AUSENCIA DE Escherichia coli O157:H7 EN MUESTRAS AMBIENTALES

Belloso Claudio

Belloso Claudio Mendoza 4197 - 2.000 Rosario - Argentina Tel-Fax: 041-380853 e-mail: belloso@satlink.com

Palabras Claves: Escherichia coli O157:H7, Sndrome Urmico Hemoltico, Verocitotoxina.

RESUMEN Se investig la presencia de Escherichia coli O157:H7 en 529 muestras ambientales provenientes de distintas regiones, industrias e instituciones de la zona conformadas por 493 muestras de aguas, 25 muestras de aire ambiental y 10 muestras de suelos. El resultado fue negativo, en ninguna de las muestras analizadas se pudo encontrar esta bacteria. La ausencia de Escherichia coli O157:H7 en las muestras analizadas podra obedecer tanto a factores ambientales como a inhibiciones competitivas por parte de la flora de acompaamiento.

INTRODUCCION
Desde hace tiempo, la bacteria Escherichia coli es considerada uno de los indicadores microbiolgicos de contaminacin fecal ms importantes. En el medio ambiente se la suele encontrar preferentemente en aguas contaminadas con materia fecal, suelos y en todo aquello que pueda tomar contacto con estos, como por ejemplo, los alimentos. El trmino descriptivo Escherichia coli comprende un grupo diverso de microorganismos que pueden infectar cualquier sistema del husped y producir un vasto nmero de factores de virulencia que varan desde caractersticas estructurales hasta toxinas excretadas. Se han descripto hasta el presente, cuatro cepas patgenas de E. coli, Enteropatgena (EPEC), Enterotoxignica (ETEC), Enteroinvasiva (EIEC) y Enterohemorrgica (EHEC) (1). Escherichia coli O157:H7 es el prototipo del grupo de EHEC, produce una toxina llamada verocitotoxina o shiga-like toxin. Se conocen dos tipos: VT1 (SLT-I) y VT2 (STL-II). Estas verocitotoxinas han sido asociadas con tres sndromes humanos: diarrea acuosa, colitis hemorrgica y el Sndrome Urmico Hemoltico (SUH) (2). El SUH comprende una anemia hemoltica microangioptica, trombocitopenia e insuficiencia renal aguda. Los nios menores de 5 aos y los adultos mayores de 60 aos constituyen los grupos de riesgo para el SUH (3). Argentina posee una tasa de incidencia anual de 7,8/100.000 nios menores de 5 aos, la ms alta del mundo (3). Las infecciones en humanos estn asociadas al consumo de alimentos contaminados como carnes y leches no pasteurizadas. Relevamientos epidemiolgicos mostraron que el ganado vacuno puede excretar VTEC en sus heces, representando as un importante reservorio y fuente de infeccin. E. coli O157:H7 es considerado patgeno para humanos desde 1982, despus de la investigacin de dos brotes producidos en Estados Unidos asociados al consumo de hamburguesas en restaurantes pertenecientes a una cadena de comidas rpidas (3). El 5 de Julio de 1995, el Winnebago Country Health Department (WCHD) de Illinois, recibi un reporte de un Hospital local el cual notificaba la infeccin de 5 nios residentes en Rockford con E. Coli O157:H7. Una entrevista realizada a los padres de los chicos no revel una fuente comn en los alimentos consumidos, sin embargo, coincidentemente, todos los nios haban concurrido a un parque de Illinois y haban nadado en el lago del parque. Finalmente, luego de un arduo trabajo de investigacin epidemiolgica, se determin que la fuente de contagio podra haber sido el agua del lago (7). A principios del ao 1996, en Argentina, se notificaron varios casos de SUH en nios. En la mayora de stos casos no se pudo determinar el medio de contagio, por lo cual varios efectores de salud comenzaron a desconfiar de su transmisin a travs del agua.

OBJETIVO

Investigar la presencia de este serotipo no slo en aguas sino tambin en suelos y aerosoles producidos en plantas de tratamiento de efluentes industriales.

