como Tris-HCl, tris-acetato, son usados como agentes buffer. La mayora de las PCR son llevados a cabo en un rango de pH de 8.3 a 8.8.

3. Partidores (Primers): Los primers son pequeas secuencias de ADN que sirven de molde para la Taq polimerasa. Deben alinearse a regiones altamente conservadas del genoma de las especies analizadas para maximizar la especificidad y la eficiencia de la reaccin de amplificacin. En la mayora de las aplicaciones, es la secuencia y la combinacin de los primers las que determinan el xito de los ensayos. Dependiendo del objetivo, la longitud de primers apropiada es la de 14 a 30 bases. 4. Nucletidos (dNTPs): Generalmente una solucin stock con cada uno de los 4 dNTPs (ATP, CTP, GTP, TTP) es apropiada para los ensayos. Las mezclas con concentraciones desbalanceadas de los dNTP reducen la fidelidad de la Taq polimerasa. La concentracin ptima de dNTPs depende de la longitud de los productos de amplificacin, de la concentracin de magnesio, de la concentracin del primer y de la astringencia de la reaccin. 5. Taq DNA polimerasa: La Taq DNA polimerasa cataliza la sntesis de largas cadenas de polinucleotidos usando una de las cadenas originales de DNA como molde para la sntesis de una cadena nueva complementaria. La sntesis procede en la direccin 5-3 y se requiere un pequeo segmento de DNA o primer para alinearse a una secuencia complementaria para iniciar la sntesis. Se van uniendo dNTPs covalentemente al extremo del primer y se forma as una nueva cadena complementaria al molde. La velocidad de sntesis de la Taq depende de la temperatura, de la concentracin de magnesio, la concentracin de dNTPs. La cantidad de polimerasa para la mayora de los ensayos, es de 0.5 a 2.5 unidades en un volumen de reaccin de 50ul. 6. Magnesio (MgCl2): El magnesio es esencial para la actividad de la Taq polimerasa. La concentracin de magnesio puede afectar la eficiencia del PCR como consecuencia de su unin a los dNTPs y a la cantidad de magnesio requerido por la enzima. Un exceso de magnesio causa acumulacin de productos no especficos mientras que bajos niveles de magnesio reducen el rendimiento del producto. La concentracin de magnesio puede variar de aproximadamente 0.5mM a 5mM. Los buffers tambin pueden ser suplementados con componentes auxiliares o aditivos como que no son esenciales en el PCR, pero que ayudan a mejorar su rendimiento. Entre estos se encuentran: - Sulfato de amonio que incrementara la actividad de las polimerasas. - DMSO cuya funcin es desestabilizar el realineamiento inter e intracatenario - Glicerol, que favorece la denaturacin y estabiliza a la polimerasa en solucin, son algunos ejemplos.
III. DETECCION DE LOS PRODUCTOS DE AMPLIFICACION La deteccin del producto de PCR establece la presencia o ausencia de secuencias amplificadas, pero no de la especificidad de una PCR. Cada reaccin es llevada a cabo con un sistema de deteccin interna tal como el bromuro de etidio o un colorante de acridina que se intercala entre las bases del DNA de doble cadena. Este complejo, fluoresce en presencia de luz UV. Existen varias formas para detectar los productos de PCR, pero los mas comunes son: 1. Electroforesis en gel de agarosa: La separacin de los segmentos amplificados de acuerdo al tamao a travs de una matriz de agarosa es el mtodo ms popular de deteccin de amplicones. La migracin del DNA a travs del gel de agarosa se produce debido a la aplicacin de voltaje y depende del peso molecular del fragmento, la concentracin de la agarosa, la composicin del buffer y de la presencia de bromuro de etidio (Figura 3). Las muestras y un marcador de Peso Molecular (que servir para comparar los fragmentos) son colocadas en pequeos pozos formados durante la preparacin del gel y un campo elctrico es usado para separar los productos a travs de la matriz. La visualizacin de los segmentos se realiza mediante luz UV, ya que el bromuro de etidio es fluorescente.
Figura 3: Esquema de la migracin de los fragmentos de DNA en gel de agarosa
2. Electroforesis en gel de acrilamida: Si bien la electroforesis en acrilamida es ms cara y toma mas tiempo que la electroforesis en agarosa, este mtodo se recomienda cuando se requiere de una alta resolucin de fragmentos de DNA sobre un amplio rango de fragmentos, los que se pueden diferenciar utilizando diferentes concentraciones de acrilamida (Figura 4). Los geles de poliacrilamida se corren usualmente en un plano vertical entre lminas de vidrio.
Figura 4: Esquema de migracin de los fragmentos de ADN en geles de poliacrilamida a diferentes concentraciones
IV. VARIACIONES DE LA PCR El PCR analizado hasta el momento se denomina PCR convencional y fue el primero en ser desarrollado. Con la aplicacin de nuevas tecnologas se crearon nuevas formas de PCR que tienen diferentes aplicaciones: 1. PCR MULTIPLEX: El PCR mltiplex implica el uso de varios pares de partidores en un solo PCR. Esto reduce el trabajo, el tiempo, el costo y el riesgo de contaminacin cruzada, ya que la manipulacin de la muestra es minima. Con este mtodo, varios genes de un agente infeccioso o de un ADN eucaritico de inters pueden ser amplificados simultneamente. Este PCR es de difcil realizacin ya que el diseo de partidores de suma importancia, as como la optimizacin de las cantidades de partidores usados en la mezcla de reaccin, teniendo cuidado de evitar cualquier complementariedad entre los partidores 2. NESTED PCR: Es til cuando el DNA blanco se encuentra en un nmero extremadamente bajo de copias o cuando es esencial una especificidad absoluta. Se espera obtener una alta sensibilidad al realizar un nested PCR, sin embargo, puede introducir riesgo de contaminacin. Esencialmente, el nested PCR consiste en la realizacin de dos PCR consecutivas con dos set de partidores diferentes. En el 1PCR se amplifica una regin amplia de la zona . Edificio de Anatoma 2 Piso. Barrio Universitario . Concepcin Fono: (41) 2203211 FAX: (41)2203702 labpatologiamolecular@gmail.com

