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Note explicative

Pour la mise jour 2007 du Recueil des mthodes internationales des vins et des mots

Lors de la XXIXme Assemble gnrale de lOIV, plusieurs mthodes danalyses des vins et des mots ont t adoptes. Ces mthodes figurent dans la mise jour 2007 ci- incluse. Cette mise jour concerne 3 types de mthodes : 1/ des nouvelles mthodes qui viennent sajouter au Recueil des mthodes internationales des vins et des mots, il sagit des mthodes : AS311-06-POLYOL AS311-07-GLCFR2 AS311-08-SACCHA AS313-18-SORCAP AS313-19-ACORG2 AS313-20-SOBESA AS314-04-CO2MAN AS315-13-PCAPCP 2/ des complments aux mthodes figurant dj au Recueil des mthodes internationales des vins et des mots, il sagit des mthodes : AS314-01-DIOCAR qui complte la mthode AS314-01-DIOCAR 3/ Des nouvelles mthodes qui annulent et remplacent des mthodes figurant dj au Recueil des mthodes internationales des vins et des mots, il sagit des mthodes : AS2-11-CARCHR qui remplace la mthode AS2-07-CARCHR AS322-12-CRIPLO qui remplace la mthode AS322-11-PLOMB AS4-02-RECANT qui remplace lancienne mthode AS4-02-RECANT Par ailleurs, la liste des Limites maximales acceptables de divers lments dans le vin (C1-01LIMMAX) doit galement tre remplace compte tenu de la modification de la limite en plomb dans les vins

Federico CASTELLUCCI Directeur Gnral

ORGANISATION INTERNATIONALE DE LA VIGNE ET DU VIN

RECUEIL
DES METHODES INTERNATIONALES DANALYSE DES VINS ET DES MOUTS
EDITION 2007

VOLUME 1

INCLUSES: Rsolutions adoptes Logroo (Espagne) 4me A.G. 30 juin 2006 O.I.V. - 18, RUE DAGUESSEAU - 75008 PARIS

ORGANISATION INTERNATIONALE DE LA VIGNE ET DU VIN

RECUEIL
DES METHODES INTERNATIONALES DANALYSE DES VINS ET DES MOUTS
EDITION 2007

VOLUME 2

INCLUSES: Rsolutions adoptes Logroo (Espagne) 4me A.G. 30 juin 2006 O.I.V. - 18, RUE DAGUESSEAU - 75008 PARIS

RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSE OIV Table des matires

Plan gnral du Recueil


Table des matires

Avant-propos

ANNEXE A METHODES D'ANALYSE DES VINS ET DES MOUTS SECTION 1 DEFINITIONS ET PRINCIPES GENERAUX SECTION 2 ANALYSES PHYSIQUES SECTION 3 ANALYSES CHIMIQUES SECTION 3.1 COMPOSS ORGANIQUES SECTION 3.1.1 SUCRES SECTION 3.1.2 ALCOOLS SECTION 3.1.3 ACIDES SECTION 3.1.4 GAZ SECTION 3.1.5 AUTRES COMPOSS ORGANIQUES SECTION 3.2 COMPOSS NON ORGANIQUES SECTION 3.2.1 ANIONS SECTION 3.2.2 CATIONS SECTION 3.2.3 AUTRES COMPOSS NON ORGANIQUES SECTION 4 ANALYSES MICROBIOLOGIQUES SECTION 5 AUTRES ANALYSES ANNEXE B - MODELES DE CERTIFICATS D'ANALYSE ANNEXE C - LIMITES MAXIMALES ACCEPTABLES DE DIVERS ELEMENTS ANNEXE D AVIS ANNEXE E ASSURANCE QUALITE DANS LES LABORATOIRES

MA-F-INT-00-TABMAT 2007

RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSE OIV Table des matires

Table des matires......................................................................... MA-F-INT-00-TABMAT

VOLUME 1 Avant-propos.................................................................................. MA-F-INT-01-AVPROP Mode rdactionnel dune mthode danalyse OIV.................. MA-F-INT-04-REDMET

ANNEXE A METHODES D'ANALYSE DES VINS ET DES MOUTS SECTION 1 DEFINITIONS ET PRINCIPES GENERAUX Remarques gnrales (eco 3/2003) ............................................ MA-F-AS1-02-REMGEN Classification des mthodes danalyse (oeno 9/2000)............ MA-F-AS1-03-CLASMA Effet matrice pour le dosage des mtaux (oeno 5/2000) ........ MA-F-AS1-04-EFFMAT SECTION 2 ANALYSES PHYSIQUES Masse volumique (A 1) ................................................................ MA-F-AS2-01-MASVOL Evaluation de la teneur en sucres des mots, des mots concentrs et du raisin par rfractomtrie ................................. MA-F-AS2-02-SUCREF Extrait sec total (A 3) ................................................................... MA-F-AS2-03-EXTSEC Cendres (A 6)................................................................................. MA-F-AS2-04-CENDRE Alcalinit des cendres (A 7) ........................................................ MA-F-AS2-05-ALCCEN Potentiel d'oxydorduction (oeno 3/2000) ................................ MA-F-AS2-06-POTOXY Turbidit des vins (oeno 4/2000)................................................ MA-F-AS2-08-TURBID Mouillage - rapport isotopique 18O/16O (oeno 2/96)........... MA-F-AS2-09-MOUO18 Indice de Folin-Ciocalteu............................................................. MA-F-AS2-10-INDFOL Caractristiques chromatiques (oeno 1/2006).......................... MA-F-AS2-11-CARCHR SECTION 3 ANALYSES CHIMIQUES SECTION 3.1 COMPOSS ORGANIQUES SECTION 3.1.1 SUCRES Sucres rducteurs (A 4) ................................................................ MA-F-AS311-01-SUCRED Glucose et fructose (mthode enzymatique) ............................ MA-F-AS311-02-GLUFRU Dosage des sucres par CLHP (oeno 23/2003).......................... MA-F-AS311-03-SUCRES Stabilisation des mots en vue de la recherche du saccharose (A 5)....................................................................... MA-F-AS311-04-STAMOU Dtection de l'enrichissement des mots, des mots concentrs, du sucre de raisin et des vins par H-RMN............................... MA-F-AS311-05-ENRRMN Polyols drivant des sucres (Oeno 9/2006)............................... MA-F-AS311-06-POLYOL Glucose et fructose (pHmtrie) (Oeno 10/2006) ..................... MA-F-AS311-07-GLCFR2 Glucose, fructose et saccharose (pHmtrie) (Oeno 11/2006) MA-F-AS311-08-SACCHA

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RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSE OIV Table des matires SECTION 3.1.2 ALCOOLS Titre alcoomtrique volumique - par pycnomtrie (A 2)................................................... MA-F-AS312-01-TALVOL - par rsonateur de flexion (oeno 8/2000) .................... MA-F-AS312-01- TALVOL - par balance hydrostatique (oeno 24/2003)................. MA-F-AS312-01- TALVOL - tables de conversion ..................................................... MA-F-AS312-02- TALVOL Mthanol (A 41)............................................................................ MA-F-AS312-03-METHAN Glycrol et butane-2,3-diol (A 21) ............................................. MA-F-AS312-04-GLYBUT Glycrol (mthode enzymatique)............................................... MA-F-AS312-05-GLYENZ Dtermination du rapport isotopique de l'thanol (oeno 17/2001)......................................................... MA-F-AS312-06-ETHANO SECTION 3.1.3 ACIDES Acidit totale (A 10)..................................................................... MA-F-AS313-01-ACITOT Acidit volatile (A 11).................................................................. MA-F-AS313-02-ACIVOL Acidit fixe (A 11)........................................................................ MA-F-AS313-03-ACIFIX Acides organiques : mthode gnrale par HPLC................... MA-F-AS313-04-ACIORG Acide tartrique (A 12) .................................................................. MA-F-AS313-05-ACITAR Acide lactique - mthode chimique (A 27).......................................................... MA-F-AS313-06-ALACHI -mthode enzymatique ................................................................. MA-F-AS313-07-ALAENZ Acide citrique - mthode chimique (A 29).......................................................... MA-F-AS313-08-ACICHI - mthode enzymatique ................................................................ MA-F-AS313-09-ACIENZ Acide malique total : mthode usuelle (A 33).......................... MA-F-AS313-10-AMALTO Acide L-malique : mthode enzymatique ................................. MA-F-AS313-11-ALMENZ Acide D-malique : mthode enzymatique (oeno 6/98) ........... MA-F-AS313-12-ADMENZ Acide D-malique - faibles teneurs : mthode enzymatique (oeno 16/2002) ...................................... MA-F-AS313-12-ADMEZ2 Acide L-ascorbique (A 28) .......................................................... MA-F-AS313-13-ALASCO Acide sorbique (A 30).................................................................. MA-F-AS313-14-ACISOR pH (A 31)........................................................................................ MA-F-AS313-15-PH Acide organique : chromatographie ionique (oeno 23/2004) MA-F-AS313-16-ORGION Acide shikimique (oeno 33/2004) ............................................. MA-F-AS313-17-ACSHIK Acide sorbique (lectrophorse cap.) (oeno 4/2006) ............. MA-F-AS313-18-SORCAP Acides organiques (lectrophorse cap.) (oeno 5/2006) ....... MA-F-AS313-19-ACORG2 Acide sorbique, benzoque, salicylique (oeno 6/2006) .......... MA-F-AS313-20-SOBESA

SECTION 3.1.4 GAZ Dioxyde de carbone (A 39 modifi par oeno 21/2003 et compltte par la rsolution Oeno 3/2006)) ......................... MA-F-AS314-01-DIOCAR Mthode de mesure de la surpression des vins effervescents (oeno 21/2003)............................................................................... MA-F-AS314-02-SUPRES Dtermination du rapport isotopique 13 C/12 C du CO2 dans les vins mousseux (Oeno 7/2005) ..................................... MA-F-AS314-03-CO2MOU MA-F-INT-00-TABMAT 2007 3

RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSE OIV Table des matires Dioxyde de carbone (mthode manomtrique) (oeno 2/2006) ................................................................................. MA-F-AS314-04-CO2MAN

VOLUME 2 SECTION 3.1.5 AUTRES COMPOSS ORGANIQUES Ethanal (A 37)................................................................................ MA-F-AS315-01-ETHANA Actate d'thyle ............................................................................. MA-F-AS315-02-ACEETH Diglucoside de malvidol (A 18) ................................................. MA-F-AS315-03-DIGMAL Carbamate d'thyle (oeno 8/98) .................................................. MA-F-AS315-04-CARETH 5-(Hydroxymthyl)furfural (A 19)............................................. MA-F-AS315-05-HYDMFF Drivs cyans (oeno 4/94) ......................................................... MA-F-AS315-06-DERCYA Edulcorants de synthse (A 36) .................................................. MA-F-AS315-07-EDUSYN Colorants de synthse (A 43)...................................................... MA-F-AS315-08-COLSYN Dithylneglycol ........................................................................... MA-F-AS315-09-DIEGLY Ochratoxine A (oeno 16/2001) ................................................... MA-F-AS315-10-OCHRAT Dtermination par CLHP de neuf Anthocyanes principales dans le vin rouge et ros (oeno 22/2003) .................................. MA-F-AS315-11-ANCYAN Matires protiques dorigine vgtale (oeno 24/2004)......... MA-F-AS315-12-PROVEG Polychlorophnols et polychloroanisoles (oeno 8/2006) ....... MA-F-AS315-13-PCAPCP SECTION 3.2 COMPOSS NON ORGANIQUES SECTION 3.2.1 ANIONS Brome total (A 23)........................................................................ MA-F-AS321-01-BROTOT Chlorures (A 15)............................................................................ MA-F-SA321-02-CHLORU Fluorures (oeno 22/2004)............................................................. MA-F-AS321-03-FLUORU Phosphore total (A 16) ................................................................. MA-F-AS321-04-PHOTOT Sulfates (A 14)............................................................................... MA-F-AS321-05-SULFAT SECTION 3.2.2 CATIONS Ammonium (A 20)........................................................................ MA-F-AS322-01-AMMONI Potassium (A 8)............................................................................. MA-F-AS322-02-POTASS Sodium (A 25) ............................................................................... MA-F-AS322-03-SODIUM Calcium (A 26).............................................................................. MA-F-AS322-04-CALCIU Fer (A 9) ......................................................................................... MA-F-AS322-05-FER Cuivre ............................................................................................. MA-F-AS322-06-CUIVRE Magnsium (A 26)........................................................................ MA-F-AS322-07-MAGNES Zinc (A 45) ..................................................................................... MA-F-AS322-08-ZINC Argent.............................................................................................. MA-F-AS322-09-ARGENT Cadmium........................................................................................ MA-F-AS322-10-CADMIU Plomb (critres pour mthodes) (oeno 7/2006)........................ MA-F-AS322-12-CRIPLO

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RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSE OIV Table des matires SECTION 3.2.3 AUTRES COMPOSS NON ORGANIQUES Arsenic (A 34) ............................................................................... MA-F-AS323-01-ARSENI Arsenic - Absorption atomique (oeno 14/2002) ...................... MA-F-AS323-01-ASSAA Azote total (A 40).......................................................................... MA-F-AS323-02-AZOTOT Azote total - Mthode Dumas (oeno 13/2002)......................... MA-F-AS323-02-AZOTDU Bore (A 44)..................................................................................... MA-F-AS323-03-BORE Dioxyde de soufre - vin (A 17) ..................................................................................... MA-F-AS323-04-DIOSOU - jus de raisin ................................................................................. MA-F-AS323-05-SO2JUS Mercure - Fluorescence atomique (oeno 15/2002).................. MA-F-AS323-06-MERCUR

SECTION 4 ANALYSES MICROBIOLOGIQUES Analyse microbiologique (oeno 8/95) ....................................... MA-F-AS4-01-ANMICR Recherche des antiseptiques et des inhibiteurs de fermentation (A 35 modifie par Oeno 6/2006)....................... MA-F-AS4-02-RECANT

SECTION 5 AUTRES ANALYSES Diffrentiation des mistelles et des vins de liqueur doux....... MA-F-AS5-01-DIFMIS

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ANNEXE B Rgles d'application des mthodes d'analyse........................... MA-F-B1-01-REGAPL Modles de certificats d'analyse................................................. MA-F-B1-02-MODCER

ANNEXE C Limites maximales acceptables de divers lments contenus dans le vin (oeno 13/2006) ......................................... MA-F-C1-01-LIMMAX

ANNEXE D AVIS Acide gluconique (oeno 4/91)..................................................... MA-F-D1-01-ACIGLU Caractrisation des vins issus du surpressurage (oeno 5/91) . MA-F-D1-02-SURPRE Teneur en ions chlorures et en ions sodium des vins (oeno 6/91)...................................................................... MA-F-D1-03-TENION

ANNEXE E ASSURANCE QUALITE DANS LES LABORATOIRES Principe de validation (oeno 7/98) ............................................. MA-F-AS1-05-PPEVAL Etude collaborative ....................................................................... MA-F-AS1-07-ETCOL Fidlit des mthodes (oeno 5/99) ............................................. MA-F-AS1-08-FIDMET Protocole pour la planification, la conduite et linterprtation des tudes de performance des mthodes danalyse (oeno 6/2000)............................................................... MA-F-AS1-09-PROPER Estimation limite de dtection et limite de quantification (oeno 7/2000).................................................. MA-F-AS1-10-LIMDET Contrle interne de qualit dans les laboratoires d'analyse (oeno 19/2002) ............................................................ MA-F-AS1-11-COQUAL Guide de validation (oeno 10/05) ............................................... MA-F-AS1-12-GUIVAL Recommandations pour la validation par un seul laboratoire (Oeno 8/05) .................................................. MA-F-AS1-13-SINVAL Recommandations sur lincertitude de mesure (Oeno 9/05).. MA-F-AS1-14-INCERT

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Caractristiques Chromatiques

Titre Type de mthode Rsolution

DTERMINATION DES CARACTRISTIQUES CHROMATIQUES SELON CIELab I Oeno 1/2006

1.

Introduction La couleur du vin est lun des lments visuels les plus importants dont nous disposons, en ce quelle nous apporte une multitude dinformations de grande pertinence. La couleur est une sensation que nous percevons visuellement par leffet de la rfraction ou de la rflexion de la lumire sur la surface dun objet. La couleur est lumire, elle est lie troitement la lumire et cest du type de lumire (illumination ou stimulus lumineux) que dpend la perception de couleurs diffrentes. La lumire est trs variable, tout comme la couleur lorsquelle est mesure. Le vin absorbe une partie seulement des radiations lumineuses quil reoit et en rflchit une autre partie, laquelle parvient jusqu lil de lobservateur , lui procurant une sensation de couleur. Par exemple, la sensation induite par un vin de teinte rouge luminosit trs fonce est due labsorption quasi complte par ce vin de la radiation incidente.

1.1.

Objet et champ dapplication Cette mthode spectrophotomtrique a pour objet de dterminer le mode de mesure et de calcul des caractristiques chromatiques des vins et autres boissons drives, avec reproduction des sensations de couleur ressenties par un observateur rel partir des composants trichromatiques X, Y, Z dfinis par la Commission internationale de lclairage (CIE, 1976).

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1.2.

Principe et dfinitions La couleur dun vin peut tre dfinie par trois attributs ou qualits spcifiques de la sensation visuelle : sa teinte, sa luminosit (ou luminance) et son chromatisme. La teinte, la plus caractristique, dsigne la couleur en soi : rouge, jaune, vert ou bleu. La luminosit est lattribut de la sensation visuelle selon laquelle un vin parat plus ou moins lumineux. Le chromatisme ou niveau de coloration, pour sa part, est li lintensit plus ou moins forte de sa couleur. La conjugaison de ces trois concepts permet didentifier les multiples nuances de couleur des vins. Les caractristiques chromatiques dun vin sont dfinies par les coordonnes colorimtriques ou de chromacit (Fig. 1) correspondant la clart (L* ), composante de couleur rouge/vert (a* ), composante de couleur jaune/bleu (b* ), et par les grandeurs drives, savoir la chroma (C* ), le ton (H* ) et la chromacit [(a*,b* ) ou (C* ,H* )]. En dautres termes, ce systme de couleur ou espace CIELab se fonde sur une reprsentation cartsienne squentielle ou continue sur 3 axes orthogonaux L* , a* et b* (Fig. * * 2 et 3). La coordonne L dsigne la clart (L* = 0 noir et L = * 100 incolore), a dsigne la composante de couleur rouge/vert (a* >0 rouge, a* <0 vert) et b* la composante de couleur jaune/bleu (b* >0 jaune, b* <0 bleu).

1.2.1. Clart Son symbole est L* et mathmatique suivante : elle se dfinit par la fonction

L* =116(Y/Y n)1/3 -16 (I) Elle est directement lie la sensation visuelle de luminosit.

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1.2.2. Composante de couleur rouge/vert Son symbole est a* et mathmatique suivante : elle se dfinit par la fonction

a* =500[(X/Xn) -(Y/Yn)] (I)

1.2.3. Composante de couleur jaune/bleu Son symbole est b* et mathmatique suivante : elle se dfinit par la fonction

b* =200-[(Y/Yn)1/3 -(Z/Zn)1/3

(I)

1.2.4. Chroma Le symbole de la Chroma mathmatique suivante : est C* , dfini par la fonction

C* =
1.2.5. Ton

(a *2 +b *2 )

* Le symbole du ton est H , son unit est le degr sexagsimal () et il est dfini par la fonction mathmatique suivante :

H* = tg-1 (b*/a* ) 1.2.6 Diffrence de ton entre deux vins Le symbole suivante : est ?H*, dfini par la fonction mathmatique

? H* = (? E *) 2 ( ? L *) 2 ( ? C *)2
(I) Voir explication annexe I.

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1.2.7. Diffrence colorimtrique globale entre deux vins Le symbole est ?E*, dfini par les formules mathmatiques suivantes :

? E* = ( ? L *) 2 + ( ? a *)2 + (? b *) 2 = ( ? L *) 2 + ( ? C *) 2 + (? H *)2
1.3. Ractifs et produits Eau distille. 1.4. Appareillage et matriel quipement et appareillage courants de laboratoire, notamment : 1.4.1. Spectrophotomtre permettant deffectuer des mesures avec une longueur donde de transmittance comprise entre 300 et 800 nm, avec illuminant D65 et observateur 10. Utiliser des appareils rsolution gale ou suprieure 5 nm et, si possible, balayage. 1.4.2. Matriel informatique et programme appropri permettant, en conjonction avec le spectrophotomtre, de calculer les * coordonnes colorimtriques (L* , a et b* ) et leurs grandeurs drives (C* et H* ). 1.4.3. Rcipients de verre, disponibles par paires, de trajet optique de 1, 2 et 10 mm. 1.4.4. Micropipettes permettant de prlever des volumes compris entre 0,020 et 2 ml. 1.5. chantillonnage et prparation de lchantillon La prise dessai doit respecter particulirement tous les concepts dhomognit et de reprsentativit. Si le vin est trouble, il doit tre clarifi par centrifugation. Concernant les vins jeunes ou mousseux, la plus grande quantit possible de dioxyde de carbone doit tre limine par agitation sous vide ou par le biais dun bain ultrasons.

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1.6.

Mode opratoire Slectionner une paire de rcipients pour raliser la lecture spectrophotomtrique en veillant ne pas dpasser le plafond de mesure dans les limites de linarit du spectrophotomtre. titre indicatif, il est conseill dutiliser pour les vins blancs et ross des rcipients de 10 mm de trajet optique et d1 mm pour les vins rouges. Une fois lchantillon prlev et prpar, mesurer sa transmittance entre 380 et 780 nm tous les 5 nm, en utilisant comme liquide de rfrence de leau distille place dans un rcipient de mme trajet optique de manire rgler la ligne de base ou le blanc. Slectionner lilluminant D65 et un observateur 10. Si le trajet optique du rcipient de lecture est infrieur 10 mm, il convient alors de transformer la transmittance * 10 mm avant de procder au calcul de : L* , a* , b , C* et * H . Rsum :

Mesures spectrales des transmittances entre 780 et 380 nm Intervalle : 5 nm Rcipients : en fonction de lintensit du vin. 1 cm (vins blancs et ross), 0,1 cm (vins rouges) Illuminant D65 Observateur standard 10
1.7. Calculs Le spectrophotomtre doit tre utilis en conjonction avec un programme informatique permettant de calculer facilement, au moyen des algorithmes mathmatiques appropris, les * * * coordonnes colorimtriques (L , a et b ) et leurs grandeurs drives (C* et H* ). En labsence de programme informatique, les calculs seront effectus conformment lAnnexe 1.

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1.8.

Expression des rsultats Les coordonnes colorimtriques du vin seront exprimes selon les recommandations nonces au tableau suivant.

Coordonnes colorimtriques Clart Composante rouge/vert Composante jaune/bleu Chroma Ton

Symbole Unit L* a* b* C* H*

Intervalle 0-100 0 noir 100 incolore >0 rouge <0 verte >0 jaune <0 bleu 0-360

Dcimales 1 2 2 2 2

1.9. Exemple numrique La figure 4 recense les valeurs des coordonnes colorimtriques et prsente le diagramme de chromaticit dun vin rouge jeune pour les valeurs suivantes : X = 12,31 ; Y = 60,03 et Z = 10,24 L* = 29,2 a* = 55,08 b* = 36,10 C* = 66,00 H* = 33,26 2. Fidlit

Les donnes ci-dessus ont t obtenues dans le cadre de deux essais interlaboratoires excuts en double aveugle sur 8 chantillons de vin ayant des caractristiques chromatiques progressives. Ces essais ont t conduits conformment aux recommandations du Protocole harmonis pour les tudes collectives en vue de la validation de la mthode danalyse.

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2.1.

Coordonne colorimtrique L* (clart, 0-100)

Identification de lchantillon Anne de lessai interlaboratoires Nombre de laboratoires participants Nombre de laboratoires admis aprs limination des valeurs aberrantes Valeur moyenne ( x ) cart -type de rptabilit (s r) cart -type relatif de rptabilit (RSDr) (%) Limite de rptabilit (r) (2,8 x s r) cart -type de reproductibilit (s R) cart -type relatif de reproductibilit (RSDR) (%) Limite de reproductibilit (R) (2,8 x s R)

A 2004 18 14 96,8 0,2 0,2 0,5 0,6

B 2002 21 16 98,0 0,1 0,1 0,2 0,1

C 2004 18 16 91,6 0,2 0,3 0,7 1,2

D 2004 18 16 86,0 0,8 1,0 2,2 2,0

E 2004 17 14 77,4 0,2 0,3 0,7 0,8

F 2004 18 17 67,0 0,9 1,3 2,5 4,1

G 2002 23 21 34,6 0,1 0,2 0,2 1,0

H 2004 18 16 17,6 0,2 1,2 0,6 1,0

0,6 1,7

0,1 0,4

1,3 3,3

2,3 5,5

1,0 2,2

6,1 11,5

2,9 2,8

5,6 2,8

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2.2.

Coordonne colorimtrique a* (vert/rouge)

Identification de lchantillon Anne de lessai interlaboratoires Nombre de laboratoires participants Nombre de laboratoires admis aprs limination des valeurs aberrantes Valeur moyenne ( x ) cart -type de rptabilit (s r) cart -type relatif de rptabilit (RSDr) (%) Limite de rptabilit (r) (2,8 x s r) cart -type de reproductibilit (s R) cart -type relatif de reproductibilit (RSDR ) (%) Limite de reproductibilit (R) (2,8 x s R)

A 2004 18

B 2002 21

C 2004 18

D 2004 18

E 2004 17

F 2004 18

G 2002 23

H 2004 18

15 -0,26 0,17 66,3 0,49 0,30

15 -0,86 0,01 1,4 0,03 0,06

14 2,99 0,04 1,3 0,11 0,28

15 11,11 0,22 2.0 0,61 0,52

13 20,51 0,25 1,2 0,71 0,45

16 29,29 0,26 0,9 0,72 0,98

23 52,13 0,10 0,2 0,29 0,88

17 47,55 0,53 1,1 1,49 1,20

116,0

7,5

9,4

4,7

2,2

3,4

1,7

2,5

0,85

0,18

0,79

1,45

1,27

2,75

2,47

3,37

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2.3.

Coordonne colorimtrique b* (bleu/jaune)

Identification de A lchantillon Anne de lessai 2004 interlaboratoires Nombre de laboratoires 17 participants Nombre de laboratoires admis aprs limination 15 des valeurs aberrantes 10,95 Valeur moyenne ( x ) cart -type de 0,25 rptabilit (s r) cart -type relatif de 2,3 rptabilit (RSDr) (%) Limite de rptabilit (r) 0,71 (2,8 x s r) cart -type de 0,79 reproductibilit (s R) cart -type relatif de reproductibilit (RSDR) 7,2 (%) Limite de 2,22 reproductibilit (R) (2,8 x s R)

B 2002 21 16 9,04 0,03 0,4 0,09 0,19 2,1

C 2004 17 13 17,75 0,08 0,4 0,21 0,53 3,0

D 2004 17 14 17,10 1,08 6,3 3,02 1,18 6,9

E 2004 17 16 19,68 0,76 3,8 2,12 3,34 16,9

F 2004 18 18 26,51 0,65 2,5 1,83 2,40 9,1

G 2002 23 23 45,82 0,15 0,3 0,42 1,44 3,1

H 2004 18 15 30,07 0,36 1,2 1,01 1,56 5,2

0,53

1,47

3,31

9,34

6,72

4,03

4,38

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Caractristiques Chromatiques

BIBLIOGRAPHIE Vocabulaire Internatio nal de l'clairage. Publication Publication I.E.C. 50(845). CEI(1987). Genve. Suisse. CIE 17.4.-

Colorimetry, 2nd. Ed.- Publication CIE 15.2 (1986) Vienna. Colorimetry, 2nd. Ed.- Publication CIE 15.2 (1986) Vienna. Kowaliski P. Vision et mesure de la couleur. Masson ed. Paris 1990 Wiszecki G. And W.S.Stiles, Color Science, Concepts and Methods,Quantitative Data and Formulae, 2end Ed.Wiley, New York 1982 Sve R. .- Physique de la couleur. Masson. Paris (1996) Echvarri J.F., Ayala F. et Negueruela A.I. .-Influence du pas de mesure dans le calcul des coordonnes de couleur du vin. Bulletin de l'OIV 831-832, 370-378 (2000) I.R.A.N.O.R . Magnitudes Colorimetricas. Norma UNE 72-031-83 Bertrand A.- Mesure de la coleur. F.V. 1014 2311/190196 Fernndez, J.I.; Carceln, J.C.; Martnez, A. III Congreso Nacional De Enologos, 1.997. Caracteristicas cromaticas de vinos rosados y tintos de la cosecha de 1996 en la region de murcia Cagnaso E..- Metodi Oggettivi per la definizione del colore del vino. Quaderni della Scuoladi Specializzazione in Scienze Viticole ed Enologiche. Universidad di Torino. 1997 Ortega A.P., Garcia M.E., Hidalgo J., Tienda P., Serrano J. 1995Identificacion y Normalizacion de los colores del vino. Carta de colores. Atti XXI Congreso Mundial de la Via y el Vino, Punta del Este. ROU 378-391 Iiguez M., Rosales A., Ayala R., Puras P., Ortega A.P.- 1995-La cata de color y los parametros CIELab, caso de los vinos tintos de Rioja. Atti XXI Congreso Mundial de la Via y el Vino, Punta del Este.ROU 392-411 Billmeyer, F.W. jr. And M. Saltzman: Principies of Color. Technology, 2. Auflage, New York; J. Wiley and Sons, 1981.

