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BiotechnologieBiotechnologie etet biosécuritébiosécurité

OGM et Biosécurité

Cours-Conférences

Dr. Nazaire KOUASSI, LCB / CNRA

UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Biosécurité

ChapitreChapitre 33

EtatEtat desdes lieuxlieux desdes OGMOGM

EtEt MéthodesMéthodes dede détectiondétection

Dr. Nazaire KOUASSI

Maître de Recherche CNRA - Côte d Ivoire

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www.uemoa.int

www.izf.net

PlanPlan

Etat des lieux des OGM

Surfaces emblavées et les pays producteurs les espèces cultivées

Détection des OGM

Méthodes sérologiques Méthodes moléculaire (ADN/ARN)

Avantages et risques potentiels des OGM

Avantages potentiels Risques potentiels

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TauxTaux d’adoptiond’adoption desdes culturescultures OGMOGM // culturescultures conventionnellesconventionnelles
TauxTaux d’adoptiond’adoption desdes culturescultures OGMOGM // culturescultures
conventionnellesconventionnelles (Millions(Millions d’hectares)d’hectares) enen 20082008
SojaSoja
CotonCoton
MaïsMaïs
ColzaColza

Quelques exemples de plantes transgéniques obtenues

CultureCulture

CaractèreCaractère d’intérêtd’intérêt

InstitutionsInstitutions

EtatEtat actuelactuel

Café

Floraison synchrone

CENICAFE (Colombie)

Essais

Café

Résistant aux insectes

CENICAFE (Colombie)

Essais

Coton

Résistant aux insectes

Monsanto

Commerce

Coton

Résistant aux herbicides

Monsanto

Commerce

Papayer

Résistant / maladie virale

Université de Hawaii

Commerce

Soja

Résistant à un herbicide

Monsanto

Commerce

Riz

Fort taux de Vitamine A

IRRI, Institut Suisse

existe

Manioc

Faible contenu en cyanure

Ohio State University

Laboratoire

Manioc

Résistant à l’ACMV

Danforth ; IPS / IITA

Essais

Maïs

Résistant à un herbicide

Monsanto

Commerce

Maïs

résistant aux insectes

Mosanto

Commerce

Arachide

Sans aflatoxine

Texas A&M University

Essais

Banane

Mûrissement retardé

Syngenta

Laboratoire

MéthodesMéthodes dede détectiondétection desdes OGMOGM

-- MéthodesMéthodes sérologiquessérologiques

TestTest ELISA,ELISA, TestTest dd ImmunodiffusionImmunodiffusion TestTest parpar BandelettesBandelettes

-- MéthodesMéthodes baséesbasées sursur ll ADNADN PCRPCR etet RTRT--PCRPCR RealReal TimeTime PCRPCR ((SyBERSyBER Green,Green, TaqManTaqMan))

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MéthodesMéthodes dede détectiondétection desdes OGMOGM

-- MéthodesMéthodes sérologiquessérologiques

TestTest ELISA,ELISA, TestTest dd ImmunodiffusionImmunodiffusion TestTest parpar BandelettesBandelettes

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Comment procéder Echantillonnage

Quelque soit ce que nous voulons détecter, il faut réaliser un bon échantillonnage (validité des résultats)

L échantillon doit donc être prélevé de manière qu'il

soit statistiquement représentatif de la quantité total

des

Il doit par exemple comporter un minimum de 3000 graines selon la méthode de travail l'ISTA (International Seed Testing Agency), il doit être homogène.

Le sous-échantillon de l'ensemble de l'échantillon devrait également être déterminés correctement (échantillon de travail) .

raines

.

g

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Détection des OGM : caractérisation phénotypique

La caractérisation phénotypique peut être utilisée pour déterminer l'absence ou la présence d'un caractère particulier.

Cette approche peut être utilisée pour tester la présence ou l'absence de résistance aux herbicides.

Cet examen comprend la germination des semences en présence de l'herbicide d'intérêt (en général, on utilise 400 graines)

Les contrôles, composés de semences avec ou sans le trait recherché doivent être inclus dans tous les échantillons testés.

Ces essais de résistance à l herbicide sont considérés comme précis et peu coûteux.

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Détection de la protéine exprimée

Il est possible de détecter la présence des protéines résultant de l'introduction d'ADN étranger par des techniques immunologiques (ELISA, Bandelettes, IMD)

Cette technique présente l'avantage de quantifier des OGM (protéine exprimée)

Cependant une transformation simple (chauffage, triturage) détruit souvent les propriétés antigéniques de la protéine exprimée dans la plante transgénique.