blanco, luego en el 2 PCR se utiliza el producto obtenido en el 1PCR y la region a ser amplificada esta dentro del segmento anterior (Figura 5)
Figura 5. Esquema del Nested PCR
3. RT-PCR: Debido a que el RNA no puede servir de molde para la PCR, la combinacin de transcripcin reversa (RT) y PCR hacen que el mRNA pueda convertirse en DNA complementario (cDNA). La sntesis de mRNA a cDNA requiere del uso de la enzima transcriptasa reversa, la cual requiere una hebra de RNA que catalizar la sntesis del DNA complementario, pero tambin sintetiza una cadena complementaria a la primera cadena de DNA y tambin tiene actividad endonucleolitica para degradar el mRNA (Figura 6) . Las aplicaciones del RT-PCR cubren un amplio campo de objetivos para propsitos clnicos y de investigacin. Las aplicaciones han sido descritas para enfermedades virales y retrovirales a fin de detectar la presencia de genoma de RNA y transcriptos especficos que pueden proveer evidencia de una infeccin activa. Otra aplicacin interesante es la deteccin de transcriptos de genes de multidrogo-resistencia durante el tratamiento de neoplasias que podran ayudar a predecir que pacientes respondern a ciertos agentes quimioterapeuticos.
Figura 6. Esquema del proceso de transcripcin reversa . Edificio de Anatoma 2 Piso. Barrio Universitario . Concepcin Fono: (41) 2203211 FAX: (41)2203702 labpatologiamolecular@gmail.com

4. PCR TIEMPO REAL (qPCR): La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real es la habilidad de monitorear el progreso de la PCR mientras ocurre la reaccin (tiempo real). Los resultados de la amplificacin se van obteniendo a lo largo del proceso, a diferencia de la PCR convencional en que se obtiene al final del mismo. De esta manera es posible cuantificar el DNA o RNA. Lo que caracteriza la PCR a tiempo real, es el momento durante la reaccin, en que el DNA blanco se detecta por primera vez (CT). Mientras mayor sea el nmero de copias de cido nucleico blanco inicial, mas rpido se observar un aumento significativo de la fluorescencia. Una gran ventaja del PCR a tiempo real es que permiti eliminar el procesamiento post-PCR que puede ser un problema por la contaminacin con amplicones. Esta PCR usa los mismos reactivos que un PCR convencional, pero se agrega una molcula intercalante de ADN que es fluorescente, y as la fluorescencia es detectada por un lser y permite su visualizacin en el momento de la amplificacin. Se puede aumentar la especificidad del ensayo cambiando la molcula fluorescente por una sonda que es diseada para hibridizar dentro del segmento amplificado, la cual tiene adicionado un fluoroforo-quencher, cuya fluorescencia es detectado por el lser El PCR tiempo real o qPCR, permite por ejemplo, realizar cuantificaciones de microorganismos en sangre Qumica de la deteccin de secuencias por PCR a tiempo real. Se desarrollaron dos tipos de qumicas mas utilizados para detectar los productos de PCR mediante instrumentos denominados Sistemas de Deteccin de Secuencias que son: Sistema de deteccin por colorante SYBR Green I. Sistema de deteccin TaqMan (o qumica fluorogenica nucleasa 5) 1. Sistema de deteccin por colorante SYBR Green I. El sistema SYBR Green I utiliza un colorante que se intercala en forma altamente especfica al DNA de doble hebra, detectando as el producto de PCR mientras se acumula durante los ciclos de PCR (Figura 7). Fue la primera qumica que se uso para medir los productos de PCR a tiempo real.
Figura 7. Esquema de la deteccin por Sybr Green
Ventajas del sistema SYBR Green I: - Puede usarse para monitorear la amplificacin de cualquier secuencia de de DNA de doble hebra. - No se necesitan sondas lo que reduce el tiempo de la reaccin y el costo. Desventajas de la qumica SYBR Green - Su principal desventaja es que puede generar falsos positivos porque el colorante SYBR Green I se une a cualquier DNA de doble hebra, por lo que se puede unir a secuencias inespecficas. . Edificio de Anatoma 2 Piso. Barrio Universitario . Concepcin Fono: (41) 2203211 FAX: (41)2203702 labpatologiamolecular@gmail.com