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ANNEXE 1

Formellement, les composantes trichromatiques X, Y, Z dun stimulus de couleur rsultent de l'intgration, sur tout le spectre, des fonctions obtenues en multipliant la courbe spectrale relative du stimulus de couleur par les fonctions colorimtriques de l'observateur de rfrence. Il sagit toujours des fonctions obtenues exprimentalement. Il nest donc pas possible de calculer les composants trichromatiques directement par intgration. En consquence, on doit dterminer les valeurs approches en remplaant ces intgrales par des sommations des intervalles des longueurs donde.

= K ( ) ( ) S ( ) X 10( ) ( )

T() est la mesure de la transmitance du vin mesure a la longueur donde exprime a 1 cm de trajet optique. () est lintervalle entre le valeur de auxquelles on mesure T() S(): coefficients fonction de et de lilluminant. (Tableau 1). X 10( ) ; Y 10( ) ; Z 10( ) : coefficients fonction de et de lobservateur. (Tableau 1)

= K ( ) ( ) S ( ) Y 10( ) ( ) = K ( ) ( ) S( ) Z 10( ) ( ) K = 100

()

S ( ) Y 10( ) ( )

Les formules pour les calculs font rfrence aux valeurs Xn, Yn, y Zn, qui correspondent au diffuseur parfait pour les conditions dillumination et de lobservateur de rfrence donns. Ici, lilluminant est D65 et lobservateur 10.

Xn = 94,825;

Y n = 100;

Zn = 107,381

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Caractristiques Chromatiques Cet espace approximativement uniforme est driv de l'espace CIEYxy, o sont dfinies les composantes trichromatiques X, Y, Z. Les calculs des coordonnes L* , a* y b* son effectus a partir des valeurs des composants Trichromatiques X, Y, Z, en utilisant les formules suivantes.

L* = 116 (Y / Yn )1/3 16 L* = 903,3 (Y / Yn ) a* = 500 [ f(X / Xn ) f(Y / Yn ) ] b* = 200 [f(Y / Yn ) f(Z / Zn ) ] f(X / Xn ) = (X / Xn )1/3 f(X / Xn ) = 7,787 (X / Xn ) + 16 / 166 f(Y / Yn ) = (Y / Yn )1/3 f(Y / Yn ) = 7,787 (Y / Yn ) + 16 / 116 f(Z / Zn ) = (Z / Zn )1/3 f(Z / Zn ) = 7,787 (Z / Zn ) + 16 / 116

para Y / Yn > 0,008856 para Y / Yn < = 0,008856

para (X / Xn ) > 0,008856 para (X / Xn ) < = 0,008856 para (Y / Yn ) > 0,008856 para (Y / Yn ) < = 0,008856 para (Z / Zn ) > 0,008856 para (Z / Zn ) < = 0,008856

L'cart colorimtrique global entre deux couleurs est donn par la diffrence de couleur CIELAB E* = [( L*)2 + ( a*)2 + ( b*)2 ]1/2 Dans l'espace CIELAB il est possible d'exprimer des carts de couleur non seulement globaux, mais aussi suivant un ou plusieurs des paramtres L*, a* et b*. Cela permet de dfinir de nouveaux paramtres et les relier avec les attributs de la sensation visuelle.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Caractristiques Chromatiques La clart, relie la luminosit, est directement reprsent par la valeur de L*. La chroma:C* = (a*
2

+ b* 2 )1/2 dfinit la chromie.

Langle de teinte: H*= tg-1 (b*/a*) (exprime en degrs). Est reli la teinte. La diffrence de teinte : H*= [( E*)2 - ( L*)2 - ( C*)2]1/2 Pour deux couleurs quelconques, C* reprsente leur diffrence de chromaticit; L*, leur diffrence de clart, et E*, leur cart de couleur global. Nous avons donc: E* = [( L*)2 + ( a*)2 + ( b*)2 ]1/2 = [( L*)2 + ( C*)2 + ( H*)2 ]1/2

Tableau 1. Coefficients appliquer dans les formules

Long. d ( ) nm. 380 385 390 395 400 405 410 415 420 425 430 435 440 445 450 455 460 465

S() 50,0 52,3 54,6 68,7 82,8 87,1 91,5 92,5 93,4 90,1 86,7 95,8 104,9 110,9 117,0 117,4 117,8 116,3

10( ) 0,0002 0,0007 0,0024 0,0072 0,0191 0,0434 0,0847 0,1406 0,2045 0,2647 0,3147 0,3577 0,3837 0,3867 0,3707 0,3430 0,3023 0,2541

10( ) 0,0000 0,0001 0,0003 0,0008 0,0020 0,0045 0,0088 0,0145 0,0214 0,0295 0,0387 0,0496 0,0621 0,0747 0,0895 0,1063 0,1282 0,1528

10( ) 0,0007 0,0029 0,0105 0,0323 0,0860 0,1971 0,3894 0,6568 0,9725 1,2825 1,5535 1,7985 1,9673 2,0273 1,9948 1,9007 1,7454 1,5549
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470 475 480 485 490 495 500 505 510 515 520 525 530 535 540 545 550 555 560 565 570 575 580 585 590 595 600 605 610 615 620 625 630 635 640 645 650 655 660 665 670 675

114,9 115,4 115,9 112,4 108,8 109,1 109,4 108,6 107,8 106,3 104,8 106,2 107,7 106,0 104,4 104,2 104,0 102,0 100,0 98,2 96,3 96,1 95,8 92,2 88,7 89,3 90,0 89,8 89,6 88,6 87,7 85,5 83,3 83,5 83,7 81,9 80,0 80,1 80,2 81,2 82,3 80,3

0,1956 0,1323 0,0805 0,0411 0,0162 0,0051 0,0038 0,0154 0,0375 0,0714 0,1177 0,1730 0,2365 0,3042 0,3768 0,4516 0,5298 0,6161 0,7052 0,7938 0,8787 0,9512 1,0142 1,0743 1,1185 1,1343 1,1240 1,0891 1,0305 0,9507 0,8563 0,7549 0,6475 0,5351 0,4316 0,3437 0,2683 0,2043 0,1526 0,1122 0,0813 0,0579

0,1852 0,2199 0,2536 0,2977 0,3391 0,3954 0,4608 0,5314 0,6067 0,6857 0,7618 0,8233 0,8752 0,9238 0,9620 0,9822 0,9918 0,9991 0,9973 0,9824 0,9556 0,9152 0,8689 0,8256 0,7774 0,7204 0,6583 0,5939 0,5280 0,4618 0,3981 0,3396 0,2835 0,2283 0,1798 0,1402 0,1076 0,0812 0,0603 0,0441 0,0318 0,0226

1,3176 1,0302 0,7721 0,5701 0,4153 0,3024 0,2185 0,1592 0,1120 0,0822 0,0607 0,0431 0,0305 0,0206 0,0137 0,0079 0,0040 0,0011 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

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680 685 690 695 700 705 710 715 720 725 730 735 740 745 750 755 760 765 770 775 780

78,3 74,0 69,7 70,7 71,6 73,0 74,3 68,0 61,6 65,7 69,9 72,5 75,1 69,3 63,6 55,0 46,4 56,6 66,8 65,1 63,4

0,0409 0,0286 0,0199 0,0138 0,0096 0,0066 0,0046 0,0031 0,0022 0,0015 0,0010 0,0007 0,0005 0,0004 0,0003 0,0002 0,0001 0,0001 0,0001 0,0000 0,0000

0,0159 0,0111 0,0077 0,0054 0,0037 0,0026 0,0018 0,0012 0,0008 0,0006 0,0004 0,0003 0,0002 0,0001 0,0001 0,0001 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

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L* (clarte)

b* (bleu) - a* (vert) +b* (jaune) + a * (r (rouge)

Figure 1 : Diagramme des coordonnes colorimtriques selon la Commission Internationale de lEclairage (CIE, 1976)

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L*

-a*

-b*
+a *

+b*

C* (cr om a)

Figure 2. Espace CIELab de couleur partir dune reprsentation cartsienne squentielle ou continue des 3 axes orthogonaux L, a et b.

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-b*

+a* -a*
H*

Figure 3. Diagramme squentiel et/ou continu des coordonnes colorimtriques a et b et de magnitude drive comme le ton (H).

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+b*

o n To

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Exemple: ROUGE Ejemplo: VIN VINO TINTOJEUNE JOVEN

r OBTENTION DES PARAMETRES ANALYTIQUES:


1.- Valeurs triestmulos X = 12,31 Y = 60,03 Z = 10,24 2.- Coordonnes CIELab a* = 55,08 b* = 36,10 L* = 29,20

r REPRESENTATION GRAPHIQUE ET
CHROMATICITE
b*, jaune

EXPRESSION DES RESULTATS:

C*, chroma C* = 66,00 H* = 33,26

b* = 36,10

- a*, vert

a* rouge

H*, ton

- b*, bleu

a* = 55,08

L*, Clart = 100 LUMINOSITE

L* = 29,20
b*, jaune - a*, vert

a*,rouge

Figure 4. Reprsentation de la couleur dun vin rouge jeune, utilis comme exemple dans le chapitre 1.8, par un diagramme tridimensionnel de lespace CIELab.

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Titre Type de mthode Rsolution

DOSAGE DES POLYOLS DERIVANT DES SUCRES ET DES SUCRES RESIDUELS DANS LES VINS SECS PAR CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE IV Oeno 9/2006

1. Domaine d'application Dosage simultan de lrythrytol, l'arabitol, le mannitol, le sorbitol et le msoinositol dans les vins. Le dosage des sucres par Chromatographie en phase gazeuse (CPG) tant long et compliqu, il est rserv la dtermination de traces de sucres et en particulier de sucres pour lesquels il n'existe pas de mthode enzymatique utilise en routine : Arabinose, Rhamnose, Mannose, Galactose mais il est applicable aussi au glucose et fructose. L'avantage tant de pouvoir doser simultanment tous les monomres, dimres ou mme trimres des sucres. Remarque1. Il n'est pas possible de doser les sucres aprs leur rduction sous forme d'alditol en raison de la prsence des polyols correspondants. Remarque 2. Les sucres donnent sous forme de drivs TMS 2 formes et et parfois 3 ou 4 (Gamma) correspondant aux diffrents anomres prsents dans le vins. Remarque 3. Sans dilution pralable la mthode permet difficilement de doser le glucose et le fructose prsents plus de 5 g/l. 2. Principe Les sucres rsiduels des vins secs peuvent tre doss par chromatographie en phase gazeuse aprs formation de leurs drivs trimthylsilyls. L'talon interne est le pentarythritol.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polyols drivant des sucres 3. Ractifs Mlange silanisant donn titre d'exemple : 3.1 Hexamthyldisilazane (HMDS) pur 3.2 Anhydride trifluoroactique (TFA) pur 3.3 Pyridine pure 3.4 Pentarythritol pur 3.5. Eau distille 3.6 Pentarythritol 10 g/l (solution d'talon interne), dissoudre 0,15 g de pentarythritol (3.4) dans 100 ml d'eau (3.5) 3.7 Produits purs pouvant tre utiliss pour prparer les solutions d'talonnage notamment glucose, fructose, arabinose, mannitol, sorbitol (liste non exhaustive) 3.8 Solutions de rfrence de produits purs 200 mg/l dissoudre 20 mg de chacun des produits doser (3.6) dans 100 ml d'eau. Remarque Les solutions de sucre doivent tre prpares juste avant l'emploi. 4. Matriel et appareillage 4.1 Pipettes de laboratoire de 1 ml gradues au 1/10e de ml 4.2 Poires propipettes 4.3 Seringue de 100 l 4.4 Tubes vis de 5 ml de capacit pouvant tre ferms par un bouchon vis muni d'une capsule d'tanchit face tflone. 4.5 Evaporateur rotatif sous vide pouvant recevoir les tubes vis (4.4) afin d'vaporer les chantillons sec 4.6 Chromatographe en phase gazeuse quip d'un dtecteur ionisation x g, de flamme et d'un injecteur fonctionnant en mode "split" : division de 1/30e 1/50e de volume inject (1 l) 4.7 Colonne capillaire apolaire pow ex (Se 30, Cpsil 5, HP1 ) 50 m x 0,25 mm paisseur du film de phase stationnaire 15 m ( titre dexemple). 4.8 Seringue d'injection de 10 l. 4.9 Systme d'acquisition des donnes 4.10 Bain ultra-sons 4.11 Sorbonne de laboratoire

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polyols drivant des sucres 5. Prparation des chantillons 5.1 Ajout de l'talon interne : 1 ml de vin (pipette, 4.1) ou de solution de rfrence 200 mg/l (3.6) est plac dans le tube vis (4.4). Remarque : Il est galement possible d'oprer avec des volumes de vin trs infrieurs en particulier si le milieu est riche en sucre. Il est ajout 50 l de la solution de pentarythritol 10 g/l (3.5) l'aide de la seringue (4.3) 5.2 Obtention d'un rsidu sec : Le tube vis est plac sur l'vaporateur rotatif dont le bain d'eau est maintenu une temprature infrieure 40 C, poursuivre l'vaporation jusqu' la disparition de toute trace de liquide. 5.3 Ajout des ractifs 5.3.1 Placer les tubes contenant l'extrait sec de mme que les ractifs 3.1, 3.2 et 3.3 dans la sorbonne (4.11), brancher la ventilation 5.3.2 A l'aide des pipettes (4.1) et de poires propipettes (4.2) ajouter dans le tube successivement 0,20 ml de pyridine (3.3), 0,7 ml de HMDS (3.1), 0,1 ml de TFA (3.2) 5.3.3 Fermer hermtiquement le tube l'aide de son bouchon 5.3.4 Placer le tube dans le bain ultra-sons (4.10) durant 5 minutes afin d'obtenir une dispersion complte du rsidu sec 5.3.5 Placer le tube dans un four 60 C durant 2 heures afin d'oprer la substitution totale des hydrognes des hydroxyles ou des acides par des groupes trimthylsilyle (TMS). Remarque : il ne doit subsister qu'une seule phase aprs chauffage sinon cela signifie quil restait de l'eau dans le tube ; de mme il ne doit pas y avoir de dpt bruntre ce qui indiquerait un excs de sucre non driv. 6. Analyse chromatographique 6.1 Placer le tube refroidi dans la sorbonne (4.11) ventile, prlever 1 l l'aide de la seringue (4.8). Injecter dans le chromatographe en mode "split" (division permanente) Traiter de la mme manire l'chantillon driv de vin et de rfrence 6.2 Programmer la temprature du four, par exemple de 60 C 240 C raison de 3 C par m inute de telle sorte que l'analyse complte dure par exemple 1 heure pour une sparation complte du mannitol et du sorbitol (rsolution suprieure 1,5) MA-F-AS311-06-POLYOL 3

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7. Calculs Exemple : calcul de la concentration en sorbitol Soit s la surface du pic du sorbitol dans le vin S la surface du pic du sorbitol dans la solution de rfrence i la surface du pic de l'talon interne dans le vin I la surface du pic de l'talon interne dans la solution rfrence la teneur ts en sorbitol dans le vin sera ts =

s I 200 S i

en mg par litre

un mme raisonnement permet de calculer la teneur tg en glucose g l tg = 200 en mg par litre G i o g est la somme des surfaces des deux pics de glucose dans le vin et G est la somme des surfaces des deux pics de glucose dans la solution de rfrence. 8. Caractristiques de la mthode Seuil de dtection environ 5 mg/l pour un polyol (un seul pic chromatographique). Rptabilit moyenne de l'ordre de 10 % pour une concentration en sucre ou polyol de l'ordre de 100 mg/l. Tableau 1 Rptabilit du dosage de quelques substances de lextrait sec du vin aprs drivation TMS.
Ac. Tartrique moyenne (mg/l) cart-type (mg/l) CV (%) 2013 184 9

Fructose 1238 118 10

Glucose 255 27 11

Mannitol 164 8 5

Sorbitol 58 2 3

Dulcitol 31 2 8

Msoinositol 456 28 6

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polyols drivant des sucres

REFERENCES RIBEREAU-GAYON P. et BERTRAND A. 1972, Nouvelles applications de la chromatographie en phase gazeuse lanalyse des vins et au contrle de leur qualit, Vitis, 10, 318-322. BERTRAND A. (1974), Dosage des principaux acides du vin chromatographie en phase gazeuse. FV OIV 717718, 253274. par

DUBERNET M.0. (1974), Application de la chromatographie en phase gazeuse ltude des sucres et polyols du vin: thse 3 Cycle, Bordeaux.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polyols drivant des sucres Figure 1 Chromatogramme dun vin blanc aprs silylation. Colonne Cpsil5CB 50 m x 0.25 mm x 0,15 m. Injection split, 60 C, 3 C/min, 240 C. Ci-dessous grossissement.
ADC1 B, ADC1 CHANNEL B (AB17OCT\AB000016.D) 1.615 1.815 2.023 2.184 2.630 4.028 4.196 5.005 5.397 10.295 10.607 11.050 14.812 19.293 20.021 20.392 26.443 31.313 Norm.

22 7
44.243

500000 8.632 24.761

14,15,16
37.388

400000

4 5

8,9

300000

36.721

13

23

40.012

2,3

31

24
200000

11 12

18

30

100000

0 10 20 30 40 50 min

Identification des pics : 1 : mlange ractionnel; 2 et 3 : acides inconnus; 4 :pentarythritol; 5 et 6 inconnus; 7 : acide tartrique + arabinose ; 8, 10 et 11 : rhamnose ; 9 : Arabinose ; 12 : xylitol ; 13 : arabitol ; 14, 15 et 16 : fructose ; 17 : galactose + inconnu ; 18 :glucose ? ; 19 : galactose + acide galacturonique ; 20 et 21 : inconnus ; 22 : mannitol; 23 sorbitol ; 24 : glucose ? ; 25 et 27 : inconnus ; 26 : acide galacturonique ; 28 et 30 : galactonolactone ; 29 : acide mucique ; 31 : mso-inositol.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle

Titre Type de mthode Rsolution

DETERMINATION CONJOINTE DU GLUCOSE ET DU FRUCTOSE DES VINS PAR pH-METRIE DIFFERENTIELLE III Oeno 10/2006

1.

PORTEE ET CHAMP D'APPLICATION

Cette mthode est applicable l'analyse du glucose et du fructose des vins entre 0 et 60 g/L (niveau moyen) ou 50 et 270 g/L (niveau haut). 2. PRINCIPE

La dtermination conjointe du glucose et du fructose par pH-mtrie diffrentielle consiste en une phosphorylation du glucose et du fructose par de l'hexokinase. Les ions H+ gnrs de manire stchiomtrique par rapport aux quantits de glucose et de fructose sont ensuite quantifis. 3. REACTIONS

Le glucose et le fructose prsents sont phosphoryls par l'adnosine triphosphate (ATP) cours d'une raction enzymatique catalyse par l'hexokinase (HK) (EC 2.7.1.1) glucose + ATP fructose + ATP 4. 4.1 4.2 4.3 4.4 REACTIFS Eau dminralise (18 M ) ou bidistille 2-Amino-2-(hydroxymthyl)propane-1,3-diol (TRIS) puret 99% Adnosine triphosphate disodique (ATP, 2Na) puret 99% Phosphate trisodique douze molcules d'eau (Na3PO4.12H2O) puret 99%
HK

glucose-6-phosphate + ADP + H+ fructose-6-phosphate + ADP+ H+

HK

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle 4.5 4.6 99% 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 Hydroxyde de sodium (NaOH) puret 98% Chlorure de magnsium six molcules d'eau (MgCl2.6H2O) puret Triton X 100 Chlorure de potassium (KCl) puret 99% 2-Bromo-2-nitropropane-1,3-diol (Bronopol) (C3H6BrNO4) Hexokinase (EC 2.7.1.1) 1 mg 145 U (ex Hofmann La Roche, Mannheim, Allemagne ref. HEXO-70-1351) Glycrol puret 98% Glucose puret 99%

4.13 Tampon de raction pH 8,0 commercial ou prpar selon la mthode suivante : dans une fiole jauge de 100 mL (5.2) verser approximativement 70 mL (5.3) d'eau (4.1), mettre en agitation continue (5.5). Ajouter 0,242 g 0,001 g (5.4) de TRIS (4.2), 0,787 g 0,001 g (5.4) d'ATP (4.3), 0,494 g 0,001 g (5.4) de phosphate de sodium (4.4), 0,009 mg 0,001 g (5.4) d'hydroxyde de sodium (4.5), 0,203 g 0,001 g (5.4) de chlorure de magnsium (4.6), 2,000 0,001 g (5.4) de Triton X 100 (4.7), 0,820 g 0,001 g (5.4) de chlorure de potassium (4.8) et 0,010 0,001 g (4.9) de bronopol. Ajuster au trait de jauge avec de l'eau (4.1). Le pH final doit tre de 8,0 0,1 (5.6),.sinon l'ajuster avec de l'hydroxyde de sodium ou de l'acide chlorhydrique. Le tampon ainsi prpar est stable pendant deux mois 4C. 4.14 Solution enzymatique commerciale ou prpare selon la mthode suivante : l'aide d'une pipette jauge (5.7) disposer 5 mL de glycrol (4.11) dans une fiole jauge de 10 mL, ajuster au trait de jauge avec de l'eau (4.1) et homogniser. Dissoudre 20 mg 1 mg (5.4) d'hexokinase (4.10) et 5 mg de Bronopol (4.9) dans 10 mL de la solution de glycrol. L'activit de la solution enzymatique doit tre de 300 U 50 U par mL pour l'hexokinase. La solution enzymatique est stable pendant 6 mois 4C. 4.15 Prparation de la solution d'talonnage (niveau moyen) si la teneur suppose est infrieure 50 g/L de glucose + fructose) Placer 3,60 g 0,01 g (5.4) de glucose (4.12) (pralablement dessch 12 heures 40 C jusqu' poids constant), 0,745 g 0,001 g (5.4) de chlorure de potassium (4.8) et 0,010 g 0,001 g de bronopol (4.9) dans une fiole jauge de 100 mL (5.2). Ajouter de l'eau (4.1). Bien homogniser (5.5). Ajuster au trait de jauge avec de l'eau (4.1) aprs avoir enlever le barreau magntique. La concentration finale est de 36 g/L de glucose La solution est stable 6 mois 4C. 4.16 Prparation de la solution d'talonnage (niveau haut) si la teneur suppose est suprieure 50 g/L de glucose + fructose) MA-F-AS311-07-GLCFR2 2

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle Placer 18,0 g 0,01 g (5.4) de glucose (4.12) (pralablement dessch 12 heures 40 C jusqu' poids constant), 0,745 g 0,001 g (5.4) de chlorure de potassium (4.8) et 0,010 g 0,001 g de bronopol (4.9) dans une fiole jauge de 100 mL (5.2). Ajouter de l'eau (4.1). Bien homogniser (5.5). Ajuster au trait de jauge avec de l'eau (4.1) aprs avoir enlever le barreau magntique. La concentration finale est de 180 g/L de glucose La solution est stable 6 mois 4C. 5. APPAREILLAGE

5.1 Appareil de pH-mtrie diffrentielle (EUROCHEM CL 10 plus, Microlab EFA ou quivalent) voir annexe A 5.2 Fiole jauge de 100 mL classe A 5.3 Eprouvette gradue pied de 100 mL 5.4 Balance de prcision permettant de peser au mg prs 5.5 Agitateur magntique et barreau magntique en tflon 5.6 pH-mtre 5.7 Pipettes jauges de 3mL, 5 mL classe A 5.8 Fiole jauge de 10 mL classe A 5.9 Pipettes automatiques piston de 25 et 50 L 6. PREPARATION DES ECHANTILLONS

Les chantillons ne doivent pas tre trop chargs de matires en suspension, dans le cas contraire, les centrifuger ou les filtrer. Les vins mousseux doivent tre dgazs. 7. MODE OPERATOIRE

L'oprateur doit respecter les instructions d'utilisation de l'appareillage (5.1). Avant toute utilisation, l'instrument doit tre stabilis en temprature. Les circuits doivent tre rincs avec la solution de tampon (4.13) aprs nettoyage ventuel.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle

7.1 Dtermination du blanc (dtermination du signal de l'enzyme) ; remplir les compartiments lectrodes (EL1 et EL2) du pH-mtre diffrentiel (5.1) avec le tampon (4.13), la diffrence de potentiel entre les deux lectrodes (D1) doit tre comprise entre 150 mpH ; ajouter 24 L de solution enzymatique (4.14) dans la chambre de raction ( la micropipette 5.9 ou par le prparateur) et remplir l'lectrode EL2 ; mesurer la diffrence de potentiel (D2) entre les deux lectrodes ; calculer la diffrence de pH, pHo pour le blanc selon le calcul suivant : pHo = D2 D1 o pHo = la diffrence de pH entre les deux mesures pour le blanc ; D1 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes remplies avec le tampon ; D2 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes dont l'une est remplie de tampon et l'autre de tampon et d'enzyme. La valeur de pHo permet de vrifier l'tat des lectrodes en cours de dosage ainsi que leur drive ventuelle avec le temps; elle doit tre comprise entre 30 et 0 mpH et 1,5 mpH entre deux mesures conscutives. Dans le cas contraire, vrifier la qualit du tampon pH et la propret du circuit hydraulique et des lectrodes, nettoyer si ncessaire puis refaire le blanc. 7.2 Etalonnage 7.2.1 Niveau moyen remplir les compartiments lectrodes (EL1 et EL2) avec le tampon (4.13); ajouter 25 L ( la micropipette 5.9 ou par le prparateur) de solution talon de glucose (4.15) dans la chambre de raction ; remplir les lectrodes EL1 et EL2 avec le mlange tampon + solution talon ; mesurer la diffrence (D3) de potentiel entre les deux lectrodes ; ajouter 24 L de solution enzymatique (4.14) et remplir l'lectrode EL2 avec le mlange tampon + solution talon + enzyme ; aprs le temps ncessaire la raction enzymatique, mesurer la diffrence de potentiel (D4) entre les deux lectrodes ; calculer la diffrence de pH, pHc pour l'chantillon de calibration selon le calcul suivant : pHc = (D4 D3) - pHo

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle o pHc = la diffrence entre les deux mesures D3 et D4 pour l'chantillon de calibration moins la diffrence obtenue pour le blanc ; D3 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes remplies avec le mlange tampon/solution de rfrence ; D4 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes dont l'une est remplie de tampon/solution de rfrence et l'autre de tampon/solution de rfrence/enzyme. calculer la pente de la droite d'talonnage : s = Cu/pHc o Cu est la concentration de glucose dans la solution talon exprime en g/L. Vrifier la validit de l'talonnage en analysant 25 L de solution talon (ML) de glucose (4.15) en suivant la procdure (7.3). Le rsultat doit tre compris entre 2% de la valeur de rfrence. Dans le cas contraire recommencer la procdure de calibration. 7.2.2 Niveau haut remplir les compartiments lectrodes (EL1 et EL2) avec le tampon (4.13); ajouter 10 L ( la micropipette 5.9 ou par le prparateur) de solution talon (HL) de glucose (4.16) dans la chambre de raction ; remplir les lectrodes EL1 et EL2 avec le mlange tampon + solution talon ; mesurer la diffrence (D3) de potentiel entre les deux lectrodes ; ajouter 24 L de solution enzymatique (4.14) et remp lir l'lectrode EL2 avec le mlange tampon + solution talon + enzyme ; aprs le temps ncessaire la raction enzymatique, mesurer la diffrence de potentiel (D4) entre les deux lectrodes ; calculer la diffrence de pH, pHc pour l'chantillon de calibration selon le calcul suivant : pHc = (D4 D3) - pHo o pHc = la diffrence de pH entre les deux mesures D3 et D4 pour l'chantillon de calibration moins la diffrence obtenue pour le blanc ; D3 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes remplies avec le mlange tampon/solution de rfrence ;

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle D4 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes dont l'une est remplie de tampon/solution de rfrence et l'autre de tampon/solution de rfrence/enzyme. calculer la pente de la droite d'talonnage : s = Cu/pHc o Cu est la concentration de glucose dans la solution talon exprime en g/L. Vrifier la validit de l'talonnage en analysant 10 L de solution talon de glucose (4.16) en suivant la procdure (7.3). Le rsultat doit tre compris entre 2% de la valeur de rfrence. Dans le cas contraire recommencer la procdure de calibration. 7.3 Quantification

remplir les compartiments lectrodes (EL1 et EL2) avec le tampon (4.13) ajouter 10 L (niveau haut ) ou 25 L ( niveau moyen) ( la micropipette 5.9 ou par le prparateur) d'chantillon dans la chambre de raction ; remplir les lectrodes EL1 et EL2 avec le mlange tampon + chantillon ; mesurer la diffrence (D5) de potentiel entre les deux lectrodes ; ajouter 24 L de solution enzymatique (4.14) et remplir l'lectrode EL2 avec le mlange tampon + chantillon + enzyme ; mesurer la diffrence de potentiel (D6) entre les deux lectrodes ; calculer la quantit de solut dans l'chantillon selon le calcul suivant : w = s [(D6 D5) - pHo] o w =la quantit de solut dans l'chantillon (en g/L) ; S est la pente dtermine par la droite de calibration ; pHo = la diffrence de pH entre les deux mesures pour le blanc ; D5 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes remplies avec l'chantillon/solution de rfrence ; D6 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes dont l'une est remplie de tampon/chantillon et l'autre de tampon/chantillon/enzyme.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle

EXPRESSION DES RESULTATS

Les rsultats sont exprims en g/L de glucose + fructose avec un chiffre significatif aprs la virgule. 9 FIDELITE

Les dtails de l'essai interlaboratoire portant sur la fidlit de la mthode sont rsums dans l'annexe B. 9.1 Rptabilit

