-'.

Fermentacin de caldo de t negro (Kombucha): Efectos de la concentracin de sacarosa y el tiempo de fermentacin sobre el rendimiento de la produccin de celulosa microbiana
Fermentation of black tea broth (Kombucha): Effects of sucrose concentration and fermentation time on the yield of microbial cellulose

40

Goh, WH, Rosma A, Kaur, B., Fazilah, A, Karim A. A. Y Rajeev Bhat '

RESUMEN
La produccin y propiedades de la celulosa generada a en este trabajo. El caldo un

partir de la fermentacin como Kombucha) de t negro se ferment

de caldo de t negro (conocido de manera natural durante

se investigaron

periodo de hasta 8 das en presencia de sacarosa. El caldo de t con una concentracin un rendimiento El espesor y el rendimiento de la celulosa bacteriana nal al crecer la proporcin Los cambios metablicas simbiticas ron relativamente de sacarosa de 90 g/l, gener bacteriana (66.9 %). de la celulosa bacteriana auLa produccin se elev de manera proporciorea superficial:profundidad. con actividades mayor de celulosa

mentaron con el tiempo de fermentacin.

en el pH se relacionaron

entre las levaduras y las bacterias en

cido acticas, y las cuentas de ambas en el t negro fuemayores que las que se encontraban Los descubrimientos y el rendimiento la capa de celulosa. dependen de este estudio de celulosa

sugieren que la produccin

de muchos factores que necesitan ser mejora-

dos para lograr un nivel mximo de ambos.

Divisin de Tecnologa de Alimentos, Escuela de Tecnologa Universidad Sains Mdlasia,1 1800-Ppnang. Malasid.

lndu-trial.

Palabras clave: Fermentacin

bacteriana,

t de Kombu-

cbe,

celulosa bacteriana.

ABSTRACT
The yield bacterial and properties fermentation were of cellulose in this produced (known The study. from as tea

of black naturally

tea broth

'" o '"
.Q

Kombucha)

investigated

E .9,'

broth was fermented concentration cellulose cellulose

over a period of up to 8

days in the presence of sucrose. Tea broth with a sucrose of 90 giL produced highest yield of bacterial time. The bacterial with (66.9 %). The thickness and yield of bacterial production increased metabolic correspondingly

cellulose increased with fermentation

increased surface area: depth ratio. Changes in pH were related to the symbiotic activities of yeasts and acetic acid bacteria, and the counts of both of these in the tea broths were relatively cellulose optimized Keywords: higher than those in the layer. Findings from this study suggest that the to achieve maximum Bacterial yield.

yield of cellulose depends on many factors that need to be

fermentation,

Kombucha

tea,

bacterial cellulose.

41
problemas tambin saludable tradicionalmenllevada a reumatismo des [6,12,31]. la kombucha relacionados con el envejecimiento. Adems, acta como laxante y es conocido en las articulaciones, Los beneficios se han reportado teraputicos por aliviar el de consumir la gota y las hemorroidesde el tener capacidade radicales libres y

INTRODUCCiN
La kombucha es una bebida

te consumida que proviene de la fermentacin, terias y levaduras), de t negro endulzado

cabo por el hongo de t (un asociacin simbitica de bac[12, 26, 35]. De origen chino, la kombucha se produce de forma tradicional en muchos hogares de Rusia y Ucrania va la fermentacin usando un hongo de t que se va pasando de casa en casa. La kombucha es una bebida refrescante que posee un sabor similar al de la sidra espumosa de manzana. Durante la fermentacin, el sabor de la kombucha cambia de ser agradable a tener un gusto amargo ligeramente espumoso, hasta un sabor parecido al del vinagre cuando se realiza una incubacin La kombucha prolongada [7, 33]. se ha consumido en muchos pases duransaludables se ha mostrado que gstrica, intesa de toxinas y a

des para la prdida de peso hasta la de curar el cncer y el SIDA [35]. La actividad antioxidante mente [20, 26]. La composicin microbiana del hongo de t ha sido bien bacterias acido actiquelante del t de kombucha se ha descrito reciente-

estudiada, y se sabe que cuenta con una relacin poderosamente simbitica. cas encontradas Las principales

te siglos y se han reportado varios beneficios [12, 15]. El consumo de la kombucha tiene efectos benficos tinal y glandular y se sobrepone en las actividades a la excrecin