- Mltiples molculas de colorante se intercalan a una sola molcula de DNA amplificada, y se aumenta la sensibilidad de deteccin de la PCR, lo que proboca que la cantidad de seal sea dependiente de la masa de DNA de doble hebra producida en la reaccin. Por lo tanto, si la eficiencia de amplificacin es la misma la amplificacin de productos ms largos van a generar ms seal que los productos cortos. Un ensayo de cuantificacin a tiempo real. Mide la cantidad de acido nucleico blanco durante cada ciclo de amplificacin de PCR. El target puede ser DNA, cDNA o RNA. El sistema SYBR Green I se usa para los siguientes tipos de ensayo de cuantificacin Cuantificacin de DNA/cDNA Cuantificacin de RNA utilizando one-step RT-PCR Cuantificacin de RNA utilizando two-step RT-PCR 2. Sistema de deteccin TaqMan (o qumica fluorogenica nucleasa 5) La qumica TaqMan usa sondas fluorogenicas que utilizan la actividad 5nucleasa de la Taq polimerasa para la deteccin de un producto especfico de PCR mientras se acumula durante los ciclos de PCR. La diferencia ms importante entre las qumicas de TaqMan y de SYBR Green I es que esta ltima detecta cualquier DNA de doble hebra, incluyendo productos no especficos, por lo que es esencial contar con una PCR bien optimizada para tener resultados confiables. El sistema TaqMan se usa para los siguientes tipos de ensayo: Cuantificacin que incluye: One-step RT-PCR para cuantificacin de RNA; Two-step RT-PCR para cuantificacin de RNA; Cuantificacin de DNA/cDNA Discriminacin Allicas Como funciona la qumica de deteccin de secuencias Taqman (Figura 8). 1. La sonda oligonucleotida TaqMan contiene un fluoroforo reportero en el 5terminal y un colorante apagador en el 3 terminal. Mientras la sonda esta intacta, la proximidad del colorante apagador reduce en gran medida la fluorescencia emitida por el fluoroforo reportero debido a un fenmeno especial denominado FRET (fluorescence resonance energy transfer). 2. Si el blanco esta presente, la sonda se hibridiza a uno de los segmentos y por la actividad 5 nucleasa de la Taq polimerasa se corta (cleavage) cuando el primer se extiende. 3. El cleavage de la sonda hace que el reportero se separe del apagador lo que aumenta su sealreportero. 4. Molculas adicionales del fluoroforo reportero van siendo cortadas de la sonda a cada ciclo resultando en un aumento de la intensidad de la fluorescencia que es proporcional a la cantidad de producto de PCR (amplicon) producido.
Figura 8. Esquema de Deteccin de sondas Taqman . Edificio de Anatoma 2 Piso. Barrio Universitario . Concepcin Fono: (41) 2203211 FAX: (41)2203702 labpatologiamolecular@gmail.com

Ventajas del sistema TaqMan Hibridacin especfica entre sonda y target es esencial para generar una seal fluorescente, esto brinda especificidad al producto de PCR detectado. Sondas pueden ser marcadas con diferentes y diferenciables reporteros lo que permite la amplificacin de distintas secuencias en un mismo tubo de reaccin. Se elimina el procesamiento post-PCR, lo que reduce costos y manipulacin. Una sola molcula de fluoroforo es liberada del apagador por cada molcula sintetizada durante la amplificacin, sin consideracin a su longitud. Desventajas de la qumica Taqman La principal desventaja es que se requiere la sntesis de diferentes sondas para diferentes secuencias. Trminos que se utilizan en Anlisis de Cuantificacin. - Amplicon . Un segmento corto de DNA que se genera por el proceso de PCR - Curva de Amplificacin. La curva de la seal de fluorescencia vs. El numero de ciclos. - Lnea Base. Ciclos iniciales de PCR en los cuales hay poco o ningn cambio en la seal de fluorescencia. - CT (threshold cycle). El numero de ciclos en que la seal de fluorescencia supera el lmite de la lnea base.
V. EXTRACCION DE DNA A PARTIR DE MUESTRAS CLINICAS Existen muchos mtodos para la extraccin del DNA y RNA y tambin numerosas fuentes desde las que se puede extraer el DNA. La pureza, homogeneidad y el contenido de DNA de las muestras puede variar considerablemente, dependiendo del material de origen y del mtodo elegido para aislar o purificar el DNA. Los criterios que influyen en la eleccin del protocolo de extraccin son: Tiempo y disponibilidad de personal Confiabilidad diagnostica Riesgos de contaminacin Rendimiento de la muestra de DNA amplificable PREPARACIN DE LA MUESTRA Y ALMACENAMIENTO Las muestras clnicas a partir de las cuales se extrae el DNA para PCR no siguen un proceso previo de fijacin o deshidratacin (los cuales prevendran su degradacin) y son transportadas tal como han sido colectadas o en soluciones salinas isotnicas. Esto las hace muy sensibles a la degradacin y a que se produzca crecimiento de bacterias. El RNA se degrada fcilmente, dependiendo del tipo de tejido y la demora en el tiempo de transporte, por lo que las muestras deben ser mantenidas a 4C. 1. Sangre perifrica: Las muestras de sangre deben ser colectadas en tubos conteniendo EDTA y no sin anticoagulante o en heparina, ya que esta ultima es un inhibidor del PCR. Si se planea aislar RNA ser esencial separar los leucocitos tan rpidamente como sea posible y continuar inmediatamente con la extraccin de RNA. 2. Lavado nasofaringeo (LNF): Varios microgramos de ADN se pueden obtener desde el mucus nasofarngeo con dos lavados vigorosos. Para que esto sea posible, los lavados deben ser realizados con NaCl 0.9% (10ml), para prevenir la disrupcin hipotnica celular. Si esto no es tolerado, el lavado puede realizarse con agua destilada e inmediatamente introducida a un frasco estril con NaCl 0.9%. En algunos casos diagnsticos es esencial no limpiar la zona nasofarngea antes del lavado. 3. Esputo y fluidos broncoalveolares: Debido a la consistencia de estas muestras, es necesario realizar un tratamiento previo a la extraccin de ADN, de tal forma que la muestra este en un estado lquido. Para ello se utilizan soluciones que sean capaces de degradar el mucus. . Edificio de Anatoma 2 Piso. Barrio Universitario . Concepcin Fono: (41) 2203211 FAX: (41)2203702 labpatologiamolecular@gmail.com