La diffrence absolue entre deux rsultats individuels obtenus sur une matire identique soumise essai par un oprateur utilisant le mme appareillage, dans l'intervalle de temps le plus court possible, ne dpassera pas la valeur de rptabilit r dans 95% des cas. La valeur est : r = 0,021x + 0,289 o x est la teneur en g/L de glucose + fructose 9.2 Reproductibilit

La diffrence absolue entre deux rsultats individuels obtenus sur une matire identique soumise essai dans deux laboratoires, ne dpassera pas la valeur de reproductibilit R dans 95% des cas. La valeur est : R = 0,033x + 0,507 o x est la teneur en g/L de glucose + fructose 10 10.1 AUTRES CARACTERISTIQUES DE L'ANALYSE Limites de dtection et de quantification

10.1.1 limite de dtection Elle est dtermine partir de 10 sries de trois rptitions d'un blanc analytique et de la rgression linaire ralise avec les vins de l'essai de fidlit, elle est gale trois carts types. Dans ce cas la mthode a donn comme rsultat une limite de dtection de 0,03 g/L. Des essais par dilutions successives ont confirm cette valeur. 10.1.2 limite de quantification Elle est dtermine partir de 10 sries de trois rptitions d'un blanc analytique et de la rgression linaire ralise avec les vins de l'essai de fidlit, elle est gale dix carts types. Dans ce cas la mthode a MA-F-AS311-07-GLCFR2 7

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle donn comme rsultat une limite de dtection de 0,10 g/L. Des essais par dilutions successives ont confirm cette valeur. Les quantifications de vins blancs et rouges ralises par les laboratoires qui ont particip l'analyse interlaboratoire confirment galement ces chiffres. 10.2 Justesse

La justesse est value partir du taux de recouvrement moyen calcul des vins surchargs analyss en double aveugle lors de l'essai interlaboratoire (vins A, B, C, D, F et J). Elle est de 98.9% a vec un intervalle de confiance de 0.22%. 11 CONTROLE QUALITE

Des contrles qualit peuvent tre raliss avec des matriaux de rfrence certifis, des vins dont les caractristiques sont issues d'un consensus ou de vins surchargs insrs rgulirement dans les sries analytiques et en suivant les cartes de contrle affrentes.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle Annexe A Schma de l'appareillage de pH-mtrie diffrentielle

A S EL

P D K

EL 1 C

P1

EL 2 P3

P2

M B W

A : amplificateur diffrentiel ; B : solution de tampon ; C : chambre de mlange ; D : indicateur ; EL1 et EL 2 lectrodes capillaires ; EL : partie lectronique ; G : mise la terre ; K : clavier ; M : agitateur magntique ; P : imprimante ; P1 P3 : pompes pristaltiques ; S : seringue d'injection de l'chantillon et de l'enzyme ; W : mise l'gout.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle Annexe B Donnes statistiques obtenues partir des rsultats des essais interlaboratoire Conformment l'ISO 5725-2:1994, les paramtres suivants ont t dfinis au cours d'un essai interlaboratoire. Cet essai a t conduit par le laboratoire du Comit Interprofessionnel du Vin de Champagne Epernay (France). Anne de l'essai interlaboratoire : 2005 Nombre de laboratoires : 13 en double aveugle Nombre d'chantillons : 10

Vin A Vin B Vin C Vin D Vin E Vin F Vin G Vin H


Moyenne en g/L Nombre de laboratoire nombre de laboratoire aprs limination des plus grandes dispersions cart type de rptabilit

Vin I

Vin J

8,44 13,33 18,43 23,41 28,03 44,88 86,40 93,34 133,38 226,63 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13

13

13

13

13

13

13

13

13

13

13

0,09

0,13 0,38 0,97 0,25 0,27 0,79 2,05 0,54

0,21 0,61 1,13 0,31 0,37 1,06 1,99 0,55

0,21 0,62 0,91 0,26 0,59 1,71 2,54 0,72

0,29 0,86 1,04 0,30 0,55 1,60 1,97 0,58

0,39 1,14 0,86 0,27 0,45 1,29 1,00 0,31

0,81 2,38 0,94 0,32 1,27 3,67 1,47 0,51

0,85 2,51 0,91 0,32 1,43 4,13 1,53 0,53

1,19 3,52 0,89 0,33 1,74 5,04 1,31 0,48

1,51 4,45 0,67 0,47 2,69 7,78 1,19 0,47

limite de rptabilit 0,27 RSDr, 100% HORRAT r cart type de reproductibilit limite de reproductibilit RSDR, 100% HORRAT R
1,08 0,26 0,17 0,50 2,05 0,50

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle
Types d'chantillons : Vin A : vin blanc contenant naturellement du sucre, surcharg de 2,50 g/L glucose et de 2,50 g/L de fructose ; Vin B : vin blanc contenant naturellement du sucre (vin A), surcharg de 5,00 g/L glucose et de 50 g/L de fructose ; Vin C : vin blanc contenant naturellement du sucre (vin A), surcharg de 7,50 g/L glucose et de 7,50 g/L de fructose ; Vin D : vin blanc contenant naturellement du sucre (vin A), surcharg de 10,0 g/L glucose et de 10,0 g/L de fructose ; Vin E : vin aromatis; Vin F : vin blanc contenant naturellement moins de 0,4 g/L de sucre, surcharg de 22,50 g/L glucose et de 22,50 g/L de fructose ; Vin G : vin rouge naturellement doux; Vin H : vin blanc doux ; Vin I : mistelle ; Vin J : vin blanc contenant naturellement moins de 0,4 g/L de sucre, surcharg de 115,00 g/L glucose et de 115,00 g/L de fructose ;

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose et fructose par pH-mtrie diffrentielle

BIBLIOGRAPHIE LUZZANA M., PERELLA M. et ROSSI-BERNARDI L (1971) : Anal. Biochem, 43, 556-563. LUZZANA M., AGNELLINI D., CREMONESI P. et CARAMENTI G. (2001) : Enzymatic reactions for the determination of sugars in food samples using the differential pH technique. Analyst, 126, 2149 2152. LUZZANA M., LARCHER R., MARCHITTI C. V. et BERTOLDI D. (2003) : Quantificazione mediante pH-metria differenziale dell'urea negli spumanti metodo classico.in "Spumante tradizionale e classico nel terzo millennio" 27-28 giugno 2003, Istituti Agrario di San Mechele. MOSCA A., DOSSI G., LUZZANA M., ROSSI-BERNARDI L., FRIAUF W. S., BERGER R.L., HOPKINS H. P. et CAREY V (1981) : Improved apparatus for the differential measurment of pH : application to the measurment of glucose. Anal. Biochem., 112, 287 294. MOIO L., GAMBUTI A., Di MARZIO L. et PIOMBINO P. (2001) : Differential pHmeter determination of residual sugars in wine. Am. J. Enol. Vitic, 52(3), 271 274. TUSSEAU D., FENEUIL A., ROUCHAUSSE J.-M. et VAN LAER S. (2004) : Mesure de diffrents paramtres d'intert oenologique par pHmtrie diffrentielle. F.V. O.I.V. n 1199, 5 pages.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose, fructose et saccharose par pH-mtrie diffrentielle

Titre Type de mthode Rsolution

DETERMINATION GLOBALE DU GLUCOSE, DU FRUCTOSE ET DU SACCHAROSE DES MOUTS ET DES VINS PAR pHMETRIE DIFFERENTIELLE IV Oeno 11/2006

1.

PORTEE ET CHAMP D'APPLICATION

Cette mthode est applicable l'analyse globale du glucose, du fructose et du saccharose dans les mots et les vins entre 0 et 270 g/L. Cette quantification se diffrencie de celle du glucose et du fructose par pHmtrie diffrentielle et ne peux pas lui tre substitue. 2. PRINCIPE

La dtermination p ar pH-mtrie diffrentielle du glucose, du fructose et du saccharose consiste en une hydrolyse pralable du saccharose par de l'invertase, suivie d'une phosphorylation du glucose et du fructose par de l'hexokinase. Les ions H+ gnrs de manire stchiomtrique par rapport aux quantits de glucose et de fructose sont ensuite quantifis. 3. REACTIONS

Le saccharose ventuellement prsent est hydrolys par de l'invertase (EC 3.2.1.26) saccharose
invertase

glucose + fructose

Le glucose et le fructose initialement prsents ou conscutifs l'action de l'invertase sont phosphoryls par l'adnosine triphosphate (ATP) cours d'une raction enzymatique catalyse par l'hexokinase (HK) (EC 2.7.1.1)

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose, fructose et saccharose par pH-mtrie diffrentielle
HK

glucose + ATP fructose + ATP 4. REACTIFS

glucose-6-phosphate + ADP + H+ fructose-6-phosphate + ADP+ H+

HK

4.1 Eau dminralise (18 M ) ou bidistille 4.2 2-Amino-2-(hydroxymthyl)propane-1,3-diol (TRIS) puret 99% 4.3 Adnosine triphosphate disodique (ATP, 2Na) puret 99% 4.4 Phosphate trisodique douze molcules d'eau (Na3PO4.12H2O) puret 99% 4.5 Hydroxyde de sodium (NaOH) puret 98% 4.6 Chlorure de magnsium six molcules d'eau (MgCl2.6H2O) puret 99% 4.7 Triton X 100 4.8 Chlorure de potassium (KCl) puret 99% 4.9 2-Bromo-2-nitropropane-1,3-diol (Bronopol) (C3H6BrNO4) 4.10 Invertase (EC 3.2.1.26) 1 mg 500 U (ex Sigma ref I-4504) 4.11 Hexokinase (EC 2.7.1.1) 1 mg 145 U (ex Hofmann La Roche, Mannheim, Allemagne ref HEXO-70-1351) 4.12 Glycrol puret 98% 4.13 Saccharose puret 99% 4.14 Tampon de raction pH 8,0 commercial (ex : DIFFCHAMB GEN 644) ou prpar selon la mthode suivante : dans une fiole jauge de 100 mL (5.2) verser approximativement 70 mL (5.3) d'eau (4.1), mettre en agitation continue (5.5). Ajouter 0,242 g 0,001 g (5.4) de TRIS (4.2), 0,787 g 0,001 g (5.4) d'ATP (4.3), 0,494 g 0,001 g (5.4) de phosphate de sodium (4.4), 0,009 mg 0,001 g (5.4) d'hydroxyde de sodium (4.5), 0,203 g 0,001 g (5.4) de chlorure de magnsium (4.6), 2,000 0,001 g (5.4) de Triton X 100 (4.7), 0,820 g 0,001 g (5.4) de chlorure de potassium (4.8) et 0,010 0,001 g (5.4) de bronopol. Ajuster au trait de jauge avec de l'eau (4.1). Le pH final doit tre de 8,0 0,1 (5.6),.sinon l'ajuster avec de l'hydroxyde de sodium ou de l'acide chlorhydrique. Le tampon ainsi prpar est stable pendant deux mois 4C. 4.15 Solution enzymatique commerciale ou prpare selon la mthode suivante : l'aide d'une pipette jauge (5.7) disposer 5 mL de glycrol (4.12) dans une fiole jauge de 10 mL, ajuster au trait de jauge avec de l'eau (4.1) et homogniser. Dissoudre 300 mg 1 mg (5.4) d'invertase (4.10) 10 mg 1 mg (5.4) d'hexokinase (4.11) dans 3 mL de MA-F-AS311-08-SACCHA 2

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose, fructose et saccharose par pH-mtrie diffrentielle la solution de glycrol. L'activit de la solution enzymatique doit tre de 50 000 U 100 U par mL pour l'invertase et de 480 U 50 U par mL pour l'hexokinase. La solution enzymatique est stable pendant 6 mois 4C. 4.16. PREPARATION DE LA SOLUTION D'ETALONNAGE Placer 17,100 g 0,01 g (5.4) de saccharose (4.13) (pralablement dessch 12 heures 40 C jusqu' poids constant), 0,745 g 0,001 g (5.4) de chlorure de potassium (4.8) et 0,010 g 0,001 g (5.4) de Bronopol dans une fiole jauge de 100 mL (5.2). Ajouter de l'eau (4.1). Bien homogniser (5.5). Ajuster au trait de jauge avec de l'eau (4.1) aprs avoir enlever le barreau magntique. La concentration finale est de 171 g/L de saccharose. La solution est stable 6 mois 4C. 5. APPAREILLAGE

5.1 Appareil de pH-mtrie diffrentielle (EUROCHEM CL 10 plus, Microlab EFA ou quivalent) voir annexe A 5.2 Fiole jauge de 100 mL classe A 5.3 Eprouvette gradue pied de 100 mL 5.4 Balance de prcision permettant de peser au mg prs 5.5 Agitateur magntique et barreau magntique en tflon 5.6 pH-mtre 5.7 Pipettes jauges de 3mL, 5 mL classe A 5.8 Fiole jauge de 10 mL classe A 5.9 Pipettes automatiques piston de 25 et 50 L 6. PREPARATION DES ECHANTILLONS

Les chantillons ne doivent pas tre trop chargs de matires en suspension, Dans le cas contraire, les centrifuger ou les filtrer. Les vins mousseux doivent tre dgazs. 7. MODE OPERATOIRE

L'oprateur doit respecter les instructions d'utilisation de l'appareillage (5.1). Avant toute utilisation, l'instrument doit tre stabilis en temprature. Les circuits doivent tre rincs avec la solution de tampon (4.14) aprs nettoyage ventuel. 7.1 - Dtermination du blanc (dtermination du signal de l'enzyme) MA-F-AS311-08-SACCHA 3

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose, fructose et saccharose par pH-mtrie diffrentielle remplir les compartiments lectrodes (EL1 et EL2) du pH-mtre diffrentiel (5.1) avec le tampon (4.14), la diffrence de potentiel entre les deux lectrodes (D1) doit tre comprise entre 150 mpH ajouter 32 L de solution enzymatique (4.15) dans la chambre de raction ( la micropipette 5.9 ou par le prparateur) et remplir l'lectrode EL2 ; mesurer la diffrence de potentiel (D2) entre les deux lectrodes ; calculer la diffrence de pH, pHo pour le blanc selon le calcul suivant : pHo = D2 D1 o pHo = la diffrence de pH entre les deux mesures pour le blanc ; D1 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes remplies avec le tampon ; D2 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes dont l'une est remplie de tampon et l'autre de tampon et d'enzyme. La valeur de pHo permet de vrifier l'tat des lectrodes en cours de dosage ainsi que leur drive ventuelle avec le temps; elle doit tre comprise entre 30 et 0 mpH et 1,5 mpH entre deux mesures conscutives. Dans le cas contraire, vrifier la qualit du tampon pH et la propret du circuit hydraulique et des lectrodes, nettoyer si ncessaire puis refaire le blanc. 7.2 Etalonnage remplir les compartiments lectrodes (EL1 et EL2) avec le tampon (4.14); ajouter 10 L ( la micropipette 5.9 ou par le prparateur) de solution talon de saccharose (5) dans la chambre de raction ; remplir les lectrodes EL1 et EL2 avec le mlange tampon + solution talon ; mesurer la diffrence (D3) de potentiel entre les deux lectrodes ; ajouter 32 L de solution enzymatique (4.15) et remplir l'lectrode EL2 avec le mlange tampon + solution talon + enzyme ; aprs le temps ncessaire la raction enzymatique, mesurer la diffrence de potentiel (D4) entre les deux lectrodes ; calculer la diffrence de pH, pHc pour l'chantillon de calibration selon le calcul suivant : pHc = (D4 D3) - pHo o pHc = la diffrence de pH entre les deux mesures D3 et D4 pour l'chantillon de calibration moins la diffrence obtenue pour le blanc ; MA-F-AS311-08-SACCHA 4

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Glucose, fructose et saccharose par pH-mtrie diffrentielle D3 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes remplies avec le mlange tampon/solution de rfrence ; D4 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes dont l'une est remplie de tampon/solution de rfrence et l'autre de tampon/solution de rfrence/enzyme. calculer la pente de la droite d'talonnage : s = Cu/pHc o Cu est la concentration de saccharose dans la solution talon exprime en g/L. Vrifier la validit de l'talonnage en analysant 10 L de solution talon de saccharose (5) en suivant la procdure (7.3). Le rsultat doit tre compris entre 2% de la valeur de rfrence. Dans le cas contraire recommencer la procdure de calibration. 7.3 Quantification remplir les compartiments lectrodes (EL1 et EL2) avec le tampon (4.14) ajouter 10 L ( la micropipette 5.9 ou par le prparateur) d'chantillon dans la chambre de raction ; remplir les lectrodes EL1 et EL2 avec le mlange tampon + chantillon ; mesurer la diffrence (D5) de potentiel entre les deux lectrodes ; ajouter 32 L de solution enzymatique (4.15) et remplir l'lectrode EL2 avec le mlange tampon + chantillon + enzyme ; mesurer la diffrence de potentiel (D6) entre les deux lectrodes ; calculer la quantit de solut dans l'chantillon selon le calcul suivant : w = s [(D6 D5) - pHo] o w =la quantit de solut dans l'chantillon (en g/L) ; S est la pente dtermine par la droite de calibration ; pHo = la diffrence de pH entre les deux mesures pour le blanc ; D5 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes remplies avec l'chantillon/solution de rfrence ; D6 = valeur de la diffrence de pH entre les deux lectrodes dont l'une est remplie de tampon/chantillon et l'autre de tampon/chantillon/enzyme.

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EXPRESSION DES RESULTATS

Les rsultats sont exprims en g/L de glucose inverti avec un chiffre significatif aprs la virgule. 9. CARACTERISTIQUES DE L'ANALYSE

A cause de l'hydrolyse du saccharose dans les mots et les vins il n'a pas t possible d'organiser une analyse interlaboratoire selon le protocole de l'OIV. L'tude intra-laboratoire de cette mthode montre pour le saccharose une linarit entre 0 et 250 g/L, une limite de dtection de 0,2 g/L, une limite de quantification de 0,6 g/L, une rptabilit de 0,0837x 0,0249 g/L et une reproductibilit de 0,0935x 0,073 g/L (o x est la teneur en saccharose). 10 CONTROLE QUALITE

Des contrles qualit peuvent tre raliss avec des matriaux de rfrence certifis, des vins dont les caractristiques sont issues d'un consensus ou de vins surchargs insrs rgulirement dans les sries analytiques et en suivant les cartes de contrle affrentes.

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Annexe A Schma de l'appareillage de pH-mtrie diffrentielle

A S EL

P D K

EL 1 C

P1

EL 2 P3

P2

M B W

A : amplificateur diffrentiel ; B : solution de tampon ; C : chambre de mlange; D : indicateur ; EL1 et EL 2 lectrodes capillaires ; EL : partie lectronique ; G : mise la terre ; K : clavier ; M : agitateur magntique ; P : imprimante ; P1 P3 : pompes pristaltiques ; S : seringue d'injection de l'chantillon et de l'enzyme ; W : mise l'gout.

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Annexe B BIBLIOGRAPHIE LUZZANA M., PERELLA M. et ROSSI-BERNARDI L (1971) : Electrometric method for measurement of small pH changes in biological systems. Anal. Biochem, 43, 556-563. LUZZANA M., AGNELLINI D., CREMONESI P. et CARAMENTI G. (2001) : Enzymatic reactions for the determination of sugars in food samples using the differential pH technique. Analyst, 126, 2149 2152. LUZZANA M., LARCHER R., MARCHITTI C. V. et BERTOLDI D. (2003) : Quantificazione mediante pH-metria differenziale dell'urea negli spumanti metodo classico.in "Spumante tradizionale e classico nel terzo millennio" 27-28 giugno 2003, Instituti Agrario di San Mechele. MOIO L., GAMBUTI A., Di MARZIO L. et PIOMBINO P. (2001) : Differential pHmeter determination of residual sugars in wine. Am. J. Enol. Vitic, 52(3), 271 274. MOSCA A., DOSSI G., LUZZANA M., ROSSI-BERNARDI L., FRIAUF W. S., BERGER R.L., HOPKINS H. P. et CAREY V (1981) : Improved apparatus for the differential measurment of pH : application to the measurment of glucose. Anal. Biochem., 112, 287 294. TUSSEAU D., FENEUIL A., ROUCHAUSSE J.-M. et VAN LAER S. (2004) : Mesure de diffrents paramtres d'intert oenologique par pHmtrie diffrentielle. F.V. O.I.V. n 1199, 5 pages.

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Titre Type de mthode Rsolution

DOSAGE DE LACIDE SORBIQUE DANS LES VINS PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE IV Oeno 4/2006

1 Domaine dapplication La prsente mthode permet de doser lacide sorbique dans les vins dans une gamme de 0 300 mg/l.

2 Principe La charge ngative de lion sorbate permet de le sparer efficacement par lectrophorse capillaire. En sortie de colonne, la dtection est effectue dans lultraviolet 254 nm. 3 Ractifs et produits 3.1 Ractifs

3.1.1 Dihydrognophosphate de sodium [10049-21-5] puret > 96% 3.1.2 Hydrognophosphate de sodium [10028-24-7] puret > 99% 3.1.3. Hydroxyde de sodium [1310-73-2] puret > 97% 3.1.4. Hippurate de sodium [532-94-5] puret > 99% 3.1.5 Eau dminralise (< 15 MOHMS) ou bidistille 3.2 Solution tampon de migration

Le tampon de migration est constitu dune solution aqueuse de : Dihydrognophosphate de sodium (3.1.1) Hydrognophosphate de sodium (3.1.2) 5 mM 5 mM

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3.3

Standard interne

Hippurate de sodium (3.1.4) en solution aqueuse 0.5 g.L-1. 3.4 Solutions de rinage

3.4.1 Hydroxyde de sodium (3.1.3) N/10 3.4.2 Hydroxyde de sodium (3.1.3) N 4 Prparation des chantillons Les chantillons de vin sont prpars selon le schma suivant qui entrane une dilution au 1/20 : Vin analyser : 0.5 ml Hydroxyde de sodium (3.1.3) N/10 : 0.5 ml Standard interne (3.1.4) 0.5 g. L-1 : 0.5 ml qsp 10 ml avec de leau dminralise (3.1.5)

5 Conditions opratoires 5.1 Conditionnement du capillaire Avant sa premire utilisation, et ds que les temps de migration augmentent, le capillaire doit tre conditionn selon le processus suivant : 5.1.1 Rinage avec une solution dhydroxyde de sodium 1N (3.4.2) sous 20 psi (140 kPA) pendant 8 mn. 5.1.2 Rinage avec une solution dhydroxyde de sodium (3.4.1) 0.1 N sous 20 psi (140 kPA) pendant 12 mn 5.1.3 Rinage leau (3.1.5) sous 20 psi (140 kPA) pendant 10 mn 5.1.4 Rinage au tampon de migration (3.2) sous 20 psi (140 kPA) pendant 30 mn 5.2 Conditions de migration

Ces conditions peuvent ventuellement tre sujettes de lgres modifications en fonction de lappareillage utilis. 5.2.1 Le capillaire en silice fondue est de 31 cm de longueur, avec un diamtre de 50 microns. MA-F-AS313-18-SORCAP 2

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acide Sorbique Electro phorse capillaire 5.2.2 Temprature de migration : 25 C 5.2.3 Longueur donde de lecture : 254 nm. 5.2.4 Lecture du signal en mode direct (lacide sorbique absorbe dans lUV). 5.2.5 Premier prrinage sous pression 30 psi (210 kPA) avec une solution dhydroxyde de sodium 0,1 N (3.4.1) pendant 30 secondes 5.2.6 Deuxime prrinage sous pression 30 psi (210 kPA) au tampon de migration (3.2) pendant 30 secondes. 5.2.7 Linjection se fait sous pression de 0,3 psi (2,1 kPA) pendant 10 secondes. 5.2.8 La migration dure environ 1.5 2 minutes sous une diffrence de potentiel de + 25 kV, en polarit normale (cathode la sortie). 5.2.9 Certains appareils dlectrophorse capillaire proposent des vials de grande contenance pour les solutions tampon de migration. Ceci est prfrable lorsque plusieurs analyses sont ralises la suite, car les proprits lectrolytes se conservent plus longtemps. 5.3 Lecture des rsultats

Les pics dabsorption du standard interne et d e lacide sorbique sont obtenus en moyenne 1 1,5 minutes aprs le dbut de la phase de migration sous tension. Le temps de migration est assez constant, mais peut lgrement varier en fonction de ltat du capillaire. En cas de dgradation du temps de migration, un reconditionnement du capillaire est ncessaire, et si les conditions nominales ne sont pas rtablies, le capillaire doit tre remplac.

6 Caractristiques de la mthode Les diffrentes tapes de validation interne dcrites ont t effectues selon la rsolution OIV OENO 10/2005. 6.1 Rptabilit intralaboratoire cart type de rptabilit Sr Rptabilit r MA-F-AS313-18-SORCAP 1,6 mg.L-1 4,6 mg.L-1 3

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6.2

Linarit Dro ite de rgression Coefficient de corrlation r cart type rsiduel Sxy cart type pente Sb Y = 0,99491 X + 2,52727 0,9997 1,6 mg.L-1 0,008 mg.L-1

6.3

Reproductibilit intralaboratoire cart type de 2,1 mg.L-1 reproductibilit SR Reproductibilit R 5,8 mg.L-1

6.4

Limites de dtection et de quantification Limite de dtection Ld Limite de quantification Lq 1,8 mg.L-1 4,8 mg.L-1

6.5

Robustesse

La mthode tant relative, les ventuelles lgres variations des conditions danalyse nauront pas dinfluence sur le rsultat final, mais auront essentiellement des influences sur le temps de migration. 6.6 Spcificit de la mthode

Lventuelle influence des principaux additifs nologiques a t teste. Aucun nentrane une modification des rsultats.

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6.7

Raccordement de la mthode la mthode de rfrence OIV

La mthode de rfrence OIV est le dosage par spectromtrie dabsorption dans lultraviolet. Lacide sorbique, extrait par entranement la vapeur deau, est dos dans le distillat du vin par spectromtrie dabsorption dans lultraviolet 256 nm. 6.7.1 Comparaison des rptabilits lectrophorse capillaire cart type de rptabilit Sr Rptabilit r 1,6 mg.L-1 4,6 mg.L-1 Mthode de rfrence OIV 2,5 mg.L-1 7,0 mg.L-1

6.7.2

Justesse de la mthode usuelle par rapport la mthode de rfrence Coefficient de corrlation r Biais moyen Md cart type biais moyen Sd Z-score (Md/ Sd) 0,999 0,03 mg.L-1 3,1 mg.L-1 0,01

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire

Titre Type de mthode Rsolution

DOSAGE DES PRINCIPAUX ACIDES ORGANIQUES DES VINS PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE III Oeno 5/2006

1.

INTRODUCTION

Les acides tartrique, malique et lactique sont spars et doss par lectrophorse capillaire aprs simple dilution et addition d'talon interne. 2. TITRE DOSAGE DES PRINCIPAUX ACIDES ORGANIQUES DES VINS PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE 3. DOMAINE D'APPLICATION

L'lectrophorse capillaire permet de doser les acides tartrique et malique des mots ainsi que les acides tartrique, malique et lactique des vins pralablement dilus, dgazs et filtrs si besoin. 4. DEFINITIONS

4.1 ELECTROPHORESE CAPILLAIRE L'lectrophorse capillaire : ensemble de techniques qui utilisent un capillaire de silice de trs faible diamtre pour sparer efficacement l'aide d'un tampon appropri, la fois des petites et des grosses molcules lectriquement charges en prsence d'un courant lectrique de fort voltage. 4.2 TAMPON POUR ELECTROPHORESE Solution contenant un ou plusieurs solvants et des soluts de mobilits lectrophortiques convenables capables de tamponner le pH de cette solution.

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4.3 MOBILITE ELECTROPHORETIQUE Aptitude d'un ion se dplacer rapidement sous l'effet champ lectrique.

d'un

4.4 FLUX ELECTROOSMOTIQUE Ecoulement du solvant du tampon le long de la paroi interne du capillaire d aux dplacements des ions solvats sous les effets du champ et des charges lectriques de la silice.

5. PRINCIPE Les sparations des soluts d'un mlange par lectrophorse capillaire sont obtenues par migrations diffrentielles dans un lectrolyte tamponn appel tampon. L'lectrophorse se droule dans un tube de silice de diamtre intrieur compris entre 25 et 75 m. Les soluts sparer sont entrans simultanment par 2 forces qui peuvent agir dans le mme sens ou en sens contraire. Ces deux forces sont dues au champ lectrique et au flux lectroosmotique. Le champ lectrique est reprsent par la tension en volts applique entre les lectrodes ramene un centimtre de capillaire, il est exprim en V.cm- 1 . La mobilit est une caractristique de l'ion. Plus les molcules sont petites et charges plus leur mobilit lectrophortique est importante. Dans le cas o la paroi interne du capillaire est non revtue, les charges lectriques ngatives de la silice vont engendrer une fixation d'une partie des cations du tampon. La solvatation et le dplacement vers la cathode d'une partie des cations du tampon crent le flux lectroosmotique. Les choix du pH du tampon et l'utilisation d'additifs permettent de contrler le sens et l'intensit de ce flux lectroosmotique. L'addition d'un ion chromophore dans le tampon permet l'obtention de pics ngatifs qui reprsentent quantitativement les soluts sparer qui n'absorbent pas la longueur d'onde utilise.

