CALIFICACiN DE UN SISTEMA DE CLAR

DR JUAN CARLOS VAZQUEZ LIRA DIPLOMADO HPLC 2014

VERIFICACION DE DESEMPEO. El desempeo de un sistema de CLAR se puede evaluar mediante el examen de las funciones clave de los distintos mdulos que componen el sistema, seguido de pruebas holsticas que desafan el desempeo de los componentes de CLAR como un sistema integrado. La prueba holstica que comnmente se conoce como la calificacin de desempeo (PQ). La prueba holstica puede ser tan simple como ejecutar un mtodo frecuentemente utilizado en el laboratorio.

Ensayo modular de varios componentes, que se realiza a menudo en la calificacin de operacin (OQ), puede proporcionar informacin detallada sobre el funcionamiento de los componentes individuales del CLAR. Es importante hacer tanto en el ensayo de componentes individuales como la prueba holstica, para verificar el desempeo del sistema. Los atributos de desempeo comunes para cada mdulo CLAR y las expectativas generales para cada atributo, se enumeran en la Tabla

MODULO DE BOMBEO Exactitud de la velocidad de flujo. Uno de los requisitos de desempeo clave para el mdulo de la bomba es la capacidad para mantener un flujo exacto y consistente de la fase mvil . Esto es necesario para proporcionar interacciones estables y repetibles entre los analitos y la fase estacionaria. Exactitud pobre en el flujo afectar el tiempo de retencin y la resolucin de la separacin.

MDULO DE BOMBEO La exactitud del flujo de la bomba se puede evaluar simplemente mediante el clculo del tiempo necesario para recoger un volumen predeterminado de fase mvil a diferentes ajustes de flujo. Materiales: Frasco volumtrico de 5 o 10 ml Cronometro calibrado Condiciones: Fase mvil: agua desgasificada Sin columna (extremo abierto) * Flujo: ajustado entre 0,5 y 3,0 mL / min Si existen sistemas de mezcla de alta presin estn instalados, esta prueba se tiene que hacer en cada canal de solvente. * Para algunos equipos, por ejemplo, en el caso de caudales bajos, la verificacin se realiza mediante el uso de una columna o de un regulador de contrapresin.

MDULO DE BOMBEO La exactitud del flujo de la bomba se puede evaluar simplemente mediante el clculo del tiempo necesario para recoger un volumen predeterminado de fase mvil a diferentes ajustes de flujo. .

MODULO DE BOMBEO
Materiales: Frasco volumtrico Cronometro calibrado . de 5 o 10 mL

Condiciones: Fase mvil: agua grado HPLC Sin columna (extremo abierto) * Flujo: ajustado entre 0.5 y 3.0 mL/min. Si existen sistemas de mezcla de alta presin estn instalados, esta prueba se tiene que hacer en cada canal de solvente. * Para algunos equipos, por ejemplo, en el caso de caudales bajos, la verificacin se realiza mediante el uso de una columna o de un regulador de contrapresin.

MODULO DE BOMBEO

MDULO DE BOMBEO

MDULO DE BOMBEO

MDULO DE BOMBEO
EXACTITUD Y PRECISION DEL GRADIENTE

Para el anlisis de gradiente, la capacidad de la bomba para suministrar la fase mvil en diversas fuerzas de disolvente a travs del tiempo mediante la variacin de la composicin de la fase mvil con exactitud es crucial para lograr la separacin cromatogrfica adecuada y reproducibilidad. La precisin de funcionamiento del gradiente puede evaluarse indirectamente mediante el control de la desviacin estndar relativa de los tiempos de retencin de los picos en los cromatogramas de las inyecciones repetidas.

MDULO DE BOMBEO
LINEALIDAD DEL GRADIENTE

La exactitud y linealidad del gradiente de disolvente suministrado se puede verificar indirectamente mediante la supervisin del cambio de absorbancia cuando la composicin de los dos disolventes de dos canales diferentes cambia . Gradiente de alta presin se ejecuta por lo general implicando dos sistemas de solventes. Gradiente de baja presin Bombas LC suelen estar equipados con vlvulas dosificadoras cuaternarias, que puede manejar hasta cuatro disolventes.