MATERIALES Y METODOS
Se analizaron un total de 528 muestras ambientales provenientes de distintas regiones, industrias e instituciones de la zona conformadas por 493 muestras de aguas, 25 muestras de aire ambiental y 10 muestras de suelos. Las muestras de aguas estaban compuestas por 118 muestras de aguas de pozo, 103 muestras de aguas superficiales tratadas, 26 muestras de aguas de arroyos, 38 muestras de agua superficial extradas del Ro Paran, 18 muestras de agua de lagos artificiales, 17 muestras de efluentes lquidos industriales y 173 muestras de agua de pileta de natacin. En las muestras de aguas se realizaron las siguientes determinaciones: recuento de bacterias aerobias hetertrofas, Coliformes Totales, Escherichia coli, presencia de Escherichia coli O157:H7 y Pseudomonas aeruginosa (4). El recuento de bacterias aerobias hetertrofas se realiz en Plate Count Agar (Merck) por la tcnica de volcado (4), las placas fueron incubadas a 35C durante 48 horas, el resultado se expres en UFC/ml. Los Coliformes totales se determinaron por la tcnica de los tubos mltiples (Nmero Ms Probable) (4) en Caldo Fluorocult Brila (Merck) con tubos Durham que se incubaron durante 48 h a 35C. Se consider positivo para Coliformes a todos aquellos tubos en los que se determin presencia de gas en tubos Durham. Se determin luego la fluorescencia a la luz UV emitida por aquellos tubos positivos para coliformes. A los tubos con fluorescencia positiva se les agreg el reactivo de Kovacs para determinar la formacin del Indol. Se consideraron positivos para E. coli aquellos tubos en los cuales se observ formacin de gas, fluorescencia y test del Indol positivo. Para investigar la presencia de E. coli O157:H7 se tom 1 ml de caldo Fluorocult Brila de cada uno de los tubos positivos y negativos del ensayo para Coliformes una vez cumplimentado las 48 horas de incubacin, siempre antes de realizar el test del indol. Se reunieron las porciones de caldo extradas en un tubo de ensayo estril. De ese caldo se tomaron ansadas y se procedi a hacer estriados en Agar Mac Conkey Sorbitol (Difco) y Fluorocult E. coli O157:H7 Agar (Merck). Las placas se incubaron a 35C durante 24 horas. Se consideraron sospechosas a todas aquellas colonias no fermentadoras de sorbitol en Agar Mac Conkey Sorbitol. En el agar Fluorocult O157:H7 (6), se consideraron sospechosas a todas aquellas colonias verdosas que no demostraron ser fluorescentes a la luz UV. Dichas colonias sospechosas en ambos medios fueron repicadas a un medio nutritivo slido inclinado como el Agar Tripticase Soya (Merck) e incubadas a 35C durante 24 horas para luego someterlas a ensayos primarios presuntivos tales como Agar Hierro Tres Azcares (Merck), Citrato de Simmons (Merck), Caldo MR-VP (Merck) y Medio SIM (Merck). En algunos casos se procedi a inocular tiras API (BioMrieux) con los cultivos puros aislados oportunamente. Finalmente se procedi a realizar la serologa correspondiente a todas aquellas colonias aisladas de los distintos agares que demostraron tener un esquema de fermentacin similar al de E. coli (8). Se emplearon los sueros de Difco, Bacto E. coli O Antiserum O157 y Bacto E. coli H Antiserum H7. Se sigui la metodologa descripta en el prospecto de los mismos. Como ensayo de control positivo, se sembraron artificialmente muestras diversas de aguas con la cepa E. coli O157:H7 ATCC 35.150. Se sigui el mismo procedimiento de recuperacin anteriormente descripto. La recuperacin de E. coli O157:H7 de las muestras de agua inoculadas artificialmente fue aproximadamente del 90 %. La investigacin de Pseudomonas aeruginosa se realiz por la tcnica de los tubos mltiples en caldo Asparagina. Se consideraron positivos presuntivos a todos aquellos tubos que emitieron fluorescencia al ser irradiados con luz ultravioleta luego de 24h de incubacin a 35C, su confirmacin se llev a cabo en caldo Acetamida. Todos aquellos tubos en los cuales se constat el uso de Acetamida luego de 36h de incubacin a 35C fueron considerados positivos para Pseudomonas aeruginosa. Se tomaron 25 muestras del aire ambiental perifrico de plantas de tratamiento de efluentes lquidos. Cada muestra estuvo compuesta por 18 placas de Petri con agares solidificados, el tiempo de exposicin a placa descubierta fue de 15 minutos (5). Los agares empleados fueron los siguientes: Plate Count Agar

(Merck), Agar Mac Conkey Sorbitol (Difco), Fluorocult E. coli O157:H7 Agar (Merck), Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (Merck), Agar Mac Conkey (Merck), Agar Violeta Rojo neutro Bilis (Merck). Las placas se incubaron a 35C durante 24 horas. Se hicieron los correspondientes recuentos de las colonias y se aislaron e identificaron las colonias sospechosas de ser Escherichia coli O157:H7. Se analizaron 10 muestras de suelos provenientes de industrias diversas de la zona en las cuales se investig Coliformes Totales, Fecales y E. coli O157:H7. Se hicieron diluciones decimales del suelo en agua destilada estril y se sembraron en tubos que contenan Caldo Fluorocult Brila con tubo Durham. Se incubaron a 35C durante 48 horas. De tubos positivos para coliformes se hicieron estriados en Agar Mac Conkey Sorbitol (Difco) y Fluorocult E. coli O157:H7 Agar (Merck), se incubaron a 35C durante 24 horas. Se aislaron e identificaron las colonias sospechosas de ser E. coli O157:H7. Finalmente se procedi a realizar la serologa correspondiente a todas aquellas colonias aisladas de los distintos agares que demostraron tener un esquema de fermentacin similar al de E. coli.