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6. REACTIFS ET PRODUITS 6.1 Produits purs de qualit pure pour analyse 99 % au moins 6.1.1 Sulfate de sodium 6.1.2 Acide L-tartrique 6.1.3 Acide D,L- malique 6.1.4 Acide citrique monohydrat 6.1.5 Acide succinique 6.1.6 Acide D,L-lactique 6.1.7 Dihydrognophosphate de sodium 6.1.8 Gluconate de sodium 6.1.9 Chlorate de sodium 6.1.10 Acide dipicolinique 6.1.11 Bromure de cthyl-trimthyl-ammonium 6.1.12 Actonitrile pour CLHP 6.1.13 Eau pure dsionise, ultrafiltre 6.1.14 Hydroxyde de sodium. 6.2 Solutions 6.2.1. Solution mre d'talonnage Solution dans l'eau pure (6.1.13) des diffrents acides doser (6.1.1 6.1.6) des concentrations exactement connues comprises entre 800 et 1200 mg l- 1 Solution conserver +5 C pendant 1 mois maximum. 6.2.2. Solution d'talon interne Solution de chlorate de sodium (6.1.9) environ 2 g l- 1 dans l'eau pure (6.1.13) Solution conserver +5 C pendant 1 mois maximum 6.2.3 Solution d'talonnage injecter Dans une fiole jauge de 50 ml de classe "A", dposer l'aide de pipettes de classe "A": 2 ml de la Solution d'talonnage (6.2.1) 1 ml de solution d'talon interne (6.2.2) Complter 50 ml avec de l'eau pure (6.1.13) Homogniser par agitation Solution prparer chaque jour

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire 6.2.4 Solutions d'hydroxyde de sodium 6.2.4.1 Solution d'hydroxyde de sodium M Placer dans une fiole de 100 ml 4 g d'hydroxyde de sodium (6.1.14) Complter avec de l'eau pure (6.1.13) Agiter jusqu' dissolution complte. 6.2.4.2 Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M Placer dans une fiole de 100 ml 10 ml d'hydroxyde de sodium M (6.2.4.1) Complter avec de l'eau pure (6.1.13) Homogniser. 6.2.5 Tampon lectrophortique Dans une fiole jauge de 200 ml de classe "A", dposer 0.668 g d'acide dipicolinique (6.1.10) 0.364 g de bromure de cthyl-trimthyl-ammonium (6.1.11) 20 ml d'actonitrile (6.1.12) 160 ml environ d'eau pure (6.1.13) Agiter jusqu' complte dissolution (si besoin ultrasons pour liminer les agrgats) placer dans un bain

Amener pH 5.64 avec tout d'abord de la solution d'hydroxyde de sodium M (6.2.4.1) puis avec de la solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M (6.2.4.2) Complter 200 ml avec de l'eau pure (6.1.13) Homogniser par agitation Solution prparer chaque mois. Conservation la temprature du laboratoire.

APPAREILLAGE

Un quipement d'lectrophorse capillaire ncessaire pour ces dosages contient essentiellement : Un passeur d'chantillons Deux flacons (vials) contenant du tampon Un capillaire de silice non revtue de 50 m de diamtre interne et de 60 cm de longueur entre l'entre du capillaire et la cellule de dtection. De 7 15 cm, suivant les appareils, 4

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire supplmentaires sont ncessaires pour que la sortie du capillaire soit immerge au centre d'un autre flacon Une alimentation haute tension de courant continu capable de dlivrer des tensions de 30 + 30 kv. Les lectrodes immerges dans les deux flacons o dbouchent les extrmits du capillaire sont relies aux bornes du gnrateur Un systme de pressurisation capable de faire circuler le tampon dans le capillaire et permettre l'injection de la prise d'essai Un dtecteur UV Un systme d'acquisition des donnes

Prparation des chantillons pour essai

8.1 Dgazage et filtration Les chantillons riches en gaz carbonique sont dgazs pendant 2 mn aux ultrasons. Les chantillons troubles sont filtrs sur une membrane dont le diamtre des pores moyen est de 0,45 m. 8.2 Dilution et ajout d'talon interne Placer 2 ml d'chantillon dans une fiole jauge de 50 ml Ajouter 1 ml de solution d'talon interne (6.2.2). Complter 50 ml avec de l'eau pure (6.1.13) Homogniser. 9 MODE OPERATOIRE

9.1 Conditionnement dun capillaire neuf Circulation d'eau pure (6.1.13) en sens inverse (de la sortie du capillaire vers le flacon d'entre) pendant 5 mn avec une pression de 40 psi environ (2,76 bar ou 276 kPa) Circulation d'hydroxyde de sodium 0,1 M (6.2.4.2) en sens inverse pendant 5 mn la mme pression Circulation d'eau pure (6.1.13) en sens inverse (de la sortie du capillaire vers le flacon d'entre) pendant 5 mn la mme pression Recommencer ce cycle : passages d'eau pure, d'hydroxyde de sodium 0,1 M, eau pure Circulation du tampon lectrophortique (6.2.5) en sens inverse pendant 10 mn. 5

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire 9.2 Reconditionnement dun capillaire en cours dutilisation Lorsque que la qualit des sparations devient insuffisante un nouveau conditionnement du capillaire s'impose. Si les rsultats obtenus ne sont toujours pas satisfaisants, changer le capillaire et le conditionner. 9.3 Vrification de la qualit du capillaire Analyser 5 reprises la solution d'talonnage (6.2.3) dans les conditions d'analyses prconises. 9.4 Conditions de sparation et de dtection Allumage de la lampe du dtecteur 1 heure avant le dbut des analyses Rinage du capillaire par circulation du tampon lectrophortique (6.2.5) pendant 3 mn en sens inverse sous une pression de 40 psi Injection par pression 0 ,5 psi pendant 6 15 secondes des chantillons prpars en 8.1 La polarit est rgle afin que l'anode soit du ct du dtecteur Appliquer une tension de 0 16 Kv en 1 mn puis de 16 Kv pendant 18 mn environ (la dure de la sparation peut lgrement varier en fonction de la qualit du capillaire ) La temprature est maintenue + 25 C La dtection dans l'ultra violet est faite 254 nm Rinage du capillaire par circulation du tampon lectrophortique (6.2.5) pendant 2 mn en sens inverse sous une pression de 40 psi Changer le du tampon lectrophortique (6.2.5) contenu dans flacons d'entre et de sortie tous les 6 injections au minimum. 9.5. Ordre dans lequel les analyses doivent tre effectues Changer le tampon lectrophortique (6.2.5) srie d'analyses La squence des analyses contient dans l'ordre : Analyse de la solution d'talonnage (6.2.3) Analyse du matriau de rfrence (chantillon externe concentration connue pour les diffrents acides doser) de 6 chaque nouvelle

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire Analyse des chantillons prpars en 8.2. A la fin des analyses effectuer un rinage l'eau pure (6.1.13) de 10 mn en sens inverse, (de la sortie du capillaire vers l'entre), Eteindre la lampe du dtecteur.

10 CALCULS DES RESULTATS Les calculs sont faits partir des surfaces des pics obtenues aprs intgrations. Les surfaces des pics de soluts de la solution d'talonnage (6.2.3) sont corriges en tenant compte des variations de surfaces des pics de l'talon interne. Le coefficient de rponse pour chaque acide est calcul. Les surfaces des pics de l'talon interne et des pics des soluts sont releves pour chaque chantillon. Les surfaces des soluts doser sont recalcules en tenant compte de nouveau des variations de surfaces des pics de l'talon interne pour obtenir des surfaces dites "corriges". Les surfaces corriges sont ensuite multiplies par la valeur du coefficient de rponse correspondant. FORMULE DE CALCULS Les abrviations utilises pour le calcul de la concentration d'un acide sont donnes dans le tableau suivant: Les surfaces sont exprimes par les nombres entiers d'units d'intgration. Les concentrations sont donnes en g/l. (ne conserver que deux dcimales). ABREVIATIONS SOLUTION DE REFERENCE SURFACES DU PIC DE L'ACIDE DOSE PICS D'ETALON INTERNE CONCENTRATION DE L'ACIDE DOSE La formule de calcul est: MA-F-AS313-19-ACORG2 7 ECHANTILLON

SAR SEIR CAR

SAE SEIE CE

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire

CE =

CAR S AE SEIR SAR S EIE

Chaque fois que cela est possible, l'analyse en double exemplaire permet de mettre en vidence une erreur ventuelle dans la reconnaissance des pics ou une imprcision des intgrations. Le passeur d'chantillons permet de raliser les analyses en mode automatique tout au long du jour et de la nuit.

11 FIDELITE 11.1. Organisation des essais Afin d'obtenir une validation interlaboratoires, des chantillons ont t confis 5 laboratoires. Chaque laboratoire a analys en doubles exemplaires 16 chantillons. Ces chantillons comprenaient 2 vins blancs secs, 2 vins blancs liquoreux, 2 vins ross et 2 vins rouges. Chaque vin tait prsent de faon anonyme ainsi que son double, le tout dans un ordre tir au hasard. 11.2. Mesure de la fidlit
ESTIMATION DE LA FIDELITE APRES ANALYSES INTERLABORATOIRES Nombre de laboratoires participants: 5

Rsultats donns en mg / l ACIDE TARTRIQUE valeurs moyennes des concentrations valeurs moyennes des carts types de rptabilit valeurs moyennes des carts types de rproductibilit 1395 38 87 ACIDE MALIQUE 1884 54 113 ACIDE LACTIQUE 1013 42 42

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire 12 ANNEXES
ESSAIS INTERLABORATOIRES Dosage de l'ACIDE TARTRIQUE par lectrophorse capillaire

Identification de l'chantillon

vins blancs vins blancs vins ross vins rouges secs liquoreux A et D B et C E et F G et H I et J K et L M et N O et P 5 5 5 5 5 5 5 5 4 5

Nombre de laboratoires participants

Nombre de rsultats accepts

Valeur moyenne en mg/l

1943

2563

1440

255

553

1885

1373

1148

Valeur accepte en mg/l

1943

2563

1387

2217

1877

1593

1370

1830

Ecart-type de rptabilit (Sr)

27

25

106

23

40

31

25

24

Coefficient de variation de rptabilit

1,4

7,7

2,2

1,9

1,8

1,3

Limite de rptabilit ( r )

77

70

298

65

113

86

70

66

Ecart-type de reproductibilit (SR)

96

128

174

80

57

55

52

53

Coefficient de variation de reproductibilit en % Limite de reproductibilit ( R )

4,9

12,6

3,6

3,5

3,8

2,9

268

359

488

223

160

154

145

148

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire

ESSAIS INTERLABORATOIRES Dosage de l'ACIDE MALIQUE par lectrophorse capillaire

Identification de l'chantillon

vins blancs secs A et D B et C 5 5

vins blancs liquoreux E et F G et H 5 5

vins ross I et J 5

vins rouges

K et L M et N O et P 5 5 5 4 5

Nombre de laboratoires participants

Nombre de rsultats accepts

Valeur moyenne en mg/l

2571

1602

1680

2539

3524

2109

173

869

Valeur accepte en mg/l

2571

1602

1680

2539

3524

2109

177

869

Ecart-type de rptabilit (Sr)

54

19

113

35

61

109

32

Coefficient de variation de rptabilit

2,1

1,2

6,7

1,4

1,7

5,2

4,1

3,7

Limite de rptabilit ( r )

151

54

315

99

170

305

20

89

Ecart-type de reproductibili (SR)

90

51

171

97

279

142

21

53

Coefficient de variation de reproductibilit en % Limite de reproductibilit ( R )

13,6

9,8

41

39,6

14,7

14,1

7,6

252

142

479

273

782

397

59

148

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire

ESSAIS INTERLABORATOIRES Dosage de l'ACIDE LACTIQUE par lectrophorse capillaire rsultats donns en mg / l Identification de l'chantillon vins blancs vins blancs vins ross vins rouges secs liquoreux A et D B et C E et F G et H I et J K et L M et N O et P

Nombre de laboratoires participants

5 4 5

Nombre de rsultats accepts

Valeur moyenne en mg/l

659

1324

258

255

553

1885

2066

1148

Valeur accepte en mg/l

650

1324

258

255

553

1885

2036

1148

Ecart-type de rptabilit (Sr)

20

42

20

39

27

99

75

16

Coefficient de variation de rptabilit

3,1

3,2

7,8

15,1

4,8

5,3

3,7

16

Limite de rptabilit ( r )

57

117

56

108

75

278

211

46

Ecart-type de reproductibilit (SR)

20,357 41,79

20

38,57 26,786 99,29 75,36 16,429

Coefficient de variation de reproductibilit en % Limite de reproductibilit ( R )

13,6

9,8

41

39,6

14,7

14,1

7,6

247

363

296

283

227

475

802

243

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11

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire

ELECTROPHOREGRAMME D'UNE SOLUTION ETALON D'ACIDES

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12

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire

ELECTROPHEROGRAMME D'UN VIN

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13

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides organiques Electrophorse Capillaire

13 BIBLIOGRAPHIE ARELLANO M., COUDERC F. et PUIG .L ( 1997 ) : Simultaneous separation of organic and inorganic acids by capillary zone electrophoresis. Application to wines and fruit juices. Am. J. Enol. Vitic., 48, 408-412. KANDL T. et KUPINA S. ( 1999 ): An improved capillary electrophoresis procedure for the determination of organics acids in grape juices and wine. Am. J. Vitic., 50, 155-161. KLAMPF C.F. ( 1999 ): Analysis of organics acids and inorganics anions in different types of beer using capillary zone electrophoresis. J. Agric. Food Chem., 47, 987-990.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides sorbique, benzoque salicylique - HPLC

Titre Type de mthode Rsolution

DOSAGE DES ACIDES SORBIQUE, BENZOQUE, SALICYLIQUE DANS LES VINS PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE IV Oeno 6/2006

1. Introduction L'acide sorbique et son sel de potassium est un antiseptique utilisable en nologie mais certains pays ne tolrent pas sa prsence dans les vins y compris l'tat de trace. Ceci se justifiant en particulier en raison de l'odeur de granium apparaissant lors de la dgradation de l'acide sorbique par les bactries lactiques. Les acides benzoques et salicyliques sont toujours interdits dans les vins mais ils sont utiliss dans d'autres boissons. 2. Domaine d'application Tous les vins ou mots de raisin en particulier ceux qui sont susceptibles de ne contenir que des traces d'acide sorbique, benzoque ou salicylique (mise en vidence partir de 1 mg/l).

3. Principe Les antiseptiques sont doss par HPLC par injection directe de l'chantillon dans une colonne fonctionnant par partage en phases inverses en isocratique avec dtection dans l'ultraviolet 235 nm. 4. Produits 4.1 Eau pure microfiltre (par exemple de rsistivit suprieure 18,2 M ) 4.2 Ttrahydrofuranne pur 4.3 Mthanol pur 4.4 Acide chlorhydrique 0,1 M (prpar partir d'ampoules diluer)

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides sorbique, benzoque salicylique - HPLC 4.5 Eau pH2 amener 650 ml d'eau (4.1) pH2 contrl l'aide du pHmtre (5.5) en versant goutte goutte sans agitation l'acide chlorhydrique 0,1 M (4.4) 4.6 Solution d'lution. Mlanger 650 ml deau pH2 (4.5), 280 ml de mthanol (4.3) et 7 ml de ttrahydrofuranne (4.2). Remarque : il est galement possible d'utiliser d'autres solvants d'lution, par exemple : 80% d'une solution d'actate dammonium 0,005M (0,38 g/l) ajuste pH 4 avec de lacide actique pur + 20% d'actonitrile 4.7 Acide sorbique pur 4.8 Acide benzoque pur 4.9 Acide salicylique pur 4.10 Alcool pur 4.11 Solution hydroalcoolique 50 % vol. Placer 500 ml d'alcool pur (4.10) dans une fiole de 1 l complter avec de l'eau distille (4.1) 4.12 Solution mre des acides 500 mg/l. Dissoudre 50 mg des acides sorbique (4.7), benzoque (4.8), salicylique (4.9) dans 100 ml de la solution hydroalcoolique 50 % vol. (4.11) 4.13 Solution filles des acides sorbique, benzoque, salicylique. Diluer la solution mre (4.12) dans la solution hydroalcoolique (4.11) de manire obtenir les concentrations finales dsires par exemple pour une solution - 200 mg/l placer 20 ml de la solution mre (4.12) dans une fiole de 50 ml complter au trait de jauge avec (4.11). - 1 mg/l placer 2 ml de solution mre (4.12) dans une fiole de 50 ml. Complter au trait de jauge avec 4.11 Des solutions intermdiaires peuvent tre ralises de la mme manire selon les ncessits de l'talonnage 5. Appareils 5.1 Verrerie de laboratoire en particulier pipette et fioles jauges 5.2 Bain ultrasons 5.3 Dispositif de filtrations sous vide pour volume important (1 l) utilisant des membranes filtrantes de diamtre de pore infrieur 1 m (gnralement 0,45 m) 5.4 Minifiltre pour chantillon (1 2 ml) utilisant des membranes filtrantes de diamtre de pore infrieur 1 m (gnralement 0,45 m) 5.5 pH mtre

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides sorbique, benzoque salicylique - HPLC 5.6 Chromatographe en phase liquide fonctionnant en mode isocratique muni d'un dispositif d'injection pour faibles volumes (par exemple) vanne boucle de 10 ou 20 l. 5.7 Dtecteur pouvant fonctionner dans l'ultra violet 235 nm muni d'une cuve circulation pour CLHP (par exemple de 8 l pour 1 cm de trajet optique) 5.8 Colonne pour CLHP de phase stationnaire de 5 m type silice greffe par des groupes octadcyles (C18) de 20 cm de long 4 mm de diamtre intrieur. 5.9 Systme d'acquisition des donnes

6. Prparation des chantillons et du solvant d'lution 6.1 Filtrer les chantillons analyser l'aide du minifiltre (5.4) 6.2 Dgazer le solvant d'lution (4.6) durant 5 minutes l'aide du bain ultrasons (5.2) 6.3 Filtrer le solvant l'aide du dispositif (5.4)

7. Mode opratoire 7.1 Conditionnement de la colonne. Avant l'injection mettre en route la pompe et rincer la colonne avec le solvant durant au minimum 30 minutes 7.2 Injecter une des solutions filles (4.13) afin de s'assurer de la sensibilit du systme et de la bonne rsolution des pics des substances analyser. 7.3 Injecter l'chantillon analyser faire ventuellement l'analyse d'un chantillon identique ayant t supplment par les acides rechercher (adapter l'ajout la quantit ventuellement dcele lors de l'analyse prcdente, pour 1 mg prsent ajouter galement 1 mg) S'assurer de la bonne rsolution des pics des acides recherchs avec les pics du vins (normalement il n'en existe pas dans cette zone)

8. Calcul Aprs avoir repr les pics des acides doser dans l'chantillon comparer l'aire des pics avec celles des acides d'une solution fille (4.13) de concentration C connue

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Acides sorbique, benzoque salicylique - HPLC Par exemple soit s l'aire du pic de l'acide doser. S l'aire du pic de la solution (4.13) de concentration C X
dans l'chantillon

= C

s S

en mg/l

9. Caractristiques de la mthode Acide sorbique Domaine de linarit Justesse (taux de rcupration) Rptabilit : r* Reproductibilit : R* Limite de dtection Limite de quantification Incertitude 0 200 mg/l > 90 % 2% 8% 3 mg/l 5 mg/l 11% Acide benzoque 0 200 mg/l > 90 % 3% 9% 3 mg/l 6 mg/l 12% Acide salicylique 0 200 mg/l > 90 % 8% 12% 3 mg/l 7 mg/l 13%

10. Bibliographie - Dosage de l'acide sorbique dans les vins par chromatographie en phase gazeuse. 1978. BERTRAND A. et SARRE Ch., Feuillets Verts O.I.V., 654-681. - Dosage de l'acide salicylique dans les vins par chromatographie en phase gazeuse. 1978. BERTRAND A. et SARRE Ch., Feuillets Verts Ol.V., 655-682. - Dosage de l'acide benzoque, dans les sodas et autres produits alimentaires liquides, par chromatographie en phase gazeuse. 1978. BERTRAND A. et SARRE Ch. Ann. Fals. Exp. Chim. 71, 761, 35-39. -Application de la chromatographie liquide lanalyse des vins et des mots. 1979. SALAGOITY-AUGUSTE M.-H. Doctorat de luniversit de Bordeaux 2. MA-F-AS313-20-SOBESA 4

RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSES OIV Dioxyde de carbone

Titre Type de mthode Rsolution

DIOXYDE DE CARBONE II Oeno 3/2006


avec une g amme de concentration jusqu 1,5 g/L (A 39 modifie par oeno 21/2003 et complte par la rsolution Oeno 3/2006)

1. Principe de la mthode 1.1. Cas des vins tranquilles (surpression de CO2 0,5 x 105 Pa) 1 Le volume de vin prlev sur l'chantillon amen au voisinage de 0 C est vers dans un excs suffisant de solution titre d'hydroxyde de sodium pour avoir un pH de 10 - 11. On titre avec une solution acide en prsence d'anhydrase carbonique. La teneur en dioxyde de carbone est dduite du volume vers pour passer de pH 8,6 (forme carbonate acide) 4,0 (acide carbonique). Un titrage tmoin effectu dans les mmes conditions sur le vin dcarboniqu permet de tenir comp te du volume de solution d'hydroxyde de sodium consomm par les acides du vin. 1.2. Cas des vins ptillants et des vins mousseux L'chantillon de vin analyser est amen au voisinage de son point de conglation. Aprs soutirage d'un certain volume destin servir de tmoin aprs dcarbonication, on alcalinise le reste de la bouteille pour fixer tout le CO2 sous forme de carbonate neutre. On titre avec une solution acide en prsence d'anhydrase carbonique. La teneur en dioxyde de carbone est dduite du volume de solution acide verse pour passer de pH 8,6 (forme carbonate acide) pH 4,0 (acide carbonique). Un titrage tmoin effectu dans les mmes conditions sur le vin dcarboniqu permet de tenir compte du volume de solution d'hydroxyde de sodium consomm par les acides du vin. 2. Description de la mthode 2.1. Cas des vins tranquilles (surpression de dioxyde de carbone 0,5 x 105 Pa).

1 bar = 105 Pascal (Pa)

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RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSES OIV Dioxyde de carbone 2.1.1. Appareillage Agitateur magntique pH mtre. 2.1.2. Ractifs Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M. Solution d'acide sulfurique 0,05 M. Solution d'anhydrase carbonique 1 gramme par litre. 2.1.3. Mode opratoire Refroidir l'chantillon de vin aux environs de 0 C ainsi que la pipette de 10 ml servant son prlvement. Prlever dans un vase cylindrique de 100 m l, 25 ml de solution 0,1 M d'hydroxyde de sodium ; ajouter 2 gouttes de solution aqueuse d'anhydrase carbonique 1 g par litre. Y introduire 10 ml de vin au moyen de la pipette refroidie 0 C. Placer le vase cylindrique sur l'agitateur magntique, mettre en place l'lectrode et le barreau magntique et procder une agitation modre. Lorsque le liquide est revenu la temprature ambiante, verser par affusion lente la solution 0,05 M d'acide sulfurique jusqu' pH 8,6. Continuer les affusions d'acide sulfurique 0,05 M jusqu' pH 4,0. Soit n ml le volume utilis entre pH 8,6 et 4,0. Procder par ailleurs l'limination du CO2 sur 50 ml environ de l'chantillon de vin par agitation sous vide pendant 3 minutes, en rchauffant la fiole dans un bain d'eau 25 C environ. Appliquer sur 10 ml de vin dcarboniqu le mode opratoire cidessus : soit n ml le volume utilis. 2.1.4. Expression des rsultats 1 ml de solution titre d'acide sulfurique 0,05 M correspond 4,4 mg de dioxyde de carbone. La quantit de dioxyde de carbone, en grammes par litre de vin, est donne par : 0,44 (n n). Elle est exprime avec 2 dcimales. Remarque : Dans le cas des vins peu chargs en CO2 (CO2 < 1 g/l), l'addition d'anhydrase carbonique pour catalyser l'hydratation du CO2 n'est pas ncessaire.

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RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSES OIV Dioxyde de carbone 2.2. Cas des vins ptillants et des vins mousseux 2.2.1. Appareillage Agitateur magntique. pH mtre. 2.2.2. Ractifs Solution d'hydroxyde de sodium 50 p. 100 (m/m). Solution d'acide sulfurique 0,05 M. Solution d'anhydrase carbonique 1 gramme par litre. 2.2.3. Mode opratoire Sur la bouteille de vin analyser, tracer un repre au niveau du remplissage et la refroidir jusqu' dbut de conglation. Laisser la bouteille se rchauffer lgrement, tout en l'agitant, jusqu' disparition des cristaux de glace. Dboucher rapidement et mettre de ct, dans une prouvette gradue, 45 50 ml de vin qui serviront au dosage tmoin. Le volume exact de ce prlvement, v ml, sera dtermin par lecture sur l'prouvette aprs son retour la temprature ambiante. Ajouter, sitt le prlvement effectu, 20 ml de solution d'hydroxyde de sodium 50 p. 1000 dans la bouteille pour une contenance de 750 ml. Attendre que le vin soit revenu la temprature ambiante. Placer dans un vase cylindrique de 100 ml, 30 ml d'eau distille bouillie et 2 gouttes de la solution d'anhydrase carbonique 1 g/l. Y ajouter 10 ml de vin alcalinis. Placer le vase sur l'agitation magntique, mettre en place l'lectrode et le barreau magntique et procder une agitation modre. Verser par affusion lente la solution d'acide sulfurique 0,05 M jusqu' pH 8,6. Continuer les affusions d'acide sulfurique 0,05 M jusqu' pH 4,0. Soit n ml le volume utilis entre pH 8,6 et 4,0. Procder par ailleurs l'limination du CO2 sur les v ml de vin, mis ct pour le dosage tmoin, par agitation sous vide pendant 3 minutes, en rchauffant la fiole dans un bain d'eau 25 C environ. Prlever 10 ml de vin dcarboniqu dans 30 m l d'eau distille bouillie, ajouter 2 3 gouttes de solution d'hydroxyde de sodium 50 p. 100 pour amener le pH 10-11. Appliquer ensuite le mode opratoire cidessus. Soit n ml, le volume d'acide sulfurique 0,05 M vers.

2.2.4. Expression des rsultats MA-F-AS314-01-DIOCAR

RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSES OIV Dioxyde de carbone 1 ml de solution d'acide sulfurique 0,05 M correspond 4,4 mg de dioxyde de carbone. Vider la bouteille de son vin alcalinis et dterminer 1 ml prs le volume initial du vin en la remplissant avec de l'eau jusqu'au trait de repre, soit V ml. La quantit de dioxyde de carbone en grammes par litre de vin est donne par : 0,44 (n n) x

V v + 20 V-v

Elle est exprime avec 2 dcimales. 2.3. Calcul de la surpression thorique La surpression 20 C, Paph20, exprime en Pascals, est donne par la formule :

Paph 20 =
avec Q A S Patm

Q Patm 1,951 x 105 (0,86 0,01A) (1 0,00144 S)

: = Teneur en grammes de CO2 par litre de vin = Titre alcoomtrique du vin 20 C = Teneur en sucres du vin en grammes par litre = Pression atmosphrique, exprim e en Pascals

2.4 Remarque Le mode opratoire ci-dessous peut tre employ titre usuel pour des vins contenant moins de 4 g par litre de dioxyde de carbone. Il est ncessaire de disposer de deux chantillons du vin analyser. Ouvrir lun des chantillons aprs lavoir refroidi aux environs de 5 C et ajouter immdiatement 5 ml dune solution dhydroxyde de sodium 50% (m/m), pour 275 ml dchantillon. Boucher aussitt et mlanger. Prlever 10 ml de vin ainsi trait dans un vase cylindrique contenant 40 ml deau et ajouter 3 gouttes de solution danhydrase carbonique 0,1 g/l. Titrer avec une solution dacide sulfurique 0,02275 M jusqu pH 8,6, puis jusqu pH 4,0 et relever le volume vers entre pH 8,6 et 4,0, soit n ml. Procder par ailleurs llimination du dioxyde de carbone sur 25 ml environ de vin, prlevs sur le deuxime chantillon, par agitation sous vide durant 1 min. dans un flacon de 500 ml contenant III gouttes de solution danhydrase carbonique. Ajouter 0,33 ml de

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RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSES OIV Dioxyde de carbone solution dhydroxyde de sodium 50% (m/m). Appliquer sur 10 ml de vin dcarboniqu le mode opratoire ci-dessus. Soit n ml le volume utilis, 1 ml H 2SO4 0,02275 M correspond 200 mg de dioxyde de carbone par litre. Teneur du vin analys en dioxyde de carbone, en milligrammes par litre : (n - n') x 200 x 1,013

BIBLIOGRAPHIE Mthode de rfrence : CAPUTI A, UEDA M., WALTER P, & BROWN T., Amer, J, Enol, Vitic., 1970, 21, 140-144, SUDRAUD P., F., O.I.V., 1973, n 350, GORANOV N., F.V., O.I.V., 1983, n 758, BRUN S, & TEP Y., F.V., O.I.V., 1981, n 736 & 1982, n 736 (bis),

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- Etude collaborative Titrage du dioxyde de carbone dans les vins ptillants et mousseux - Rapport sur les rsultats obtenus-

Objectif de ltude Lobjectif de ltude est de dterminer les caractristiques de rptabilit et de reproductibilit de la mthode de rfrence (MA-F-AS314-01DIOCAR) pour le titrage du CO2 dans les vins ptillants et mousseux. Les dfinitions de lOIV et les limites de CO2 sont disponible dans la rsolution OENO 1/2002. Besoins et objectifs de ltude La mthode de rfrence pour le titrage du CO2 nincluant pas des donnes de prcision, c'est cette fin que ces essais collaboratifs ont t mens. En raison de la particularit analytique de cette mthode, le protocole de validation conventionnel na pas pu tre compltement respect. Sur une bouteille dchantillon, on na pu effectuer quune seule dtermination indpendante. Chaque bouteille a d tre considre comme individuelle. Il na donc pas t possible de procder aux essais dhomognit prvus dordinaire dans le cadre des enqutes prliminaires dune tude collaborative. Il a donc fallu travailler en troite collaboration avec les producteurs afin davoir un matriau dessai homogne. Les chantillons ont t prlevs dans un lot au cours du remplissage des bouteilles, directement sur la ligne de remplissage dans un court intervalle de temps, en supposant donc que le CO2 avait t distribu de manire homogne dans toutes les bouteilles. Ltude a t conue comme une srie de rptitions en aveugle . Lanonymat complet des chantillons na pas pu tre garanti car les partenaires/producteurs impliqus dans ltude utilisaient diffrents types de bouteilles et/ou dobturateurs pour les diffrents chantillons. Il a donc fallu se fier lhonntet des laboratoires participant ltude qui on a demand de raliser une analyse indpendante des donnes, sans modification de ces donnes. Objet et domaine d'application 1. La mthode est quantitative. MA-F-AS314-01-DIOCAR

RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSES OIV Dioxyde de carbone 2. la mthode est applicable pour le titrage alcoomtrique du CO2 dans les vins ptillants et mousseux pour vrifier le respect des normes.

