Obtencin de cepas del gnero Pseudomonas degradadoras de plaguicidas, a partir de suelos en plantos de papaya Maradol

25 de Mayo de 2012

Obtencin de cepas del gnero Pseudomonas degradadoras de plaguicidas, a partir de suelos en plantos de papaya Maradol
M. en C. Escalante Rendiz Diana Yamily, Br. Chin Lizama Reina Guadalupe, Br. Muoz Gonzlez Dalia Selene, Br. Osorio Tuz Mariana Azucena, Br. Sols Uicab Ilse Victoria,

Universidad Autnoma de Yucatn,

Facultad de Ingeniera Qumica, Microbiologa General
25 de Mayo de 2012

Resumen La contaminacin de los suelos por la presencia de agentes txicos como los plaguicidas constituye un problema ambiental. Actualmente la recuperacin de suelos degradados con la accin de microorganismos constituye una estrategia potencialmente viable. A partir del suelo de un planto de papaya Maradol, se aislaron cepas del gnero Pseudomonas capaces de degradar plaguicida. La muestra tomada del suelo del municipio de Dzidzantn, Yucatn, se someti a un cultivo de enriquecimiento con el plaguicida organofosforado, Dimetoato (Ditiofusfato de O,O-dimetilo, S-(N-metilcarbanol) metilo), como nica fuente de carbono, para consecuentemente aislar los microorganismos en medios de cultivo King A y King B. Para la identificacin de los microorganismos pertenecientes a este gnero, se realizaron pruebas macroscpicas, bioqumicas y fisiolgicas. Se obtuvieron 20 cepas de las cuales, las cepas P06 y P09 dieron resultados que coinciden con las caractersticas correspondientes al gnero Pseudomonas. Palabras clave: Pseudomonas, plaguicida, papaya Maradol, biodegradacin.

Introduccin Los plaguicidas (herbicidas, fungicidas, insecticidas) sonbiocidas y, por lo tanto son sustancias txicas y peligrosas. Esta

peligrosidad afecta al medio ambiente y al consumidor. Son ampliamente utilizados en la agricultura y la industria en todo el mundo debido a su alta actividad (Mostafa, 2010), lo que ocasiona su

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presencia en el agua, en el aire, en la tierra y en los alimentos que ingerimos (Escriche, 2006). El uso indiscriminado de estos compuestos ha producido que en la actualidad se detecten sus residuos en el ambiente, por lo que es urgente el desarrollo de tecnologas simples, de bajo costo y eficientes para la eliminacin in situ de estos contaminantes en el ambiente (OMS, 1998). Existen diversas tecnologas para la destruccin de plaguicidas, que van desde tratamientos fsicos hasta tratamientos biolgicos y procesos avanzados de oxidacin. Una de las medidas biocorrectoras ms empleadas es la utilizacin de microorganismos para la descontaminacin de suelos (Marivela, et al., 2002). Las bacterias del gnero Pseudomonas sintetizan una cantidad de enzimas inusualmente grande y pueden metabolizar una amplia variedad de sustratos. Por consiguiente, es probable que contribuyan de manera significativa a la descomposicin de sustancias qumicas poco frecuentes, como plaguicidas, que se agregan al suelo (Tortora, et al, 2007). Estn ampliamente distribuidas en la naturaleza. Habitan en el agua dulce, el suelo, las plantas, materia orgnica en descomposicin y aguas negras (Fontanillas, et al, 2005). Son bacilos gram negativos, aerobios, que se mueven por medio de flagelos polares (Tortora, et al, 2007). Son capaces de procesar, integrar y reaccionar a una

amplia variedad de condiciones cambiantes en el medio ambiente, y muestran una alta capacidad de reaccin a seales fsico-qumicas y biolgicas (Cornelis, 2008). Algunos cultivos, como los de la papaya Maradol, son cultivos de alta actividad fisiolgica durante la mayor parte de su vida, pues en ella coinciden el rpido crecimiento, la emisin de hojas, flores y frutos, por lo que es evidente que se requiere de altos niveles de fertilizacin y uso de plaguicidas en perodos cortos, dada la produccin temprana y abundante. Por lo tanto en este estudio, se busca obtener Pseudomonas spp. a partir de suelos en plantos de papaya, los cuales sean capaces de degradar los plaguicidas utilizados en dicho cultivo.