Par ailleurs, la localisation de la protéine dans un organe spécifique peut également rendre difficile l'utilisation d'une telle technique.

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TestTest ELISAELISA :: SérologieSérologie
TestTest ELISAELISA :: SérologieSérologie

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Dépistage des agents pathogènes Les étapes du test DAS-ELISA

1. Le "coating" ou dépôt d anticorps de capture

Les puits d une plaque ELISA sont tapissés avec un

anticorps de capture capable de se lier spécifiquement à

l antigène recherché présent dans le broyats des feuilles

ou autres tissus. L anticorps de capture se fixe aux parois

des puits par adsorption après une incubation de 2h à 37°C ou 4°C toute la nuit.

Lavage des puits pour éliminer les anticorps non fixés,

2. Blocage des sites non occupés (optionnel)

Les puits sont remplis d une solution de PBSt contenant 3% de lait écrémé ou du 1% BSA (Bovin Sérum Albumine). La plaque ELISA est mise incuber à 37°C / 1 heure.

Dépistage et élimination des parasites

Les étapes du test DAS-ELISA

3. Le dépôt d antigènes

Les organes à tester sont broyés dans le tampon PBSt puis clarifiés par centrifugation. Le SN est déposé

dans les puits de la plaque. Si l'antigène recherché est présent, il va se lier spécifiquement à l anticorps de

b

3

°C

d

h eure.

capture après une incubation à 37 C pendant 1

Lavage des puits pour éliminer les antigènes non fixés

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LES ETAPES DU TEST ELISA

LES ETAPES DU TEST ELISA

Dépistage et élimination des parasites

Les étapes du test DAS-ELISA

4. Le dépôt du deuxième anticorps

Un deuxième anticorps (anticorps conjugué AP*)

capable de se lier à l'antigène de capture est ajouté dans les puits. Après une incubation de 2 h à 37°C ou une nuit à 4°C.

Les anticorps conjugués non fixés sur l antigène sont éliminés par rinçage.

5. Dépôt du substrat

En présence de son substrat (p-NPP) la phosphatase

alcaline catalyse une réaction qui aboutit à la formation d'un produit coloré dont l intensité sera proportionnelle à la concentration de la protéine recherchée dans le broyat.

LES ETAPES DU TEST ELISA

LES ETAPES DU TEST ELISA

Dépistage et élimination des parasites

Les étapes du test DAS-ELISA

6. lecture de la densité optique ou absorbance La réaction sera quantifiée par spectrophotométrie à partir d'une lecture des densités optiques à une longueur d onde de 405 nm de chaque puits à l aide d un lecteur de plaque ELISA.

chaque puits à l aide d un lecteur de plaque ELISA. Lecteur ELISA ( exPrimary EIA)

Lecteur ELISA (exPrimary EIA)

un lecteur de plaque ELISA. Lecteur ELISA ( exPrimary EIA) Plaque de microtitration - ELISA Un

Plaque de microtitration - ELISA

Un échantillon est déclaré positif si sa D.O SP ±10%. Un échantillon est déclaré positif
Un échantillon est déclaré positif si sa D.O SP ±10%.
Un échantillon est déclaré positif si sa D.O SP ±10%.
Le Seuil de Positivité (SP) = 2 x Moy. des témoins négatifs
Le Seuil de Positivité (SP) = 2 x Moy. des témoins négatifs

Test de détection rapide des OGM

Test de détection rapide des OGM
TestTest dede BandelettesBandelettes
TestTest dede BandelettesBandelettes

Les bandelettes de détection rapide : kit rapide Flashkit

Kits rapides Flashkits® (systèmes sérologiques vendu dans le commerce) (Envirologix)

Il s agit de bandelettes de papier-filtre tout comme celles utilisées dans les tests de grossesse.

Ces bandelettes préalablement imprégnées d anticorps spécifiques

Par capillarité, l extrait de plante monte le long du papier-filtre et rencontre les anticorps dirigés contre la protéine recherchée.

les anticorps dirigés contre la protéine recherchée. La présence d une seule ligne indique le bon

La présence d une seule ligne indique le bon fonctionnement de la manipulation atteste de

l absence de la protéine recherchée.

