DETERMINACIN CUANTITATIVA DE AMINOACIDOS POR EL METODO DE LA NINHIDRINA AMINOACIDO Todos los aminocidos componentes de las protenas son L-alfa-aminocidos.

Por lo tanto, estn formados por un carbono alfa unido a un grupo carboxilo, a un grupo amino, a un hidrgeno y a una cadena (habitualmente denominada Radical alquilo o arilo) de estructura variable, que determina la identidad y las propiedades de los diferentes aminocidos; existen cientos de cadenas R por lo que se conocen cientos de aminocidos diferentes, pero slo 20 forman parte de las protenas y tienen codones especficos en el cdigo gentico. La unin de varios aminocidos da lugar a cadenas llamadas polipptidos o simplemente pptidos, que se denominan protenas cuando la cadena polipeptdica supera los 50 aminocidos o la masa molecular total supera las 5.000 uma. ESTRUCTURA GENERAL DE UN AMINOACIDO La estructura general de un aminocido se establece por la presencia de un carbono central alfa unido a: un grupo carboxilo (rojo en la figura), un grupo amino (verde), un hidrgeno (en negro) y la cadena lateral (azul):

"R" representa la cadena lateral, especfica para cada aminocido. Tcnicamente hablando, se los denomina alfa-aminocidos, debido a que el grupo amino (NH2) se encuentra a un tomo de distancia del grupo carboxilo (COOH). Como dichos grupos funcionales poseen H en sus estructuras qumicas, son grupos susceptibles a los cambios de pH; por eso, al pH de la clula prcticamente ningn aminocido se encuentra de esa forma, sino que se encuentra ionizado.

Los aminocidos a pH bajo (cido) se encuentran mayoritariamente en su forma catinica (con carga positiva), y a pH alto (bsico) se encuentran en su forma aninica (con carga negativa). Sin embargo, existe un pH especfico para cada aminocido, donde la carga positiva y la carga negativa son de la misma magnitud y el conjunto de la molcula es elctricamente neutro. En este estado se dice que el aminocido se encuentra en su forma de ion dipolar o zwitterin.

CLASIFICACIN DE AMINOACIDOS A los aminocidos que necesitan ser ingeridos por el cuerpo se les llama esenciales; la carencia de estos aminocidos en la dieta limita el desarrollo del organismo, ya que no es posible reponer las clulas de los tejidos que mueren o crear tejidos nuevos, en el caso del crecimiento. Para el ser humano, los aminocidos esenciales son: Valina (Val, V) Leucina (Leu, L) Treonina (Thr, T) Lisina (Lys, K) Triptfano (Trp, W) Histidina (His, H) Fenilalanina (Phe, F) Isoleucina (Ile, I) Arginina (Arg, R) Metionina (Met, M) A los aminocidos que pueden ser sintetizados o producidos mediante la sntesis de aminocidos por el cuerpo se los conoce como no esenciales y son:

Alanina (Ala, A) Prolina (Pro, P) Glicina (Gly, G) Serina (Ser, S) Cistena (Cys, C) Asparagina (Asn, N) Glutamina (Gln, Q) Tirosina (Tyr, Y) cido asprtico (Asp, D) cido glutmico (Glu, E)

REACCIONES DE AMINOACIDOS En los aminocidos hay tres reacciones principales que se inician cuando un aminocido se une con el piridoxal-P formando una base de Schiff o aldimina. De ah en adelante la transformacin depende de las enzimas, las cuales tienen en comn el uso de la coenzima piridoxal-fosfato. Las reacciones que se desencadenan pueden ser:

1. la transaminacin (transaminasa): Necesita la participacin de un -cetocido. en la que el grupo amino es transferido de aquel a ste, con la consiguiente conversin del aminocido en su correspondiente alfa-cetocido. Un ejemplo importante de transaminacin se presenta entre glutamato y oxaloacetato, que produce alfacetoglutarato y aspartato, el que puede transferir su grupo amino a otros alfacetocidos para formar aminocidos diferentes por reacciones de transaminacin 2. la descarboxilacin: reaccin metablica fundamental durante la oxidacin de molculas orgnicas, catalizada por enzimas del tipo descarboxilasa Los aminocidos sufren descarboxilacin a aminas; un ejemplo particular sera la descarboxilacin de la histidina a histamina. 3. la racemizacin: Es la conversin de un compuesto L en D, o viceversa. Aunque en las protenas de los eucariotas (animales, plantas, hongos...) los aminocidos estn presentes nicamente en la forma estructural levgira (L), en las bacterias podemos encontrar D-aminocidos.

