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Ann Toxicol Anal. 2009; 21(1): 49-53 c Socit Franaise de Toxicologie Analytique 2009 DOI: 10.

1051/ata/2009024

Disponible en ligne www.ata-journal.org

Article court Immunochimie : quelle place en 2008 ?


Immunochemistry in 2008
Jean-Pierre Goull1 , 2 , lodie Saussereau1 , Michel Guerbet2 , Christian Lacroix1
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Laboratoire de pharmacocintique et de toxicologie Cliniques, Groupe Hospitalier du Havre, BP 24, 76083 Le Havre Cedex, France Laboratoire de Toxicologie, Facult de Mdecine et de Pharmacie, 22 boulevard Gambetta, 76183 Rouen Cedex, France
Rsum Au cours des deux dernires dcennies, des avances dterminantes ont t ralises dans le domaine de

lanalyse toxicologique. Le dtecteur de masse simpose dsormais comme loutil universel, coupl un chromatographe en phase gazeuse, un chromatographe en phase liquide ou un spectromtre plasma induit. Dans un tel environnement, on pourrait penser que limmunochimie na plus sa place. Il nen est rien, limmunoanalyse savre tre un moyen de dpistage utile dans les dirents domaines de la toxicologie, clinique, judiciaire ( lexception de la recherche de soumission chimique), professionnelle, environnementale. Il sagit dune mthode rapide, simple et qui permet le traitement de grandes sries dchantillons pour un cot rduit. Quelle soit utilise comme moyen de dpistage sur le terrain ou comme mthode de criblage en laboratoire, deux pr-requis simposent : labsence de faux ngatif et la conrmation de tout rsultat positif par une mthode chromatographique sparative couple la spectromtrie de masse.
Mots cls : Immunochimie, toxicologie clinique, toxicologie judiciaire Abstract Over the past two decades great progress has been made in analytical toxicology. The development of mass spectrometry as a new technology for gas chromatography, liquid chromatography or induced coupled plasma spectrometry is a major advancement in the eld of toxicology. Despite this major progress, immunochemistry still remains up to date. Immunoassays are useful screening techniques and have been successfully applied to various elds of toxicology, i.e. clinical toxicology, forensic toxicology (except for drug facilitated crimes), workplace testing toxicology, and environmental toxicology. Immunoanalysis is quite easy to perform, economic and a highly eective method, especially when numerous samples have to be tested. Used as on-site testing or as a laboratory screening technique, it is mandatory to obtain no false negative results and each positive result must be conrmed by a coupled chromatographymass spectrometry technique. Key words: Immunochemistry, clinical toxicology, forensic toxicology

Reu le 17 novembre 2008, accept aprs modications le 9 mars 2009 Publication en ligne le 19 avril 2009

1 Introduction
Au cours des deux dernires dcennies, des avances dterminantes ont t ralises dans le domaine de lanalyse toxicologique. Les mthodes chromatographiques ont remplac les ractions colorimtriques peu spciques et peu sensibles. Le dtecteur de masse simpose dsormais comme loutil universel du toxicologue analyste, coupl un chromatographe en phase gazeuse (GC-MS ou GC-MS/MS), un chromatographe
Correspondance : Jean-Pierre Goull, Tl. 02 32 73 32 23, Fax. 02 32 73 32 38, jgoulle@ch-havre.fr

en phase liquide (LC-MS/MS), ou un spectromtre plasma induit (ICP-MS). Dans ce contexte de haute technologie, la recherche de performances analytiques amliores, on pourrait penser que limmunochimie na plus sa place. Il nen est rien, bien au contraire. Les techniques immunochimiques savrent trs utiles dans les dirents domaines de lanalyse toxicologique : toxicologie clinique, toxicologie judiciaire, toxicologie professionnelle, toxicologie environnementale. En eet, le dlai de mise en uvre des mthodes chromatographiques nest pas toujours compatible avec la prise en charge optimale dune urgence dans une intoxication mdicamenteuse par exemple.

