Construccion y Validacion de Modelos

Fundamentos de Microbiologa Predictiva: aplicaciones
tericas y prcticas

Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D.
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Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2013

DESARROLLO DE UN MODELO MATEMTICO PARA EVALUAR EL EFECTO
DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO DE S. aureus EN CALDO
BHI

En la presente gua se explica en forma sencilla cmo desarrollar un modelo
matemtico que permita evaluar el efecto de la temperatura de 25C a 40C sobre
el crecimiento de S. aureus en caldo BHI. Para tal fin se usarn datos reales
obtenidos a travs de las prcticas de laboratorio del curso de Microbiologa
Predictiva del programa de Microbiologa de la Universidad de Pamplona. As
mismo, se emplearan herramientas informticas para la construccin de los
modelos adecuados, especficamente se usarn los software DMFit, GraphPad
Prism Version 3 para Windows y Microsoft Excel 2010.

1. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS

Computador con paquete Microsoft Office 2010, GraphPad Prism y conexin a
internet.

2. PROCEDIMIENTO

El Desarrollo de la siguiente actividad se realiza en tres etapas sucesivas as:

Modelamiento primario: en esta etapa se usar el modelo primario de Baranyi y
Roberts para determinar la velocidad de crecimiento de S. aureus en cada
temperatura evaluada. Para tal fin nos apoyaremos en el software DMFit, el cual
se encuentra disponible en lnea en la siguiente direccin electrnica:
http://modelling.combase.cc/DMFit.aspx. Al ir a esta direccin se despliega una
ventana como se muestra en la figura 1, en la cual tendremos que crear una
nueva cuenta dando clic en el cuadro rojo y diligenciar los datos solicitados. Una
vez registrados ya podemos ingresar al software escribiendo la direccin de correo
electrnico y la contrasea que hemos creado anteriormente.

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Figura 1. Pgina principal de acceso al ComBase.

Modelamiento secundario: Una vez obtenidas las mximas velocidades de
crecimiento para cada temperatura, se construir un modelo secundario ajustando
los datos de velocidad vs temperatura a una funcin matemtica conocida
mediante regresin lineal. Posteriormente se obtendr la ecuacin matemtica que
representa esa relacin. Esta expresin matemtica se convertir en el modelo
que se usar para generar los datos de velocidad de crecimiento de S. aureus
para las temperaturas no estudiadas en el laboratorio mediante interpolacin. Para
esta etapa se usar el software Microsoft Excel 2010 y el software GraphPad
Prism v 3.0 para Microsoft.

Ajuste y validacin del Modelo: la tercera etapa consistir en la validacin
estadstica del modelo matemtico empleando para ello los datos obtenidos en el
laboratorio (Observados) y los datos generados por el modelo en la segunda etapa
(Estimados). La validacin se har comparando estadsticamente el factor de
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sesgo (B
f
), factor de exactitud (A
f
) y el Error cuadrado medio (RMSE) tal como ha
sido descrito por varios autores (Ross, 1996; Baranyi et al., 1999; Judet-Correia et
al., 2010; Garca, D et al., 2011).

2.1. MODELAMIENTO PRIMARIO

A continuacin se muestra en la tabla 1 los datos experimentales de crecimiento
de S. aureus a temperaturas entre 25C y 40C, e incubado en caldo BHI durante
5 6 horas.

Tabla 1. Resultados del crecimiento de S. aureus en caldo BHI incubado a 25C,
30C, 35C y 40C.
25C 30C 35C 40C
Tiempo
min
Poblacin
Ln ufc/ml
Tiempo
min
Poblacin
Ln ufc/ml
Tiempo
min
Poblacin
Ln ufc/ml
Tiempo
min
Poblacin
Ln ufc/ml
0 15.549 0 16.042 0 16.088 0 15.133
30 15.891 30 16.550 30 16.042 30 15.993
60 16.182 60 16.474 60 16.657 60 16.826
230 17.431 230 16.981 90 16.657 80 17.611
250 17.775 250 18.479 225 19.154 200 18.760
290 19.015 290 18.919 255 20.328 230 19.971
310 19.165 310 19.086 285 20.671 260 20.402
350 19.383 350 19.887 315 20.798 290 20.645
370 19.587 370 20.034 -- -- 320 20.873

Antes de procesar los datos anteriores, ingresamos al ComBase y se despliega la
ventana mostrada en la figura 2. En esta ventana nos ubicamos en la parte
superior derecha en la pestaa Resource (Recursos) y seleccionamos la opcin
DMFit para ingresar a la versin online.