Materiales y Mtodos
La muestra de suelo se tom de un planto de papaya Maradol ubicado en el municipio de Dzidzantn, Yucatn, 8 horas antes de su anlisis en el laboratorio. Se mezcl una porcin de la rizsfera de 3 plantas diferentes, tomando la parte del suelo ubicada entre 4 y 10 cm de profundidad (Cornelis, 2008). Se recolectaron aproximadamente 500 g. de muestra. sta se almacen en una bolsa estril hasta el momento de su procesamiento. Para el cultivo de enriquecimiento se tom 250 g de la muestra de suelo y se le aadi 250mL de agua mineral no

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carbonatada esterilizada, con composicin en g/L: , 1.73; , 0.68: , 1; , 0.1; , 0.02; , 0.03; , 0.03, la cual se esteriliz.a 121C por 15 minutos (Carrillo, et al, 2004). Al agua mineral se le agregaron 200 l de plaguicida Dimetoato (Ditiofusfato de O,O-dimetilo, S-(N-metilcarbanol) metilo) y se homogeneiz para dar una concentracin final de 800 ppm. (Gua Uruguaya para la proteccin y fertilizacin vegetal).Se incub el cultivo durante 3 das en una incubadora a 37+ 2C con agitacin constante (Santacruz, et al, 2005). Para el aislamiento de las colonias, se tomaron 10mL del cultivo de enriquecimiento y se mezclaron con 90mL de agua mineral no carbonatada esterilizada. A partir de esta nueva solucin, se realizaron diluciones seriadas tomando 1mL de la solucin anterior (primera dilucin) y se mezcl con 9mL de agua mineral estril hasta obtener una dilucin de10-5. De cada una de las diluciones se tom 0.1mL y se sembr por triplicado mediante la tcnica de extensin en placa sobre el agar King A y King B. El medio de cultivo King A se prepar con la siguiente composicin en g/L: peptona de gelatina, 20; sulfato de potasio, 10; cloruro de magnesio, 1.4; agar, 15 (Pseudomonas agar P). El medio de cultivo King B se prepar con la siguiente composicin en g/L: Triptona de soya, 10; polipeptona 10; fosfato

dipotsico, 1.5; sulfato de magnesio, 1.5; agar, 15 (PseudomonasagarF ). Para la purificacin se tom cada una de las colonias con apariencia distinta y se sembr por la tcnica de estras en su medio correspondiente, dando prioridad a las que presentaron fluorescencia y coloracin amarilla en King B. En el medio de cultivo King A se debe observar un resultado positivo con la aparicin de pigmentos de piocianina (zona de color azul, azul-verdoso que rodea la colonia) y/o piorrubina (zona de color rojo alrededor de la colonia). En el medio King B se debe observar un pigmento de color amarillo, amarillo-verdoso fluorescente que rodea la colonia o se extiende por todo el medio (Romero, 1999). Para la identificacin de las colonias aisladas en los medios King A y King B, se realizaron las siguientes pruebas: Tincin de Gram, oxidasa, catalasa, TSI, motilidad, LIA, MIO y reduccin de nitratos.

Resultados y Discusiones
Se observ crecimiento en los medios de cultivo King A y King B, provenientes del medio de enriquecimiento que contena plaguicida como nica fuente de carbono. Comprobando as, la existencia de microorganismos capaces de degradar el plaguicida Dimetoato (Ditiofusfato de O,O-dimetilo,S-(N-metilcarbanol)metilo). Se han realizado estudios que demuestran la capacidad del gnero Pseudomonas spp como las bacterias ms efectivas para la