4. Fluido cerebroespinal: El volumen depende de la cantidad de muestra disponible, lo mnimo es 0.5ml, el que deber ser removido con mucho cuidado y almacenado en frasco estril a 4C 5. Orina: A veces, la orina contiene sustancias que inhiben la PCR. De 1 a 50ml de orina son centrifugados. Se lava el pellet obtenido solo una vez con 1ml de NaCl 0,9% y se centrfuga. Se resuspende el pellet en 10 a 100 ul de agua dependiendo del volumen de pellet, el que ser utilizado para la extraccin de ADN 6. Biopsias y muestras de tejido slidas: Las muestras de tejido deben ser colocadas SIN aditivos o con una solucin salina fra isotnica y llevada al laboratorio tan rpido como sea posible. La muestra debe ser separada de la solucin isotnica inmediatamente, trasferida a un tubo limpio y sumergida en nitrgeno lquido. 7. Tejido fijado en formalina e incluido en parafina: El aislamiento exitoso del DNA de tejido fijado en parafina permite el anlisis retrospectivo del material de pacientes colectados por un largo periodo de tiempo por PCR. Mientras que las preparaciones de DNA de tejido fresco estn listas para la PCR, las preparaciones de tejidos fijados en parafina tienen limitaciones. No todas las PCR que se hacen a partir de DNA extrado de tejido fijado en parafina pueden ser amplificadas. Es de suma importancia extraer la parafina de los cortes de tejido antes de iniciar el protocolo de extraccin de ADN.
TIPOS DE EXTRACCION DE ADN Existen diversos mtodos para realizar la extraccin de ADN, y la eleccin del mtodo depende de la cantidad de clulas contenidas en la muestra, lo que incide en el rendimiento de la extraccin. De los mtodos utilizados tenemos los siguientes: 1. Mtodo rpido de calor y detergente: Utilizado en muestras de LNF y esputo, los que se centrifugan obteniendo un pellet de clulas, el que se lava una vez con buffer TE conteniendo 1% de Triton X-100 (detergente), luego se centrifuga y se descartar cuidadosamente el sobrenadante. Se resuspende el pellet en un pequeo volumen de buffer TE con 1% de Tritn X-100 conteniendo 5% de Chelex-100 y calentar a 95C por 30 minutos. Finalmente se centrifuga a alta velocidad y el sobrenadante, que contiene el ADN, es guardado a 4C si se usa inmediatamente o a -20C para largos periodos. 2. Extraccin mediante fenol-cloroformo: Se utiliza para extraccin de Lquido Cefalorraqudeo (LCR) o para otras muestras de bajo contenido de ADN. Aadir una mezcla de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico en proporcin (25:24:1) a la muestra. Se vortexea y se centrifuga para separar las fase acuosa de la orgnica. Transferencia de fase acuosa a un nuevo tubo limpio. Aadir solucin acuosa de NaAc 3M pH 5.2, en proporcin 1/10 y aadir tambin 2.5ul glucgeno y mezclar. Precipitacin de DNA. Aadir 2 volmenes de etanol 100% (mantenido a 20C) y vortexear y colocar las muestras en congelador a -70C durante 2 horas Centrifugar a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4C. Desechar el sobrenadante sin perturbar el pellet (pellet corresponde al ADN). Rehidratacin del ADN. Se aade 20-50ul de buffer TE dependiendo del tamao del pellet. Dejar rehidratar por 5 minutos a temperatura ambiente. Guardar las muestras a 20C hasta su utilizacin. 3. Extraccin mediante KIT: Existen diversos kit que permiten la extraccin de ADN de forma rpida y sistemtica, sin embargo, siguen una secuencia de pasos relativamente similar. A continuacin se presenta el protocolo del Kit Gentre de Puregene: Lisis de Glbulos Rojos. En caso de muestras de sangre, debe ser tratada previamente con una solucin de lisis de glbulos rojos (RBC Lysis Solution) durante 10 min, luego se centrifuga y se elimina sobrenadante.