En esta nueva ventana que se muestra en la figura 3, podemos ver dos paneles.
En el panel superior se presentan las opciones de ingreso de datos, seleccin del
tipo de modelo y el ajuste de los datos. En el panel inferior se muestran los datos
de salida tales como la evaluacin del ajuste de los datos frente al modelo
escogido, los parmetros estimados segn el modelo seleccionado y la
representacin grfica de los datos observados y el ajuste de los mismos. As
mismo, se muestra en el panel de color gris los datos estimados.
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Figura 2. Pgina de acceso al DMFit web edition.

Figura 3. Ventana principal del DMFit web edition.

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Bien, ahora comenzamos con el ingreso de los datos en la caja 1, tal como se
muestra en la figura 4. Se coloca primero el dato del tiempo, espacio, y luego el
valor de la poblacin en Log
10
o Ln y luego enter. Repetir estos pasos para cada
dato y al finalizar el ingreso de los mismos damos clic en display data (mostrar
datos) para ver la forma de la grfica. La otra opcin es importar los datos desde
una hoja Excel, para ellos copiamos en una columna los valores de tiempo y el
columna siguiente los valores de la poblacin usando como el separador de
decimales el punto y no la coma, ya que el DMFit reconoce el punto como
separador de decimales.

Figura 4. Ingreso de los datos en el DMFit web edition.

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En el ejemplo anterior, podemos ver que el ajuste de los datos de crecimiento
reflejan una curva completa, es decir caracterizada por las tres fases del
crecimiento: latencia lag, exponencial y estacionaria.

De acuerdo con lo anterior, seleccionamos en la ventana 2 modelo completo del
modelo de Baranyi y Roberts y si no se hace el ajuste automtico al modelo
seleccionado, damos clic en la opcin 3 a la pestaa Fit para realizar este ajuste.
En este caso aparecern en la ventana inferior los datos del ajuste: Convergencia
entre los datos y el modelo seleccionado, los parmetros cinticos estimados
(Y
min
, ,
mx
y Y
max
, respectivamente) y sus errores estndar; as como los datos
estimados de crecimiento vs tiempo (Figura 5).

Figura 5. Valores de ajuste dados por el DMFit web edition.

Repetir este procedimiento para cada una de las temperaturas evaluadas y con los
valores obtenidos del ajuste, especialmente la velocidad mxima de crecimiento
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se proceder a construir el modelo secundario, consignando en la tabla 2 estos
datos.

Tabla 2. Velocidad mxima estimada y error estndar del ajuste de los datos
obtenidos con el DMFit para el crecimiento de S. aureus en funcin de la
temperatura.
Temp (C)
mx
(Ln ufc/ml*min)

R
2

25 0.0219 0.0029 0.9840 0.2709
30 0.0243 0.0055 0.9379 0.3864
35 0.0270 0.0055 0.9798 0.2273
40 0.0190 0.0018 0.9702 0.3724

Tabla 3. Otros parmetros cinticos estimados con el DMFit para el crecimiento de
S. aureus en funcin de la temperatura.
Temp
(C)
Y
min
(Ln ufc/ml)

Y
mx
(Ln ufc/ml)

Lag / Shoulder
(min)

25 16.1267 0.2058 21.0528 0.4688 71.4618 25.6119
30 16.3457 0.2231 20.0457 0.4056 186.1880 26.6772
35 15.8736 0.1313 19.4870 0.1675 175.2310 17.8241
40 15.5040 0.2344 21.0727 0.5530 NO
NO: no observada.