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degradacin de las compuestos txicos derivados de las plaguicidas, gracias a que estos microorganismos se alimentan a partir de los tomos de carbono del plaguicida, destrozando las cadenas qumicas que formaban las compuestos txicos hasta transfrmalos en molculas de CO2 y agua (Colin y Beyer, 2008). Segn Xiang, et al, (2009), en su estudio realizado utilizando las tcnicas de cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) y un novedoso modelo que consista en un serie de cuarzo de cristal piezoelctrico (SPQC) fueron exitosamente aplicados para monitorear la degradacin del dimetoato, usado como nica fuente de carbono, en el crecimiento de una especie de Pseudomonas (P. aeroginosa), adems, en este estudio se observ que altas concentraciones del plaguicida puede tener un efecto contraproducente en el crecimiento de este microorganismo debido a que la concentracin mxima de tolerancia del plaguicida es del 2%. Otros estudios, han demostrado que varias especies de Pseudomonas spp. contienen
Cepas Fluorescencia Medio de Cultivo

plsmidos en las que se encuentran codificadas enzimas capaces de degradar, al menos parcialmente, compuestos orgnicos derivados del petrleo y compuestos organoclorados u organofosfatados (Cornelis, 2008). De los microorganismos obtenidos, se purificaron 20 cepas; a 15 se les realiz Tincin de Gram para identificar los posibles microorganismos pertenecientes al gnero de Pseudomonas. Las 5 restantes no mostraron un aislamiento adecuado para realizarles pruebas de identificacin En la Tabla 1, se indican las caractersticas morfolgicas y los resultados de la Tincin Gram de las diferentes cepas aisladas. Puede observarse que no se tom un solo tipo de colonia, ya que algunas especies de Pseudomonas pueden presentar colonias lisas, rugosas, mucoides, redondas, alargadas, con pigmentos verdes, azules, rojos, negros o/y amarillos en agar King A y coloracin amarilla en King B (Romero, 1999).

Caractersticas macroscpicas de la colonia

Caractersticas Microscpicas Tincin Gram Forma

Color P01 P02 P03 P04 P05 P06 + + + + King B King B King B King B King B King B Amarillo huevo Blanca Blanca Blanca Transparente Blanca Amarillo

Apariencia Cremosa Cremosa Cremosa Cremosa Cremosa Cremosa

Tamao 1mm 2mm 1 mm 2 mm 1 mm 2mm

Forma Redonda Redonda Redonda Redonda Redonda Redonda

+ -

Bacilos cortos y anchos Bacilos largos

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P07 P08 P09

+ + -

King B King B King B King B

transparente Blanca Amarillo huevo Amarillo transparente Amarillo huevo

Cremosa Cremosa Cremosa Cremosa con halo transparente alrededor colonia Cremosa Cremosa Cremosa

3mm 1 mm 3 mm

Amorfa Redonda Redonda

y delgados Bacilos largos Bacilos largo Bacilos largos

P10

1mm

Amorfa

Bacilos corto y delgado Bacilos pequeo Bacilos con esporas Bacilos cortos y chicos en cadenas Bacilos pequeos y cortos Bacilos cortos Bacilos largos Bacilos cortos

P11 P12 P13

+ -

King B King B King A

Blanca Blanca Crema transparente Blanca transparente Blanca Crema Blanca Blanca Crema transparente Amarillo huevo

2 mm 1 mm 3 mm

Redonda Redonda Amorfa

+ -

King A P14 P15 P16 P17 P18 P19 P20 King A King A King A King A King A King A

Cremosa Cremosa Seca Seca c/grumos Cremosa Seca Cremosa

1 mm 1 mm cm 1mm 2 mm 1mm mm

Redonda Redonda Amorfa Amorfa Redonda Redonda Redonda

+ + +

+ -

Bacilos largos Bacilos largos pequeos

Tabla 1.-Caractersticas macroscpicas y microscpicas de las 20 cepas aisladas El crecimiento de la cepa no fue adecuado para la realizacin de pruebas bioqumicas.

Con la prueba de Tincin Gram (Tabla 1) fue posible seleccionar las primeras cepas, que posiblemente pertenecan al gnero de Pseudomonas, pues ste grupo de bacterias tienen la caracterstica de ser Gram Negativos (Cornelis, 2008).