Article publi par EDP Sciences

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Lanalyse dun grand nombre dchantillons, dans le cadre du dpistage des stupants au bord de la route ou en sant au travail ncessite la mise en uvre de tests rapides, faciles utiliser sur le terrain. Dans ces deux derniers cas, limmunoanalyse savre tre un complment indispensable et non un concurrent de lanalyse chromatographique, permettant de limiter le nombre dexamens de conrmation. Dans le domaine judiciaire, si lintrt de limmunochimie nest plus dmontrer, son usage impose toujours la conrmation par une mthode sparative et spcique. Ceci explique quen 2008, les techniques immunologiques occupent une place de choix dans le secteur de lindustrie du diagnostic. Les possibilits de dveloppement sont importantes dans un march en pleine expansion et face aux nombreux besoins quil sagisse de tests rapides de terrain ou danalyses en laboratoire.

Lagence ralise galement des oprations dvaluation et de contrle de ces produits pour sassurer de leur conformit aux exigences de la directive. Les travaux de lAfssaps sont nancs par une taxe de 0,24 % sur le chire daaires des fabricants commercialisant des produits sur le march franais.

3 Place de limmunoanalyse dans les diffrents domaines de la toxicologie


Lintrt de limmunoanalyse peut galement se mesurer au travers des nombreux articles publis dans les Annales de Toxicologie Analytique dans ce domaine depuis 2000 : quil sagisse de lvaluation du dpistage de drogues sur le terrain [3], de la place dun test immunochimique dans le criblage des cannabinodes dans le sang total [4], des limites de limmunoanalyse dans le dpistage urinaire [5], des biomarqueurs de toxicit dans les principales intoxications graves [6], du dpistage de quatre classes de stupants dans les cheveux [7], de lintrt dun immunoessai pour le dpistage urinaire de drogues illicites et de mdicaments [8], ou de lvaluation du dpistage de quatre classes de stupants et des benzodiazpines dans le sang total laqu [9]. Il ne sagit l que des publications principalement axes sur ce sujet ou pour lesquels limmunochimie occupe une place trs importante.

2 Place de limmunoanalyse sur le march mondial et national de lindustrie du diagnostic


Le march mondial de lindustrie du diagnostic in vitro sest lev 27 milliards deuros en 2007 [1]. Le premier march, celui des tats-Unis dAmrique, reprsente 10,2 milliards deuros soit 38 %, le second est celui de lEurope (27 pays) estim 9,8 milliards deuros soit 36 %, le reste du monde et le Japon avec 7,0 milliards deuros atteint 26 %. Au sein de lEurope, lAllemagne avec 21 %, la France et lItalie avec chacune 16 % constituent les trois marchs les plus importants. Le syndicat de lindustrie du diagnostic in vitro qui regroupe 200 entreprises, value le march national en 2007 1,59 milliards deuros [2]. Ce montant est rparti en deux catgories : les ventes aux laboratoires danalyses pour 1,25 milliards deuros et les ventes dautotests pour 0,34 milliards deuros, composes 95 % de systmes dautosurveillance de la glycmie. Parmi les ventes aux laboratoires, les ractifs, hors autotests, reprsentent la part la plus importante avec 1,04 milliards, les instruments natteignant que 0,21 milliards. En ce qui concerne la rpartition des ractifs, en 2007, limmunochimie arrive trs largement en tte avec 34,5 % du total (359 millions deuros), puis limmunologie infectieuse avec 22,6 %, lhmatologie avec 19,6 %, la biochimie avec 11,9 % et la microbiologie avec 10,3 % ; les tests gntiques ne reprsentant quenviron 1 %. Tous ces dispositifs de diagnostic in vitro sont soumis une rglementation europenne, la directive 98/79 CE ayant introduit une obligation marquage CE pour tous les dispositifs. Cette directive a t transpose en droit franais par une ordonnance de mars 2001 complte par un dcret du 4 fvrier 2004, puis par six arrts de novembre 2004 et un arrt de fvrier 2005. La mise sur le march des produits est eectue sous la responsabilit des fabricants qui, en apposant le marquage CE, sengagent au respect des exigences essentielles de la directive garantissant la qualit des produits et la scurit des utilisateurs. LAgence franaise de scurit sanitaire des produits de sant (Afssaps) a sous sa responsabilit le contrle et la surveillance du march des dispositifs mdicaux de diagnostic in vitro. Un systme de ractovigilance a t mis en place par lAfssaps qui exige la dclaration de tout incident ou risque dincident d un dispositif de diagnostic in vitro.
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3.1 Immunoanalyse et toxicologie clinique en 2008