Lisis del tejido. Se pone la muestra (clulas blancas, tejido fresco o tejido fijado e incluido en parafina) en un tubo y se adiciona una solucin de lisis celular (Cell Lysis Solution, kit Gentra Puregene). Digestin del tejido con proteinasa K. Adicionando proteinasa K (20 mg/ml), mezclar e incubar a 65C toda la noche. Precipitacin de protenas. Enfriar la muestra agregar solucin precipitadora (Protein Precipitation Solution, kit Gentra Puregene), mezclar y centrifugar Precipitacin del ADN. Agregar el sobrenadante con el ADN en suspensin a un tubo con isopropanol. Mezclar y dejar 2h a -70C. Recuperacin del ADN. Centrifugar a alta velocidad y se descartar el sobrenadante, el pequeo pellet de ADN queda en el fondo del tubo. Lavado del ADN. Agregar al pellet de ADN etanol al 70%, invertir el tubo varias veces para lavarlo y centrifugar. Secado del ADN. Descartar el sobrenadante sin perturbar el pellet. Invertir el tubo sobre papel limpio absorbente y dejar secar el pellet de ADN al ambiente. Rehidratacin del ADN. Agregar 20 a 100ul buffer TE 1X dependiendo del tamao del pellet. Rehidratar a 65C por 1h o a temperatura ambiente por toda la noche. Almacenaje de ADN. Guardar a 20C hasta su uso.
VI. APLICACIONES DE LA TECNICA DE PCR. 1. Deteccin de agentes infecciosos: La deteccin por PCR de agentes infecciosos, los cuales no son siempre patgenos intracelulares obligatorios, es posible a partir de muestras con clulas libres (suero, orina, sobrenadantes), o muestras con pequeas cantidades de material biolgico. El PCR es de gran utilidad para la deteccin de microorganismos de difcil cultivo como por ejemplo Mycobacterium tuberculosis, cuyo crecimiento puede demorar hasta 3 meses. Tambin se utiliza en casos en los cuales no existen mtodos de deteccin sensibles o especfica como el caso de los virus tales como Hepatitis B y C, Virus Papiloma Humano, Virus Herpes, entre otros. Tambin se pueden realizar diversos hongos y parsitos. Algunos ejemplos de microorganismos detectados por PCR son: VIRUS Citomegalovirus (CMV). Virus Epstein Barr (EBV). Virus Herpes Simplex (HSV) I y II. Virus Herpes Humano-6 (HHV-6). Virus Inmunodeficiencia Humana (VIH-1) Virus Papiloma Humano (HPV). Genotipos Bajo y Alto Riesgo CCU. Parvovirus B19. BACTERIAS Bacterias universales. Chlamydia trachomatis. Chlamydia pneumoniae. Legionella pneumophila Mycobacterium tuberculosis (TBC). Mycobacterium avium.
Sangre en EDTA, fluidos corporales*, Tejido fresco y/o en parafina Sangre en EDTA, Liquido Cefalorraquideo (LCR), Tejido fresco y/o en parafina Sangre en EDTA, LCR, Tejido fresco y/o en parafina Sangre en EDTA, LCR, Tejido fresco y/o en parafina Sangre en EDTA, LCR, semen, Tejido fresco y/o en parafina Liquido de citobrush, Liquido PAP, Tejido fresco y/o en parafina Sangre en EDTA, Tejido en fresco y/o en parafina
Fluidos corporales esteriles Secrecin ocular, Secrecin cervical, Orina Esputo, Lavado bronquiolo alveolar (LBA), Aspirado Nasofaringeo (ANF). Tejido fresco y/o en parafina
Sangre en EDTA, Esputo, Lavado bronquiolo alveolar, ANF
Esputo, Lquido Pleural (LP), ANF, LBA, LCR, Liquido Sinovial (LS), orina. Sangre en EDTA, Tejido en fresco y/o en parafina Esputo, LP, ANF, LBA, LCR, LS, orina. Sangre en EDTA, Tejido en fresco y/o en parafina

Mycobacterium spp. Micoplasma pneumoniae. Esputo, LP, ANF, LBA, LCR, LS, orina. Sangre en EDTA, Tejido en fresco y/o en parafina Esputo, LP, ANF, LBA, LCR. Sangre en EDTA, Tejido en fresco y/o en parafina
HONGOS Y PARASITOS Borrelia burgordoferi ( lyme disease). Hongos Universales. Pneumocystis jiroveci. (P.carinii, PCP) Toxoplasma gondii . Tripanosoma cruzi (Enf. Chagas)
Sangre en EDTA, LS, Liquido Cefalorraqudeo (LCR) Fluidos corporales esteriles, Sangre en EDTA. Tejido fresco y/o en parafina Esputo, LBA, ANF. Tejido fresco y/o en parafina Sangre en EDTA, LCR, Tejido fresco y/o en parafina Sangre en EDTA, Tejido fresco y/o en parafina
2. Diagnstico de Enfermedades Genticas: Enfermedades Hereditarias, Oncolgicas entre otras. Hoy en da, las pruebas ADN ms comunes son: Sndrome hereditario de cncer de mama y ovario (BRCA1, BRCA2) Sndrome de Lynch o Cncer de colon rectal hereditario no poliposo (HNPCC) Exceso de hierro o hemocromatosis Fibrosis cistica Anemia de clulas falciformes, Sndrome de Down Espina bfida
3. Investigacin forense: La ciencia forense en la actualidad utiliza de manera rutinaria el anlisis de ADN mediante PCR, solucionando por ejemplo, delitos seriamente complejos. En general esta tcnica se utiliza para relacionar perfiles genticos obtenidos de diferentes muestras. - Pruebas de Paternidad: la prueba idnea es la prueba gentica basndose en polimorfismo en regiones STR (Short Tandem Repeat, o tambin llamada SSR por Short Sequence Repeat). Esto se realiza comparando entre 13-19 locus del genoma del hijo, del presunto padre y opcionalmente de la madre, en regiones que son muy variables para cada individuo (STR). Con el uso de 15 marcadores se puede tener exactitudes de alrededor de 99,999%. Figura 9. Pruebas de paternidad
- Criminalstica: Se analizan patrones genticos, donde se relacionan los perfiles obtenidos en muestras de la victima, las pruebas y los sospechosos Ejemplo: las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantaln (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil gentico de la vctima (V) (Figura 10)
Figura 10. Anlisis criminalstico . Edificio de Anatoma 2 Piso. Barrio Universitario . Concepcin Fono: (41) 2203211 FAX: (41)2203702 labpatologiamolecular@gmail.com

