VARIANTES DE PCR175,80: RT-PCR (reaccin encadena de polimerasa-transcripcin inversa) Se utiliza para la deteccin y amplificacin de ARN.

Permite estudiar la expresin de determinados genes (su traduccin a protenas). En primer lugar se extrae el ARNtotal de las clulas en estudio y se separa la fraccin correspondiente al mensajero (ARNm). Tras purificarlo el ARN se transcribe a ADN mediante una transcriptasa inversa, por cada molcula de ARNm se sintetiza una molcula de cADN monocatenaria que posteriormente se ha de convertir en bicatenaria utilizando una ADN polimerasa (la rTth ADN polimerasa de Thermus thermophilus es un enzima recombinante y termoestable que acta como transcritasa inversa y como ADN polimerasa simultneamente). A partir de aqu se aplica la tcnica de PCR lo que permite una deteccin de la expresin de ARNm mucho ms sensible que con Northern blot o con hibridacin in situl76. La,80. secuencia del fragmento amplificado se determina mediante secuenciacin automtica de ADN. Existen diversos kits comerciales, como Gene Amp de ARN-PCR (Pekin-Elmer, Alemania) que pueden ser utilizados para RT-PCR,50,80 PCR asimtrica Produce fragmentos de ADN de cadena simple al utilizar los dos cebadores necesarios a concentraciones molares distintas en una relacin entre 50/1 y 100/1. as se produce ADN de doble cadena en cantidad exponencial hasta que se agota el cebador minoritario y luego slo se produce la cadena que hibrida con el ADN que se encuentra en exceso, producindose a partir de entonces de forma lineal. De esta forma el producto de PCR contiene 10 a 20 veces ms de ADN monocatenario que de ADN bicatenario. Recuperando exclusivamente el ADN monocatenario se puede utilizar para una secuenciacin directa con la tcnica de Sanger 200,80 PCR anclada Permite la amplificacin de ADN o ARN cuando slo se conoce el extremo 3'de la secuencia de inters. Por ejemplo, el extremo 5' de la regin a amplificar es artificialmente creado aadiendo una cola de nucletido definida utilizando la enzima terminal deoxinucleotidiltransferasa (Tdt). Esta cola, a su vez sirve de secuencia que ahora puede ser reconocida por un iniciador 5'. A partir de aqu se realiza PCR convencional201.

PCR anidada ( "meste" PCR) Se realizan dos PCR consecutivas de 25 a 30 ciclos cada una. En la primera se utilizan un par de cebadores llamados externos; en la segunda se usan cebadores complementarios a secuencias de ADN contenidas en los fragmentos que se amplificaron en la primera PCR (cebadores internos) que flanquean una regin central que es la que queremos amplificar202,80 . La idea que persigue esta tcnica es que los productos de la primera amplificacin son un molde ideal para la segunda amplificacin, mucho mejor que el ADN genmico original203. Dada su enorme sensibilidad, uno de los peligros de esta tcnica es la contaminacin, por lo que su utilizacin es difcil en laboratorios de rutina204. En el estudio de los genes IgH, el ADN genmico puede ser amplificado utilizando oligonucletidos especficos para la regin variable (FR2A) y de unin (LJH). La secuencia obtenida es comparada con la secuencia VH de lnea germinal utilizando programas informticos como HUSAR84. PCR semianidada ("semi-nested' PCR) Es una PCR anidada en la que slo se utiliza uno de los cebadores internos. El mtodo no aade mucha especificidad pero en ciertas aplicaciones aade la suficiente especificidad para conseguir el producto PCR deseado203. De esta forma, para la deteccin de genes IgH reordenados clonalmente puede utilizarse PCR semi-anidada 84. "Drop-In/Drop-Out Nested" PCR Esta tcnica se basa en incluir cebadores internos (anidados) con el punto de fusin significativamente ms bajo que los cebadores externos, lo que evita que esos cebadores internos se hibriden (annealing) durante la primera PCR. Con este mtodo se evita la utilizacin de capas de aceite que de otra forma seran necesarias para separar los reactivos de las dos PCRs203. PCR mltiplex Consiste en hacer diversas amplificaciones en el mismo tubo de reaccin colocando mltiples parejas de cebadores. Las secuencias a detectar han de estar lo suficientemente lejos unas de otras para que las amplificaciones no interfieran entre s8O.