22

MéthodesMéthodes dede détectiondétection desdes OGMOGM

-- MéthodesMéthodes baséesbasées sursur ll ADNADN

PCRPCR etet RTRT--PCRPCR RealReal TimeTime PCRPCR ((SyBERSyBER Green,Green, TaqManTaqMan))

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Pourquoi détecter / identifier

Les acteurs impliqués dans le développement, l utilisation et la régulation des OGM doivent vérifier la présence de l OGM (détection, identification) et le quantifier dans la

Semences ou la production à des fins de traçabilité

Dans les variétés ou espèces compatibles (surveillance du flux de gènes)

Détecter (cribler des semences pour détecter des OGM) Identifier (type d OGM et les gènes impliqués) Quantifier (déterminer la quantité de chaque OGM)

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Que pouvons nous détecter dans un OGM

••

lele promoteurpromoteur quiqui estest lele régulateurrégulateur dede l'activitél'activité desdes gènesgènes

••

lele terminateurterminateur quiqui estest lele signalsignal dede terminaisonterminaison

••

lele gènegène marqueurmarqueur dede sélectionsélection desdes cellulescellules transforméestransformées

••

lele gènegène dd intérêtintérêt introduit,introduit, supprimésupprimé ouou modifiémodifié

••

lele gènegène inséréinséré (ADN)(ADN) ouou ll ARNmARNm issueissue dede lala transcriptiontranscription dede cece gènegène

dede lala transcriptiontranscription dede cece gènegène Plasmide Vecteur + Promoteur + GI + NosT = Cassette
dede lala transcriptiontranscription dede cece gènegène Plasmide Vecteur + Promoteur + GI + NosT = Cassette
dede lala transcriptiontranscription dede cece gènegène Plasmide Vecteur + Promoteur + GI + NosT = Cassette
dede lala transcriptiontranscription dede cece gènegène Plasmide Vecteur + Promoteur + GI + NosT = Cassette
dede lala transcriptiontranscription dede cece gènegène Plasmide Vecteur + Promoteur + GI + NosT = Cassette

Plasmide Vecteur + Promoteur + GI + NosT = Cassette

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ÉÉtapestapes dudu ddééroulementroulement dede lala PCRPCR

••

LaLa dénaturationdénaturation est réalisée à environ 95°C, pour une dissociation complète des deux brins d ADN. Cette étape dure généralement 0,5 à 1 minute et permet de déshybrider les brins ADN, de « décrocher » les polymérases qui seraient encore liées à une matrice et d homogénéiser le milieu réactionnel.

L hybridation ou annealing se fait à une température qui sera définie selon la nature des amorces (cette température varie de 55 à 65°C). Cette étape dure généralement 5 à 60 secondes et permet aux amorces sens (F) et anti-sens (R) de s hybrider aux ADN

Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C) où A, T, G et C sont respectivement le nombre de chacune de ces bases dans l amorce.

Calculer les Tm des amorces suivants et leur température

D hybridation: F = ATG CGC GAA ACA AGC TTC TTA TC

 

R

= ACT TTC TCA TGG ATG CTT CTC

Tm =

2 (?)

+

4 (?) =

??

ÉÉtapestapes dudu ddééroulementroulement dede lala PCRPCR

••

LaLa polymérisationpolymérisation est réalisée à environ 72°C, température

àà

••

permettant l activité optimale de l ADN polymérase thermorésistant qui entre en action. La durée de cette étape dépend normalement de la longueur du fragment à amplifier elle dure généralement 30 à 120 secondes.A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'ADN double brin. RéparationRéparation desdes boutsbouts (extension(extension final)final) :: 55 1010 minmin

7272°°CC

••

LeLe nombrenombre dede cyclecycle

on peut espérer obtenir avec 30 à 40 cycles, En effet, à chaque cycle de la PCR, les quantités d oligonucléotides amorces et de dNTP diminuent ainsi que l enzyme (inactivité)

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EtapeEtape dede dénaturationdénaturation -- HybridationHybridation

EtapeEtape dede dénaturationdénaturation -- HybridationHybridation 28
EtapeEtape dede dénaturationdénaturation -- HybridationHybridation 28

Animation vidéo PCR

Voir l animation PCR

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PCR (Polymerase Chain Reaction)

amorce

0 cycle 1 cycle 2
0
cycle 1
cycle 2

2 n

(n = nombre de cycles)

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Machines PCR

Machines PCR UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Biosécurité

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MISEMISE ENEN PRATIQUEPRATIQUE DEDE LL’ELECTROPHORESE’ELECTROPHORESE SURSUR GELGEL D’AGAROSED’AGAROSE