Matriaux et matrices Ltude collaborative a port sur 6 chantillons diffrents. Ceux-ci ont tous t envoys en rpliques en aveugle. Au total 12 bouteilles ont donc t distribues aux participants. Tableau 1 : Echantillons et codes Echantillon Echant. A Echant. B Echant. C Echant. D Echant.E Echant. F Code bouteille (Code 1 + 9) (Code 2 + 5) (Code 3 + 4) (Code 6 + 10) (Code 7 + 11) (Code 8 + 12) Type Vin mousseux Vin ptillant Vin mousseux Vin ptillant Vin ptillant Vin mousseux (rouge)

Mesures de contrle La mthode tudie dans le prsent document est dj approuve dans la pratique. Seules les donnes de prcision manquantes devaient tre dtermines par ltude collaborative. Il na pas t ncessaire deffectuer dessai prliminaire car la plupart des laboratoires utilisaient dj la mthode de rfrence pour leurs analyses usuelles.

Mthode suivre et pices justificatives Toutes les pices justificatives ncessaires ont t fournies aux participants (lettre daccompagnement, rfrence de la mthode danalyse, formulaire de rception de lchantillon et fiche de rsultats). La dtermination de la teneur de CO2 devait tre exprime en g/l.

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RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSES OIV Dioxyde de carbone Analyse des donnes 1. La dtermination des valeurs aberrantes a t value par le test de Cochran, le test de Grubbs unilatral et le test de Grubbs bilatral. 2. Une analyse statistique a t effectue pour obtenir les donnes de rptabilit et reproductibilit 3. Les valeurs de HORRAT ont t calcules.

Participants 13 laboratoires appartenant plusieurs pays ont particip ltude collaborative. On a attribu un code chaque laboratoire. Les laboratoires participants ont une exprience reconnue dans lanalyse du CO2 dans les vins mousseux.

Tableau 2 : Liste des participants.


Landesuntersuchungsamt D-56068 Koblenz (Coblence) ALLEMAGNE Landesuntersuchungsamt D-67346 Speyer ALLEMAGNE Servicio Central de Viticultura y Enologia E-08720 Villafranca Del Pendes ESPAGNE Landesuntersuchungsamt D-85764 Oberschleiheim ALLEMAGNE Chemisches Landes- u. Staatl. Veterinruntersuchungsamt D-48151 Mnster ALLEMAGNE Bundesamt fr Weinbau A-7000 Eisenstadt AUTRICHE Chemisches und Veterinruntersuchungsamt D-70736 Fellbach ALLEMAGNE Institut fr Lebensmittelchemie und Arzneimittelprfung D-55129 Mainz (Mayence) ALLEMAGNE Institut fr Lebensmittel, Arzneimittel und Tierseuchen D-10557 BERLIN ALLEMAGNE Landesuntersuchungsamt D-54295 Trier (Trves) ALLEMAGNE Instituto Agrario di S. Michele I-38010 S. Michele all Adig ITALIE Ispettorato Centrale Repressione Frodi I-31015 Conegliano (Treviso) ITALIE BgVV D-14195 Berlin ALLEMAGNE

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RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSES OIV Dioxyde de carbone 9. Rsultats Pour la dtermination du CO2 les valeurs dincertitude sont calcules directement partir des rsultats soumis. Aux fins de lvaluation de ltude collaborative, le calcul de la valeur Horrat est pertinent. Pour tous les chantillons on a obtenu une valeur Horrat < 2 pour la reproductibilit et la rptabilit, ce qui est convaincant pour une tude collaborative. Le Tableau 3 donne les rsultats du titrage de CO2 par chantillon.

Tableau 3 : Rsum des rsultats du titrage de CO2.


CO2 Moyenne[ g/l] r [g/l] sr [g/l] RSDr % Hor 0,626 0,224 2,379 0,893 0,180 0,064 1,921 0,617 0,560 0,200 2,145 0,804 0,407 0,145 3,314 1,109 0,365 0,130 2,803 0,946 0,327 0,117 1,352 0,501 ECHANT. A ECHANT. B ECHANT. C ECHANT. D ECHANT. E ECHANT. F 9,401 3,344 9,328 4,382 4,645 8,642

R [g/l] sR [g/l] RSDR % HoR

1,323 0,473 5,028 1,245

0,588 0,210 6,276 1,331

0,768 0,274 2,942 0,728

0,888 0,317 7,239 1,599

0,999 0,357 7,680 1,711

0,718 0,256 2,967 0,726

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Titre Type de mthode Rsolution

DOSAGE DU DIOXYDE DE CARBONE DANS LE VIN PAR METHODE MANOMETRIQUE pour une chelle de concentration II allant de 0,5 g/l 7 g/ Oeno 2/2006

1. PRINCIPE Le dioxyde de carbone de l'chantillon est fix par de la soude 10M. Il est ensuite libr par de l'acide sulfurique dans une fiole vide connecte un manomtre. L'augmentation de pression qui en rsulte permet de calculer la quantit de dioxyde carbone contenu dans l'chantillon. 2. REACTIFS 2.1. Eau frachement distille ou dsionise ; 2.2. Hydroxyde de sodium (puret >98%) ; 2.3. Acide sulfurique (puret >95-97%) ; 2.4. Carbonate de sodium anhydre ( puret >99%). Prparation des solutions ractives 2.5. Hydroxyde de sodium 10 M : Dissoudre 100 g d'hydroxyde de sodium (2.2) dans 200 ml d'eau (2.1) et ajuster 250 ml dans une fiole jauge. 2.6. Acide sulfurique environ 50 % (v/v) : Ajouter avec prcaution, de l'acide sulfurique (2.3) un volume gal d'eau (2.1). Bien mlanger par agitation. Laisser refroidir jusqu' temprature ambiante. 2.7. Mlange talon de dioxyde de carbone 10 g/l : scher le carbonate de sodium une nuit (2.4) dans un four 260-270C, laisser revenir temprature ambiante dans un dessiccateur. Dissoudre 6,02 0, 01 g de carbonate de sodium sch dans de l'eau (2.1) et ajuster 250 ml dans une fiole jauge. 2.8. Mlanges talons de dioxyde de carbone 0,4 ; 1 ; 2 ; 4 and 6 g/l : l'aide de pipettes verser 2, 5, 10, 20 et 30 ml de la

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Dioxyde de Carbone - Manomtrique solution talon (2.7) dans des fioles jauges de 50 ml et ajuster avec de l'eau (2.1). 3. APPAREILLAGE 3.1. Fioles jauges de 250 ml et 50 ml ; 3.2. Four ; 3.3. Dessiccateur ; 3.4. Balance d'une exactitude de 0.1 mg ; 3.5. Rfrigrateur ou bain rfrigrant - 4oC ; 3.6. Densimtre lectronique (ou pycnomtre) et bain thermostat 20 C; 3.7. Pipettes de 0,5, 2, 3, 5, 10, 20 et 30 ml ; 3.8. flacons cniques de 100 ml, large ouverture ; 3.9. Manomtre numrique (permettant de mesurer des carts de pression de l'ordre de 200 kPa avec une exactitude de 0,1 kPa) ; 3.10. Fiole vide de 25 ml quip d'un flacon de raction de 3 ml et d'une vanne trois voies (voir la figure 1) ; 3.11. Gnrateur de vide (par exemple une trompe eau). 3.12 Ampoule dcanter 4. MODE OPERATOIRE 4.1. Prparation de l'chantillon Prparer les chantillons en double. Refroidir l'chantillon en le laissant une nuit dans un rfrigrateur ou 40 minutes dans un bain rfrigrant 4C (3.5). Verser 3 ml dhydroxyde de sodium 10M (2.5) dans un flacon cnique de 100 m l (3.8). Peser le flacon et son contenu 0,1 mg prs. Verser approximativement 75 ml de l'chantillon refroidi dans le flacon cnique contenant l hydroxyde de sodium. Peser 0,1 mg prs. Mlanger et laisser revenir temprature ambiante. 4.2. Dosage du dioxyde de carbone contenu par mthode manomtrique Transfrer 2 ml de l'chantillon prpar (4.1) dans la fiole vide (3.10). La connecter au manomtre (3.9) via la vanne trois voies en position ouverte. A l'aide d'une pipette (3.7) dposer 0,5 ml d'acide sulfurique 50 % (2.6) dans le flacon de raction. Le raccorder la fiole vide. Fixer et scuriser l'ensemble l'aide de clips. Noter la

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Dioxyde de Carbone - Manomtrique pression. Fermer la vanne trois voies. Mlanger l'acide et l'chantillon en inclinant l'ensemble et en le s ecouant vigoureusement. Noter la pression. L'chantillon peut tre dilu si ncessaire.

environ environ

Fig. 1. Appareillage. A manomtre, B tuyau en caoutchouc, C valve trois voies, D ballon raction (gauche) et caractristiques approximatifs de la verrerie (centre et droite)

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4.3. Etalonnage Evaluer le contenu de dioxyde de carbone dans les solutions dtalonnage (4.2). Dterminer trois solutions dtalonnage qui encadrent la valeur de l'chantillon. Ces points d'talonnage sont rpts deux fois. 4.4. Mesure de la densit de l'chantillon. Enlever le contenu de dioxyde de carbone des solutions dtalonnage par agitation dans une ampoule dcanter puis sous un vide gnr par une trompe eau pendant trois minutes. Mesurer la masse volumique l'aide dun densimtre lectronique ou dun pycnomtre. 5. CALCUL Calculer l'augmentation de pression due au dioxyde carbone libr par chaque solution talon et tracer le graphique. Calculer la pente (a) et l'ordonne l'origine (b). Le volume V de l'chant illon est donn par la formule : V = [(m2- m1) x 1000]/d o m1 (g)= poids de (fiole vide + 3 ml NaOH) ; m2 (g) = poids de (fiole vide + 3 ml NaOH + chantillon) ; (1)

3 d (kg/m ) = masse volumique de l'chantillon.

L'augmentation de pression p i provoque par le dioxyde de carbone libr de l'chantillon est donne par la formule: pi = ps - pap (2)

o ps = lecture de la pression aprs action de dioxyde de carbone de lchantillon pap = lecture de la pression avant addition de H 2 SO4 (par exemple la pression atmosphrique)

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La concentration (C) du dioxyde de carbone dans l'chantillon (en g/L) est donne par : C = [( pi - b) / a] x [(V + 3)/V] x L o pi = augmentation de pression (quation 2) a = pente de la droite d'talonnage b = ordonne l'origine de la droite d'talonnage V = volume d'chantillon (quation 1) L = facteur de dilution en cas de dilution de l'chantillon (3)

La teneur en % de masse de dioxyde de carbone est donne par : CO2 % (m/m) = C x 100/d (4)

Exemple de c alcul de la teneur en dioxyde carbone :

Etalonnage
Conc de l'talon g/l
pression initiale pression finale
augmentation de pression

CO2 talonnage
140 120 100 m b a r 80 60 40 20 0 0 1 2 3 g/l 4 5 6 7

2 2 4 4 6 6 pente ordonne l'or. correlation

mbar 1021 1021 1021 1021 1021 1021 18.25000 7.50000 0.99995

mbar 1065 1065 1101 1102 1138 1138

mbar 44 44 80 81 117 117

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Echantillon vin mousseux 1 vin mousseux 1 vin mousseux 2 vin mousseux 2

masse volumique d (en kg/m 3) 1027,2 1027,2 1025,3 1025,3

poids (fiole + soude) m1 (g) 84,6287 84,6287 86,1066 86,1066

Poids (fiole + soude +chant.) m1 ( g) 156,1620 156,1620 153,4407 153,4407

pression initiale p ap (mbar) 1021 1021 1021 1021

volume de Pression l'chantillon finale p s - p ap V ( mL) p s (mbar) (2) (1) 1112 1113 1118 1118 91 92 97 97 69,64 69,64 65,67 65,67

CO2 ( g/L) (3) 4,77 4,83 5,13 5,13

valeur moyenne de CO2 (g/L) 4,80

5,13

6. VALIDATION 6.1 Performances de la mthode

Ecart type moyen estim d'aprs les rptitions, so = 0,07 g/l Ecart-type relatif, RSD = 1,9% Rptabilit, r = 5,6 % Incertitude largie (k=2), U = 3,8% Gamme dtalonnage 0,4-6 g/L Gamme de dtermination 0,3 -12 g/L (chantillons avec concentration au dessus de 6 g/L diluer 1 :2 avec leau conformment la gamme de calibration - Limite de dtection 0,14 g/L - Limite de quantification 0,48 g/L

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Annexe A Rfrence

European Brewery Convention Analytica-EBC, Fourth edition, 1987, 9.15 Carbon dioxide. Ali-Mattila E et Lehtonen P.(2002), OIV, FV 1153. OIV, SCMA 2002, FV N 1153, determination of carbon dioxide in alcoholic beverages by a modified EBC method OIV, SCMA 2004, FV N 1192, determination of carbon dioxide in alcoholic Beverages by a modified EBC method, Statistical results of the collaborative study OIV, SCMA 2005, FV N 1222, comparison of the titrimetric method and the modified EBC method for the determination of carbon dioxide in alcoholic beverages Ali-Mattila, E. and Lehtonen, P., Determination of carbon dioxide in alcoholic beverages by a modified EBC method, Mitteilungen Klosterneuburg 52 (2002): 233-236

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Dioxyde de Carbone - Manomtrique Annexe B Rsultats statistiques de l'tude collaborative DTERMINATION DE LA TENEUR EN DIOXYDE DE CARBONE DES BOISSONS ALCOOLISES SELON UNE MTHODE EBC MODIFIE 1. But de l'tude L'tude avait pour objectif de dterminer la rptabilit et la reproductibilit de la mthode EBC modifie de dtermination de la teneur en dioxyde de carbone des vins, vins mousseux, cidres et bires. 2. Besoins et finalit de l'tude La fermentation produit du dioxyde de carbone dans les boissons alcoolises. Dans la production de vins mousseux, le dioxyde de carbone est l'un des produits les plus essentiels et peut galement tre ajout certaines boissons alcoolises. Le dioxyde de carbone modifie le got et l'arme et est un agent de conservation des boissons alcoolises. Conformment aux dfinitions du Code international des pratiques nologiques, les vins mousseux devront prsenter une surpression minimale de 3 bars, due au dioxyde de carbone en solution, lorsqu'ils sont conservs la temprature de 20C dans des rcipients ferms. De mme les vins ptillants devront prsenter une surpression minimale de 1 bar et maximale de 2,5 bars. Des surpressions de 3 bars, 2,5 bars et 1 bar correspondent respectivement 20C environ 5,83 g/L, 5,17 g/L et 3,08 g/L de dioxyde de carbone en solution. A l'heure actuelle, il n'existe aucune mthode pratique et fiable permettant de doser le dioxyde de carbone dans les boissons alcoolises. La grande variabilit des teneurs dioxyde de carbone obtenues lors d'essais d'aptitude internationaux indique clairement la ncessit de disposer d'une mthode fiable.

3. Porte et applicabilit La mthode propose est quantitative et applicable la dtermination de la teneur en dioxyde de carbone des boissons alcoolises. Cette mthode a t valide dans le cadre d'une tude collaborative de dtermination de la teneur en dioxyde de carbone de vins, bires, cidres et vins mousseux au moyen d'analyses pratiques des niveaux compris approximativement entre 0,4 g/L et 12 g/L (Remarque : le

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Dioxyde de Carbone - Manomtrique niveau d'talonnage actuel est compris entre 0,4 g/L et 6 g/L. Les chantillons doivent tre dilus avec de l'eau jusqu' ce niveau, lorsque la teneur en dioxyde de carbone est suprieure 6 g/L).

4. Matriaux et matrices L'tude collaborative a port sur 6 chantillons diffrents. Tous les chantillons, l'exception des chantillons de bire, ont t envoys en double aveugle, ce qui fait qu'au total 12 bouteilles ont t distribues aux participants : deux de bire, deux de cidre, deux de vin rouge, deux de vin blanc, deux de vin ptillant et deux de vin mousseux. Chaque bouteille a reu un code individuel pour chaque participant. Tous les chantillons ont t prsents dans leurs bouteilles d'origine, et les tiquettes ont t enleves sur tous les chantillons l'exception des chantillons de vin mousseux. La mesure de la quantit de dioxyde de carbone dans 10 bouteilles du mme lot a permis d'valuer l'homognit des chantillons. 5. chantillons d'apprentissage Quatre chantillons tmoins ont t remis aux participants pour quils se familiarisent avec la mthode. Ces chantillons comprenaient un chantillon de bire, un de vin, un de vin ptillant et un de vin mousseux.

6. Mode opratoire et documents de support Le mode opratoire et un tableau Excel pour le calcul des rsultats ont t remis aux participants. Des documents de support ont galement t fournis, parmi lesquels la lettre d'accompagnement, un formulaire de prise en charge d'chantillons et des fiches de rsultat. 7. Analyse des donnes 7.1. La dtermination des valeurs aberrantes a t value en utilisant les tests de Cochran et de Grubbs ainsi que le test de Grubbs bilatral. 7.2. Une analyse statistique a t effectue pour obtenir les donnes de rptabilit et de reproductibilit.

8. Participants Neuf laboratoires de diffrents pays ont particip l'tude collaborative. Des codes ont t attribus ces laboratoires. Les laboratoires

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Dioxyde de Carbone - Manomtrique participants avaient une exprience tablie en matire d'analyse de boissons alcoolises. Alcohol Control Laboratory Alko Inc. P.O.Box 279 FIN-01301 Vantaa Finlande Arcus AS Haslevangen 16 P.O.Box 6764 Rodelkka 0503 Oslo Norvge Bundesamt fr Weinbau Glbeszeile 1 A-7000 Eisenstadt Autriche Altia Ltd Valta-akseli Rajamki Finlande ARETO Ltd Mere pst 8a 10111 Tallinn Estonie

Comit Interprofessionnel du Vin de Champagne 5, rue Henri MARTIN BP 135 51204 EPERNAY CEDEX France Institut fr Radioagronomie Forschungszentrum Jlich GMBH Postfach 1913 52425 JLICH Allemagne

High-Tec Foods Ltd Ruomelantie 12 B 02210 Espoo Finlande Systembolagets laboratorioum Armaturvgen 4, S-136 50 HANINGE Sude

9. Rsultats L'homognit des chantillons a t dtermine par l' Alcohol Control Laboratory (Finlande), en mesurant la teneur en dioxyde de carbone de 10 bouteilles du mme lot. Des chantillons portant les numros de lots correspondants ont t envoys aux participants :

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CO2 g/L Moy. s Bire 1 5,191 0,020 Bire 2 5,14 0,027 Cidre 4,817 0,025

Vin blanc 1,337 0,036

Vin rouge 0,595 0,038

Vin ptill. 5,254 0,022

Vin mouss. 7,463 0,046

Selon l'essai d'homognit, la teneur en CO2 des deux bires tait la mme, elles furent donc considres comme doubles aveugles.

Les rsultats individuels pour l'ensemble des chantillons et laboratoires de l'tude collaborative sont donns ci-dessous.
Vin Vin Vin Vin Vin Vin Vin Vin Bire 2 Cidre 1 Cidre 2 blanc 1blanc 2 rouge 1rouge 2 ptill. 1 ptill. 2 mouss. 1 mouss2 5,08 4,75 4,91 1,25 1,11 0,54 0,54 5,15 5,22 6,93 6,91 3 3 2 2 3 3 3 3 1,90 1,78 0,73 1,19 5,85 5,93 7,66 7,72 5,53 4,71 4,70 5,14 3,951 4,73 4,91 5,15 5,40 5,13 4,93 4,361 4,96 4,71 4,82 5,05 4,65 4,94 0,381 4,78 5,01 4,86 5,12 4,76 1,36 1,111 1,52 1,33 1,37 1,15 1,16 1,41 1,111 1,52 1,40 1,36 1,30 1,19 0,51 0,431 0,78
3

Code Lab Bire 1 A 5,39 B 4,76 C D E F G H I 5,15 3,131 4,87 5,34 5,18 5,42 5,14

0,48 0,381 0,80


3

5,23 4,471 4,98 5,22 5,22 5,12 5,16

5,33 4,291 4,94 4,95 5,27 5,10 5,06

7,33 5,541 5,83 6,52 7,54 7,25 6,88

7,36 5,521 6,17 6,67 7,47 7,34 6,48

0,46 0,56 0,52 0,47

0,57 0,59 0,53 0,61

1. Enlev en raison d'une erreur systmatique importante, manifestement due un mauvais talonnage 2. Valeur aberrante selon le test de Cochran 3. Valeur aberrante selon le test de Grubbs

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Les rsultats statistiques de l'essai interlaboratoire sont rcapituls cidessous.


Vin Bire Moyenne (g/L) Moyenne (Rp.1) (g/L) Moyenne (Rp.2) (g/L) Ecart type de rptabilit (s r) (g/L) Ecart type de reproductibilit (sR) (g/L) Ecart type relatif de rptabilit (SDRr) (%) Ecart type relatif de reproductibilit (RSDR) (%) Limite de rptabilit r (2,8*sr) (g/L) Limite de reproductibilit R (2,8*sR) (g/L) Cf xValeur de HORRAT 5,145 5,156 5,134 0,237 0,237 4,597 4,611 0,662 0,664 1,043 Cidre 4,859 4,833 4,885 0,089 0,139 1,821 2,855 0,248 0,388 0,640 blanc 1,316 1,306 1,327 0,060 0,135 4,562 10,22 0,168 0,377 1,883 Vin rouge 0,532 0,510 0,553 0,053 0,059 9,953 11,07 0,148 0,165 1,779 Vin ptillant 5,139 5,154 5,124 0,086 0,124 1,663 2,407 0,239 0,346 0,544 Vin mousseux 6,906 6,897 6,914 0,149 0,538 2,163 7,795 0,418 1,507 1,843

Conclusion Les valeurs de Horrat sont infrieures 2, ce qui signifie que la mthode est acceptable. Les valeurs de Horrat sont cependant lgrement leves. Dans cinq des neuf laboratoires participants ces essais ont t raliss pratiquement sans exprience pralable. Les rsultats peuvent par consquent tre considrs comme pour le moins trs satisfaisants. La mthode donne les rsultats en g/L mais ces rsultats peuvent tre convertis en units de pression. 1

Troost, G. and Haushofer, H., Sekt, Schaum- und Perlwein, Eugen Ulmer Gmbh & Co., 1980, Klosterneuburg am Rhein, ISBN 3-80015804-3, diagramme 1 en page 13.
1

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Dioxyde de Carbone - Manomtrique Annexe C Validation des niveaux bas de dioxyde de carbone

1. Limite de dtection et limite de dtermination Un chantillon de vin blanc a t analys dix fois en double. Les donns statistiques sont les suivantes: Rsidus Moyenne CO2 (g/L) Ecart standard de la moyenne, s (g/L) Limite de dtection 3 x s Limite de dtermination 10 x s 2. Ajouts dtalons Des solutions talons de 5 concentrations diffrentes, ralises en double, ont t ajouts au mme vin qui a t utilis pour dterminer les limites de dtection et de dtermination. Les concentrations correspondantes en CO2 ont t galement ajoutes de leau. Les rgressions linaires de ces deux essais ont t compares. 10 0.41 0.048 0.14 0.48

eau + standards Echantillon+standards Augmentation de la pression (mbar) 60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5


Concentration en CO2 (gl/l)

y = 18,85x + 6,38 2 R = 1,00 y = 19,28x + 6,60 2 R = 1,00

Fig. 1 Ajouts dtalons lchantillon et leau

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Dioxyde de Carbone - Manomtrique

Donnes statistiques des essais: Eau+ talons Pente Incertitude de la pente Intersection Incertitude de lintersection Ecart rsiduel standard Nombre dchantillons 19,3 0,3 6,6 0,4 0,4 15 Echantillon+Etalons 18,9 0,3 6,4 0,5 0,3 10

Selon les donnes statistiques les deux droits de rgression sont similaires.

Rsidus
Pression Rsiduelle (mbar) 1,0000 0,5000 0,0000 0 -0,5000 -1,0000 Concentration de CO2 (g/l) 0,5 1 1,5 2 2,5

Fig. 2. Les rsidus de lquation eau+standards Les rsidus se rpartissent des deux cts du zro ce qui montre que la rgression est linaire.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Dioxyde de Carbone - Manomtrique Annexe D Comparaison avec dautres techniques et laboratoires 1. Comparaison de la mthode EBC modifie avec lappareil commercial Anton Paar CarboQC

Echantillon Vin mousseux Cidre Vin blanc Vin rouge Bire 1 Bire 2 Bire 3 Bire sans alcool 1 Bire sans alcool 2

Mthode EBC modifie (g/l) 9,14 4,20 1,18 1,08 5,26 4,89 4,90 5,41 5,39

Anton Paar CarboQC (g/l) 9,35 4,10 1,10 0,83 5,15 4,82 4,92 5,33 5,36 Moyenne

Diffrence

-0,21 0,1 0,08 0,25 0,11 0,07 -0,02 0,08 0,03 0,06

Selon le t-test il nexiste pas de diffrence systmatique dans les mesures.

