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Licence - Unit d'Enseignement 1 - Travaux dirigs d'Enzymologie N1 - E.

JASPARD (Vitesse initiale - L'quation de Michaelis-Menten - Vmax, Km, kcat) Exercice N1. Une enzyme E catalyse la raction d'hydrolyse: A + H2O <=====> B + C On suit la cintique d'apparition du produit C, pour diffrentes concentrations en substrat A. Les valeurs obtenues (en moles de C par tube) sont prsentes dans le tableau suivant: temps (min) 0 2,5 5 7,5 12,5 17,5 [S0] (mM) 30 100 0 0 1,9 3,2 3,9 6,4 5,6 9,6 7,6 15,2 9,1 18,3

10 0 0,9 1,8 2,5 3,7 4,4

150 0 3,6 7,1 10,7 17,6

1. Reprsentez les cintiques et dterminez la vitesse initiale de chacune d'elle. Dans quelle condition de concentration du substrat A s'est-on plac pour suivre ces cintiques? Pourquoi ne se procupe-t-on pas de la concentration de l'eau ? 2. Tracez la courbe de saturation et commentez la. Dterminez les paramtres cintiques de l'enzyme partir de cette reprsentation. 3. Dterminez les paramtres cintiques l'aide de la reprsentation des double inverses. Expliquez la diffrence entre les valeurs dtermines partir de ces deux reprsentations. 4. Les ractions enzymatiques sont effectues dans un tube contenant 1 ml de la solution d'enzyme une concentration initiale de 3 M, le volume ractionnel tant complt par 2 ml de substrat dans le tampon appropri. Calculez les valeurs des paramtres cintiques (exprimez la concentration en molarit). 5. Une unit d'enzyme (U) est la quantit qui hydrolyse 1 mole de substrat par minute. Par ailleurs, l'activit spcifique d'une enzyme est le rapport de l'activit maximale de l'enzyme sa concentration (exprime en mg/ml) dans le milieu ractionnel. Enfin, la masse molaire de l'enzyme E est de 100.000 dalton. Calculez l'activit spcifique en U.mg-1. 6. On considre que l'enzyme a t totalement purifie. Calculez la valeur de la constante catalytique (kcat) en s-1. 7. Si l'enzyme E est une enzyme dite "Michaelienne", quelle constante du schma ractionnel classique pour une telle enzyme correspond cette constante ? Expliquez-en les units. Retrouvez les units de Km sur la base de celles des constantes de vitesse k1, k-1 et k2. Exercice N2. L'tude prliminaire de l'activit de deux enzymes (E1 et E2) vis--vis du mme substrat donne les rsultats suivants: [S0] (mM) E1: vi (M.min -1) E2: vi (M.min -1) 1 0,040 0,270 2 0,078 0,280 3 0,124 0, 275 4 0,160 0,280 5 0,205 0,285

Tracez la courbe vi = f([S0]). Quelles conclusions pouvez-vous en tirer ? Exercice N3. La phosphatase alcaline catalyse l'hydrolyse des esters de l'acide ortho-phosphorique. Pour suivre l'activit enzymatique, on utilise un substrat synthtique, le paranitrophnol-phosphate (M. M. = 371 g.mol-1) qui libre du paranitrophnol (M. M. = 139 g.mol-1) qui absorbe 410 nm avec un coefficient d'extinction pondral: 1% = 1260 g-1.100 mL.cm-1. Chaque raction est effectue dans un volume ractionnel de 10 ml contenant 0,2 ml d'enzyme une concentration initiale de 10 mg/ml. On obtient les rsultats suivants (longueur du trajet optique = 1 cm): [S0] (mg/tube) vi (unit DO.min-1) 0 0 0,26 0,39 0,65 1,50 1,95 3,80 0,147 0,167 0,190 0,212 0,231 0,238

Dterminez les valeurs des paramtres cintiques de cette enzyme vis--vis de ce substrat (on exprimera la concentration en molarit). Calculez l'activit spcifique de l'enzyme avec l'unit de concentration prcise dans l'exercice N1. Exercice N4: (Epreuve TD de Biochimie - Janvier 1999 - 4 points) D'une part, on a purifi une isomrase. D'autre part, on a clon la squence codant cette isomrase dans un vecteur d'expression et transform des bactries. On a fait une culture de ces bactries et induit la synthse protique. Enfin, de l'extrait brut bactrien obtenu, une enzyme recombinante a t purifie que l'on appelle l'enzyme inconnue (Einc). On tudie la raction d'isomrisation d'un substrat S en un produit P, en prsence: - 1re exprience: de l'isomrase seule; - 2me exprience: de l'isomrase ET de l'enzyme inconnue. Pour chaque exprience, on mesure la vitesse initiale de la raction (exprime en nM.s-1) pour diffrentes concentrations [S0] du substrat. Les rsultats sont rsums dans le tableau suivant: vi (nM.s-1) [S0] (M) 0,2 0,4 1 2 1re exprience: [Isomrase] = 10 pM 1,2 1,6 2,1 2,3 2 exprience: [Isomrase] = 10 pM + [Einc] = 10 pM 2,4 3,2 4,2 4,6

1. Pour chaque exprience, dterminez les paramtres cintiques Vmax et KM, partir de la reprsentation graphique de votre choix. Il n'est pas ncessaire de tracer les courbes de saturation. 2. Calculez la valeur de la constante catalytique de l'isomrase (kcatIso). On a dtermin la constante catalytique de l'enzyme inconnue: kcatEinc = 15360 min-1. 3. Un seul paramtre cintique diffre entre les 2 expriences (d'un facteur 2). Lequel et pourquoi ? 4. En conclusion, l'enzyme inconnue dont le gne a t clon est-elle bien l'isomrase ?