Un article de ce numro tant consacr la pertinence de limmunochimie pour les services durgence hospitalire, nous ne dvelopperons pas cet aspect. Il est cependant utile de rappeler le consensus clinico-biologique selon lequel lanalyse biologique prime sur lanalyse toxicologique [6, 10]. En eet, le dlai dobtention des rsultats par les mthodes chromatographiques est souvent incompatible avec les contraintes lies la prise en charge mdicale du malade, alors que le bilan biologique de base est disponible rapidement grce aux automates dont sont quips tous les laboratoires. Il existe cependant une exception cette rgle, ce sont les dosages de mdicaments qui peuvent tre raliss par immunoanalyse, sur lautomate du bilan biologique ou sur un quipement ddi, dans le dlai du bilan biologique et disponibles avec ce dernier. Leur quantication est parfois utile, comme pour les anticonvulsivants, voire indispensable pour quelques molcules : digitaliques, mthotrexate, paractamol, salicyls, thophylline [6]. La recherche qualitative ou semi-quantitative peut savrer utile ou prcieuse pour deux familles de mdicaments, benzodiazpines et antidpresseurs tricycliques, ainsi que pour les principales drogues avec les limites quil convient de rappeler quant linterprtation des rsultats, de la comptence exclusive du biologiste [6]. Mura en dresse la liste dans ce numro [11]. Dans un contexte, o la prise en charge clinique est prioritaire, lidentication formelle du toxique par une mthode chromatographique, pour conrmer le rsultat du dosage eectu par immunoanalyse, nest pas ncessaire. Cette rgle peut galement tre applique linterprtation des rsultats lors de la recherche dune famille mdicamenteuse. Ainsi,

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dans notre exprience clinico-biologique, le dosage plasmatique semi-quantitatif des antidpresseurs tricycliques ladmission est un lment indispensable la prise en charge et lorientation du malade [12]. La prsence de lun des trois critres suivants constitue une condition ncessaire mais sufsante pour surveiller le patient dans une structure spcialise (soins intensifs ou ranimation) : dfaillance vitale, signes lectriques caractristiques lECG, concentration en tricycliques exprime en imipramine suprieure 500 ng/mL [12]. Dune manire gnrale, les immunoessais peuvent tre utiliss avec succs en toxicologie clinique tant pour le diagnostic que le dpistage dune intoxication, ainsi que pour le suivi thrapeutique et toxicologique. Cest ce que montrent Hoizey et Labat avec la cotinine [13], Kintz avec les marqueurs dthylisme chronique [14] et Alvarez avec les mdicaments substitutifs de lhrone et autres opiodes [15]. Cependant, les limites de ces examens doivent tre connues des utilisateurs. Parmi les causes derreur il convient de rappeler les interfrences possibles lies au milieu biologique (hmolyse, trouble, ictre. . . ). Les interfrences dues des structures chimiques (autres que celles rechercher) reconnues par lanticorps susceptibles de donner une raction faussement positive ou de majorer le signal doivent tre connues (les phnothiazines ou la carbamazpine peuvent majorer la rponse lors de la recherche des antidpresseurs tricycliques par exemple). Les adultrants des tests urinaires constituent galement une cause derreur [16]. Le niveau du seuil de positivit doit galement tre choisi de telle sorte que le test ne comporte pas de faux ngatif. Ce choix a pour corollaire un plus grand nombre de faux positifs. Dans tous les cas, seules les mthodes chromatographiques sparatives (GC-MS, LC-MS/MS), permettent de conrmer la prsence dun xnobiotique, mdicament ou drogue.