2. Comparaison entre Bfr, Allemagne et ACL, Finlande Bfr a envoy quatre chantillons ACL et ACL a envoy cinq chantillons Bfr. Ces neuf chantillons ont t analyss dune manire indpendante par ACL utilisant la mthode prsente dans ce document et en Allemagne chez Bfr utilisant la m thode titrimtrique. Les rsultats statistiques sont les suivants: Diffrence moyenne Diffrence standard Z-score 0,14 g/l 0,13 g/l 1,04

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Dioxyde de Carbone - Manomtrique

La mthode prsente ici et la mthode titrimtrique ont t compares galement par le Bundesamt fr Weinbau en Autriche en utilisant 21 de ses propres chantillons. Les donnes statistiques sont les suivantes:

Diffrence moyenne Diffrence standard Z-score

-0,01 g/l 0,26 g/l -0,03

Conclusion Selon ce document et les essais effectus prcdemment cette mthode est universelle. Elle convient pour la dtermination de la teneur en dioxyde de carbone dans tous les types de boissons alcooliques comme les bires, les vins, les vins de fruits, les cidres, les vins ptillants et les vins mousseux prsentant un niveau de concentration de 0,3 g/l et plus.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polychlorophnols et polychloroanisoles

Titre Type de mthode Rsolution

RECHERCHE ET DOSAGE DES POLYCHLOROPHENOLS ET DES POLYCHLOROANISOLES DANS LES VINS, LES BOUCHONS, LES BOIS ET LES BENTONITES UTILISEES COMME PIEGES D'ATMOSPHERE IV Oeno 8/2006

1. DOMAINE DAPPLICATION Tous les vins, les bouchons en lige, bentonites (piges datmosphre) et bois. 2. PRINCIPE Dosage du 2,4,6-trichloroanisole, du 2,4,6-trichlorophnol, du 2,3,4,6ttrachloroanisole, du 2,3,4,6-ttrachlorophnol, du pentachloroanisole et du pentachlorophnol en chromatographie en phase gazeuse par injection dun extrait lhexane du vin et lther/hexane des chantillons solides analyser et talonnage interne. 3. REACTIFS Note pralable : tous les ractifs et solvants doivent tre exempts des composs doser lists en 2 au seuil de dtection. 3.1 Hexane de puret > 99 % 3.2 Ether thylique de puret > 99 % 3.3 Mlange ther/hexane (50/50 ; v/v) 3.4 Produit pur pour talon interne : lindane (Hexachlorocyclohexane), cas 55963-79-6 ou 2,4-dibromoanisole cas 21702-84-1 de puret > 99 % 3.5 Ethanol pur 3.6 Eau distille et/ou microfiltre 3.7 Solution hydroalcoolique 50 % vol. placer 50 ml dthanol pur (3.5) dans une fiole jauge de 100 ml (4.9.7) et complter 100 ml avec de leau distille (3.6), homogniser. 3.8 Etalon interne :

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polychlorophnols et polychloroanisoles 3.8.1 Solution mre 1,5 g/l. Placer 150 mg de lindane ou 2,4dibromoanisole (3.4) dans une fiole jauge de 100 ml (4.9.7) complter avec la solution hydroalcoolique 50 % volume (3.7) et homogniser. 3.8.2 Solution dtalon interne. Placer 1 ml de la solution mre de lindane ou 2,4-dibromoanisole (3.8.1) dans une fiole jauge de 100 ml (4.9.7), complter avec la solution hydroalcoolique 50 % volume (3.7) et homogniser. 3.9 Produits purs 2,4,6-trichloroanisole : 99 %, cas : 87-40-1 2,4,6-trichlorophnol : 99.8 %, cas : 88-06-2 2,3,5,6-ttrachloroanisole : 98 %, cas : 6936-40-9 (remarque : le produit recherch dans les chantillons est le 2,3,4,6ttrachloroanisole mais il nexiste pas dans le commerce) 2,3,4,6-ttrachlorophnol : 99.9 %, cas : 58-90-2 pentachloroanisole : 98 %, cas : 1825-21-1 pentachlorophnol : 98 %, cas : 87-86-5 3.10 Solution mre de calibrage 200 mg/l Dans une fiole jauge de 100 ml (4.9.7), placer 20 mg environ des produits purs (3.9.1 3.9.6) mais de poids exactement connu (4.7), complter avec de lthanol pur (3.5). Homogniser. 3.11 Solution intermdiaire de calibrage 200 g/l Dans une fiole jauge de 50 ml (4.9.8) remplie dthanol pur (3.5), ajouter 50 l de la solution mre de calibrage 200 mg/l (3.10) laide de la micro-seringue de 100 l (4.9.1) et homogniser. 3.12 Solution fille de calibrage 4 g/l Dans une fiole jauge de 50 ml (4.9.8) contenant de lthanol pur (3.5) ajouter 1 ml de la solution intermdiaire de calibrage 200 g/l (3.11) laide dune pipette de 1 ml (4.9.6). Complter 50 ml avec lthanol pur (3.5) et homogniser. 3.13 Solutions de calibrage. Il est possible de prparer diverses solutions de calibrage diverses concentrations en rajoutant, laide de la microseringue de 100 l (4.9.1), par exemple 50 l de la solution fille de calibrage 4 g/l (3.12) dans 50 ml de vin pour obtenir un enrichissement de celui-ci de 4 ng/l en substances doser Le mme raisonnement peut permettre de prparer des solutions de calibrage de diverses concentrations soit dans des solutions hydroalcooliques pures ou du vin ou encore denrichir un milieu dextraction avec une quantit parfaitement connue de produits purs. 3.14. Bentonite du commerce.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polychlorophnols et polychloroanisoles

4. MATERIEL 4.1 Chromatographe en phase gazeuse avec injecteur split-splitless coupl un dtecteur capture dlectrons. (Il est galement possible dutiliser un spectromtre de masse) 4.2 Colonne capillaire de type apolaire : 0,32 mm x 50 m, paisseur de film 0,12 m 4.3 Conditions chromatographiques : 4.3.1 Injection en mode "split-splitless" (temps de fermeture des vannes 30 secondes) 4.3.2 Dbit gaz vecteur : 30 ml/mn dont 1 ml dans la colonne Hydrogne U 2 (Il est galement possible d'utiliser de l'hlium). 4.3.3 Dbit gaz auxiliaire : 60 ml/mn Azote U 2 (ou argonmthane) 4.3.4 temprature du four : - de 40 C 160 C raison de 2 C/mn - de 160 C 200 C raison de 5 C/mn - palier 220 C pendant 10 mn 4.3.5 temprature injecteur : 250 C 4.3.6 temprature dtecteur : 250 C 4.4 Acquisition et intgration : lacquisition se fait sur un ordinateur. Les pics des diffrents composs identifis par comparaison avec la rfrence, sont ensuite intgrs. 4.5 Agitateur et barreaux magntiques. 4.6 Vortex avec adaptation pour flacon de 30 ml (4.9.3) 4.7 Balance de prcision au mg 4.8 Rpe de mnage pour rmoulade manuelle ou lectrique 4.9 Matriel de laboratoire : 4.9.1 Micro Seringue de 100 l 4.9.2 Micro Seringue de 10 l 4.9.3 Flacon de 30 ml fermant avec un bouchon vis et opercule face tflone 4.9.4 Pipette bton de 10 ml gradue au 1/10 de ml 4.9.5 Pipette bton de 5 ml gradue au 1/10 de ml 4.9.6 Pipette de prcision de 1 ml 4.9.7 Fiole jauge de 100 ml 4.9.8 Fiole jauge de 50 ml 4.9.9 Ampoule dcanter de 100 ml 4.9.10 Pipettes Pasteur et poire propipette adapte 4.9.11 Feuille d'aluminium de mnage en rouleau.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polychlorophnols et polychloroanisoles

5. PREPARATION DE L'ECHANTILLON 5.1 Le bouchon est rp (4.8) en granuls (diamtre < 3 mm) 5.2 Le bois est dbit avec une tenaille pour obtenir des morceaux de quelques millimtres seulement. 5.3 La bentonite (3.14) (30 g par exemple) est tale sur une feuille d'aluminium (4.9.11) d'environ 30 cm x 20 cm et expose dans l'atmosphre analyser pendant 72 heures.

6. MODE OPERATOIRE 6.1 Processus d'extraction 6.1.1 Bouchon : dans un flacon de 30 ml (4.9.3), placer 1 g environ de bouchon rp (5.1) mais de poids exactement connu (4.7) 6.1.2 Bois : dans un flacon de 30 ml (4.9.3), placer 2 g environ de morceaux de bois (5.2) mais de poids exactement connu (4.7) 6.1.3 Bentonite contrle : dans un flacon de 30 ml (4.9.3), placer 5 g environ de bentonite (3.14) mais de poids exactement connu (4.7) 6.1.4 Bentonite chantillon : dans un flacon de 30 ml (4.9.3), placer 5 g environ de bentonite (5.3) mais de poids exactement connu (4.7) 6.1.5 Ajouter 10 ml (4.9.4) de mlange ther/hexane (3.3) 6.1.7 Ajouter la micro-seringue (4.9.1) 50 l de la solution dtalon interne (3.8.2) 6.1.8 Agiter au vortex (4.6) pendant 3 mn 6.1.9 Dcanter et rcuprer la phase liquide dther/hexane dans un flacon de 30 ml (4.9.3) 6.1.10 Recommencer lopration avec 2 fois 5 ml de mlange ther/hexane (3.3) 6.1.11 Extrait final : mlanger les 3 phases dther/hexane. 6.2 Extraction du vin 6.2.1 Prlever 50 ml de vin laide de la fiole jauge (4.9.8) 6.2.2 Les placer dans la fiole jauge de 100 ml (4.9.7) 6.2.3 Ajouter la microseringue (4.9.1) 50 l d'talon interne (3.8.2) 6.2.4 Ajouter 4 ml (4.9.5) dhexane (3.1) 6.2.5 Effectuer l'extraction l'aide de l'agitateur magntique (4.5) durant 5 mn. 6.2.6 Dcanter en ampoule (4.9.10) 6.2.7 Rcuprer la phase organique avec l'mulsion dans un flacon de 30 ml (4.9.3) et le vin dans la fiole jauge de 100 ml (4.9.7) 6.2.8 Recommencer l'extraction du vin par 2 ml dhexane (3.1)

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polychlorophnols et polychloroanisoles 6.2.9 Effectuer l'extraction l'aide de l'agitateur magntique (4.5) durant 5 mn. 6.2.10 Dcanter en ampoule (4.9.9) 6.2.11 Rcuprer la phase organique avec l'mulsion dans un flacon de 30 ml (4.9.3) 6.2.12 Mlanger les 2 phases organiques et casser l'mulsion par agitation trs lente l'aide d'un barreau magntique (4.5) en dcantant priodiquement la phase aqueuse, cest dire en liminant la phase aqueuse infrieure laide dune pipette Pasteur (4.9.10) munie dune poire propipette. Remarque : Il est galement possible de casser lmulsion par centrifugation. 6.2.13 Extrait final du vin : il sagit de lextrait organique rsiduel aprs dcantation du vin et du rsidu dmulsion 6.3 Injecter 2 l chromatographe. 7. CALCUL : de l'extrait final (6.1.11 ou 6.2.13) dans le

Aire du pic du produit concentration du produit = x Coefficient de rponse Aire du pic de ltalon interne

Coefficient de rponse = concentration dans la solution de calibrage (3.13) * (Aire du pic de ltalon interne/ Aire du pic du produit pur dans la solution de calibrage). Vrification de ltalonnage tous les deux mois, limite dacceptation des coefficients de rponse +/ - 10 %. 8. RESULTATS Les rsultats sont exprims en ng/l pour le vin et en ng/g pour les bouchons en lige, les bentonites et les bois.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polychlorophnols et polychloroanisoles

9. CARACTERISTIQUES DE LA METHODE 9.1 Taux de recouvrement, Le taux de recouvrement calcul par rapport des quantits rajoutes dans des bois, de polychloroanisoles et de polychlorophnols de 115 ng/g est de : - 2,4,6-trichloroanisole : 96 % - 2,4,6-trichlorophnol : 96 % - 2,3,4,6-ttrachloroanisole : 96 % - 2,3,4,6-ttrachlorophnol : 97 % - pentachloroanisole : 96 % - pentachlorophnol : 97 %

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9.2 Rptabilit des mesures, Calcules pour chaque produit, les valeurs de rptabilit sont les suivantes :

Dans un bouchon ng/g 2,4,6-trichloroanisole 2,4,6-trichlorophnol 2,3,4,6-ttrachloroanisole 2,3,4,6-ttrachlorophnol pentachloroanisole pentachlorophnol

Moyenne 1,2 26 1,8 2,6 23,3 7,4

Ecart type 0,1 3,3 0,4 0,3 2,9 1,9

rptabilit 0,3 9,2 1,2 0,9 8,1 5,4

Dans un bois 23 ng/g 2,4,6-trichloroanisole 2,4,6-trichlorophnol 2,3,4,6-ttrachloroanisole 2,3,4,6-ttrachlorophnol pentachloroanisole pentachlorophnol

Ecart type 1,9 1,9 2,6 3,3 2,7 3,6

rptabilit 5,3 5,3 7,4 9,3 7,5 10,1

Dans un vin 10 ng/l 2,4,6-trichloroanisole 2,4,6-trichlorophnol 2,3,4,6-ttrachloroanisole 2,3,4,6-ttrachlorophnol pentachloroanisole pentachlorophnol

Ecart type 0,4 2,1 0,6 4 1,2 6,5

rptabilit 1,1 5,9 1,7 11,2 3,4 18,2

Dans une bentonite 15 ng/g 2,4,6-trichloroanisole 2,4,6-trichlorophnol 2,3,4,6-ttrachloroanisole 2,3,4,6-ttrachlorophnol pentachloroanisole

Ecart type 0,9 4 1,2 5,2 4,3

rptabilit 2,5 11,2 3,4 14,6 12,0

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polychlorophnols et polychloroanisoles


pentachlorophnol 12,1 33,9

9.3 Limites de dtection (L.D) et de quantification (L.Q) calcules selon la mthode OIV : 9.3.1 Bois 2,4,6-trichloroanisole 2,4,6-trichlorophnol 2,3,4,6ttrachloroanisole 2,3,4,6-ttrachlorophnol pentachloroanisole pentachlorophnol L.D en ng/g 0,7 0,6 0,6 1,1 0,4 0,9 L.Q en ng/g 2,4 2,0 2,0 3,7 1,4 3,1

9.3.2 Bentonite 2,4,6-trichloroanisole 2,4,6-trichlorophnol 2,3,4,6ttrachloroanisole 2,3,4,6-ttrachlorophnol pentachloroanisole pentachlorophnol L.D en ng/g 0,5 1 0,5 1 0,5 Non det. L.Q en ng/g 1 3 1 3 1 Non det.

9.3.3 Bouchon 2,4,6-trichloroanisole 2,4,6-trichlorophnol 2,3,4,6ttrachloroanisole 2,3,4,6-ttrachlorophnol pentachloroanisole pentachlorophnol L.D en ng/g 0,5 1 0,5 1 0,5 1 L.Q en ng/g 1,5 2 1,5 2 1,5 2

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Polychlorophnols et polychloroanisoles 9.3.4 Vin 2,4,6-trichloroanisole 2,4,6-trichlorophnol 2,3,4,6ttrachloroanisole 2,3,4,6-ttrachlorophnol pentachloroanisole pentachlorophnol L.D en ng/l 0,3 1 0,3 0,3 0,5 1 L.Q en ng/l 1 3 1 1 3 3

2 Air liquide

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb

Titre Type de mthode Rsolution

CRITERES POUR LES METHODES DE DETERMINATION DE LA TENEUR EN PLOMB DU VIN

Oeno 7/2006

1.1

Dfinitions des critres de la mthode troitesse de laccord entre la valeur moyenne obtenue partir dune grande srie de rsultats dessais et la valeur de rfrence accepte.

justesse

r=

limite de rptabilit, valeur au-dessous de laquelle la valeur absolue de la diffrence entre deux rsultats dun mme essai obtenus sous des conditions de rptabilit (cest dire mme chantillon, mme oprateur, mme appareillage, mme laboratoire, et court intervalle de temps), peut tre attendue dans une limite de probabilit spcifique (en principe 95 %), do r = 2,8 x sr. cart-type, calcul partir des rsultats obtenus dans des conditions de rptabilit. cart-type relatif, calcul partir des rsultats obtenus dans des conditions de rptabilit [(Sr/ x ) x 100], o x reprsente la moyenne des rsultats pour tous les laboratoires et chantillons. limite de reproductibilit, valeur au-dessous de laquelle la valeur absolue de la diffrence entre deux rsultats dun mme essai obtenus dans des conditions de reproductibilit (cest dire pour un produit identique, obtenu par les oprateurs dans des laboratoires diffrents en utilisant la mme mthode dessais), peut tre attendue avec une certaine probabilit (en principe 95 %) ; R = 2,8 x sR.
1

Sr = RSDr=

R=

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb

SR =

cart-type, calcul partir de rsultats obtenus dans des conditions de reproductibilit. cart-type relatif calcul partir de rsultats obtenus dans des conditions de reproductibilit [(SR/ x x 100] valeur du HORRAT: la valeur observe du RSDR, divise par la valeur RSDR calcule partir de lquation de Horwitz [1].

RSDR =

HoR =

2 Mthode danalyse utiliser par le laboratoire et exigences de contrle pour le laboratoire 2.1 Exigences

Il nexiste pas de mthodes spcifiques de dtermination de la teneur en plomb du vin. Les laboratoires sont tenus dutiliser une mthode valide selon les exigences de lOIV [2] et qui rpond aux critres de performance figurant dans le Tableau 1. Les mthodes GFAA (spectromtrie dabsorption atomique au four graphite) ou ICP-MS (spectromtre de masse) sont applicables condition quelles respectent les critres de performance indiqus ci-dessous. Chaque fois que possible, la validation doit inclure un matriau de rfrence certifi dans les matriaux soumis lessai collaboratif. Dans le cas contraire, une estimation de l a justesse devra tre effectue. Des exemples de mthodes valides pour la dtermination de la teneur en plomb du vin sont prsents dans les Annexes 1 et 2.

2.2

Considrations gnrales

Tout appareillage entrant en contact avec lchantillon doit tre dun matriau inerte (par ex. polypropylne, polyttrafluorothylne [PTFE], etc.). Lutilisation de la cramique nest pas recommande en raison de la prsence possible de plomb. Si les matriaux disponibles ne sont pas exempts avec certitude des analytes prcits, leur utilisation doit tre value au moyen dtudes ad hoc , qui doivent tre considres comme faisant partie intgrante de la validation de la mthode danalyse. Tout le matriel en plastique, y compris les rcipients pour chantillons, doivent

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb tre nettoys lacide. Lquipement utilis pour prparer les chantillons doit si possible tre rserv aux analyses du plomb uniquement.

Tableau 1 : Critres de performance pour les mthodes danalyse de la teneur en plomb du vin

Paramtres Applicabilit Limite de dtection Limite de quantification

Valeur/Commentaire Convient pour dterminer le plomb dans le vin dans des buts officiels. Pas plus dun dixime de la valeur correspondant la limite de lOIV (exprime en g/l) Pas plus dun cinquime de la valeur correspondant la limite de lOIV, (exprime en g/l) sauf si la valeur prcise pour le plomb est infrieure 100 g/l. Dans ce dernier, pas plus de deux cinquime s de la valeur prcise. Valeurs du HORRAT infrieures ou gale s 2 dans lessai collaboratif de validation. 80 % - 105 % (comme indiqu dans lessai collaboratif) Pas dinterfrences spectrales ou de matrice

Fidlit Recouvrement Spcificit Justesse

xm

< 1,96 *

sR ( lab) sr ( lab) * (1 1 n )

o m est la valeur certifie du matriau de rfrence vin et x est la moyenne de n mesures de la concentration en plomb de ce vin, dans le mme laboratoire. SR(lab) et Sr(lab) reprsentent les carts-types calculs partir des rsultats obtenus dans un mme laboratoire dans des conditions de reproductibilit et de rptabilit.

2.3

Estimation de la justesse analytique et calculs de recouvrement

Chaque fois que possible, la justesse des analyses doit tre estime [3] en incluant dans la partie analytique les matriaux de rfrence certifis requis. Lanalyste doit galement bien prendre note des Directives harmonises concernant lutilisation des taux de recouvrement dans les

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb mesures analytiques [4], mises au point sous les auspices de lUIPAC, lISO et lAOAC. La rcupration devrait avoisiner 100 %, auquel cas les calculs de recouvrement sont alors de moindre importance.

Bibliographie

[1] [2] [3]

W Horwitz, Evaluation of Analytical Methods for Regulation of Foods and Drugs, Anal. Chem., 1982, 54, 67A - 76A Protocol for the design, conduct and interpretation of methodperformance studies, FV 1061, OIV, 1998 ISO 5725-6:1994, 4.2.3. International Organisation Standardisation, case Postal 56, CH-1211, Genve Switzerland. for 20,

[4]

ISO/AOAC/IUPAC Harmonised Guidelines for the Use of Recovery Information in Analytical Measurement. Edited Michael Thompson, Steven L R Ellison, Ales Fajgelj, Paul Willetts and Roger Wood, Pure Appl. Chem., 1999, 71, 337 348

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb EXEMPLE 1 DETERMINATION DE LA TENEUR EN PLOMB DANS LES VINS PAR SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION ATOMIQUE (Type III) 1 DOMAINE DAPPLICATION

La mthode peut tre utilise pour les vins rouges, blancs, tranquilles, mousseux et fortifis. 2 DEFINITION

Concentration en plomb du vin : Concentration en plomb dtermine par cette procdure exprime en mg/l. 3 PRINCIPE

Le vin est dilu par une matrice synthtique simulant la composition du vin et la concentration en plomb mesure directement par spectrophotomtrie dabsorption atomique utilisant un four graphite (SAAFG). Une matrice synthtique simulant la composition du vin est ajoute aussi bien au vin analyser quaux solutions modles dtalonnage de plomb. Ce mlange contient les modificateurs de matrice et les composants simulant le vin. Leur but est de modifier les matrices de sorte que la mme allure dabsorption par rapport au temps soit obtenue la fois sur les solutions talons et les solutions chantillons pendant ltape datomisation dans le four graphite.

Un mcanisme datomisation retard, tel une plate-forme de Lvov, est ncessaire. Il se peut que la composition exacte du diluant ait besoin dtre ajuste pour convenir des modles particuliers dinstruments du four graphite. Avant dappliquer la mthode, des expriences doivent tre menes pour vrifier le rapport absorbance temps produit par les talons et chantillons, et le diluant doit faire lobjet des ajustements qui simposent . Linstrument utilis doit tre capable de contrler le rapport de labsorption au temps pendant latomisation. Le profil doit tre tel que les talons et chantillons parviennent aux mmes rsultats et que le pic datomisation du plomb prcde la majeure partie de labsorption de fond non spcifique, permettant le mcanisme de correction de fond employ MA-F-AS322-12-CRIPLO 5

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb de fonctionner efficacement. Des exemples de profils correspondants sont donns dans lAnnexe 2. 4 REACTIFS

Les produits chimiques doivent tre aussi exempts de plomb que possible. Il convient dutiliser de leau distille desionise, ou de leau dune puret quivalente. Sauf contre-indication, toutes les solutions sont prpares chaque jour danalyse. 4.1 Solution du diluant

NOTE 1 : la composition exacte du diluant utilis peut ncessiter un ajustement pour correspondre au modle spcifique dinstrument et de four graphite utiliss. Si des problmes surviennent avec la composition du modificateur suggre, ajuster les concentrations en phosphate et nitrate afin dobtenir : i) un signal stable de llment la temprature dincinration optimale et ii) latomisation avec un pic unique danalyte reproductible dcal dans le temps par rapport au signal de labsorption non spcifique. Lquipement avec des amnagements VDU permet aux analystes de confirmer le dcalage dans le temps entre les pics dchantillon et labsorption non spcifique (voir lAnnexe). Lexemple suivant est une technique pour dterminer lallure de la courbe dabsorbance en fonction du temps : Mesurer la largeur totale mi-hauteur (LTMH) dun pic dchantillon et le comparer la LTMH dun talon de calibration dabsorbance maximale similaire. Si les allures des pics sont lvidence diffrentes, il convient alors dajuster la composition du modificateur de matrice. Ci-dessous des exemples de diluants utiliss pour : (a) un appareillage Perkin-Elmer 3030 quip dun correcteur dabsorption non spcifique arc au deutrium, quip dun four HGA 500 ; et (b) un Thermo-Electron Video 12E quip dun correcteur dabsorption non spcifique Smith-Hieftje,dun four CTF 188 et dun systme de dpt dchantillon FASTAC. 4.1.1 Diluant Perkin-Elmer 3030 : MA-F-AS322-12-CRIPLO 6

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb Dans une bouteille en plastique de 250 ml (5.1) 187 g deau, ajouter 11 g dthanol (4.1.3), 1,1 g de glucose (4.1.4), 1,1 g de fructose (4.1.5) et 0,28 g de chlorure de sodium (4.1.6). Agiter pour dissoudre les solides. Puis ajouter 22 ml dacide nitrique (4.1.7) et 4,4 g de dihydrognophosphate dammonium (4.1.8). Agiter jusqu ce que tout le phosphate soit dissous. Ajouter enfin 0,88 g de nitrate de magnsium (4.1.9) et agiter de nouveau jusqu ce que tout le solide soit dissous. 4.1.2 Diluant Thermo-Electron Video 12E : Comme prcdemment, mais en utilisant seulement 0,66 g de dihydrogno-phosphate dammonium (4.1.8) et 0,44 g de nitrate de magnsium (4.1.9). 4.1.3 Ethanol (absolu) 4.1.4. D-glucose 4.1.5. D(-)fructose 4.1.6. Chlorure de sodium 4.1.7. Acide nitrique (concentr) 4.1.8. Dihydrogno-phosphate dammonium 4.1.9. Nitrate de magnsium hexahydrat 4.2 Ethanol 10 %(v/v)

Dans une bouteille en plastique de 250 ml (5.1), ajouter 180 ml deau 20 ml dthanol (4.1.3.) en utilisant une pipette et agiter pour mlanger. 4.3. Solutions-talons de plomb

4.3.1. Solution-talon de plomb (1000 mg/l) 4.3.2 Solution-talon de plomb (10,00 mg/l) Dans un ballon jaug de 100 ml (5.2), pipeter (5.7) 1,00 ml de solutiontalon de plomb (4.3.1). Diluer au volume avec de leau et mlanger soigneusement. NOTE 2 : vrifier la calibration de la pipette juste avant lutilisation.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb 4.3.3 Solution de travail talonne en plomb (1,00 mg/l) Dans un ballon jaug de 100 ml (5.2), peser 10,00 g de la solution mre de plomb (4.3.2) en utilisant une pipette Pasteur (5.3). Laver leau lintrieur du col du ballon jaug, ajouter 1 ml dacide nitrique (4.1.7) et amener jusquau trait de jauge avec de leau. Mlanger soigneusement. 4.3.4. Solutions dtalonnage en plomb. Les huit solutions talon de calibration sont prpares dans des rcipients universels (5.4). Les talons varient de 0 50 g/l. Ils correspondent 0,0 ; 2,5 ; 5,0 ; 10,0 ; 20,0 ; 30,0 ; 40,0 et 50,0 g/l. Un neuvime conteneur est utilis pour prparer un blanc ractif.

Rincer trois fois lintrieur de chaque rcipient avec de leau, et scher en agitant ; rincer les couvercles trois fois et scher en agitant. Laisser debout les rcipients ferms pendant 5 -10 minutes puis vider le liquide rsiduel en agitant. Pipeter (5.8) dans les 9 rcipients, dans lordre : 5,00 ; 5,00 ; 4,95 ; 4,90 ; 4,80 ; 4,60 ; 4,40 ; 4,20 et 4,00 ml deau. Pipeter (5.8) dans chacun des rcipients 5,00 ml dthanol 10 % (4.2) suivi de deux fois 5,00 ml de diluant (4.1). Dans les 9 rcipients, pipeter (5.6) (5.7) dans lordre : 0 (blanc ractif), 0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 et 1000 l de solution de travail talonne (4.3.3). Fermer les rcipients et agiter pour mlanger les contenus. Refaire ces prparations pour chaque lot dchantillons. 4.4 5. Acide nitrique 1 % (v/v). APPAREILLAGE

Toute la verrerie et les articles en plastique doivent tre lavs lacide (tremper dans de lacide nitrique 20 % pendant au moins 24 heures), rincer soigneusement avec de leau distille avant utilisation et les maintenir ferms (avec film tirable si ncessaire) pour empcher toute contamination par lair. 5.1 ou 5.2 250 bouteilles en plastique, avec bouchon (par exemple : Nalgene quivalent). Fioles jauges, 100 ml (classe A).

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 Pipettes Pasteur, avec poires Rcipients universels de 30 ml (Nunc, Sterilin ou quivalent). Rcipients coniques en verre de 600 ml. Pipette*, 40 200 l (Finnpipette de Labsystem ou quivalent). Pipette*, 200 1000 l (Finnpipette de Labsystem ou quivalent). Pipette*, 0.5 - 5.0 ml (Finnpipette de Labsystem ou quivalent). Pipette*, 2.0 - 10.0 ml (Finnpipette de Labsystem ou quivalent).

*NOTE 3: les pipettes doivent tre calibres chaque jour (d utilisation). 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 5.16 Balance analytique, (+ ou 1 mg, Mettler PC440 ou quivalent). Agitateur de type Vortex ou quivalent. Tubes essai, capacit de 20 ml. Portoirs de tubes essai, compatibles pour utilisation avec 5.12. Portoirs de conteneurs, compatibles pour utilisation avec 5.4. Agitateur magntique. Barreau magntique, recouvert de PTFE.

5.17 Embouts de pipette, compatibles pour utilisation avec 5.6, 5.7, 5.8 et 5.9 5.18 Spectrophotomtre dabsorption atomique,

Spectrophotomtre dabsorption atomique quip dun four graphite, dune cuvette de retard latomisation, dun injecteur automatique, dun correcteur dabsorption non spcifique, et dun quipement de contrle de labsorbance en fonction du temps quivalent ce qui suit. Les conditions instrumentales doivent tre ajustes de faon approprie au modle utilis.

Exemples donns ci-dessous : MA-F-AS322-12-CRIPLO 9

RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb (a) Spectrophotomtre dabsorption atomique, Perkin-Elmer 3030 quip dun correcteur dabsorption non spcifique arc au deutrium pur. Lampe cathode creuse au plomb que lon fait fonctionner 12 mA. Slectionner la raie 283,3 nm; largeur de fente 0,7 nm. Four graphite, HGA 500 quip dun tube de graphite revtement pyrolytique avec lintrieur une plate-forme Lvov de graphite pyrolytique solide. Utiliser de largon comme gaz de purge. Les conditions du four pour le HGA 500 sont les suivantes :

Etape Temprature ( C) Rampe (s) Plateau (s) Gaz Dbit de gaz (ml/min) Lecture (intgration 2,5 s)

1 200 5 60 Ar 50

2 1100 20 20 Ar 50

3 1100 1 2 Ar 0

4 1800 0 3 Ar 0 X

5 2400 1 6 Ar 300

6 20 1 25 Ar 300

Echantillonneur/injecteur automatique, AS 40. Volume dinjection de 20 l, 3 injections par position de plateau. (b) Spectrophotomtre dabsorption atomique Thermo -electron Video 12E utilis avec un four graphite CTF 188 et un systme de dpt dchantillon FASTAC rpondant aux conditions suivantes :

Etape Temprature ( C) Rampe (s) Plateau (s) Gaz Dbit du gaz (ml/min) Lecture (intgration 2,5 s)

1 150 0 2 Ar 50

2 350 30 0 Ar 50

3 650 15 5 Ar 0

4 1000 1 4 Ar 0 X

5 2400 10 Ar 300

Dpt dchantillon 5 s, retard FASTAC 10 s, avec 3 injections par position de plateau. Slectionner la raie 283,3 nm.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb 6. 6.1. MODE OPERATOIRE Prparation du vin

Agiter le rcipient de vin pour bien mlanger les contenus avant le souschantillonage. Les vins mousseux doivent tre transfrs dans un bcher propre et placs dans un bain ultrasonique jusqu ce quil ny ait plus dmission de gaz avant utilisation. 6.2 Solutions de mesure

6.2.1 Echantillons de vin Dans un tube essai de 20 ml (5.12), pipeter (5.8) 2,00 ml deau, 4,00 ml de diluant (4.1) et 2,00 ml de lchantillon de vin. Mlanger soigneusement en utilisant lagitateur vortex (5.11). 6.2.2 Estimation du recouvrement Afin destimer le recouvrement, dans un tube essai de 20 ml (5.12), pipeter (5.8) 1,80 ml deau, 4,00 ml de diluant (4.1), 2,00 ml de lchantillon de vin et ajouter 0,200 ml de solution de travail talonne en plomb (4.3.3) en utilisant une pipette (5.7). Mlanger soigneusement en utilisant lagitateur vortex (5.11). NOTE 4 : tout chantillon dpassant ltalon de calibration le plus lev devra tre analys nouveau en utilisant une quantit dchantillon plus petite. Ajouter de lthanol supplmentaire 10 % (4.2) au volume de lchantillon. 6.3. Mesure

Les dterminations sont effectues par lots. Chaque lot doit contenir au moins quatre rpliques du blanc ractif et trois rpliques des chantillons supplments pour estimation du recouvrement. Les solutions dtalonnage du plomb sont distribues de faon rgulire parmi les inconnues sur le plateau de lchantillonneur automatique. Transfrer les chantillons et talons dans les rcipients pour chantillons de lchantillonneur automatique en utilisant une pipette Pasteur (5.3). Se dbarrasser du premier remplissage du rcipient et mesurer le deuxime remplissage (sil ny a pas assez dchantillon, prendre garde ce que les rcipients des chantillons soient parfaitement propres). Laver la pipette Pasteur quatre ou cinq fois lacide nitrique 1 % (4.4.) entre chaque transfert dtalon et dchantillon.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb 6.4. Quantification du plomb

La moyenne des absorbances de 3 injections est utilise dans tous les cas. Tracer une courbe dtalonnage partir des rponses moyennes fournies par les lots dtalons. Noter les absorbances enregistres par linstrument pour chaque chantillon. La concentration en plomb des chantillons est dtermine par comparaison avec la courbe dtalonnage. NOTE 5 : il est recommand de remplacer le tube du four et la plateforme tous les deux lots voire plus frquemment si une baisse de labsorbance des talons est note. 7 EXPRESSION DES RESULTATS

Corriger les rsultats pour la rcupration moyenne par lots . 7.1 Calcul

Obtenir partir du graphique dtalonnage la concentration en plomb de toutes les solutions de mesure. Calculer la concentration en plomb des chantillons de vin et des chantillons de vins supplments en utilisant le calcul suivant :

Concentration en plomb

(mg/l) =

(Cm - Cb) x Vt --------------------------Vm

o : Cm est la concentration moyenne en plomb de la solution de mesure (mg/l). Cb est la concentration moyenne en plomb mesure, des solutions de blanc ractif (mg/l). Vt est le volume total final de la solution de mesure (ml).