Esta tcnica se utiliza en la deteccin del gen de la distrofina en la distrofia muscular de Duchenne; un gen enorme (de mas de 2 millones de pares de bases), que no es adecuado para ser estudiado mediante anlisis indirecto, y que adems presenta una marcada heterogeneidad en sus mutaciones208. El anlisis de sonda fluorognica, desarrollado en 1997, es un mtodo sencillo que puede ser aplicado a la deteccin de HPV y subtipos en varios tipos de muestras. La tcnica se basa en la actividad 5'->3 exonucleoltica de la Taq polimerasa que aumenta la seal de marcadores fluorescentes al liberarlos de las sondas especificas para esos genomas durante PCR mltiple. Esa fluorescencia puede ser detectada en un fluormetro automtico y se correlaciona con la cantidad de ADN de HPV presente en la muestra antes de la amplificacin209. "Touch-down" PCR Es una reaccin de PCR en dos partes. En la primera parte, que dura 20 ciclos, se empieza con una temperatura de hibridacin elevada y se va disminuyendo hasta la temperatura de hibridacin ptica; esto evita la formacin de dmeros de cebadores en las primeras fases. Luego, en la segunda parte, se hacen otros 20 ciclos ms a la temperatura de hibridacin ptima para que se produzca cantidades masivas de ADN. Se utiliza cuando se trabaja con cebadores degenerados porque es difcil calcular la temperatura de hibridacin ptima8O, tambin es til cuando no se ha determinado exactamente el grado de complementariedad del molde del cebador, pero esta tcnica tiene algunos inconvenientes, como requerir una programacin complicada, sobre todo en las mquinas equipadas para reducir automticamente y progresivamente la temperatura en cada ciclo sucesivo203. "Hot start" PCR Consiste en empezar la PCR a una temperatura elevada. Antes de calentar la muestra ya se puede formar dmeros y uniones inespecficas si la Taq polimerasa est presente. Para evitarlo se aade la Taq polimerasa en ltimo lugar antes de comenzara ciclar, a una temperatura de 95C80. Con la Amplitaq gold de Perkin-Elmers no es necesario este paso porque slo se activa tras el Primer calentamiento16 PCR cuantitativa Se utiliza un segundo objetivo dentro de la muestra que sirve de control interno para la sntesis de cADN y se basa en la competencia de los iniciadores

por las dos secuencias objetivo. Es muy difcil y casi nunca se usa80 PCR "n situ" Consiste en realizar la PCR directamente sobre cortes de tejido o extensiones citolgicas de forma que, posteriormente, se puede detectar los productos de PCR amplificados en el lugar donde se localiza el ADN (o ARN) original en la muestra, en lugar de utilizar un gel o una membrana80 En realidad este trmino se ha utilizado indistintamente para denominar dos tcnicas diferentes: PCR-hibridacin in situ (PISH) Consiste en realizar una PCR sobre el corte de tejido o la extensin citolgica y despus detectar el ADN amplificado mediante hibridacin in situ con sondas complementarias marcadas colorimtricamente (avidina-biotina-peroxidasa). Aunque tcnicamente compleja, es utilizada para detectar la infeccin latente de VIH en cortes histolgicos, por ejemplo, en ganglios linfticos, msculo esqueltico, o crvix, en individuos portadores asintomticos210. Utilizando PCR hibridacin in situ podemos detectar una nica copia de genoma del virus del papiloma humano (HPV) en una clula determinada. Esto permite localizar clulas que contienen el virus en infecciones ocultas94. Utilizando PCR in situ, se ha detectado en ADN del HPV en algunas lesiones no diagnsticas en vulva y pene que fueron negativas para hibridacin in situ, frecuentemente por estar ocultas tras una capa granulosa engrosada focalmente o por hiperqueratosis94. Si el virus no puede ser detectado mediante PCR in situ, es muy improbable que est presente en esa seccin tisular Sin embargo, su complejidad y la prdida de calidad del tejido despus de sucesivos calentamientos y su elevado costo no hacen de la hibridacin in situ una alternativa vlida en el trabajo diario. El virus del sarampin tambin puede ser localizado en tejido gracias a esta tcnica311. PCR in situ (en sentido estricto) Consiste en realizar una PCR sobre el corte de tejido o la extensin citolgica utilizando dNTPs (nucletidos) o cebadores marcados colorimtricamente o con

fluorescencia. En ambos casos es necesario utilizar termocicladores con bloque trmico adaptado a la utilizacin de portas. Para evitar las uniones del ADN en el rea de inters se utiliza irradiacin ultravioleta (y se procede como en la PCR convencional) o se combina PCR con hibridacin in situ, como hemos visto ms arriba. PCR de clula nica Se ha utilizado en el anlisis preimplantacin del gen de la fibrosis qustica en una clula nica extrada de un embrin de ocho clulas212, en el anlisis de esperma y en el estudio de la expresin de genes en clulas de ReedSternberg213. PCR-inmuno Se emplean dos tecnologas, la deteccin basada en anticuerpos y PCR, La deteccin del antgeno por el anticuerpo se ve enormemente potenciada por la conjugacin del sistema de deteccin del anticuerpo con un fragmento de ADN que posteriormente es amplificado mediante PCR. Esta tcnica recuerda a ELISA (anlisis inmuno absorbente ligado a enzima) y permite detectar incluso 10 femtogramos de protena. Una variacin de PCR-inmuno es el empleo de cromgenos unidos a uno de los cebadores o iniciadores, y la posterior determinacin colorimtrica de la cantidad de producto generado214.