MDULO DE BOMBEO

La prueba se realizar para dos canales a la vez, bomba LC de gradiente tiene cuatro canales: A, B, C, y D. Canal A se llena con un solvente puro tal como metanol, mientras que el canal B se llena con un disolvente que contiene un trazador UV-activo , tal como la cafena (15 mg por litro de disolvente), una mezcla 99,5: 0,5 (v / v) de metanol y acetona se utiliza a menudo como trazador tambin.

MDULO DE BOMBEO
LINEALIDAD DEL GRADIENTE
El perfil de gradiente est programado para variar la composicin de la mezcla a partir de 100% A a 100% de B en un corto perodo de tiempo, y luego volver a cambiar a 100% de A en una manera escalonada.

MDULO DE BOMBEO
LINEALIDAD DEL GRADIENTE

La exactitud y linealidad del gradiente de disolvente suministrado se puede verificar indirectamente mediante la supervisin del cambio de absorbancia cuando la composicin de los dos disolventes de dos canales diferentes cambia . Gradiente de alta presin se ejecuta por lo general implicando dos sistemas de solventes. Gradiente de baja presin Bombas LC suelen estar equipados con vlvulas dosificadoras cuaternarias, que puede manejar hasta cuatro disolventes.

MDULO DE BOMBEO
LINEALIDAD DEL GRADIENTE

El cambio de absorbancia a partir de 100% A (lnea de base) a 100% de B se mide y se expresa como la altura H en la grafica de absorbancia frente a tiempo .Como el porcentaje de disolvente B disminuye en la mezcla de disolventes, la absorbancia de UV de la mezcla debe disminuir en consecuencia. Si la composicin de la mezcla 20% A y 80% de B es exacta, la altura B1, que corresponde a la absorbancia a 80% de B, debe estar cerca de 80% de la altura H. Del mismo modo, las verificacin de exactitud puede ser determinada en 60%, 40%, 20%, y 0% B.

MDULO DE BOMBEO
LINEALIDAD DEL GRADIENTE

La linealidad del gradiente de entrega puede ser verificada por el trazado de la absorbancia a diferentes composiciones de fase mvil, en comparacin con la composicin terica, El proceso completo puede repetirse para los canales C y D.

MDULO DE BOMBEO

Condiciones: Capilar de acero Inoxidable, por ejemplo, 2000 x 0,12 mm instalado en lugar de una columna
Deteccin: UV-Detector ajustado a 265 nm Fase mvil A: agua grado HPLC. Fase mvil B: agua desgasificada que contiene 0,5% de acetona Velocidad de flujo: 1,0 ml / min

MDULO DE BOMBEO

MDULO DE BOMBEO

MDULO DE BOMBEO Empezar la prueba mediante el bombeo de agua durante al menos 10 min para equilibrar el sistema. El valor de cero% al principio de la prueba es la lnea base. Todas las etapas se miden al comienzo de la parte horizontal de la lnea, ya sea por software o manualmente en el papel de impresin, utilizando una regla

MDULO DE BOMBEO Ondulacin de la composicin de gradiente Es el porcentaje de ruido de la lnea de 50% desde el programa de gradiente.

MDULO DE INYECCIN

Precisin .
La capacidad del inyector para extraer la misma cantidad de muestra en inyecciones repetidas es crucial para la precisin y la exactitud del rea del pico o altura del pico para la cuantificacin por comparacin con el patrn externo. Si la variabilidad de la muestra y el estndar que se inyectan en la columna no se controlan estrictamente, el principio bsico de cuantificacin por estndar externo est seriamente comprometido. Ninguna comparacin significativa entre las respuestas de la muestra y el estndar se pueden hacer. La exactitud absoluta del volumen de inyeccin no es crtico, siempre que la misma cantidad de estndar y la muestra sea inyectada.

MDULO DE INYECCIN

Precisin. La precisin del volumen del inyector se puede demostrar realizando al menos seis inyecciones repetidas de una muestra. La desviacin estndar relativa (RSD%) de la respuesta de las inyecciones se calcula a continuacin para evaluar la precisin.

MDULO DE INYECCIN CARRY OVER ( REMANENTES ).