ANEXOS
ANEXO 1. Ficha de solicitud de examen
LABORATORIO DE DIAGNOSTICO CLNICO MOLECULAR-UDEC Edificio Anatoma, 2 Piso, Campus Universitario V ctor Lamas s/n, Concepcin Fono: (41) 220 3211 FAX: (41) 220 3702 labpatologiamolecular@gmail.com Director: Dra. Sonia Montenegro
Solicitud de Examen de PCR

NOMBRE:....................................................................................................................... RUT:. N FICHA CLINICA EDAD:.
PROCEDENCIA.FECHA TOMA DE MUESTRA...... TIPO DE MUESTRA: Sangre c/EDTA.. LCR.. LBA.. Esputo.. Fluido ml:........ Tejido Fresco mg.: ....... 5 Tejido Parafina :... PAP Citobrush: Esptula:.. OTROS. OBSERVACIONES: ENSAYOS DE PCR NESTED BACTERIAS UNIVERSALES (GEN RIBOSOMAL) BORRELIA BURGORDOFERI ( LYME DISEASE) CITOMEGALOVIRUS (CMV) CHLAMYDIA TRACHOMATIS CHLAMYDIA PNEUMONIAE HONGOS UNIVERSALES (GEN RIBOSOMAL) LEGIONELLA PNEUMOPHILA MYCOBACTERIUM SPP. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (TBC) MYCOBACTERIUM AVIUM (MAI/MAC) MICOPLASMA PNEUMONIAE PARVOVIRUS B19 PNEUMOCYSTIS JIROVECI ( P.CARINII, PCP) TOXOPLASMA GONDII TRIPANOSOMA CRUZI VIRUS EPSTEIN BARR (EBV) VIRUS HERPES HUMANO-6 (HHV-6) VIRUS HERPES SIMPLEX (HSV) I Y II VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH-1) VIRUS PAPILOMA HUMANO (HPV) deteccin/tipificacin (LR/HR) OTROS FECHA ENVIO .......................... MEDICO SOLICITANTE
DIAGNOSTICO CLINICO:. N BIOPSIA : ..DIAGNOSTICO BIOPSIA FONO CONTACTO ................................ e-mail......................................................................

ANEXO 2. FICHA DE REGISTRO DE MUESTRAS
UNIVERSIDAD DE CONCEPCIN FACULTAD DE MEDICINA
LABORATORIO DE DIAGNOSTICO CLNICO MOLECULAR DIRECTOR DE LABORATORIO: DRA. SONIA MONTENEGRO AUTORIZACION SEREMI SALUD BIOBIO. RES. N0314 FONO: 041-220-3211 FAX 041-220-3702 EMAIL:labpatologiamolecular@gmail.com FICHA DE REGISTRO DE MUESTRA N Interno de Laboratorio: ... ANTECEDENTES PERSONALES NOMBRE:..RUT:.. EDAD N Ficha Clnica. Procedencia: .. Fecha Toma muestra: . Fecha/Hora de Recepcin ...... Medico solicitante Diagnostico Clnico.. Test Solicitado.
DATOS DE LA MUESTRA ORIGEN DE LA MUESTRA: CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA: .. VOLUMEN: .............. CONTENEDOR: .. INFORME DE BIOPSIA... ....... Medico Patlogo: MUESTRA ACEPTABLE: S NO Si es NO, indicar motivos del rechazo de la muestra. PROCESAMIENTO MUESTRA Fecha Procesamiento de Muestra: TRATAMIENTO PREVIO: .... METODO EXTRACCION DNA: Amplificabilidad de DNA: SI NO METODO UTILIZADO: PCR B- Globina 110 pb METODO: Espectrofotmetro NO Extraccin Aceptable: SI Concentracin DNA ng/ul:. Ratio OD260/280:. Vol. de suspensin DNA:
Si es NO, mtodo correctivo....... . . EXTRACCION REALIZADA POR: ...... RESULTADO PCR: FECHA INFORME O COMUNICACIN. REALIZADO POR ........... FECHA
REVISADO POR FECHA