RESULTADOS
Muestras de agua
TIPO DE AGUA ANALIZADA N DE MUESTRAS ANALIZADAS N DE MUESTRAS APTAS N DE MUESTRAS NO APTAS N DE MUESTRAS QUE CONTIENEN COLIFORMES TOTALES N DE MUESTRAS QUE CONTIENEN E. coli N DE MUESTRAS QUE CONTIENEN E. coli O157:H7

AGUA DE POZO (i) 118 AGUA SUPERFICIAL TRATADA (i) 87 (74%) 31 (26%) 23 (19,5%) 4 (3,38%) 0 (0%)

103

74 (71,8%)

29 (28,1%)

10 (9,7%)

1 (0,97%)

0 (0%)

AGUA DE ARROYOS (ii)

26

26 (100%)

26 (100%)

26 (100%)

0 (0%)

AGUA DEL RIO PARANA (ii)

38

38 (100%)

38 (100%)

38 (100%)

0 (0%)

AGUA DE LAGOS (ii)

18

18 (100%)

18 (100%)

18 (100%)

0 (0%)

EFLUENTES LIQUIDOS INDUSTRIALES (iii) AGUAS DE PILETAS DE NATACION (iiii)

17

6 (35,3%)

11 (64,7%)

10 (58,8%)

8 (47%)

0 (0%)

173

154 (89%)

19 (11%)

13 (7,4%)

1 (0,57%)

0 (0%)

( ) Porcentajes referidos al nmero total de muestras analizadas. Las condiciones de Apto o Inapto desde el punto de vista microbiolgico para los distintos tipos de agua se asignaron de acuerdo a las reglamentaciones vigentes segn: (i) Cdigo Alimentario Argentino. (ii) Environmental Protection Agency. Water Quality Criteria Documents, Availability. USA. 1980. (iii) Normas vigentes en la provincia de Santa Fe, Argentina, para el vertido de lquidos residuales. Ley 8711/80 - Control de la Contaminacin, Cap. XII, art. 41. (iiii) Decreto N 38.871 de la Direccin General de Bromatologa del Municipio de Rosario. Argentina. La denominacin agua superficial tratada se refiere a que ha recibido un tratamiento de potabilizacin convencional

Muestras de aire
N DE MUESTRAS ANALIZADAS N DE MUESTRAS QUE CONTIENEN COLIFORMES TOTALES N DE MUESTRAS QUE CONTIENEN E. coli N DE MUESTRAS QUE CONTIENEN E. coli O157:H7 BACTERIAS AISLADAS EN LA MAYORA DE LAS MUESTRAS PERTENECIENTES A LA FLORA DE ACOMPAAMIENTO Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Plesiomonas shigelloides Proteus mirabilis Aeromonas hydrofila

25

21 (84%)

21 (84)

0 (0%)

Muestras de suelo
N DE MUESTRAS ANALIZADAS N DE MUESTRAS QUE CONTIENEN COLIFORMES TOTALES N DE MUESTRAS QUE CONTIENEN E. coli N DE MUESTRAS QUE CONTIENEN E. coli O157:H7 BACTERIAS AISLADAS EN LA MAYORA DE LAS MUESTRAS PERTENECIENTES A LA FLORA DE ACOMPAAMIENTO Acinetobacter calcoaceticus var. anitratus Pseudomonas spp.

10

10 (100%)

3 (30%)

0 (0%)

DISCUSION
La ausencia de Escherichia coli O157:H7 en las muestras analizadas podra obedecer tanto a factores ambientales como a inhibiciones competitivas por parte de la flora de acompaamiento. El ganado vacuno excreta de por s grandes cantidades de este serotipo con sus heces, evidentemente el curso receptor de stas debera contenerlo. Puede ocurrir que las condiciones ambientales permitan posiblemente que la bacteria se encuentre en forma viable, pero no cultivable. Su transmisin a travs del agua todava sigue siendo un mecanismo no dilucidado an, aunque a modo de reflexin, si se transmitiera fcilmente a travs del agua debera haber ms casos notificados y de acuerdo a relevamientos epidemiolgicos no los hay.

BIBLIOGRAFIA
(1) Cahoon FE, Thompson JS. Frecuency of Escherichia coli O157:H7 isolation from stool specimens. Can J Microbiol 31:915, 1987. (2) Bell BP, Goldoft M, Griffin PM, et al. A multistate outbreak of Escherichia coli O157:H7 associated bloody diarrhea and hemolytic uremic syndrome from hamburgers: the Washington experience. JAMA 1994; 272:1349-53. (3) Rivas M. Escherichia coli productor de verocitotoxina en alimentos de origen animal. VII Congreso Argentino de Microbiologa. Buenos Aires. 1995.

(4) American Public Health Association. Standards Methods for the Examination of Water and Wastewath ter, APHA, 18 . ed., New York, 1992. (5) Environmental Protection Agency. Federal Register. Rules and Regulations USEPA, Air quality criteria documents. vol. 50, N 224:25345-25348. USA. 1989. (6) Szabo RA, Todd EC, Jean A. Method to isolate E. coli O157:H7 from food. J. Food Prot., 10: 768 772. 1986. (7) Lake-Associated Outbreak of Escherichia coli O157:H7. Illinois, 1995. Centers for Disease Control and Prevention. Morbidity and Mortality Weekly Report MMWR 45(21):437-444, 1996. (8) Holt JG, Krieg NR, Sneath PH, Staley JT, Williams ST. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology 9th ed., Baltimore, Williams & Wilkins, 1994.