. Vm est le volume de lchantillon de vin prlev (ml).

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb 7.2 Calcul des estimations de recouvrement

Rcupration

(%) =

(Cs - Ca) x Vs x 100 ----------------------S

o : Cs est la concentration calcule moyenne en plomb de lchantillon de vin supplment (mg/l). Ca est la concentration calcule moyenne de plomb dans le vin non supplment (mg/l). Vs est le volume de vin auquel le supplment est ajout (ml).

est la quantit de supplment ajoute (g).

7.3

Calcul des rsultats corrigs du recouvrement

Concentration en plomb corrige

(mg/l) =

Cw x 100 ---------Ra

o:

Cw est la concentration en plomb calcule de lchantillon de vin (mg/l). Ra est la moyenne de recouvrement par lots (%).

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ANNEXE : ETUDE DE VALIDATION Ltude suivante a men des procdures acceptes lchelle internationale (1)(2). TABLEAU 1 ECHANTILLONS
Description de lchantillon Bordeaux (vin doux) Chardonnay italien (blanc) Vin rouge espagnol supplment avec 260 g/l Pinot Noir roumain Pinot Noir roumain supplment avec 150 Echantillon 3/11 supplment avec 124 g/l Echantillon 3/11 supplment avec 134 g/l

Code de lchantillon 5&9 3 & 11 7&8 6 & 10 g/l 2 & 12 1 4

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TABLEAU II RESUME DES PARAMETRES STATISTIQUES POUR LETUDE COLLABORATIVE SUR LA CONCENTRATION EN PLOMB DU VIN (Les rsultats dun laboratoire nont pas t retenus dans lanalyse statistique)

Echantillon Code n n (-val. aberr.) Valeur cible Moy. r Sr RSDr Hor R SR RSDR HoR

A 5, 9 16 16 56 50,8 23 8,1 16 1,0 42 15,1 30 1,2

B 3, 11 15* 15 24 27,2 15 5,3 19 1,1 25 8,8 28 1 ,2

C 7, 8 16 14 279 298 24 8,7 3 0,2 83 29,8 10 0,5

D 6, 10 16 16 67 70,6 32 11,8 17 1,1 57 20,3 29 1,2

E 2, 12 16 15 192 189 51 18.2 10 0,7 154 55,2 29 1,4

F 1 16 16 143 143 38 13,6 9 0,7 79 28,2 19 0,9

F1 4

153 149

CONCERNANT LES TABLEAUX I-II

Nombre initial de laboratoires

n (-val. aberr.)Nombre de laboratoires aprs limination des valeurs aberrantes (*) Laboratoire 17 a indiqu <20 g/l pour le matriel de test 11. Ses rsultats nont pas t inclus dans lanalyse statistique pour cet chantillon (B). Moyenne observe, la moyenne obtenue des donnes de lessai collaboratif aprs limination des valeurs aberrantes.

Moy.

Valeur cible La valeur moyenne observe linterne en utilisant lICP-MS


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Sr RSDr Hor

Limite de rptabilit, la valeur en dessous de laquelle on peut estimer que se situe la diffrence absolue entre deux rsultats danalyse unique obtenus dans des conditions de rptabilit (cest dire mme chantillon, mme oprateur, mme appareillage, mme laboratoire, et court intervalle de temps) dans une limite donne de probabilit (en principe 95 %) do r = 2,8 x sr. Lcart-type de rptabilit. Lcart-type relatif de rptabilit (Sr x 100/MOYENNE). Le RSDr observ divis par la valeur RSDr estime partir de lquation de Horwitz en supposant que r=0.66R. Limite de reproductibilit, la valeur en dessous de laquelle on peut estimer que se situe la diffrence absolue entre deux rsultats danalyse unique obtenus dans des conditions de reproductibilit (cest dire avec du matriel identique obtenu par des oprateurs dans diffrents laboratoires, en utilisant la mthode dessai standardise), dans une limite donne de probabilit (en principe 95 %) ; R = 2.8 x sR. Lcart-type de la reproductibilit (entre la variation des laboratoires). Lcart-type relatif de la reproductibilit (SR x 100/MOYENNE). La valeur RSDR observe divise par la valeur RSDR calcule partir de lquation de Horwitz. RSDR = 2(1-0.5log10C) (o C = concentration exprime en dcimale)

SR RSDR HoR

Les valeurs du HORRAT(4) sont : - Pour la rptabilit, la RSDr observe divise par la valeur RSDr estime partir de lquation de Horwitz en supposant que r = 0.66R. - Pour la reproductibilit, la RSDR observe divise par la valeur RSDR estime partir de lquation de Horwitz.

8. BIBLIOGRAPHIE

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb 8.1 Paul A. Brereton, Paul Robb, Christine M Sargent, Helen M. Crews and Roger Wood. Determination of Lead in Wine by Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry: Interlaboratory Study. JAOAC Int ., 1997, 80, No 6, 1287-1297. 8.2 "Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Collaborative Studies." Editor W Horwitz, Pure & Appl. Chem., Vol. 67, No., 2, pp.331-343, 1995 8.3 Horwitz W, Evaluation of Methods Used for Regulation of Foods and Drugs, Analytical Chemistry, 1982, 57, 67A-76A. 8.4 Peeler J T, Horwitz W and Albert R, Precision Parameters of Standard Methods of Analysis for Dairy Products, JAOAC , 1989, 72, No 5, 784-806.

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Annexe

Allure des courbes absorbance - temps pour la mesure de la concentration en plomb du vinavec utilisation dun spectrophotomtre dabsorption atomique Perkin-Elmer 3030 quip dune correction dabsorption non spcifique arc au deuterium.

(i)

talon de vin 30 ng/l

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(ii)
Cl :

chantillon de vin

absorbance corrige, absorbance non spcifique

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EXEMPLE 2 DETERMINATION DE LA TENEUR EN PLOMB DANS LES VINS PAR SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION ATOMIQUE (Type III) 1. DOMAINE D'APPLICATION

La mthode danalyse est applicable tout type de vins, eut gard la limite maximum fixe par lO.I.V. 2. BIBLIOGRAPHIE 2.1. Journal Officiel des Communauts Europennes (3 octobre 1990). Mthode de dosage du plomb dans le vin (p. 152 et 153). 2.2. Teissdre P.L., Brun S., Mdina B. (1992). Dosage du plomb dans les vins / Proposition de modifications la mthode du Recueil. Feuillet Vert de lO.I.V., n928, 1997/151292. 2.3. Moreira Balio da Silva M., Gaye J., Mdina B. (1996). Comparaison de six mthodes de dosage du plomb dans les vins par absorption atomique en four graphite. Feuillet Vert de lO.I.V. n 1013, 2310/190196. 2.4. Brereton P., Robb P., Sargent C., Crews H., Wood R. (1996). Validation of a graphite furnace atomic absorption spectrometry method for the detection of lead in wine. Feuillet Vert de lO.I.V. n 1016, 2913/230196. 2.5. Bourguignon J.B., Douet Ch., Gaye J., Mdina B. (1997). Dosage du plomb dans le vin / Interprtation des rsultats de lessai interlaboratoire. Feuillet Vert 1055 de lO.I.V. n 2456/190397. 3. PRINCIPE Le vin ne subit aucune prparation, except une dilution dans le cas des vins blancs doux. Lajout de dihydrogno-phosphate dammonium permet au plomb contenu dans le vin dtre stable haute temprature - ce qui conduit liminer les interfrences - et de se comporter de faon identique une solution talon. Latomiseur est un tube en graphite pyrolytique chauff par effet Joule quip dune plate-forme. La longueur donde de la raie utilise est de 283,3 nanomtres. La correction de labsorption non spcifique peut se faire par effet Zeeman ou avec une lampe au deutrium.

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb Le type de dtermination du plomb dans le vin est une mthode directe de dosage avec un talonnage externe. 4. REACTIFS 4.1. Eau dminralise : ultra pure ; ayant une rsistivit suprieure 18 MO/cm. 4.2. Acide nitrique : 65 % ; acide de qualit pour analyses. 4.3. Dihydrogno-phosphate dammonium NH4H2PO4 pour analyses. 4.4. Solution talon de plomb : 1000 g/mL (ou 1 g/l) dans de lacide nitrique 2 % (solution du commerce, prte lemploi). 5. APPAREILLAGE 5.1 5.2 5.2.1 5.2.2 Balance analytique (e = 1 mg). Verrerie : Fioles jauges de 50, 100 ml (classe A), Pipettes jauges de 1, 10 ml (classe A),

5.2.3 Dcontamination de la verrerie utilise : rinage l'eau dminralise; trempage au moins 24 heures dans un bac d'acide nitrique 10 % ; rinage deux fois l'eau dminralise. 5.3 Spectrophotomtre d'absorption atomique quip d'un atomiseur tube de graphite, avec correction de l'absorption non spcifique et passeur automatique d'chantillons (rincer auparavant les godets du passeur dans de l'acide nitrique 10 %). 5.3.1. Four en graphite pyrolytique contenant une plate- forme de L'Vov ventuellement tantalise (rfrence 9.1 - voir ci-dessous: 5.3.1.1 solution de tantale : placer 3 g de poudre de tantale (tantale mtal dont la puret est suprieure 99,7 %) dans un bcher en tflon de 100 mL ; ajouter 10 mL dacide fluorhydrique dilu (1 + 1), 3 g dacide oxalique dshydrat et 0,5 mL deau oxygne 30 % ; chauffer lensemble avec prcaution pour dissoudre le mtal ; ajouter de leau oxygne lorsque la raction se ralentit ; quand la dissolution est complte, ajouter 4 g dacide oxalique dshydrat et approximativeme nt

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb 30 mL deau dminralise ; dissoudre lacide ; porter la solution 50 mL ; cette solution est stocke dans un flacon en matire plastique. 5.3.1.2 tantalisation d'une plate-forme : la plate- forme est dpose l'intrieur d'un tube en graphite. L'ensemble est fix sur l'unit d'atomisation du spectrophotomtre. Un volume de 10 L de la solution de tantale est inject sur la plate- forme l'aide du distributeur automatique d'chantillons. Le cycle des tempratures est fix selon le programme suivant : schage 150C pendant 40 s ; minralisation 900C pendant 60 s ; atomisation 2600C pendant 2,5 s. L'argon est utilis comme gaz inerte. 6. MODE OPERATOIRE 6.1 Prise dessai : Le goulot dune bouteille de vin possdant une capsule de surbouchage en plomb-tain doit tre trs soigneusement nettoy avant dbouchage. 6.2 Prparation de lchantillon : gnralement, aucune prparation du vin nest ncessaire ; les chantillons sont placs directement dans les godets du passeur automatique. Il faut filtrer les vins troubles. Pour prolonger la dure dutilisation des plates-formes, les vins blancs doux sont dilus : pour des teneurs en sucre de 10 50 g/l, diluer au 1/2 ; pour des teneurs suprieures 50 g/l, diluer au 1/4. 6.3 Prparation des solutions :

6.3.1 Blanc de dilution : la solution servant de complment au volume l'injection est constitue par de leau dminralise contenant 1 % dacide nitrique (4.2.). 6.3.2. Modificateur de matrice : introduire 3 g de dihydrogno-phosphate dammonium (4.3.) dans un ballon jaug de 50 mL (5.2.1.) ; dissoudre et complter avec de leau dminralise (4.1.). 6.3.3. Solution de plomb 10 mg/l : placer 1 mL de la solution 1 g/l (4.4.) dans un ballon jaug de 100 mL (5.2.1.) ; ajouter 1 % dacide nitrique (4.2.) ; complter au volume avec de leau dminralise (4.1.). Cette solution se conserve un mois la temprature de + 4C. 6.3.4 Solution de plomb 100 g/l :

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb placer 1 mL de la solution de plomb 10 mg/l (6.3.3.) dans un ballon jaug de 100 ml (5.2.1.); complter au volume avec de leau dminralise (4.1.). Cette solution doit tre prpare chaque jour danalyse. 6.3.5 Gamme dtalonnage ( titre indicatif) : 0 ; 16,7 ; 33,3 et 50 g/l (voir tableau II). 6.4 6.4.1 6.4.1.1 6.4.1.2 6.4.1.3 6.4.1.4 6.4.1.5 Etalonnage et dosage : Mesurages spectromtriques :

longueur donde : 283,3 nm; largeur de la fente : 0,5 nm; intensit de la lampe cathode creuse : 5 mA ; correction du fond continu : par effet Zeeman ou deutrium ; introduction chaud des talons et des chantillons dans le four graphite, avec un passeur automatique dchantillons. Le liquide de rinage est constitu de 500 ml deau dminralise contenant une goutte de Triton X 100. Note: pour obtenir une injection 90C sur la plate- forme, il faut rgler la temprature du four 150C environ. 6.4.1.6 mesure du signal: en hauteur de pic ; 6.4.1.7 dure de la mesure: 3 secondes ; 6.4.1.8 nombre de mesures par talon ou chantillon: 2 Note: la moyenne de ces deux mesures constitue le rsultat dessai. Si le coefficient de variation de deux mesures est suprieur 15 %, on doit refaire deux autres mesures. 6.4.1.9. paramtres du four ( titre indicatif) : voir tableau I.

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Tableau I Paramtres du four pour le dosage du plomb dans les vins temprature (en C) 150 750 750 750 2400 2400 2400 40 dure (en s) 60 10 30 2 1 2 2 20 argon argon argon argon argon argon argon argon type de gaz dbit du gaz (en l/mn) 3,0 3,0 3,0 0 0 0 3,0 3,0 oui oui lecture du signal

6.4.1.10. Paramtres de lchantillonneur automatique ( titre indicatif): voir tableau II.


Tableau II - Paramtres de l'chantillonneur pour le dosage du plomb dans les vins volumes injects en l Analyse : blanc de calibration talon n1 talon n2 talon n3 chantillon chantillon solution de Pb "blanc" de 100 g/l 0 0 0 0 2 0 1 2 3 0 dilution 5 4 3 2 3 modificateur de matrice 1 1 1 1 1

6.4.2 Trac de la courbe dtalonnage : le cycle du distributeur automatique permet de raliser la prparation des talons partir de la solution de plomb 100 g/l (tableau II). On tablit le graphe dtalonnage : absorbance en fonction de la quantit de plomb en microgrammes par litre. MA-F-AS322-12-CRIPLO 24

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7. EXPRESSION DES RESULTATS 7.1 Concentration en plomb de la solution injecte : On l'obtient partir de la courbe dtalonnage (6.4.2.). 7.2 Concentration en plomb du vin : On la dduit en multipliant par 3 le rsultat donn en 7.1. (2 l de solution injecte pour un volume final de 6 l sur la plate- forme). Tenir compte dune ventuelle dilution du vin (cas des vins blancs doux). 7.3 Rsultat : On l'exprime en milligrammes de plomb par litre de vin (mg/l), avec deux chiffres significatifs. 8. ESSAI INTERLABORATOIRE L'essai a t conduit "en double aveugle" avec 8 vins diffrents, obtenus partir de mlanges de vins de Bordeaux : deux vins rouges (R1 et R2), deux vins ross (Ro1 et Ro2), deux vins blancs secs (Bs1 et Bs2) et deux vins blancs doux (D1 et D2). Onze laboratoires espagnols, portugais, marocains et franais ont particip l'tude en dosant le plomb dans les 16 chantillons reus. 8.1 Prsentation des 8 chantillons de vins :
Tableau III : Caractristiques des vins utiliss pour l'essai interlaboratoire Vins R1 R2 Ro1 Ro2 Bs1 Bs2 D1 D2 Type Rouge Rouge Ros Ros Blanc sec Blanc sec Blanc doux Blanc doux T.A.V. (% Vol.) 11,86 12,54 12,23 11,43 11,65 12,32 12,94 12,66 Acidit Totale (g/l H2SO4) 4,43 3,77 5,30 4,88 4,62 4,57 3,72 4,70 Acidit Volatile (g/l H2SO4) 1,57 0,34 0,44 0,45 0,37 0,31 0,67 0,45 Sucres Rducteurs (g/l) 1,2 1,5 1,2 1,1 2,2 0,9 76,4 62,8

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8.2

Exploitation statistique des rsultats :

Tableau IV : Analyse statistique des rsultats de l'essai interlaboratoire Echantillon de vin Rptitions en double aveugle Nombre initial de laboratoires Nombre de laboratoires aprs limination des plus grandes dispersions Moyenne (g/l) Limite de rptabilit r Ecart-type de rptabilit Sr Coefficient de variation de rptabilit RSDr (en %) Valeur du Horrat (Hor):RSDr observ / RSDr Horwitz Limite de reproductibilit R Ecart-type de reproductibilit SR Coefficient de variation de reproductibilit RSDR (en %) Valeur du Horrat (HoR):RSDR observ / RSDR Horwitz R1 C&K 11 R2 F&I 11 Ro1 D&G 11 Ro2 J&L 11 BS1 B&H 11 BS2 P&N 11 D1 A&E 11 D2 M&0 11

11

10

11

11

10

10

11

10

44 18 6,4

162 12 4,3

28 7 2,5

145 17 6,1

52 6 2,1

138 13 4,6

60 28 10

145 7 2,5

14,5

2,8

9,2

4,2

4,2

3,4

16,5

1,8

0,6

0,1

0,3

0,2

0,2

0,2

0,7

0,1

34 12,3

105 37,5

23 8,2

86 30,8

30 10,7

101 35,9

86 30,6

144 51,6

28

23,1

29,3

21,2

20,6

26

51

35,6

1,1

1,1

1,1

0,8

1,2

2,1

1,7

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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Critres pour les mthodes de dtermination du plomb Parmi les 11 laboratoires ayant particip l'essai, 7 ont dclar avoir suivi la mthode d'analyse propose, 4 ont modifi quelques paramtres.
9. PERFORMANCES DE LA METHODE ET CONTROLE QUALITE 9.1 Limite de dtection : Elle est dtermine partir d'une srie de 20 rptitions du blanc analytique et elle est gale 3 carts types. Dans le cas de la mthode propose, une srie de 20 mesures du blanc analytique a donn comme rsultat : moyenne = 1,29 g/l; cart type = 0,44 g/l; limite de dtection = 1,3 g/l. 9.2 Limite de quantification : Elle est gale 3 fois la limite de dtection. Dans le cas de la mthode propose, la limite de quantification est de 4 g/l (3 * 1,32 = 3,96). 9.3 Justesse : L'intervalle de confiance de la moyenne d'une srie de rsultats est compar avec celui donn pour un matriau de rfrence. Trois matriaux de rfrence ont t utiliss: un vin rouge, un vin blanc sec et un vin blanc doux dont les concentrations en plomb ont t certifies par le B.C.R. (Bureau Communautaire de Rfrence) en 1992.

Tableau V : Justesse de la mthode Vin rouge BCR E Valeur certifie (B.C.R. 1992) Valeur moyenne (srie : 10 rsultats) 36,1 4,9 Vin blanc sec BCR C 65,1 9,1 Vin blanc doux BCR D 132,4 32

Concentration

en plomb (g/l)

41,0 3,8

66,0 4,4

128,3 14,1

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9.4

Carte de contrle

Une carte de contrle peut tre tablie pour chaque matriau de rfrence utilis. Les limites de contrle sont gales : +/- 2 SR intra (SR intra : cart-type de reproductibilit).

Carte de contrle
Plomb du BCR E
80 plomb en g/l 70 60 50 40 30 20 15/12/95 26/06/96 29/04/97 08/12/97 09/10/98 date moyenne : 46,3 g/l limites : + 2SR = 63,9 g/l - 2SR = 28,7 g/l

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10.

BIBLIOGRAPHIE

10.1. Zatka V. (1978). Treated graphite atomizer tubes for atomic absorption spectrometry. Analytical Chemistry, vol. 50, n3. 10.2. US Bureau of Alcohol, Tobacco and Firearms (1991). Analysis of lead in wines and related products by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Note dinformation de lO.I.V. du 21 aot 1991 : Plomb dans les vins aux U.S.A. . 10.3. Mindak W.R. (1994). Determination of lead in table wines by graphite furnace atomic absorption spectrometry. Journal of A.O.A.C. International, vol. 77, n4, p. 1023-1030. 10.4. Mdina B. (1994). Apport de nouvelles techniques au dosage des mtaux dans les vins. Congrs des nologues de France Bordeaux. 10.5. Norme franaise NF ISO 5725-2 (1994). Application de la statistique : Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure. 10.6. Jorhem L., Sundstrm B. (1995). Direct determination of lead in wine using graphite furnace AAS. Atomic Spectroscopy, September/October 1995.

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RECUEIL INTERNATIONAL DES METHODES DANALYSES OIV Limites maximales acceptables de divers lments dans le vin

Limites maximales acceptables de divers lments dans le vin


(dition 2007)

Acide citrique : Acidit volatile :

1 g/l 20 milliquivalents/l L'acidit volatile de certains vins vieux d'laboration particulire (vins soumis une lgislation particulire et contrls par le gouvernement) peut dpasser cette limite.

Arsenic : Bore : Brome :

0,2 mg/l 80 mg/l (exprim en acide borique). 1 mg/l (limite dpasse exceptionnellement dans des vins provenant de certains vignobles sous-sol saumtre). 0,01 mg/l 1 mg/l 10 mg/l, la limite de quantification 15 mg/l (dtermin par la mthode quantitative dcrite dans le Recueil).

Cadmium : Cuivre : Dithylne glycol : Diglucoside de malvidol :

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Dioxyde de soufre total au moment de la vente au consommateur: (oeno 9/98) - 0,150 g/l pour les vins rouges contenant au plus 4 g/l de matires rductrices, - 0,200 g/l pour les vins blancs et ross contenant au plus 4 g/l de matires rductrices, - 0,300 g/l pour les vins rouges, blancs et ross contenant plus de 4 g/l de matires rductrices, - 0,400 g/l pour certains vins blancs doux spciaux. 10 mg/l

Etanediol/Ethylne glycol

Fluor (oeno 8/91)

1 mg/l sauf pour les vins issus de vignobles traits la cryolithe, conformment la loi nationale ; dans ce cas, la teneur en fluor ne doit pas tre suprieure 3 mg/l

Mthanol (Oeno 19/2004): 400 mg/l pour les vins rouges 250 mg/l pour les vins blancs et ross Ochratoxine A (CST 1/2002): Plomb (oeno 13/06): 2 g/l

(pour les vins obtenus compter de la rcolte 2005)

0,15 mg/l

pour les vins produits partir de la campagne 2007,

Propane-1,2- diol / Propylne glycol (oeno 20/2003) Sodium excdentaire :

Vins tranquilles: = 150 mg/l. Vins mousseux: = 300 mg/l.

60 mg/l (2,6 m/l) (limite exceptionnellement dpasse dans les vins produits dans des vignobles reconnus comme tels par les services officiels).
2

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Sulfates : (exprims en sulfate de potassium)

1 g/l Toutefois cette limite est porte : - pour les vins ayant fait l'objet d'une priode de vieillissement en fts de 2 ans au moins - pour les vins dulcors - pour les vins obtenus par adjonction des mots ou des vins d'alcool ou d'eau de vie - pour les vins additionns de mots concentrs - pour les vins naturellement doux - pour les vins obtenus sous voile 1,5 g/l 2 g/l

} 2,5 g/l

Zinc :

5 mg/l

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Recherche des antiseptiques et des inhibiteurs de fermentation


Mthode A 35 modifie par la rsolution Oeno 6/2006 1. Test de fermentescibilit 1.1. Objectif Mettre en vidence la prsence ventuelle d'une ou plusieurs substances action antifermentaire dans les vins, mais sans en prciser la nature. 1.2. Principe Le vin, dont le dioxyde de soufre libre a t combin par addition d'une solution aqueuse d'thanal, est ramen 10% vol. d'alcool, additionn de glucose pour que sa teneur en sucres soit compr ise entre 20 et 50 g/l et de solutions nutritives. Aprs un ensemencement par une souche de levure rsistant l'alcool, la fermentation est suivie par pese de la quantit de dioxyde de carbone dgage. La vitesse de fermentation est compare, d'une part celle d'un vin naturel authentique, de composition aussi voisine que possible de celle du vin analys, d'autre part celle du vin analys dont le pH a t amen 6 (la plupart des antiseptiques minraux et organiques sont sans action sur la fermentatio n ce pH). Ces deux vins tmoins sont ensemencs dans les mmes conditions que le vin analys. 1.3. Appareillage Flacon de 90 ml obtur par un bouchon de caoutchouc perfor d'un trou, dans lequel est engag un tube trs effil son extrmit suprieure. 1.4. Ractifs et milieux de culture 1.4.1.- Solution aqueuse d'thanal : Solution prpare partir d'thanal obtenu par distillation de mtaldhyde ou de paraldhyde, en prsence d'acide sulfurique et titre par la mthode au sulfite de sodium. On ajuste le titre de la solution 6,9 g/1. 1 ml de cette solution fixe 10 mg de dioxyde de soufre. 1.4.2. Solutions nutritives : - Sulfate d'ammonium, (NH4 )2 SO4 .......................................... 25 g/l - Asparagine .......................................................................................... 20 g/l Ces solutions sont conserver au rfrigrateur. 1.4.3. Milieux de culture : - Milieu solide : malt glos. Malt en poudre ................................................................................... 3 g Glucose .................................................................................................. 10 g Peptone pancratique ..................................................................... 5 g Extrait de levure en poudre ......................................................... 3 g
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Glose ..................................................................................................... 20 g Eau q.s.p. ............................................................................................... 11 pH .............................................................................................................. 6 Striliser 20 min. 118 C. Ce mlange existe sous forme de prparations commerciales. - Milieu liquide (au choix) : Rpartir du jus de raisin contenant 170 200 g/1 de sucres, en tubes bouchs avec du coton, raison de 10 ml par tube; striliser au bain d'eau 100 C pendant 15 min. Malt liquide : mme milieu que le milieu solide, mais sans glose. 1.4.4. Culture et entretien de la souche de Saccharomyces bayanus et prparation du levain. . a) Culture et entretien de la souche sur milieu solide : partir d'une souche de collection, ensemencer en stries les tubes de milieux solides. Ces tubes sont mis incuber l'tuve 25 C jusqu' ce que la culture soit bien apparente (3 jours environ); ces tubes peuvent tre conservs au rfrigrateur. Il suffit de les repiquer tous les 6 mois. b) Prparation du levain : Un des tubes du milieu liquide est ensemenc selon les techniques microbiologiques partir de la souche cultive sur milieu solide; aprs croissance (24 48 h), repiquer 2 fois conscutivement sur le mme milieu enrichi 10% vol. d'alcool, de faon accoutumer la souche. La deuxime culture en pleine activit renferme environ 50 millions de levures par millilitre. Cette culture servira ensemencer le vin tudi. Effectuer une numration et ensemencer raison de 105 levures/ml. 1.5. Mode opratoire - Prparation du vin : 100 ml de vin sont traits par la quantit ncessaire d'thanal calcule d'aprs la teneur en dioxyde de soufre libre (44 mg d'aldhyde bloquent 64 mg de dioxyde de soufre). Attendre 24 h et vrifier que le vin contient moins de 20 mg de dioxyde de soufre libre par litre. Si le titre alcoomtrique est suprieur 10 % vol., le vin sera dilu avec des solutions de glucose et de l'eau en quantit calcule de manire raliser une teneur en sucres comprise entre 20 et 50 g/l et ramener le titre 10 % vol. environ. Pour les vins titrant moins de 10 % vol., ajouter du glucose solide pour ramener sans dilution la teneur en sucres entre ces valeurs, pour lesquelles la vitesse de fermentation n'est pas modifie par la teneur en sucres. - Test de fermentescibilit : Dans le flacon de 90 ml, placer 60 ml de vin prpar comme ci-dessus, 2,4 ml de solution de sulfate d'ammonium et 2,4 ml de solution d'asparagine. Ensemencer par 3 gouttes d'une culture de 3 jours de Saccharomyces bayanus, de manire raliser une population initiale voisine de 105 levures/ml. Mettre en
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place le bouchon avec son tube effil, peser 10 mg prs l'ensemble et le placer dans une tuve 25 C. Une pese est effectue quotidiennement pendant au moins 8 jours. Oprer chaque fois paralllement, d'une part avec un vin de composition et d'origine analogues dont on est sr qu'il n'a pas reu d'antiseptique, d'autre part avec le vin essayer dont on a ajust le pH 6. Un flacon de vin non ensemenc indique la perte par vaporation. 1.6. Interprtation Dans la plupart des cas, la fermentation se dclare en 48 h et le dgagement quotidien est maximum entre le 3me et le 5me jour. On ne pourra affirmer la prsence d'un inhibiteur de fermentation que : a) Si la fermentation ne se dclare pas ou est retarde d'au moins 2 jours par rapport l'un des 2 tmoins. Il est difficile de se prononcer lorsque le retard est lger, car il peut y voir des rsultats "faux positifs", certains vins naturels se conduisant parfois comme s'ils contenaient des traces d'inhibiteurs (en particulier les vins liquoreux issus de raisins atteints de pourriture noble). b) Si le dgagement maximum quotidien n'a pas eu lieu entre le 3me et le 5me , mais aprs le 7me jour, ce dgagement doit tre suprieur ou gal 50 mg pour 60 ml de vin. c) Le trac de la courbe de fermentation et celui de la courbe de dgagement quotidien de C02 en fonction du temps peuvent faciliter l'interprtation dans les cas difficiles. 2. Recherche des acides sorbique, benzoque, p -chlorobenzoque, salicylique, p -hydroxybenzoque et ses esters 2. 1. Chromatographie sur couche mince 2.1.1. Principe Ces antiseptiques sont extrait par l'ther du vin acidifi au pralable. Aprs sparation par chromatographie sur couche mince de poudre de poly amide, ils sont localiss et caractriss par un examen du chromatogramme sous rayonnement ultraviolet. 2.1.2. Appareillage - Dispositif pour l'talement en couche mince. - Plaques de verre 20 X 20 cm. Prparation des plaques - Mlanger intimement sec 12 g de poudre de polyamide avec 0,3 g d'indicateur fluorescent; ajouter en agitant 60 ml de mthanol; taler sur plaques sur une paisseur de 0,3 mm. Scher la temprature ordinaire.
Remarque : Des plaques prtes l'emploi commercialises peuvent tre utilises.