Adems, la mayor parte de estas bacterias presentan forma de bacilos delgados, rectos o ligeramente curveados (Figura 1.e), con clulas de una longitud que vara de 1 a 5 m y un espesor de 0.5 a 1 m (Forbes, et al, 2009).

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Figura 1.- Observacin microscpica, Tincin Gram.

a)P06b)P08 c)P09 d)P10 e) Pseudomona aeruginosa ( Centers for Disease Control and Prevention (CDC))
En las 5 imgenes se observan bacilos delgados. Los bacilos de a, b y c son ms largos que los de d .La imagen c) muestra dos colores, es decir gran positivo y negativo, lo que sugiere una contaminacin.

Ocho de las quince cepas resultaron ser Gram Negativos, y de stas slo las cepas P06, P08, P09 y P10 tenan forma de bacilos largos y pequeos (Figura 1). Por

consecuente, se realizaron las dems pruebas bioqumicas a estas cuatro cepas. Los resultados de las pruebas bioqumicas se enuncian en la siguiente tabla:

Tabla 2.Comparacin de los resultados de las cepas P06, P08, P09 Y P10 en las pruebas bioqumicas, con los resultados comunes en
Pseudomonas ssp. (MacFaddin., 2000). Pruebas/ Cepas Oxidasa Catalasa Motilidad Reduccin nitratos LIA (Descarboxilacin lisina) Motilidad MIO Indol Ornitol P06 + + + + + P08 + + + + + + P09 + + + +- * + + + P10 + + + + + + + Pseudomonas spp. + + + + + Movilidad (Difusin del crecimiento en la lnea de siembra) - Indol(No hay cambio de color) +Ornitrinadescarboxilasa(No hay cambio de color)

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Glucosa TSI Lactosa Sacarosa

+ +

+ +

* Las pruebas se realizaron por duplicado. En todas las cepas el resultado fue el mismo en ambas muestras, a excepcin de P09, donde se obtuvieron resultados diferentes en cada muestra.

De acuerdo a los resultados mostrados en la Tabla 2, las cepas P08 Y P10 no pueden pertenecer al gnero de Pseudomonas, pues, a pesar de coincidir con las caractersticas de este grupo de bacterias, en la prueba TSI, presentaron cambios de coloracin del medio, es decir, la fermentacin de sacarosa y lactosa. Las Pseudomonas son bacterias no fermentadoras, por lo que el medio de TSI no debe mostrar cambio de coloracin, pues no hay fermentacin de azucares (MacFaddin, 2003). La diferencia entre los resultados de la cepa P06 en la prueba LIA, con los resultados comunes en Pseudomonas, radica en la posibilidad de que la cepa pertenece a una especie como la P. Oryzihabitans. Algunos estudios sobre esta especie, indican que se obtienen resultados diferentes en las pruebas bioqumicas aplicadas a sta, permitiendo diferenciarla de las dems Pseudomonas. (Tayeb L, et al, 2005). Por tanto, hay una alta probabilidad de que P06 y P09 pertenezcan al gnero de Pseudomonas. Sin embargo, no se puede determinar que sean o no de ste gnero hasta haber realizado una prueba biolgica molecular, usando la Subunidad ADNr 16S, codificada para el gen rrs o

16S ADNr para la identificacin de los microorganismos pertenecientes a este gnero (Gillespie y Hawkey, 2006).As mismo, con P09 sera conveniente realizar otra purificacin para un nuevo anlisis.

Conclusin
Se logr la obtencin de una cepa P06, la cual posee una gran probabilidad de pertenecer al gnero Pseudomonas, sta cepa tuvo la capacidad de sobrevivir en una solucin con una concentracin de 800ppm de plaguicida Dimetoato. Con esto se busca una posible alternativa para la bioremedacin, que permita el uso sustentable de los suelos expuestos a este tipo de plaguicidas. Seria conveniente realizar en un estudio posterior, una cintica de la degradacin del plaguicida Dimetoato por la cepa aislada, as como someterla a otros plaguicidas, para conocer su capacidad de degradacin sobre stos.

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