2.2. MODELAMIENTO SECUNDARIO

El siguiente paso en la determinacin del efecto de la temperatura sobre el
crecimiento de S. aureus es el desarrollo del modelo secundario, el cual permite
relacionar el cambio en la velocidad de crecimiento cuando cambia la temperatura.

Los datos de temperatura y velocidad de crecimiento () se llevan a una hoja de
clculo Excel (Figura 6). Posteriormente procedemos a graficar los datos de
crecimiento, seleccionamos en la columna A las filas correspondientes desde A2
hasta B5 (A2:B5) que corresponde a los datos de temperatura y velocidad de
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crecimiento de S. aureus, posteriormente vamos a la pestaa de insertar y
escogemos dentro de la opcin de grficos de dispersin con lneas suavizadas
(Figura 7).

Figura 6. Cuadro de datos de crecimiento de S. aureus en funcin de la
temperatura.

Figura 7. Representacin del crecimiento de S. aureus en notacin cientfica.

Posteriormente obtendremos la grfica del efecto de la temperatura sobre la
velocidad de crecimiento de S. aureus (Figura 8). En esta figura podemos apreciar
que la velocidad de crecimiento aumenta con la temperatura hasta un valor
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cercano al ptimo de crecimiento para luego decaer nuevamente. La forma que
adopta esta grfica obedece a una parbola, la cual puede describirse mediante
una funcin polinmica de tercer orden o superior, para generar la ecuacin
matemtica que represente esta relacin.

Figura 8. Representacin del efecto de la temperatura sobre la velocidad de
crecimiento de S. aureus.

Posteriormente, nos situamos sobre la grfica generada y seleccionamos la opcin
de agregar lnea de tendencia (Figura 9) y escogemos la tendencia polinmica y
ordenacin de tercer (3) grado (funcin cbica), as mismo seleccionamos la
opcin de presentar la ecuacin en el grfico y el valor del coeficiente de regresin
(R
2
) para obtener el modelo matemtico adecuado y el grado de ajuste de los
datos frente al modelo seleccionado (Figura 10). En este caso la ecuacin que
obtendremos tendr la estructura siguiente: Y = A+BX+CX
2
+DX
3
.

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Figura 9. Seleccin del tipo de grfico de crecimiento de S. aureus.

Figura 10. Seleccin del tipo de tendencia para el grfico generado.

Con lo anterior se obtiene la ecuacin matemtica que representa la relacin del
efecto de la temperatura sobre la velocidad de crecimiento (Figura 11).

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Figura 11. Grfica de la velocidad de crecimiento vs temperatura para S. aureus y
la ecuacin matemtica generada.

Fuente: Autor.

Al analizar la figura 11 podemos observar que el coeficiente de determinacin
o regresin (R
2
) es uno (1). Por lo tanto, la ecuacin generada se adapta a los
datos observados de velocidad de crecimiento vs temperatura. Esta ecuacin
podemos transformarla en el siguiente modelo matemtico:

p
mx
= C
0
C
1
I + C
2
I
2
C
3
I
3

Donde los coeficientes C
0
, C
1
, C
2
y C
3
corresponden a los valores obtenidos
mediante ajuste de regresin cbica, y que para este caso equivalen a:
C
0
= 0,3994000
C
1
= 0,0390833
C
2
= 0,0013260
C
3
= 0,0000147
T = Temperatura en C
mx
= mxima velocidad de crecimiento

y = -0.0000147x
3
+ 0.0013260x
2
- 0.0390833x + 0.3994000
R = 1.0000000
0.0100
0.0150
0.0200
0.0250
0.0300
20 25 30 35 40 45
m
a
x
(
L
n

u
f
c
/
m
l
*
m
i
n
)
Temperatura (C)
Velocidad de crecimiento de S. aureus vs
Temperatura
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2.3. VALIDACION DEL MODELO

De acuerdo con Baranyi et al. (1999) los modelos microbiolgicos predictivos son,
tpicamente generados en el laboratorio usando medios de cultivo lquidos. En
ese sentido afirma el autor que, Ross en 1996 propuso como medidas para
evaluar el desempeo de los modelos matemticos usados en microbiologa
predictiva el factor de sesgo y el factor de exactitud. Posteriormente, Baranyi et al.
(1999) presentaron un refinamiento de estos factores en su trabajo Validating and
comparing predictive models, los cuales han sido usados hasta hoy para evaluar
el desempeo de los modelos predictivos.