ANEXO 4. FICHA CONTROL DE CALIDAD DE PCR PARA DIAGNOSTICO DE TBC

ANEXO 5. FICHA CONTROL DE CALIDAD DE PCR PARA DIAGNOSTICO DE HSV

ANEXO 6. INFORME RESULTADO DE PCR PARA DIAGNOSTICO DE TBC

ANEXO 7. INFORME RESULTADO DE PCR PARA DIAGNOSTICO DE HSV

GLOSARIO DE TRMINOS CIDO RIBONUCLEICO: (ARN o RNA) es un cido nucleico formado por una cadena de ribonucletidos. El ARN celular es lineal y de hebra sencilla y es la molcula que dirige las etapas intermedias de la sntesis proteica; el ADN se vale del ARN para transferir esta informacin durante la sntesis de protenas . Varios tipos de ARN regulan la expresin gnica, mientras que otros tienen actividad cataltica. El ARN esmucho ms verstil que el ADN. Est presente tanto en las clulas procariotas como en las eucariotas, y es el nico material gentico de ciertos virus ARN, en el genoma de algunos virus es de doble hebra. AMPLIFICACION GENICA: Es el aumento en el nmero de copias de un fragmento de ADN . Una clula tumoral amplifica o copia segmentos de ADN en forma aberrante, como resultado de las seales celulares o por daos causados por efectos ambientales. La reaccion en cadena de la polimerasa es un tipo de amplificacion genica. EPIGENOMICA. Cambios en la regulacion de la expresion de la actividad de genes que no alteran su estructura genetica. ESTUDIO DE ASOCIACION DE GENOMA AMPLIO.Enfoque utilizado en investigaciones geneticas que buscan asociaciones entre muchos( generalmente cientos de miles) variaciones geneticas especificas ( SNPs) y enfermedades en particular. EXPRESIN GNICA es el proceso mediante el cual los organismos procariotes y eucariotes transforman la informacin codificada en los cidos nucledos en las protenas necesarias para su desarrollo y funcionamiento. Un grupo de genes se expresan en todas las clulas del organismo ya que codifican protenas esenciales para el funcionamiento de estas y se denominan "housekeeping genes". El resto de los genes se expresan o no en los diferentes tipos de clulas, dependiendo de la funcin de la clula en un tejido particular. Por ejemplo, genes que codifican protenas responsables del transporte axonal se expresan en neuronas pero no en linfocitos en donde se expresan genes responsables de la respuesta inmune. Tambin existe especificidad temporal, esto quiere decir que los diferentes genes en una clula se activan o silencian en diferentes momentos. La regulacin de los genes vara segn su funcion. GENOMA: Es la secuencia de ADN contenida en 23 pares de cromosomas en el ncleo de cada clula humana diploide.. GENOMA DE CANCER. Es el set completo de DNA unico que produce un cancer especifico. GEN KNOCK-DOWN. Tecnica mediante la cual la expresion de uno o mas genes de un organismo es reducida mediante tratamiento con una secuencia especifica de RNA dirigida a un gen especifico. HIBRIDACIN Tcnica de biologa molecular usadas para estudiar el ADN y el ARN aprovechando las caractersticas de complementariedad los nucletidos. Empleando fragmentos de ADN o sondas de cadena sencilla marcada con una molcula reportera, se puede identificar el par complementario en una mezcla compleja de material gentico. HIBRIDACIN IN SITU Tcnica que identifica la presencia de una secuencia de ADN o ARN o la expresin de una protena en una clula determinada de un tejido. Se marca una sonda con una molecula reportera fluorescente que permite detectar la molcula de inters en las celula y visualizada en un microscopio. Permite observar el sitio en particular en la clula donde se localiza esta secuencia o se expresa esa protena de inters.

