ACTIVIDAD ENZIMATICA Objetivo: Observar el comportamiento de la enzima ante diferentes concentraciones de sustrato.

Introduccin: El estudio de las velocidades de reaccin con una enzima y la forma en que cambia en respuesta a cambios en los parmetros experimentales se conoce como cintica enzimtica y es uno de los mtodos ms antiguos para conocer el mecanismo enzimtico. La velocidad de una reaccin bioqumica se define como el cambio de la concentracin de un reactante o producto por unidad de tiempo. El estudio cuantitativo de la catlisis enzimtica, se denomina cintica enzimtica porque proporciona informacin sobre las velocidades de reaccin. Los estudios cinticos miden tambin la afinidad de las enzimas por los sustratos y los inhibidores, y proporciona informacin sobre los mecanismos de reaccin. La cintica enzimtica tiene varias aplicaciones prcticas, que incluyen una mejor comprensin de las fuerzas que regulan las rutas metablicas y el diseo de tratamientos adecuados. Lo primero que se observo del comportamiento de las enzimas, fue el efecto poco comn de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de reaccin enzimtica. Para estudiar las velocidades de reaccin se mezclan la enzima y el sustrato en una solucin adecuada amortiguadora a una temperatura fija. Uno de los factores clave que afecta a la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima es la cantidad de sustrato presente. Pero el estudio de los efectos de la concentracin de sustrato es complicado debido al hecho de que la concentracin de sustrato cambia durante el transcurso de una reaccin a medida que el sustrato se convierte en producto. Una aproximacin consiste en medir la

velocidad inicial cuando la concentracin de sustrato es generalmente mucho mayor que la concentracin de enzima. En estas circunstancias, si el tiempo es suficientemente corto despus del inicio de la reaccin, los cambios en la concentracin de sustrato son insignificantes por lo que se puede considerar que la concentracin de sustrato es constante complejo enzima sustrato constituye la clave para comprender el comportamiento cintico. En una reaccin catalizada por una enzima, el enzima existe en dos formas, la forma libre o sin combinar enzima y la forma combinada enzima- sustrato. A baja concentracin de sustrato, la mayor parte de la enzima estar en la forma sin combinar enzima. Aqu la velocidad ser proporcional a la concentracin de sustrato. La mxima velocidad inicial de la reaccin catalizada se observa cuando todo el enzima este virtualmente como complejo ES y la concentracin de enzima sea extremadamente pequea. En estas condiciones el enzima esta saturado con su sustrato de modo que el aumento adicional de concentracin de sustrato no tiene efecto sobre la velocidad. Esta condicin se produce cuando la concentracin de sustrato es suficientemente alta, de modo que todo el enzima libre se convierte en la forma Es. Cuando el complejo ES se descompone dando el producto, el enzima queda libre para catalizar otra reaccin, el efecto de saturacin es una caracterstica distintiva de la catlisis enzimatica. Con concentraciones relativamente bajas de sustrato, la velocidad inicial de la reaccin aumenta conforme se aade mas sustrato; pero con concentraciones mas altas, el aumento en la velocidad es cada vez mas lento hasta el punto en que la velocidad se hace constante sin importar cuanto sustrato este presente, al graficar la curva tiene forma de una hiprbola. La velocidad constante se define como la velocidad mxima. Este comportamiento cataltico lo observamos

en la mayora de las enzimas, se puede describir como un efecto de saturacin de sustrato. Los investigadores que analizaron y explicaron la forma de esta curva de velocidad fueron los bioquimicos Leonor Michaelis y Maud Menten. En 1913 propusieron una teoriza general de la accin enzimatica y desarrollaron una ecuacin matemtica para expresar la forma hiperblica de la curva y calcular las constantes de velocidad:

Vo = Vmax {S} KM + {S}

Ellos propusieron que las molculas de enzima y las de sustrato se combinan en forma reversible y por etapas para formar un complejo ES. El complejo ES tiene dos posibles destino: revertirse, liberando la enzima y el sustrato, o proceder por medio de una reaccin reversible para formar la enzima libre y un producto.

CATALASA Los antioxidantes pueden ser enzimas que aumentan la velocidad de ruptura de los agentes oxidantes (radicales libres). La catalasa es una enzima que protege a las clulas frente al perxido de hidrgeno producido en el metabolismo del oxgeno. Qumicamente, la catalasa es una hemoprotena de estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4 tomos de hierro de la molcula estn en estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. La actividad catalasa se detecta aadiendo unas gotas de perxido de hidrgeno (3%) El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el

perxido de hidrgeno es letal para las clulas bacterianas. Acta cuando la concentracin de perxido de hidrgeno es muy grande (peroxixomas). [pic] Si la concentracin de agua oxigenada es muy pequea no acta la catalasa, Fue una de las primeras enzimas purificadas y ha sido muy estudiada. Es una de las enzimas ms eficientes con una velocidad de aproximadamente 200,000 transformaciones/segundo/subunidad.

CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES La catalasa es una de las enzimas ms abundantes en la naturaleza y se encuentra ampliamente distribuida en el organismo humano, aunque su actividad vara en dependencia del tejido; sta resulta ms elevada en el hgado y los riones, ms baja en el tejido conectivo y los epitelios, y prcticamente nula en el tejido nervioso. A nivel celular se localiza en las mitocondrias y los peroxisomas, excepto en los eritrocitos, donde se encuentra en el citosol. En algunas especies la catalasa contiene molculas de nicotinamn adenn dinucletido fosfatado en su forma reducida (NADPH) ligadas estrechamente a la enzima; as se ha demostrado que la catalasa humana est ligada a 4 molculas de NADPH, 1 en cada subunidad y que no existe interaccin directa entre el grupo hemo y el NADPH.4 El NADPH unido a la enzima no est involucrado en su actividad cataltica o peroxidativa. Esta molcula puede intervenir en la prevencin y reversin parcial de la inactivacin de la catalasa por su propio sustrato txico y estabiliza a la enzima por tener un efecto alostrico (cambio) sobre su conformacin. Adems, la catalasa constituye un reservorio de NADPH, lo cual juega un importante papel durante el estrs oxidativo.

FUNCION ENZIMATICA Esta enzima se caracteriza por su alta capacidad de reaccin pero relativamente poca afinidad por el sustrato. Presenta 2 funciones: la cataltica y la peroxidativa. Ambas se pueden representar por la ecuacin: H2O2 + H2R ---------- 2H2O La reaccin general entraa la reduccin del sustrato tomando los tomos de hidrgeno aportados por el donador, y los productos finales seran el sustrato reducido y el donador oxidado. En la funcin cataltica, el donador es otra molcula de H2O2. Esta funcin slo puede ser realizada por la enzima en su forma tetramrica. H2O2 + H2O2 ----- 2H2O + +O2 El peroxido de hidrogeno formado por la superoxido dimutasa y por las oxidasas flavino dependientes, se descompone por la accin de la enzima catalasa, el agua oxigenada o perxido de hidrgeno se transformar en agua y oxgeno. El desprendimiento de oxgeno se pone de manifiesto como un intenso burbujeo. La accin protectora de la catalasa esta probablemente favorecida por el cido ascrbico, el glutation y la vitamina E, que aceptan fcilmente electrones y pueden ejecutar una funcin de apoyo eliminando radicales libres. La actividad de la catalasa puede ser inhibida por el cianuro, la azida, el sulfuro, la hidroxilamina, el paracetamol, la bleomicina, la adriamicina y la benzidina.

Hiptesis: Si la concentracin del sustrato (H2O2) es mayor entonces se espera que la velocidad de la reaccin se incremente de forma significativa.

Material: 4 Tubos de ensaye grandes

 2 Tubos de vidrio de 5 cm. (aprox.) o dos pipetas Pasteur despuntadas 2 Tapones de goma horadados Piceta Manguera de Ltex Cristalizador grande 2 Vasos de pp. De 100ml. 3 Pipetas de 10ml. 1 Mortero Hgado grande de pollo Agua oxigenada Reloj con segundero Pistola de silicn Navaja o cuchillo pequeo Marcador indeleble Masking tape

Reactivos:

Agua destilada Solucin amortiguadora (PBS)

Procedimiento:

Montaje del experimento

1. Introducir el tubo de vidrio de 5cm. a travs del tapn horadado y conectar al tubo numero

1 (tubo de ensaye grande) verificando que no existan fugas 2. Llenar por completo el tubo de vidrio nmero 2 (tubo de ensaye grande) y colocarlo invertido dentro del cristalizador lleno de agua. 3. Conectar ambos tubos por medio de una manguera.

Actividad de la catalasa

1. Cortar el tejido en trozos pequeos y macerarlo con un poco de solucin amortiguadora (aprox. 20 ml.). Esta suspensin ser la solucin de la enzima. 2. Preparar cada uno de los experimentos de acuerdo con la siguiente tabla. 3. Colocar en un tubo de ensaye agua oxigenada y agua destilada en las proporciones indicadas. 4. Colocar en cada experimento 1ml. De la solucin de enzima y cerrar a presin con el tapn horadado, para recibir el oxigeno en el tubo lleno de agua. 5. Marcar el volumen de oxigeno producido cada 10s en el tubo sumergidos en el cristalizador, hasta que se haya desplazado por completo el agua o hasta que despus de dos minutos no incremente el volumen de oxigeno. 6. Realizar, de ser posible, los experimentos por duplicado. 7. Con los resultados obtenidos realizar una grafica de cintica enzimtica de acuerdo con los parmetros de Michaelis Menten

|Experimento

|Agua destilada (ml) | |0

|Agua destilada (ml)

Solucin de enzima (ml) |1 | |2 | |3 |3 |4 |5

|1

|1

|1

|2

|1

| |4 |1 |5 | |6 | |0 |5 |1 |1 |2 | |4 |1 |3

Resultados: |EXPERIMENTO |AGUA |LIBERACION DE|PRUEBA 2 | |DESTILADA | |AGUA OXIGENDA|SOLUCION DE |PRUEBA 1 |LIBERACION DE| |ENZIMA(ML) |TIEMPO(s) |OXIGENO