Para la validacin de la capacidad para describir adecuadamente los datos
experimentales observados de nuestro modelo, usaremos esas definiciones dadas
por Baranyi, es decir, se calcularan el factor de sesgo (B
f
), y factor de exactitud
(A
f
), as como otros ndices matemticos y estadsticos: error cuadrtico medio
(RMSE) y el coeficiente de regresin (R
2
).

Factor de sesgo (B
f
): el B
f
responde a la pregunta de si, en promedio, los valores
observados se encuentran por encima o por debajo de la lnea de equivalencia y,
en caso afirmativo, en qu medida. Es comn trazar los parmetros de crecimiento
estimados en contra de sus valores observados para demostrar la concordancia
del modelo. Si los puntos as obtenidos estn en la lnea de equivalencia entonces
las predicciones son exactas. La diferencia entre un punto y la lnea de
equivalencia es una medida de la inexactitud de la prediccin respectiva.

Una concordancia perfecta entre las predicciones y observaciones dar lugar a un
factor de sesgo de 1. Si el factor de sesgo es menor a 1, indicar que los valores
observados se encuentran por debajo de la lnea de equivalencia, y que en
principio el modelo generado no arrojar predicciones seguras. El caso contrario
se presenta cuando el factor de sesgo es mayor a 1, indicando que los datos
observados se encuentran por encima de la lnea de equivalencia.

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B
]
= 1u
_
Iog_
Est
Obs
]
n
_

Donde
n = nmero de observaciones usadas en el clculo
Est
= Velocidad de crecimiento estimada
Obs
= Velocidad de crecimiento observada

Factor de exactitud (A
f
): mide la distancia mnima entre cada punto promedio y la
lnea de equivalencia como una medida de qu tan cerca, en promedio, se
encuentran los valores predichos y los observados, por lo tanto, el A
f
es una
medida de la desviacin media y puede ser utilizado como una simple medida del
nivel de confianza que se puede tener con el modelo de prediccin. Cuanto ms
grande sea el valor, menos precisa es la estimacin promedio.

A
]
= 1u
_
_Iog_
Est
Obs
]_
n
_

Donde
n = nmero de observaciones usadas en el clculo
Est
Obs

Error cuadrtico medio (RMSE): mide la desviacin media entre los valores
observados (Obs) y los valores estimados (Est). Cuanto menor sea el valor de
este ndice, mejor es el ajuste del modelo frente a los datos experimentales.

RHSE = _
RSS
J

Es decir,
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RHSE = _
(p
Lst
p
0bs
)
2
n p

Donde
n = nmero de observaciones
p = nmero de parmetros a ser estimados
Est
Obs

Debe dejarse claro que la validacin de los modelos se hace frente a aquellos
datos observados que no fueron usados para construir el modelo. Sin
embargo, en nuestro caso y a manera de ejemplo, la validacin se har con los
mismos datos experimentales usados para construir el modelo ya que se tienen
pocos datos.

El clculo de cada uno de los ndices matemticos se har empleando la hoja de
clculo Excel. Se disear una tabla de frecuencias en la cual se incluirn los
factores o parmetros a modelar (en este caso uno = temperatura), velocidades de
crecimiento observada y estimada, pre-factor de sesgo, etc., tal como se muestra
en la figura 12.

Figura 12. Tabla de frecuencias para la validacin del modelo generado.

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Determinacin del factor de sesgo (B
f
):

El factor de sesgo se obtendr en la casilla E8 de nuestro ejemplo (Figura 12).