DETECCION Y MEDICIN CUANTITATIVA La ninhidrina es un poderoso agente y reactivo comn para visualizar las bandas de separacin de aminocidos por cromatografa o electroforesis, tambin es utilizada con fines cuantitativos para la determinacin de aminocidos. Reacciona con todos los aminocidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloracin que vara de azul a violeta intenso. Este producto colorido (llamado prpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la coloracin producida por la ninhidrina es independiente de la coloracin original del aminocido. La reaccin con la ninhidrina produce colores que sirven como base para la cuantificacin de todos los aminocidos primarios se evala midiendo la absorcin de la luz con la longitud de onda de 540 nm. Aminocidos secundarios como la prolina forman productos ligeramente distintos; estos son amarillos tienen su mxima absorcin a 440 nm. El clculo de la concentracin se basa en la relacin de Beer-Lambert. El orto-ftaldehdo (OPA, del ingles orto-ptaldehyde, tambin llamado fluoraldehdo) es un nuevo reactivo de revelado, ms sensible, con el cual puede detectarse concentraciones de aminocidos de orden de picomoles (10E-12) a femtomoles (10E-15). Esta enorme diferencia en sensibilidad se debe a los productos intensamente fluorescentes. Despus de la reaccin, la exposicin a una radiacin de 360 provoca una emisin fluorescente a 445 nm, cuya intensidad se relaciona con la concentracin del aminocido. Esta reaccin ocurre con rapidez si se trata de aminocidos primarios, pero no cuando son secundarios. No obstante, la prolina puede detectarse oxidndola primero a una amina primaria. Los derivados de la feniltiohidatoina que absorbe la luz ultravioleta, los derivados fluorescentes del densilo y los derivados amarillos del dinitrofenilo son tiles no son solo para la deteccin cuantitativa de aminocidos, sino tambin para su identificacin.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL. Esta tcnica se basa en el principio de que un compuesto se reparte o distribuye entre dos fases lquidas. En un ambiente que contiene vapor de agua, el papel de cromatografa absorbe una cantidad de agua que mantiene entre las fibras de la celulosa del papel. Esta agua se considera como uno de los disolventes y constituye la fase estacionaria. Si se permite que un disolvente no acuoso ( la fase mvil) se traslade por el papel impulsada por la accin capilar, tan pronto como el disolvente alcance a cualesquiera molculas de soluto en el papel, estas se distribuirn entre las dos fases en una proporcin caracterstica de sus coeficientes de reparto. Cuanto ms soluble sea un soluto en la fase mvil, tanto ms se trasladara el compuesto por el papel en la direccin del flujo del disolvente y viceversa Podemos citar como ejemplo del procedimiento de cromatografa en papel la separacin de aminocidos en fracciones por cromatografa descendente en papel Whatman No. 1, empleando la elucin fenol saturado con agua. Los aminocidos aparecen como manchas coloridas despus de revelar el cromatograma rocindolo con reactivo de ninhidrina. Se desconoce con certera el mecanismo de la cromotagrafa en papel. Es probable que los constituyentes de la muestra probablemente sean retenidos por el papel a causa de su solubilidad en el agua que el papel absorbe, o por absorcin de los propios constituyentes de la muestra o por una combinacin de ambos. SEPARACIN DE AMINOCIDOS POR CROMATOGRAFA EN PAPEL Tabla No.1 AMINOCIDOS ANALIZADOS POR CROMATOGRAFA EN PAPEL TUBO AMINOCIDO DISTANCIA RECORRIDA (cm) RF OBSERVACIONES 1 Isoleucina 6.5 cm 0.76 cm Mancha color morado larga y recorri bastante. 2 Arginina 1.0 cm 0.12 cm Mancha color morado fuerte ancha y recorri la mitad de la anterior. 3 Histidina 0.5 cm 0.05 cm Mancha color morado fuerte pequea y recorri poca distancia. (Fuente: Datos experimentales) DISCUSIN DE RESULTADOS La cromatografa en papel es un mtodo de separacin y aislamiento de sustancias. Se basa en dos fases; la fase mvil que es una capa de solvente orgnico que asciende por la capilaridad por el papel, en este caso el butanol, y la fase estacionaria que es papel filtro. La ninhidrina nos revela las posiciones de los aminocidos (Isoleucina, Arginina, Histidina), utilizadas en la prueba como manchas de color violeta. La polaridad relativa establece la movilidad cromatografa. Los aminocidos con grandes grupo R no polares en este caso la Isoleucina migran ms lejos que aquellos con grupo R no polares ms cortos o con grupos R polares en este caso la Arginina y la Histidina. La proporcin entre la distancia a la cual viaja un aminocido y la distancia a la cual viaja el frente del solvente es el valor Rf que es la movilidad relativa respecto al frente del solvente. Dando como resultados

del Rf: la Isoleucina 0.75, Arginina 0.12, la Histidina 0.05. Los valores Rf para un aminocido determinado pueden variar segn las condiciones experimentales como por ejemplo el solvente utilizado. (Murray, 2001)