(mm3)|TIEMPO (S) |OXIGENO (mm3)| | |1 |2 | | | |3 | | | | | |4 | | | | |2 | | |3 | | |1 |10 |20 |0 |61 |71 |0 |10 |20 |0 |54 |76 |0 | | | | | | | | | | |3 | | | | |(ml) |5 |4 | | | |2 | | | | | |0 |1 | | | |1 |10 |20 | | | | | |1 |1 |10 |20 |30 |0 |44 |47 | |10 |0 |11 |20 |21 |0 |10 |20 |30 |40 | |0 |0 |10 |20 |30 |0 |34 |41 |44 |46 | | | |10 |0 |13 |21 |23 |0 | | | |0 |0 | | | | | |

| | | | |5 | | | | |6 | | |

| | | | |1 | | | | |0 | | | |30

| | | | |4 | | | | |5 | | | |121 |

| | | | |1 | | | | |1 | | | | |

|30 |40 |50 |60 |0 |10 |20 |30 |40 |0 |10 |20 | |

|74 |76 |78 |81 |0 |64 |70 |83 |92 |0 |75 |118

|30 |40 |50 |60 |0 |10 |20 |30 | |0 |10 |20

|79 |83 |88 |92 |0 |66 |73 |87 |95 |0 |73 |116 |

| | | | | | | |

| | |

|40

|123

Discusin: Como ya se menciono anteriormente los antioxidantes pueden ser enzimas que aumentan la velocidad de ruptura de los agentes oxidantes (radicales libres). La catalasa es una enzima que protege a las clulas frente al perxido de hidrgeno que se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aerbico de los hidratos de carbono. Ya que si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal.

En el experimento uno solo se coloco 5 ml de agua destilada y se puede observar como la catalasa no posee afinidad hacia esta sustancia, pues no se libero oxigeno y por tanto no hubo reaccin.

En el experimento dos se agreg slo 1 ml de H2O2 y 4 ml de agua destilada en 1ml de solucin de enzima. Como la concentracin de sustrato es menor, la enzima no alcanzo gran velocidad pero se pudo observar que la liberacin de O2 es mayor al inicio de la reaccin y al transcurrir el tiempo disminuye notablemente.

En esta grafica se nota una gran diferencia en la velocidad de reaccin al realizar la comparacin de ambas pruebas, esto se debi a que en la prueba numero uno el tubo de ensaye que contena la enzima se agito mas rpidamente que en la segunda prueba, lo cual favoreci la formacin del complejo enzima- sustrato.

Si hacemos una comparacin de esta grafica con la grafica del experimento 2, se puede observar como la enzima a mayor cantidad de sustrato incrementa con mayor rapidez la velocidad de la reaccin. Pues tan solo a los 10s de haber iniciado el experimento ya se haban liberado 61 mm3

En este experimento agregamos a 1ml solucin de enzima 4ml de agua oxigenada, y 1ml. de agua destilada. Como se explic en la introduccin cuando la concentracin de la enzima es menor que el sustrato, se forma ms rpidamente el complejo enzima sustrato, y velocidad de la reaccin es mayor. Lo cual se puede notar claramente al comparar la velocidad que toma la reaccin a los diez segundos comparada con la que toma en el experimento 2.

En el experimento 6, la cantidad de agua oxigenada en 1ml. de solucin de enzima es de 5ml.

En esta grafica la enzima alcanza la velocidad mxima en menor cantidad de tiempo, debido a la cantidad de sustrato en la que se encuentra. Es decir como la

concentracin de sustrato es mayor la enzima acelera la reaccin mas rpido.

Conclusin:

Bibliografa:

Trudy Mckee, Bioqumica, la base molecular de la vida, primera edicin en espaol, editorial McGRAW-HILL/INTERAMERICANA DE ESPAA, S.A.U. 2003, Madrid, pp.167-169.

Rodney Boyer, Conceptos en Bioqumica, Las Bases Moleculares de la Estructura y Funcin Molecular Editorial Internacional Thomson Editores, S.A. de C.V. 1999, Mxico, pp. 147-152.

Albert L. Lehninger. Principios de bioqumica, segunda edicin, Copyright, 1993, Ediciones Omega, S.A., Barcelona, pp.209-214.

Albert L. Lehninger. Bioqumica, segunda edicin, Ediciones Omega, S. A., Barcelona 1985, pp. 514

La nueva biotecnologa enolgica Por Jos-Vicente Gil Ponce, Departamento de Biotecnologa de los Alimentos, Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos, Consejo Superior de Investigaciones Cientficas Fuente: http://www.uv.es/metode/anuario2001/58_2001.html

www.porquebiotecnologia.com.ar/educacion/cuaderno/ec_54_act.asp - 61k

w3.cnice.mec.es/eos/MaterialesEducativos/mem2002/proteinas/practica/catalasab oton.html Hora de consulta 9:49 pm., 25/07/2008. En realidad no conocemos que tan confiables sean estas pgin