Pequeas cantidades de analito pueden arrastrarse de la inyeccin anterior y contaminar la muestra siguiente a ser inyectada. El arrastre afectar a la cuantificacin exacta de la muestra subsiguiente. El problema es ms grave cuando una muestra diluida se inyecta despus de una muestra concentrada. Para evitar la contaminacin cruzada de la inyeccin de la muestra anterior, todas las partes del inyector que estn en contacto con la muestra (el circuito de inyeccin, la aguja de inyeccin, y el asiento de la aguja) tienen que ser limpiados eficazmente despus de la inyeccin.

MDULO DE INYECCIN CARRY OVER ( REMANENTES ).

El arrastre se puede evaluar mediante la inyeccin de un espacio en blanco despus de una muestra que contiene una alta concentracin de analito. La respuesta del analito encontrado en la muestra blanco expresada como un porcentaje de la respuesta de la muestra concentrada se puede utilizar para determinar el nivel de contaminacin por arrastre. La cafena puede ser utilizada para la prueba de arrastre de sistema para evaluar el desempeo de un inyector y sirve como un estndar comn para comparar el desempeo de los diferentes inyectores.

MDULO DE INYECCIN

Linealidad.
Muchos inyectores LC automatizados son capaces de variar el volumen de inyeccin. Un volumen variable de muestra ser colocado en un bucle de inyeccin de la muestra mediante una jeringa u otro dispositivo de medicin. La uniformidad del bucle de muestra y la capacidad del dispositivo de medicin para depositar diferentes cantidades de muestra en una proporcin adecuada afectar a la linealidad del volumen de inyeccin.

MDULO DE INYECCIN

La linealidad es importante para los mtodos que requieren el uso de volmenes de inyeccin variables, tales como el mtodo de alto-bajo en la cuantificacin de las impurezas. La linealidad del inyector se puede demostrar mediante inyecciones, tpicamente 5,10, 20, 50, y 100 ul , para cubrir el rango de 0 a 100 ul . La respuesta de la inyeccin se representa en funcin del volumen de inyeccin. El coeficiente de correlacin de la grafica se utiliza en la evaluacin de la linealidad de la inyeccin.

Linealidad.

MDULO DE INYECCIN

Linealidad.

MDULO DE INYECCIN

Linealidad.

MDULO DE DETECCIN
UV-V Exactitud de la Longitud de onda Se define como la desviacin de la lectura de longitud de onda en una banda de absorcin o emisin de la longitud de onda conocida de la banda. Los efectos perjudiciales de la desviacin de la longitud de onda en la evaluacin cualitativa y cuantitativa de UV-Vis son las que se revisaron respecto al espectrofotmetro UV-V. La exactitud y la sensibilidad de la medicin se vern comprometidas si hay un problema de exactitud de longitud de onda.

MDULO DE DETECCIN
UV-V Para los ensayos de impurezas, el analito principal y las impurezas relacionadas puede tener un perfil UV muy similar. Un cambio en la longitud de onda de deteccin de la configuracin ptima requerida por el mtodo puede tener un gran efecto en la cuantificacin de las impurezas en relacin al pico principal.

MDULO DE DETECCIN
UV-V

Para los detectores con una funcin de verificacin de longitud de onda, la lnea de deuterio a 656 nm o las bandas de absorcin a 360, 418, 453, y 536 nm en un filtro de xido de holmio se utilizan a menudo. La lnea de deuterio y de las bandas de xido de holmio son fciles de usar, pero se limita al rango visible. La verificacin de longitud de onda del rango UV, donde se realizan la mayor parte de anlisis cuantitativos, se puede realizar llenando una celda de flujo con una solucin de un compuesto con un espectro de absorcin UV bien caracterizado . La solucin se escanea en busca de la absorcin mxima y la mnima.

MDULO DE DETECCIN

UV-V El valor max o min del espectro se compara entonces con el valor conocido o max min del compuesto para determinar la exactitud de longitud de onda. Solucin acuosa de cafena (12,5 mg / ml), que es fcil de preparar y manejar, con max a 272 y 205 nm y min a 244 nm , se puede utilizar. Aceptacin. 1 nm en el rango UV (200 a 380 nm ).