HIBRIDIZACIN IN SITU FLUORESCENTE (FISH) Un proceso que detecta a los cromosomas o porciones de ellos, con molculas fluorescentes. Esta tcnica es til para identificar anomalas cromosmicas y elaborar mapas gnicos y genticos. INTRON: Son porciones de DNA genmico que son transcritas pero que luego son removidas ( splicing), por lo que no se hallan en mRNA final. MARCADOR GENTICO: Segmento de DNA que puede ser localizado fsicamente en el cromosoma y cuya herencia puede ser rastreada. Un marcador puede ser un gen o puede ser un trozo de DNA cuya funcin se desconoce. Debido a que los segmentos de ADN cuyas secuencias son contiguas tienden a ser heredadas juntas, los marcadores son usados con frecuencia indirectamente para rastrear el patrn de herencia de un gen que aun no ha sido identificado pero cuya localizacin fsica aproximada es conocida mRNA: RNA mensajero , es el RNA que sirve de plantilla para la sntesis de protenas. Cada set de 3 bases, que son los codones, especifica la secuencia de aminocidos que comprende una protena que va a ser sintetizada. La secuencia del mRNA depende de la secuencia de una cadena complementaria de ADN. microRNA. Una forma corta reguladora del RNA que se une a un RNA blanco y generalmnete suprime su traslacion por los ribosomas. MUTACION INACTIVANTE. Un cambio en la secuencia de DNA de un gen especifico que resulta en perdida de la funcion biologica ONCOGEN: Gen presente en una clula cancerosa o un virus de tumor que cuando es transferido a otras clulas, es capaz de causar transformacin en stas, aunque no todas las clulas son susceptibles de transformacin por oncogenes. Los oncogenes funcionales no estn presentes en clulas normales, sino que estn presentes muchos proto-oncogenes que tienen funciones normales pero que puede convertirse en oncogenes bajo determinadas condiciones. PROMOTOR: Promotor es la parte de la molcula de ADN que tiene la informacin que determina que el gen se active o desactive. Como un interruptor necesario para que el ADN se convierta en ARN. Todos los genes tienen varias partes y el promotor es la parte que est antes de la regin que codifica para la protena.El proceso de transcripcin se inicia en el promotor. PROYECTO GENOMA HUMANO: El genoma haploide humano tiene una longitud aproximada de 2900 millones de pares de bases de ADN (2900 Mb) que contienen unos 27.000 genes. Este proyecto produjo una secuencia de referencia del genoma humano eucromtico, usado en todo el mundo en las ciencias biomdicas. La secuencia de ADN que conforma el genoma humano contiene codificada la informacin necesaria para la expresin, coordinada y adaptable al ambiente, del proteoma humano (conjunto de protenas). Las protenas, y no el ADN, son las principales biomolculas efectoras; poseen funciones estructurales, enzimticas, metablicas, reguladoras, sealizadoras, organizndose en enormes redes funcionales de interacciones. El proteoma fundamenta la particular morfologa y funcionalidad de cada clula, la organizacin estructural y funcional de las distintas clulas que conforman cada tejido y cada rgano y finalmente, el organismo vivo en su conjunto. As, el genoma humano contiene la informacin bsica necesaria para el desarrollo fsico de un ser humano completo. El genoma humano presenta una densidad de genes muy inferior a la que inicialmente se pensaba, con slo alrededor del 1,5% de su longitud compuesta por exones codificantes de protenas. Un 70% est compuesto por ADN extragnico y un 30 % por secuencias relacionadas con genes. Del total de ADN extragnico, aproximadamente un 70% corresponde a repeticiones dispersas, de manera que, ms o menos, la mitad del genoma humano corresponde a secuencias repetitivas de ADN. Por su parte, del total de ADN relacionado con genes se estima que el 95% corresponde a ADN no codificante: pseudogenes, fragmentos de genes, intrones y secuencias UTR. . Edificio de Anatoma 2 Piso. Barrio Universitario . Concepcin Fono: (41) 2203211 FAX: (41)2203702 labpatologiamolecular@gmail.com

PERFIL (DE EXPRESION GENICA) BASADO EN MICROARRAY : Uso de signaturesde expresion genica obtenidas de muestras de cancer para definir algunos aspectos del resultado (outcome)por ej tasas de recurrencia y respuesta a tratamiento. SECUENCIAMIENTO PROFUNDO: Secuenciamiento genetico de suficiente cobertura capaz de identificar mutaciones de baja frecuencia. SECUENCIAMIENTO DE PROXIMA GENERACION: Secuenciamiento tecnologia de miniaturizacion que permiten secuenciar simultaneamente multiples areas del genoma en forma rapida y a bajo costo. siRNA ( small interfering RNA): Molecula de RNA corta y reguladora de doble hebra que se une e induce la degradacion de ciertas moleculas blanco de RNA. SNPs (POLIMORFISMO DE UN SOLO NUCLEOTIDO) La mayora de las variaciones genticas en los humanos son de este tipo. Hay aproximadamente 10 millones de estos polimorfismos comunes en la especie humana. Su deteccion es una importante herramienta que permite rastrear la herencia en familias, algunos de los SNPs son funcionalmente importantes y un grupo de ellos juega un papel en la susceptibilidad a enfermedades. SONDA GENTICA: Oligonucleotido (cido nucleico de una hebra) que puede emplearse para identificar una secuencia complementara mediante la formacin de enlaces de hidrogeno entre ambas. Se emplean en ciertas tcnicas de laboratorio para detectar genes o protenas y estudiar sus funciones. tRNA: Molculas de RNA que se unen a aminocidos especficos y actan como molculas adaptadoras en la sntesis de protenas. Los anticodones de tRNA se unen a codones de mRNA complementario TRANSCRIPCION:Sntesis de RNA transcrito a partir de DNA. Primer paso en la expresin de un gen . El RNA resultante, si codifica para una protena, es escindido (splicing), poliadenilado, transportado al citoplasma y luego mediante el proceso de traduccin se produce la molcula proteica. TRANSCRIPTOMICA: Estudio del transcriptoma, set de todas las moleculas de RNA en una poblacion dada de celulas; el analisis de la expresion del mRNA es generalmente realizado mediante el uso de plataforma de microarrays de DNA.

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Figura 2: Amplificacin exponencial de un segmento de DNA.

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Figura 3: Esquema de la migracin de los fragmentos de DNA en gel de agarosa

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Figura 5. Esquema del Nested PCR

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Figura 7. Esquema de la deteccin por Sybr Green

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DIAGNOSTICO CLINICO:. N BIOPSIA : ..DIAGNOSTICO BIOPSIA FONO CONTACTO ................................ e-mail......................................................................

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