Comenzaremos por determinar el pre-factor B
f
, que en este caso
corresponde a Log (
Est
/
Obs
). Nos ubicamos en la casilla E4 y escribimos la
siguiente frmula: =LOG10(D4/C4), repetimos la formula en la casillas E5,
E6 y E7 sustituyendo D4/C4 por D5/C5, D6/C6 y D7/C7.
Para obtener el valor de B
f
nos situamos en la casilla E8 y colocamos la
siguiente frmula: =POTENCIA(10,((SUMA(E4:E7))/4)) y para nuestro caso
nos dar un valor de 0,9429

Determinacin del factor de exactitud (A
f
):

El factor de exactitud se obtendr en la casilla E9 de nuestro ejemplo (Figura 12).
El factor A
f
se obtiene con la misma frmula que el B
f
pero teniendo en
cuenta que se trabaja con valores absolutos.
En la casilla E9 colocamos las siguiente frmula que nos dar directamente
este valor: =POTENCIA(10,((ABS(SUMA(E4:E7)))/4))
El valor obtenido para A
f
es 1,0605

Determinacin del error cuadrado medio (RSME):

El RSME se obtendr en la casilla E10 de nuestro ejemplo (Figura 12).
Inicialmente determinaremos el cuadrado de la diferencia entre el valor
Estimado y el Observado (Est - Obs)
2
. Para ello nos ubicamos en la casilla
F4 y escribimos la siguiente frmula: =POTENCIA((D4-C4),2). Repetimos
esta frmula en las casillas F5, F6 y F7 sustituyendo D4-C4 por D5-C5, D6-
C6 y D7-C7.
Al finalizar las operaciones nos ubicamos en la casilla E10 y colocamos la
siguiente frmula: =RAIZ((SUMA(F4:F7))/(4-1))
Se obtiene un valor de 0,0016

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Figura 13. ndices matemticos y estadsticos obtenidos para el modelo de
crecimiento de S. aureus en funcin de la temperatura.

En general podemos concluir que: los valores estimados por el modelo son
menores a los observados y por ello el factor de sesgo (Bf) es menor a uno. Esto
indica que los valores estimados se encuentran por debajo de la lnea de
equivalencia (ver figura 14). Sin embargo, el factor de exactitud es ligeramente
superior a uno, por lo que no existe una gran diferencia entre los valores
estimados y la lnea de equivalencia, es decir, se encuentran muy prximas. Esto
se confirma con el RMSE obtenido, el cual es muy pequeo (0,0016) indicando
que no existe mucha diferencia entre los valores observados y los estimados.

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Figura 14. Representacin de los valores de velocidad de crecimiento estimados
vs observados para S. aureus.

Fuente: Autor.

3. NIVEL DE RIESGO

Para el desarrollo de la anterior prctica se ha definido un nivel de Riesgo muy
bajo o nivel 0; es decir que no se requiere del uso de Bata de Laboratorio Manga
Larga, Zapato Cerrado Bajo o Pantaln Largo siempre y cuando no se realice en
los laboratorios de prcticas.

4. BIBLIOGRAFA

Allman, E.S. and Rhodes, J.A. (2004). Chapter 8: Curve Fitting and Biological
Modeling. In: Mathematical Models in Biology an Introduction. Cambridge
University Press. Pgs 315 343. ISBN 978-0-511-07846-0 eBook.
Baranyi, J., Pin, C. and Ross, T. (1999). Validating and comparing predictive
models. International Journal of Food Microbiology 48: 159 166.
Garca, D., Ramos, A.J., Sanchis, V., and Marn, S. (2011). Modelling the
effect of temperature and water activity in the growth boundaries of Aspergillus
ochraceus and Aspergillus parasiticus. Food Microbiology 28: 406 417.
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
x
E
s
t
mx
Obs
x = y
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Judet-Correia, D., Bollaert, S., Duquenne, A., Charpentier, C, Bensoussan, M.,
and Dantigny, P. (2010). Validation of a predictive model for the growth of
Botrytis cinerea and Penicillium expansum on grape berries. International
Journal Food Microbiology 142: 106 113.
Ross, T. (1996). Indices for performance evaluation of predictive models in
food microbiology. Journal of Applied Bacteriology 81: 501 508.

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