MDULO DE DETECCIN
UV-V Si estn incorporados en los procedimientos de ensayo para la determinacin y el ajuste de exactitud de longitud de onda, siga las instrucciones del manual del instrumento. En todos los dems casos usar el procedimiento descrito a continuacin.

Condiciones: Fase mvil: 15% de acetonitrilo en agua Columna: RP18, 5 m 30-50 x 2,1-4.6 mm o capilar 2,0 m x 0,12 mm ID Temperatura del horno: 40 C Velocidad de flujo: 1,0 ml / min (ajustado mediante el uso de 15% de acetonitrilo en agua) Deteccin: anlisis de 230 nm a 290 nm (DAD) Volumen de inyeccin: 20 l

MDULO DE DETECCIN
UV-V Mtodo: DAD: Inyectar 20 l de la solucin de cafena y registrar el espectro. El mximo es a 272 nm y el mnimo a 244 nm . UV / VIS: llenar la celda con la solucin de antraceno y cambiar la longitud de onda de 248 a 254 nm en pasos de 1 nm ; grabar el mximo de absorcin. El valor terico es de 251 nm . Lmites: 2 nm

MDULO DE DETECCIN

MDULO DE DETECCIN

Linealidad de la respuesta. Dado que el analito en las muestras de inters puede variar en concentracin, la capacidad de un detector para producir una respuesta lineal al variar la concentracin dentro de un rango razonable, es importante para la exactitud de rea de pico y la para comparacin entre estndares y muestras. La linealidad de la respuesta del detector puede ser comprobado con una serie de soluciones estndar de varias concentraciones. Las soluciones acuosas de cafena son convenientes para la medicin de linealidad.

MDULO DE DETECCIN

Linealidad de la respuesta. El intervalo de concentracin normalmente debe generar respuestas desde cero a 1,5 UA. Absorbancia superior a 1,5 UA son ms propensos a la desviacin por luz parsita. Desde la grafica de respuesta frente a la concentracin de las soluciones, el coeficiente de correlacin entre la concentracin de la muestra y la respuesta se puede calcular para determinar la linealidad

MDULO DE DETECCIN
Linealidad de la respuesta.

MDULO DE DETECCIN
Linealidad de la respuesta.

MDULO DE DETECCIN
El ruido y la deriva electrnica
La bomba y el ruido fotomtrico; intensidad baja de la lmpara, una celda de flujo sucia, y la inestabilidad trmica contribuyen al ruido global y la deriva en el detector. El ruido excesivo puede reducir la sensibilidad del detector y por lo tanto afectan a la cuantificacin de los analitos de bajo nivel. La precisin de los datos est relacionada con la relacin de seal a ruido. La deriva del detector puede afectar la determinacin de la lnea base y la integracin del pico La mayora del software cromatogrficos son capaces de calcular el ruido del detector y la deriva. Las fluctuaciones de temperatura se deben evitar durante la prueba.

MDULO DE TERMOSTATIZACIN
La eficiencia de una columna de CLAR vara con la temperatura de la columna. La retencin se reduce en 1 a 3% por cada aumento de 1 C [17]. La capacidad de mantener estable y exacta la temperatura de la columna es fundamental para lograr el tiempo de retencin deseado y los requerimientos de resolucin en la separacin consistentemente. Incluso para la separacin realizada a temperatura ambiente, el termostato de la columna tambin se puede utilizar para mantener una temperatura de la columna estable para evitar que el tiempo de retencin de pico se desplaza debido a la variacin de temperatura en el tiempo debido al aire acondicionado y ciclos de calefaccin / refrigeracin.

MDULO DE TERMOSTATIZACIN

La exactitud de la temperatura del calentador de columna se evala colocando un termmetro calibrado en el compartimento de la columna para medir la temperatura real del compartimiento. Las lecturas del termmetro se comparan a la temperatura predefinida en 40 y 60 C. Muchos fabricantes de equipos LC tiene los requerimientos fijados a 2 C.

MDULO DE TERMOSTATIZACIN

Exactitud de la termostatizacion Materiales: Termmetro calibrado Mtodo: Establecer la temperatura del horno de columna a 40 C, esperar unos 30 minutos para equilibrar el sistema, poner un termmetro calibrado en el horno y leer la temperatura despus de 10 minutos. Lmites: 38 - 42 C.