mtabolites urinaires et non les principes actifs. Par ailleurs, le sang prlev en biologie mdicale donne aprs centrifugation du srum ou du plasma limpide, ce qui est primordial pour une immunoanalyse de qualit. Ceci est trs rarement le cas pour le sang prlev sur un cadavre qui ne permet dobtenir que du srum plus ou moins hmolys, voire uniquement du sang laqu, incompatible avec lemploi de nombreux immunoessais. Dautre part les tests utiliss dans un contexte judiciaire sont destins des usages varis : test rapides lecture visuelle directe dexcution facile sur le terrain, immunoessais pour laboratoire ncessitant un quipement de lecture. Verstraete et Labat font le point dans ce numro sur lutilisation de tests rapides salivaires au bord de la route et en sant au travail [17]. Cirimle propose dappliquer des mthodes immunologiques pour le dpistage des xnobiotiques dans les cheveux [18], dans le prolongement du dpistage de quatre classes de stupants par une technique immuno-enzymatique par la mme quipe [7]. Ppin a dcrit quant lui le criblage des stupants dans le sang total par immunochimie [19]. Ds 2001, Kintz et coll. [4] montraient lintrt dun tel test immunochimique de dpistage des cannabinodes dans le sang total. En ce qui concerne lemploi de limmunoanalyse en toxicologie judiciaire, il convient de considrer deux cas de gure et les pr-requis correspondants : le dpistage dune conduite aprs avoir consomm un stupant, dans le cadre de la scurit routire : les tests utiliss, quils soient urinaires ou salivaires, doivent tre exempts de faux ngatifs. Dans le cas contraire, ceci entranerait larrt de la procdure, alors que le conducteur pouvait avoir consomm un stupant. Si le dpistage utilis ne comporte pas de faux ngatif, tous les sujets positifs, donc susceptibles davoir consomm subiront une prise de sang, dont seule lanalyse a force de loi ; le criblage des stupants dans le sang total par immunochimie ncessite quant lui deux pr-requis : labsence de faux ngatif, ce qui conduirait arrter la procdure alors que le sujet avait consomm un stupant, mais galement la conrmation de tous les rsultats positifs par une mthode chromatographique sparative (GC-MS, LC-MS/MS). Lemploi dune technique dimmunoanalyse de type ELISA pour le criblage sanguin des stupants, sous rserve de labsence de faux ngatif, ne ncessite pas a priori de conrmation par une mthode sparative. Tout au plus, il peut tre exig de raliser ces analyses en double comme cela est le cas au Royaume Uni [20]. Outre le fait que les chantillons doivent tre analyss deux fois, le dbut et la n de chaque srie comportent obligatoirement au minimum trois calibrateurs (ngatif, positif, seuil de positivit). Il est dailleurs recommand dutiliser une courbe de calibration. Dans notre exprience, aprs avoir ralis la fois le criblage sanguin par immunoanalyse, puis la quantication par GC-MS sur plusieurs milliers dchantillons, nous avons constat pour les cannabinodes, contrairement aux trois autres familles, de rares faux ngatifs. Il sagissait toujours dchantillons montrant de faibles concentrations de THC-COOH avec un THC voisin de 0,5 1,0 ng/mL. Ceci rejoint la constatation faite ds 2001 par Kintz et coll. [4].
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3.2 Immunoanalyse et toxicologie judiciaire en 2008