1. Coulage du gel.

SURSUR GELGEL D’AGAROSED’AGAROSE 1. Coulage du gel . Agarose (%) .Taille (Pb) Agarose (%) .Taille (Pb)
Agarose (%) .Taille (Pb) Agarose (%) .Taille (Pb) 0,75% 0,75% - - 10 000 -15
Agarose (%) .Taille (Pb)
Agarose (%) .Taille (Pb)
0,75%
0,75%
-
-
10 000 -15 000 pb
10 000 -15 000 pb
1%
1%
-
-
500-10 000 kb
500-10 000 kb
1,25%
1,25%
-
-
300-5000 pb
300-5000 pb
1,5%
1,5%
-
-
200-4000 pb
200-4000 pb
2%
2%
-
-
100-2500 pb
100-2500 pb
2,5%
2,5%
-
-
50-1000 pb
50-1000 pb

2. Chargement du gel avec les échantillons 3. Migration des fragments

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Transluminateur

Transluminateur

Révélation des produits d’amplification

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
45 46 47 48

Électrophorèse sur gel d’agarose

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Les limites de la méthode PCR

L ADN est supposé résistant à certains traitements chimiques ou thermiques,

Cependant la détection de la présence d OGM dans les produits alimentaires transformés (exemple : purée de tomates, huile) est hypothétique.

E

n e

ff

et,

d

l

ans ce cas, a pro

b

a

bili é d

t

e trouver

d

e

l ADN

transgénique est infime (dégradation partielle)

Un autre problème que l on peu rencontrer est la définition d un seuil minimal de détection.

En effet, la méthode de PCR est très sensible et l on peut déceler d infimes traces d OGM (selon la maîtrise des opérateurs).

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ChromatogrammeChromatogramme // séquençageséquençage

ChromatogrammeChromatogramme // séquençageséquençage 36 UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et

36

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Séquenceur automatique

Séquenceur automatique

LaLa PCRPCR enen tempstemps réelréel ouou QQ--PCRPCR

LaLa PCRPCR enen tempstemps réelréel (Real-time PCR) est une technique qui

consiste à mesurer la quantité d ADN polymérisé à chaque cycle grâce à un marqueur fluorescent (2 méthodes : CYBERGreen et TaqMan PCR)

Elle permet par son principe de faire des mesures quantitatives mais elle nécessite des thermocycleurs particuliers.

Le nom le plus communément utilisé est la Q-PCR ou Q-RT-PCR pour PCR Quantitative (ADN) ou RT-PCR Quantitative (ARN)

Comme pour la PCR, la Q-PCR (ex.TaqMan PCR) utilise en plus des deux amorces (sens et antisens) une amorce interne (sonde)

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PCR quantitative avec une sonde TaqMan®

Cette méthode repose sur deux principes :

- la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) - l activité 5 -exonucléase de la Taq Pol

 

FAM, VIC

TAMRA

 

Reporter

Quencher

 

FP

  FP  
 
  FP  

3’

3’ 5’

5’

5’

3’

  FP   3’ 5’ 5’ 3’ RP - Spécificité l’amorce pour la PCR - Spécificité

RP

- Spécificité l’amorce pour la PCR - Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

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LaLa PCRPCR enen tempstemps réelréel :: PrincipePrincipe

LaLa PCRPCR enen tempstemps réelréel :: PrincipePrincipe LorsqueLorsque lala polymérisationpolymérisation estest

LorsqueLorsque lala polymérisationpolymérisation estest terminée,terminée, pourpour chaquechaque moléculemolécule d’ADNd’ADN synthétisée,synthétisée, unun reporteurreporteur émetémet uneune fluorescence.fluorescence.

41

LALA PCRPCR ENEN TEMPSTEMPS REELREEL

PCRPCR enen tempstemps réelréel versusversus PCRPCR enen pointpoint finalfinal

réelréel versusversus PCRPCR enen pointpoint finalfinal UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et

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Réaction TaqMan RT-PCR

dilution A 1 10 -1 10 -2 10 - 3 10 - 4 LD 4,5
dilution A
1
10 -1
10 -2
10 - 3
10 - 4
LD 4,5 pg

dilution de l’ARN (dilution limite) en TaqMan RT-PCR Ech. A (30ng/µl) (RNA qty=[S] ng/µl x dilution x1.5 µl) = LD (limite détectable)

PCR en temps réel

PCR en temps réel 1 . O n e S t e p R e a

1. OneStep Real Time PCR

O n e S t e p R e a l T i m e P

2. Machine QPCR (TaqMan)

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AvantagesAvantages potentielspotentiels desdes OGMOGM etet RisquesRisques PotentielsPotentiels pourpour lala santésanté etet l’environnementl’environnement