2.1.3. Ractifs - ther dithylique. - Mthanol.


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- Alcool 96% vol. - Acide sulfurique dilu 20 p. 100 (v/v). - Sulfate de sodium anhydre. - Poudre de polyamide pour chromatographie (par exemple, Macherey-Nagel ou Merck). - Indicateur fluorescent (F254 Merck ou quivalent). - Solvants : Pentane ..................................................................................................... . 10 vol. Hexane ................................................................................................... 10 vol. Acide actique glacial ....................................................................... 3 vol. - Solutions talons : Prparer des solutions 0,1 g pour 100 ml d'alcool 96% vol. avec les acides sorbique, p -chlorobenzoque, salicylique, p -hydroxybenzoque et ses esters. Prparer une solution 0,2 g pour 100 ml d'alcool 96% vol. avec l'acide benzoque. 2.1.4. Mode opratoire Placer 50 ml de vin dans une ampoule dcanter; acidifier par l'acide sulfurique dilu 20 p.100 et extraire 3 reprises par 20 ml d'ther dithylique chaque fois. Runir les solutions thres dans une ampoule dcanter et les laver avec quelques millilitres d'eau distille. Scher ensuite cet ther avec du sulfate de sodium anhydre. Evaporer l'ther sec, soit sur un bain d'eau 100 C, soit dans un vaporateur rotatif. Si l'vaporation est effectue sur un bain d'eau, il est avantageux d'activer l'vaporation par un courant d'air modr jusqu'aux 2 ou 3 derniers millilitres et de terminer l'vaporation froid. Dissoudre le rsidu dans 1 ml d'thanol, dposer 3 5 1 de cette solution sur la plaque de polyamide, ainsi que 3 5 l des solutions alcooliques talons des divers conservateurs. Introduire la plaque dans une cuve chromatographie, sature des vapeurs du solvant. Laisser migrer le solvant sur une hauteur de 15 cm environ, ce qui demande 1 h 30 2 h 30. Retirer la plaque de la cuve et la laisser scher la temprature ordinaire. Examiner ensuite en lumire ultraviolette, la longueur d'onde 254 nm. Les conservateurs apparaissent de bas en haut de la plaque dans l'ordre suivant : acide p -hydroxybenzoque, esters de l'acide p -hydroxybenzoque, acide salicylique, acide p -chlorobenzoque, acide benzoque, acide sorbique. l'exception de l'acide salicylique qui prsente une fluorescence bleu clair, les autres conservateurs donnent des spots foncs sur fond jaune-vert fluorescent. Sensibilit - Cette technique permet de dceler les quantits suivantes des divers conservateurs exprimes en milligrammes par litre : Acide salicylique ........................................................................................ 3 Acide sorbique ............................................................................................. 5 Esters de l'acide p -hydroxybenzoque ............................................ 5
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Acide p -hydroxybenzoque .................................................................. 5-10 Acide p -chlorobenzoque ....................................................................... 5-10 Acide benzoque .......................................................................................... 20 2.2. Chromatographie liquide haute performance 2.2.1. Mode opratoire Le dosage s'effectue directement sur le vin, sans prparation d'chantillon. Il faut cependant diluer les vins rouges avant de les injecter afin de mnager la colonne. D'aprs cette mthode, le seuil de dtection de chaque antiseptique dans la solution soumise au dosage est d'environ 1 mg/l. 2.2.2. Conditions opratoires Les conditions qui se sont rvles tre les plus avantageuses sont les suivantes : A. Pour le dosage des acides sorbique et benzoque Procder selon la mthode de dosage des acides sorbique, benzoque, salicylique dans les vins par chromatographie liquide haute performance (AS313-20-SOBESA) figurant au Recueil B. Pour le dosage de l'acide p -chlorobenzoque, de l'acide p -hydroxybenzoque et ses esters Colonne : voir A Phase mobile : Solution 0,01 M d'actate d'ammonium-mthanol (40:60) pH : 4,5-4,6 Dbit : voir A Volume inject : voir A Dtecteur : UV, 254 nm Temprature : voir A

BIBLIOGRAPHIE JUNGE Ch., Zeits. Unters. Lebensmit., 1967, 133, 319

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3. Recherche des drivs monohalogns de l'acide actique 3.1. Principe Les drivs monohalogns de l'acide actique sont extraits par l'ther du vin acidifi. On soumet ensuite cet ther une extraction au moyen d'une solution 0,5 M d'hydroxyde de sodium. La solution d'extraction dont l'alcalinit doit tre maintenue entre 0,4 et 0,6 M, est additionne d'acide thiosalicylique, la synthse du thioindigo se ralise en passant par les tapes suivantes : a) Condensation du driv monohalogn avec l'acide thiosalicylique et formation de l'acide phnylthioglycolique orthocarboxyl; b) cyclisation de l'acide form en milieu alcalin chaud, avec formation de thioindoxyle; c) Oxydation du thioindoxyle par l'hexacyanoferrate III de potassium en milieu alcalin avec formation de thioindigo, soluble dans le chloroforme qu'il colore en rouge. 3.2. Appareillage Bain d'eau 100 C. Agitateur mcanique. tuve permettant d'obtenir une temprature de 200 2 C. 3.3. Ractifs ther dithylique. 1 Solution d'acide chlorhydrique dilu au /3 (v/v). Mlanger une partie d'acide chlorhydrique pur, 20 = 1,19 g/ml, avec 2 parties d'eau distille. Sulfate de sodium anhydre. Solution d'acide thiosalicylique : Acide thiosalicylique ................................................................................... 3g Solution d'hydroxyde de sodium 1,5 M q.s.p. ............................... 100 ml Solution d'hydroxyde de sodium : 0,5 M. Solution d'hexacyanoferrate III de potassium contenant 2 g de K3 Fe(CN)6 pour 100 ml d'eau. Chloroforme. 3.4. Mode opratoire Placer dans une fiole d'extraction bouche l'meri 100 ml de vin analy ser; ajouter 2 ml d'acide chlorhydrique dilu au 1 /3 et 100 ml d'ther. Agiter nergiquement le contenu pendant quelques secondes la main, puis pendant 1 h avec un agitateur mcanique. Transvaser dans une ampoule dcanter et recueillir la couche thre aprs avoir laiss dcanter et avoir limin la couche infrieure. Agiter l'extrait thr avec 8 10 g de sulfate de sodium anhydre pendant quelques secondes. Transvaser cet extrait dans une ampoule dcanter, ajouter 10 ml de la solu tion 0,5 M d'hydroxyde de sodium; agiter pendant 1 min. Laisser reposer.
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Prlever 0,5 ml de l'extrait alcalin et vrifier, par titration au moyen d'acide sulfurique 0,05 M, que son titre est bien compris entre 0,4 et 0,6 M. Recevoir l'extrait alcalin contenu dans l'ampoule dcanter dans un tube essai, dans lequel on a plac 1 ml de solution d'acide thiosalicylique Ajuster, si ncessaire, le titre de l'extrait alcalin pour qu'il soit compris dans les limites indiques, au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium de titre plus lev et connu exactement. Agiter le contenu du tube essai pendant 30 s et le transvaser dans une capsule de porcelaine. Placer la capsule sur un bain d'eau 100 C en projetant sa surface un courant d'air froid. Maintenir la capsule sur le bain d'eau 100 C pendant 1 h, dure qui devra tre respecte, mme si l'on arrivait en un temps plus court un rsidu pratiquement sec. S'il se formait au cours de l'vaporation une crote la surface du rsidu, il convient de la rompre en la triturant avec une fine baguette de verre pour faciliter l'vaporation. Placer ensuite la capsule dans une tuve maintenue 200 2C pendant 30 min. exactement. Aprs refroidissement, reprendre le contenu de la capsule par 4 ml d'eau; transvaser dans u n tube sparateur robinet placer dans la capsule 3 ml de la solution d'hexacyanoferrate III de potassium pour finir de dissoudre le rsidu qui pourrait y adhrer et le placer ensuite dans le tube sparateur. Agiter pendant 30 s pour favoriser l'oxydation. Ajouter 5ml de chloroforme, agiter par 3 4 retournements Laisser dcanter. Une coloration rose ou rouge (selon la quantit de thioindigo form) indique la prsence de driv monohalogn de l'acide actique. Sensibilit - La mthode permet de dceler 1,5 2mg d'acide monochloractique par litre de vin et les quantits correspondantes des autres driv monohalogns. Mais le rendement des diverses extractions n'tant pas quantitatif, cette mthode ne peut tre utilise pour le dosage de ces drivs monohalogns dans les vins. BIBLIOGRAPHIE
FRIEDLANDER, Ber. Deutsch. Chem. Gesell., 1906, 39, 1062. RAMSEY L.L., PATTERSON W.I., J. Ass. Off. Agr. Chem., 1951, 34, 827. PERONNET M., ROCQUES S., Ann. Fais. Fraudes, 1953, 21-23. Trait de chimie organique, publi sous la direction de V. GRIGNARD, 1942, 19, 565566. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists 11e dition, publie par l'Association of Official Analytical Chemists, Washington 1970, 340-341. T ERCERO C., F. V. O.I. V., 1967, n 224.

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4. Recherche et dosage du pyrocarbonate d'thyle 4.1. Principe Le carbonate dithylique form par la dgradation du pyrocarbonate d'thyle (ester dithylique de l'acide pyrocarbonique) en prsence d'thanol est extrait du vin par le sulfure de carbone et dos par chromatographie en phase gazeuse. L'un ou l'autre des modes opratoires dcrits ci-dessous peut tre utilis. 4.2. Appareillage 4.2.1. Chromatographe en phase gazeuse avec dtecteur ionisation de flamme. 4.2.2. Colonnes : Colonne capillaire garnie de Carbowax 1540 Longueur de la colonne : 50 pieds (15,24 m) Diamtre intrieur : 0,02 pouce (0,51 mm) Polypropylneglycol sur Celite 545 (15:100), 60-100 mesh Longueur de la colonne : 2 m Diamtre intrieur : 3 mm 4.3. Ractifs Sulfate de sodium anhydre Sulfure de carbone Le sulfure de carbone ne devra pas prsenter d'impurets dans la zone de rtention critique (de 5 7 min.) pour une sensibilit maximale dans les conditions de chromatographie en phase gazeuse indiques dans le paragraphe 4.4.2. 4.4. Mode opratoire 4.4.1. Utilisation de la colonne capillaire. Introduire 100 ml de vin dans une ampoule dcanter de 250 ml de capacit avec 1 ml de sulfure de carbone. Agiter vigoureusement pendant 1 min. La phase sulfure de carbone spare est centrifuge fortement, puis sche au moyen de sulfate de sodium anhydre. Injecter 10 l du liquide limpide surnageant dans le chromatographe. Conditions de la chromatographie : Gaz d'alimentation du dtecteur : hydrogne : 37 ml/min. air : 250 ml/min. Gaz vecteur : azote : 40 ml/min. Un systme de division dans un rapport voisin de 1/10 envoie dans le dtecteur le mlange gazeux avec un dbit de 3 5 ml/min. Temprature : injecteur : 150 C, four : 80 C, dtecteur : 150 C, Limite de dtection : 0,05 mg/1 de vin.
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4.4.2. Utilisation de la colonne au polypropylneglycol. Introduire 20 ml de vin et 1 ml de sulfure de carbone dans un tube centrifuger fond conique et pouvant tre bouch. Agiter vigoureusement pendant 5 min., puis centrifuger pendant 5 min. en appliquant une force centrifuge de 1000 1200 g. Le liquide surnageant est prudemment aspir au moyen d'une pipette pointe effile; la phase sulfure de carbone est sche par une faible quantit de sulfate de sodium anhydre, ajoute en agitant avec une baguette de verre. Injecter 1 l du liquide limpide dans le chromatographe en phase gazeuse. Conditions de la chromatographie. Gaz d'alimentation du dtecteur : hydrogne : 35 ml/min. air : 275 ml/min. Gaz vecteur : azote : 25 ml/min. Temprature : injecteur : 240 C four : 100 C dtecteur : 240 C Domaine de sensibilit : 12 x 10-11 A 3 X 10-11 A Vitesse de droulement du papier enregistreur : 1 cm/min. Limite de dtection : 0,10-0,05 mg/1 de vin En observant exactement ces conditions, le carbonate dithylique prsente un temps de rtention voisin de 6 min. L'talonnage de l'appareil est effectu au moyen de solutions 0,01 et 0,05 p. 100 (m/v) de carbonate dithylique dans le sulfure de carbone. 4.5. Calculs La dtermination quantitative du carbonate dithylique est effectue de prfrence par la mthode de l'talon interne, en se rfrant aux pics de l'alcool isobutylique ou de l'alcool isoamylique qui sont voisins de celui du carbonate dithylique. Pour ce faire, prparer deux chantillons du vin analyser : l'un tant le vin additionn de 10 ml d'alcool 10 % vol., l'autre le mme vin additionn de 1 mg de carbonate dithylique par litre au moyen de 10 -ml d'une solution de carbonate dithylique 100 mg/l dans l'alcool 10 % vol. Traiter ces deux chantillons selon l'une ou l'autre des techniques ci-dessus en fonction de la colonne utilise.

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Soit : S = la surface du pic du carbonate dithylique correspondant au vin sur charg de 1 mg de carbonate dithylique par litre. Sx = la surface du pic correspondant au vin, I = la surface du pic de l'talon interne dans le vin, 1 = la surface du pic de l'talon interne dans le vin surcharg. La concentration du carbonate dithylique en mg/1 de vin est :
S S x i S I Dans le cas o l'on effectue l'talonnage au moyen d'une solution talon pure de carbonate dithylique, il est ncessaire de dterminer au pralable le rendement de l'extraction par le sulfure de carbone dans les conditions opratoires utilises. Ce rendement est exprim par le facteur d'extraction F, sous forme d'un nombre dcimal infrieur ou gal 1 (rendement 100%). Soit : Sx = la surface du pic de carbonate dithylique donn par le vin, Se = la surface du pic donn par l'injection d'un mme volume de solution talon de carbonate dithylique de concentration C en mg/1, Vx = le volume de vin soumis l'extraction par le sulfure de carbone, Vs = le volume de sulfure de carbone utilis pour l'extraction, Ex = la sensibilit pour l'enregistrement de Sx , Ee = la sensibilit pour l'enregistrement de Se. La concentration du carbonate dithylique en mg/1 de vin est : C x S x E x Vs Se x Ee x F x V

Si les concentrations des deux solutions injectes dans le chromatographe sont voisines, la sensibilit est la mme pour l'enregistrement de S x et de S e, la formule se simplifie et devient :
C x S x Vs Se x F x V

BIBLIOGRAPHIE
KIELHOFER E., WURDIG G., Dtsch. Lebensmit. Rdsch. . 1963, 59, 197-200 et 224-228. PRILLINGER F., Weinberg u. Keller, 1967, 14, 5-15. REINHARD C., Dtsch. Lebensmit. Rdsch., 1967, 5, 151-153. BANDION F., Mitt. Klosterneuburg, Rebe und. Wein, 1969, 19, 37-39.

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5. Recherche de l'acide dhydroactique 5.1. Principe Le vin acidifi par l'acide sulfurique est trait par un mlange parties gales d'ther dithylique et d'ther de ptrole. Aprs vaporation du solvant, l'extrait, repris par une petite quantit d'thanol 96% vol., est dpos sur une couche mince de polyamide et de gel de silice avec indicateur de fluorescence et soumis l'action du solvant mobile benzne-actone-acide actique. L'acide dhydroactique est localis et caractris par un examen en ultraviolet du chromatogramme. 5.2. Appareillage Dispositif pour chromatographie en couche mince. tuve. vaporateur rotatif. Lampe U.V. 254 nm. 5.3. Ractifs ther dithylique. ther de ptrole (point d'bullition 40 C). - Mthanol. Acide sulfurique 20 p. 100 (v/v). - Sulfate de sodium anhydre. thanol 96% vol. Couche de sparation chromatographique : 10 g de poudre de polyamide avec indicateur de fluorescence (par exemple polyamide DC II UV254 de Macherey-Nagel) sont agits fortement avec 60 ml de mthanol. Ajouter, en continuant l'agitation, 10 ml d'eau et 10 g de gel de silice G avec indicateur fluorescent (par exemple Kiesselgel GF254 de Merck). taler ce mlange sur 5 plaques (200 x 200 mm) sur une paisseur de 0,25 mm. Scher les plaques temprature ambiante pendant 30 min. puis l'tuve 70 C pendant 10 min. Solvant de migration : Benzne cristallisable ............................................................................................. 60 vol. Actone ........................................................................................................................... 3 vol. Acide actique cristallisable ............................................................................... 3 vol. Solutions tmoins Solutions alcooliques d'acide dhydroactique et d'acide benzoque 0,2 p. 100. Solutions alcooliques d'acide sorbique, d'acide p -chlorobenzoque, d'acide salicylique, d'acide p -hydroxybenzoque et de ses esters propylique, mthylique et thylique 0, 1 p. 100 (m/v). 5.4. Mode opratoire Acidifier 100 ml de vin par 10 ml d'acide sulfurique dilu 20 p. 100, puis procder 3 fois l'extraction avec chaque fois 50 ml d'un mlange ther diethylique-ther de ptrole (1:1, v/v). Les mulsions peuvent tre habi-

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tuellement limines en laissant s'couler la partie limpide de la phase aqueuse. Agiter nouveau le liquide restant dans l'ampoule dcantation compos d'une mulsion et de la phase thre. -La phase aqueuse rsiduelle se spare dans la plupart des cas d'une faon nette de la phase ther. S'il demeurait encore un peu d'mulsion, celle -ci serait limine par addition de quelques gouttes d'thanol. Les phases ther dithylique-ther de ptrole runies sont laves au moyen de 50 ml d'eau, dessches par le sulfate de sodium, puis vapores dans un vaporateur rotatif 30-35 C. Le rsidu est repris par 1 ml d'thanol. Dposer 20 l de cette solution sur la ligne de dpart sous forme d'un trait de 2 cm de largeur, ou 10 l sous forme d'une tache circulaire. A titre de comparaison, dposer 5 l de chacune des solutions tmoins indiques ci-dessus. Aprs la chromatographie (ascendante, hauteur de migration 15 cm, dure 1 h 15 min. 1 h 45 min., saturation normale de la chambre), la plaque est sche temprature ambiante. L'acide dhydroactique et les autres conservateurs ventuellement prsents sont localiss sous la lampe U.V. 254 nm. Lorsque l'examen du chromatogramme a rvl la prsence d'acide p chlorobenzoque, des esters propylique ou mthylique de l'acide p hydroxybenzoque qui ne sont spars qu'en partie par cette mthode leur identification peut s'oprer, en partant de l'extrait ci -dessus, suivant la mthode dcrite dans ce chapitre, en 2 Recherche des acides sorbique, benzoque, parachlorobenzoque . . . , 2. 1. Chromatographe sur couche mince. BIBLIOGRAPHIE HALLER H.E., JUNGE Ch., F.V. O.LV., 1972, n* 397, Mitt. BI. der Gd CH, Fachgruppe, Lebensmitt. u. gerichtl. Chem., 1971, 25, n 5, 164-166. 6. Azothydrate de sodium 6. 1. Mthode par chromatographie liquide haute performance 6.1.1. Principe L'acide azothydrique isol du vin grce une double distillation est dcel aprs une drivation avec le chlorure de 3,5-dinitrobenzoyle, par chromatographie en phase liquide haute performance. La dtection est effectue au spectrophotomtre d'absorption dans l'ultraviolet 240 nm. 6.1.2. Appareillage 6.1.2.1. Appareil distiller (appareil de distillation pour la dtermination du titre alcoomtrique volumique); l'extrmit du rfrigrant se termine par un tube effil. 6.1.2.2. Ballons col rod de 500 ml. 6.1.2.3. Flacon de 10 ml bouchant l'meri.
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6.1.2.4. Appareil pour HPLC. Conditions opratoires : Colonne : C18 , 25 cm de long. Phase mobile : actonitrile -eau (50 :50) Dbit : 1 ml/min. Volume inject : 20 l Dtecteur : spectrophotomtre d'absorption dans l'ultraviolet 240 nm Temprature : ambiante 6.1.3. Ractifs 6.1.3.1. Hydroxyde de sodium en solution 5 p. 100 (m/v). 6.1.3.2. Acide sulfurique en solution 10 p. 100 (m/v). 6.1.3.3. Ractif indicateur : rouge de mthyle 100 mg, bleu de mthylne 50 mg, alcool 50% vol. 100 ml. 6.1.3.4. Actonitrile pour la chromatographie. 6.1.3.5. Ractif pour la drivation : solution de chlorure de 3,5-dinitrobenzoyle 10 p.100 (m/v) dans l'actonitrile. 6.1.3.6. Solution-tampon d'actate de sodium, pH 4,7 : mlanger un volume de solution d'actate de sodium (NaC2 H3 O2 .3H 2O) 1 M avec un volume de solution d'acide actique 1 M,. 6.1.3.7. Azothydrate de sodium, NaN3 . 6.1.4. Mode opratoire 6.1.4.1. Prparation de l'chantillon. Dans un ballon col rod, placer 100 ml de vin, distiller en plongeant l'extrmit du rfrigrant dans 10 ml d'une solution d'hydroxyde de sodium 5 p. 100 additionne de quelques gouttes du ractif indicateur. Distiller jusqu' recueillir 40-50 ml de distillat. Transvaser le distillat dans un autre ballon col rod en rinant la fiole avec deux fois 20 ml d'eau et ajouter de l'eau pour atteindre, le volume de dpart (100 ml). Pour chasser l'thanol, fixer le ballon l'appareil distiller et liminer environ 50 ml de distillat (rduction du volume au demi). Refroidir compltement le ballon. Acidifier par de l'acide sulfurique 10 p. 100. Distiller, recueillir le distillat dans un flacon de 10 ml bouchant l'meri, contenant 1 ml d'eau et immerg dans un bain glac. Arrter la distillation lorsque le volume total est de 10 ml. 6.1.4.2. Drivation Mlanger 1 ml du distillat + 0,5 ml d'actonitrile + 0,2 ml de la solution tampon + 30 l de ractif pour la drivation et agiter vigoureusement; attendre cinq minutes. 6.1.4.3. Chromatographie Injecter 20 l dans les conditions adoptes, le driv de l'acide azothydrique a un temps de rtention voisin de 11 minutes.
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Limite de dtection : 0,01 mg/l Remarque : Parfois, une autre substance non drive peut simuler l'acide azothydrique. C'est pourquoi il faut vrifier un rsultat positif comme suit : on injecte 20 l de distillat directement; une disparition du pic indique la prsence d'acide azothydrique. 6.1.5. Calcul Pour connatre la concentration de l'azothydrate de sodium, se rfrer la rponse donne par une solution talon aprs drivation. Tenir compte de la concentration d'un facteur 10 de l'chantillon de vin lors de l'analyse. 6.2. Mthode colorimtrique 6.2.1. Principe L'acide azothydrique, trs volatil, est spar par double distillation, condition permettant l'limination de l'thanol, de l'acide actique et du dioxyde de soufre, puis dos colorimtriquement aprs formation d'un complexe color avec le chlorure de fer III (absorbance maximum 465 nm). 6.2.2. Appareillage 6.2.2.1. Appareil distiller simple, compos d'un ballon de 500 ml col rod et d'un rfrigrant termin par un tube effil. 6.2.2.2. Spectrophotomtre et cuves de verre de 1 cm de trajet optique. 6.2.3. Ractifs 6.2.3.1. Hydroxyde de sodium en solution M. 6.2.3.2. Acide sulfurique M. 6.2.3.3. Peroxyde d'hydrogne 3 p.100 en vol.; son titre doit tre contrl extemporanment par une solution 0,02 M de permanganate de potassium; soit p ml le volume qui oxyde 1 ml de la solution de peroxyde d'hydrogne 3 p.100. 6.2.3.4. Solution de fer III 20 g par litre en Fe III : (peser 96,6 g de FeC13 .6H 2O, ou davantage car ce sel est trs hygroscopique, contrler la teneur en Fe III de la solution et l'ajuster si ncessaire 20 g par litre 0,5 g). 6.2.3.5. Solution mre d'azothydrate de sodium (NaN3 ) 1 g par litre dans l'eau distille. 6.2.3.6. Solution d'azothydrate de sodium 200 mg par litre prpare extemporanment par dilution de la solution 1 g par litre. 6.2.4. Mode opratoire a) Dans un ballon de 500 ml col rod, placer 200 ml de vin, distiller, recueillir le distillat dans une fiole jauge de 50 ml contenant 5 ml d'eau et immerge dans un bain glac. Arrter la distillation lorsque le volume total est de 50 ml environ.
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b) Transvaser quantitativement le distillat dans un autre ballon rod de 500 ml en rinant la fiole de 50 ml avec 2 fois 20 ml d'eau. Neutraliser au moyen de la solution d'hydroxyde de sodium M (utiliser un papier indicateur de pH). Acidifier par 10 ml d'acide sulfurique M, agiter, puis oxyder le dioxyde de soufre par addition de solution de peroxyde d'hydrogne 3 p. 100. Si le vin contient S mg par litre de dioxyde de soufre, et si p ml est le volume de solution de permanganate de potassium 0,02 M ncessaire pour oxyder 1 ml de solution de peroxyde d'hydrogne 3 p. 100, il faut utiliser pour 200 ml de vin :
S = S ml de solution H2 O2 5 x 3 ,2 p 16p

Complter le volume 200 ml environ par addition d'eau distille. Distiller, recueillir le distillat dans une fiole jauge de 50 ml contenant 5 ml d'eau distille et immerge dans un bain g lac; arrter la distilla tion juste avant le trait de jauge, ramener la temprature ambiante et ajuster le volume 50 ml. c) Ajouter 0,5 ml (exactement mesur) de solution de chlorure ferrique, homogniser et mesurer aussitt (dlai maximum 5 min.) l'absor bance 465 nm dans une cuve de 1 cm de trajet optique, le zro de l'appareil tant rgl sur un essai blanc constitu par 50 ml d'eau additionne de 0,5 ml de solution de chlorure ferrique. d) tablissement de la courbe talon. Dans des fioles jauges de 50 ml introduire 1, 2, 3, 4, 5 ml de solution d'azothydrate de sodium 200 mg par litre, complter le volume 50 mi par de l'eau distille, ajouter 0,5 ml de solution de chlorure de fer III et mesurer les absorbances 465 nm. Ces solutions contiennent 4, 8, 12, 16, 20 mg d'azothydrate de sodium par litre. Les teneurs correspondantes par litre de vin sont : 1, 2, 3, 4, 5 mg. La courbe reprsentative de la variation des absorbances en fonction des concentrations est une droite passant par l'origine. 6.2.5. Calcul Reporter l'absorbance lue pour l'chantillon analyser sur la droite d'talonnage et relever la teneur en azothydrate de sodium en mg/1 de vin. BIBLIOGRAPHIE
Mthode par HPLC : SWARIN S.J. et WALDO R.A., J. Liquid. Chrom., 1982, 5 (4), 597-604. BATTAGLIA R. et MITISKA J., Z. Lebensm. Unters. Forsch., 1986, 182, 501-502. Mthode colorimtrique : CLERMONT S. et CHRTIEN D., F. V. 0. L V., 1977, n 627.
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