Si limmunoanalyse peut galement savrer utile en toxicologie judiciaire, son emploi doit imprativement obir des rgles direntes de celles qui prvalent en toxicologie clinique. En eet, tout rsultat positif ou ngatif, obtenu par un immunoessai doit obligatoirement tre valid par une mthode de conrmation sous peine de nullit du rapport dexpertise toxicologique. Limmunoanalyse ne peut donc tre utilise en mdecine lgale que comme une mthode de dpistage et dorientation uniquement lusage de lexpert analyste. Son emploi doit donc tre proscrit au pied de la table dautopsie, ainsi que dans tout laboratoire ne disposant pas de lquipement requis pour raliser les conrmations. Cest dans ce domaine de la toxicologie que lusage de limmunoanalyse savre la plus dlicate. Outre le sang et les urines, milieux traditionnels analyss en biologie mdicale, la salive et les phanres prsentent un intrt majeur dans un cadre mdico-lgal. Cependant, lemploi des immunoessais pose de nombreux problmes spciques ces matrices. Dans ces milieux, contrairement aux urines, en raison de proprits pharmacocintiques particulires, ce sont le plus souvent les molcules mres qui caractrisent le prol dexposition une substance. Or, les tests dimmunoanalyse ont t dvelopps pour reconnatre les

Annales de Toxicologie Analytique 2009; 21(1): 49-53 Tableau I. Dure de dtectabilit dans les urines par direntes techniques aprs ingestion dune unit galnique [21]. Molcule lorazpam OH-bromazpam bromazpam zopiclone 7-NH2 -unitrazpam zolpidem 7-NH-2-clonazpam Immuno sauf CEDIA Non dtect Non dtect Non dtect Non dtect Non dtect Non dtect Non dtect CEDIA 96 h / 48 h Non dtect 48 h Non dtect 96 h LC-DAD Non dtect 36 h 12 h 12 h 36 h 24 h 12 h GC-MS 84 h 24 h 72 h dgrade 48 h 12 h 132 h LC-MS 84 h 108 h 48 h 3648 h 96 h 3660 h 144 h

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LC-MS/MS >144 h 144 h >144 h 120 h 144 h 4896 h 144 h

Dans le prolongement des pratiques en toxicologie clinique, o des corets de ractifs destins aux urines sont utiliss avec du srum, il peut tre tentant de les employer avec du sang. Avec les techniques non ELISA qui ne comportent pas dtape de lavage permettant dliminer la matrice biologique susceptible dinterfrer, lanalyse sur le sang doit imprativement tre proscrite. Dans ce cas, pour limiter ces eets de matrice, un prtraitement de lchantillon faisant appel une prcipitation, le plus souvent par lactone ou lactonitrile, est parfois propos. Ces techniques ne sont pas conseilles et lutilisation en mdecine lgale est proscrite par les fabricants. Cas particulier de la soumission chimique : la soumission chimique fournit un trs bel exemple des limites de limmunoanalyse dans la dtection urinaire de faibles concentrations de benzodiazpines et de drivs apparents. Ltude exprimentale in vivo, sur 12 volontaires sains ayant consomm chacun une unit galnique des principes actifs suivants : lorazpam 2,5 mg, bromazpam 6 mg, unitrazpam 1 mg, zolpidem 10 mg, clonazpam 2 mg, zopiclone 7,5 mg, montre quaucune technique immunochimique, ne peut tre utilise pour le dpistage de la soumission chimique comme le rappelle le tableau I [21].
3.3 Immunoanalyse et toxicologie professionnelle et environnementale en 2008

ouvrant aux industriels un march fort potentiel. Il convient cependant dtre vigilant sur la diversit des rponses des direntes molcules dune mme classe vis--vis dun anticorps, qui doit inciter la prudence dans linterprtation dun test immunologique, mais galement dans le choix du seuil de positivit. Que limmunochimie soit utilise comme moyen de dpistage rapide sur le terrain ou comme mthode de criblage au laboratoire, deux pr-requis simposent : labsence de faux ngatif et la conrmation de tout rsultat positif par une mthode chromatographique sparative couple la spectromtrie de masse. Si ces conditions sont remplies, limmunoanalyse savre tre une mthode de dpistage rapide, simple permettant le traitement de grandes sries dchantillons tout en bnciant dun cot rduit.