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AvantagesAvantages potentielspotentiels dede lala biotechnologiebiotechnologie pourpour lesles agriculteursagriculteurs

Moins de pesticides Amélioration des récoltes grâce aux OGM Utilisation efficiente des terres disponibles Amélioration de la valeur nutritionnelle Santé : Diagnostic et traitements des maladies Élaboration de vaccins & Nutrition animale

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AvantageAvantage potentielspotentiels desdes OGMOGM

La biotechnologie agricole améliore les plantes cultivées en fournissant et permettant une protection intégrée contre les maladies et les insectes.

Elle permet d induire la tolérance aux herbicides, et permet de produire beaucoup aliments de qualités certaines et ceci de façon durable.

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AvantageAvantage potentielspotentiels desdes OGMOGM

1. Moins de pesticides

LaLa luttelutte contrecontre lesles insectesinsectes quiqui ravagentravagent lesles culturescultures permetpermet dede sécurisersécuriser lesles récoltes,récoltes, cece quiqui estest depuisdepuis toujourstoujours uneune prioritépriorité dede l'agriculture.l'agriculture.

LaLa créationcréation dede plantesplantes OGMOGM résistantesrésistantes auxaux insectesinsectes aa pourpour butbut dede supprimersupprimer enen partiepartie lele recoursrecours auxaux pesticidespesticides chimiques.chimiques.

Dans les meilleurs cas, l'utilisation de plantes OGM

a permis

de pesticides

de consommer de trois à cinq fois moins

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2.2. BénéficesBénéfices économiqueséconomiques etet socialsocial

économiqueséconomiques etet socialsocial Réduction des pertes dues aux maladies et ravageurs

Réduction des pertes dues aux maladies et ravageurs (virus, bactéries, champignons, insectes, etc.)

Réduction de la pénibilité et de la rentabilité du travail (60 km de marche avec un poids de 40 kg pour pulvériser un ha de coton avec les pesticides ( si l on économie de 3 4 pulvérisations)

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3. Amélioration du rendement

3. Amélioration du rendement Coton : variété locale sans pulvérisation. Rdt: 735 kg/ha Coton Bt sans

Coton : variété locale sans pulvérisation. Rdt: 735 kg/ha

Coton : variété locale sans pulvérisation. Rdt: 735 kg/ha Coton Bt sans pulvérisation. Rdt: 1102 kg/ha

Coton Bt sans pulvérisation. Rdt: 1102 kg/ha

CotonCoton BtBt enen essaisessais àà FadaFada N’GourmaN’Gourma (Burkina(Burkina Faso)Faso)

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4. Amélioration de la valeur nutritive

Acides gras, vitamines, sucre, etc.

La plante de colza génétiquement modifiée pour augmenter la valeur nutritive de l huile (+ acide oléique, - acide linoléique) est commercialisées.

Des modifications de la valeur nutritive ont lieux chez

le soja (acide ras) et maïs ( rotéine) et le riz (provitamine A et Fer)

g

p

Le Sorgho biofortifié en Afrique = ABS (teneur en vitamine A et E, fer, lysine, Zinc)

Manioc biofortifié (B6)

Le riz doré (Golden rice, riche en vitamine A) Le gène inséré = Beta-carotène (provitamine A)

AvantagesAvantages potentielspotentiels :

5. Utilisation efficiente des terres disponibles

Grâce à la biotechnologie, les variétés de cultures peuvent être améliorées pour produire plus de nourriture dans les zones auparavant non propices aux cultures.

Réduction de la pression foncières sur les autres régions du monde, tels que les forêts tropicales, qui sont actuellement surexploitées. On peut faire une exploitation à la carte (en fonction des stress biotiques ou abiotiques)

6. Santé : Le consommateur souhaite désormais que

l

aliment contribue à améliorer sa santé ou à prévenir

l

apparition de maladies.

Risques potentiels des OGM

Les OGM ne sont autorisés qu après des séries d évaluations scientifiques rigoureuses et complètes,

Cependant la production à grande échelle des OGM suscite de multiples interrogations sur la santé publique et sur l environnement.

Risques toxicologiques et allergiques

Risque de résistance aux antibiotiques

Risques pour l environnement : Flux de gènes

Résistance des insectes

Impact sur des insectes utiles "non ciblés "

Modification des pratiques culturales

Réduction de la biodiversité

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