Rfrences
Chires cls de lindustrie du diagnostic in vitro 2008. Syndicat de lindustrie du diagnostic in vitro. Edition novembre 2008. 2. Site internet www.sfrl.fr consult le 27/10/2008. 3. Samyn N, Areschka V, Verstraete A. valuation de tests de dpistage des drogues sur le terrain. Ann Toxicol Anal. 2000; 12(2): 105115. 4. Kintz P, Lohner S, Sengler C, Cirimele V. Place dun test immunochimique dans le criblage des cannabinodes dans le sang total. Ann Toxicol Anal. 2001; 13(4): 284285. 5. Capolaghi B. Dpistage urinaire : les limites de limmunoanalyse. Ann Toxicol Anal. 2002; 14(1): 2426. 6. Goull JP et coll. Biomarqueurs de toxicit et anomalies mtaboliques dans les principales intoxications graves. Ann Toxicol Anal. 2003; 15(3): 208220. 7. Pujol ML, Tritsch PJ, Cirimele V, Kintz P. Dpistage de quatre classes de stupants dans les cheveux par technique ELISA laide du test One-StepTM et conrmation par chromatographie gazeuse couple la spectromtrie de masse. Ann Toxicol Anal. 2006; 18(4): 291296. 8. Mura P, Papet Y, Brunet B. Intrt du Triage TOX Drug Screen pour le dpistage urinaire de drogues illicites et de mdicaments. Ann Toxicol Anal. 2007; 19(3): 221225. 9. Grassin Delyle S, Mathieu B, Abe E, Alvarez JC. valuation du dpistage de quatre classes de stupants et des benzodiazpines dans le sang total laqu par lanalyseur Evidence Investigator . Ann Toxicol Anal. 2008; 20(1): 1724. 10. Capolaghi B, Moulsma M, Houdret N, Baud FJ. Stratgies analytiques en toxicologie durgence. Ann Toxicol Anal. 2000; 12(4): 274281. 1.

La plupart des constats et remarques faits dans les paragraphes prcdents sont applicables en toxicologie professionnelle et environnementale. lheure actuelle si lutilisation de tests rapides en surveillance professionnelle progresse lentement, nous manquons de tests immunochimiques dans le cadre de la surveillance environnementale, vaste domaine, ouvert de nombreux dveloppements. Hoizey et Labat [13] ainsi que Mouthon [22] consacrent un article des applications sur ces thmes.

4 Conclusion
Face au dveloppement des mthodes sparatives, limmunoanalyse savre tre aujourdhui un complment indispensable dans les domaines du dpistage, du diagnostic et du traitement. Les besoins et les attentes des analystes, mais galement dautres catgories de professionnels sont nombreux,
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Annales de Toxicologie Analytique 2009; 21(1): 49-53 11. Brunet B et coll. Pertinence de limmunochimie pour les services durgence hospitalire. Ann Toxicol Anal. 2009; 21(1): 3743. 12. Goul JP, Rigaud JP, Lacroix C, Nouveau J. Intoxications graves par antidpresseurs tricycliques. propos de 38 observations. Toxicorama. 1998; 10(4): 255267. 13. Hoizey G, Labat L. Cotinine en pdiatrie et en sant au travail. Ann Toxicol Anal. 2009; 21(1): 2735. 14. Kintz P et coll. Les marqueurs de lthylisme chronique. Focus sur les approches immuno-chimiques. Ann Toxicol Anal. 2009; 21(1): 2125. 15. Alvarez JC. Le dpistage immunochimique des mdicaments substitutifs de lhrone et autres opiodes. Ann Toxicol Anal. 2009; 21(1): 1319. 16. Dumestre-Toulet V, Verstraete AG. Les adultrants des tests urinaires. Toxicorama. 1999; 11(3): 155166.

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