Acetobacter xylinum, A. xylinoides, A. aceti, A. pasterianus y Bacterium g/uconicum [4, 23, 35]; mientras que las levaduras incluyen: Candida sp., Kloeckera sp., Schizosaccharomyces pombe, S. ludwigii, S. cerevisiae, Torulospora sp., Zygosaccharomyces bailii y especies de Pichia [28, 23, 35]. Mayser et al. (1995) reportaron que la composien el hongo de t incluyen: cin simbitica variaba dependiendo de las condiciones geogrficas y climticas, as como de las especies locales

a la arteriosclerosis,

la diabetes, al nerviosismo,

de levaduras y bacterias usadas. Se ha reportado simbiotas inhiben el crecimiento de contaminacin Los principales monosacridos, [4]. metabolitos que se obtienen de la kombucha

que los

tiempo de fermentacin influencia

hasta 21 das. Adicionalmente,

la

de-bacterias potenciales

de variables vitales, como el pH del sustrato y del producto, el volumen y la

las fuentes de carbono sobre el rendimiento as como los efectos del rea superficial, como subincluyen: profundidad sobre la produccin

de la celulosa bacteria-

productos de la fermentacin nas [25]. La celulosa

na tambin fueron investigados.

varios tipos de cidos orgnicos y vitamibacteriana cuenta con una amplia y en farmacutica, en alimentos

variedad de aplicaciones

MATERIALES
MATERIALES

Y MTODOS

debido a su alta pureza y a sus caractersticas fisicoqumicas nicas. Adems, la celulosa bacteriana encuentra uso y una amplia aplicacin puede ser utilizada. en donde la celulosa vegetal no de alimentos, la ce(por En la industria Se us t negro (Boh, Superior Cameron vo hongo de t de una fuente comercial utilizada celulosa delphia, por el cual se realiz este estudio fue que ocurren duen la fermenCONSERVACiN DE LA MUESTRA DE HONGO DE T

Highlands

Tea,

Malasia) como el sustrato para la fermentacin, como fuente de carbono microcristalina comercial

y se obtu-

lulosa bacteriana se ocupa como matriz alimentaria ejemplo, en nata de coco), como fibra diettica, te, estabilizante productos, incluyendo en aplicaciones

local. La sacarosa

espesan-

fue grado alimentario (MCC, Avicel, Philaen

y como enlazante en un amplio rango de bajas en grasa o

(Gula Prai, Malayan Sugar Mfg. Co. Bhd., Malasia). Se us PA, EUA) como compuesto de comparacin

sin grasa [21, 29].

los estudios de caracterizacin

de la celulosa. Todos los

< <
:::::::

El objetivo principal rante la produccin

qumicos

utilizados fueron grado HPLC o grado analtico.

para investigar los cambios bioqumicos

de celulosa microbiana

tacin esttica de un extracto natural de t negro. Ya que

La muestra de hongo de t se mantena en conservacin o se activaba cada dos semanas por el procedimiento Brevemente, un volumen conocido que describen Chen y Liu (2000), con algunas modificaciones. de agua destilada se hirvi antes de aadir sacarosa (70 g) y tres bolsitas (aprox.

la produccin

mxima de la celulosa bacteriana a partir prolongada sobre el rendimiento extendiendo el

42

del hongo de t toma un mnimo de 7 a 8 das, los efectos de la fermentacin de celulosa bacteriana se determinaron

6.00 g) de t negro. La mezcla se dej reposando durante 10 minutos. Despus de remover las bolsitas de t, el t negro endulzado se verti inmediatamente en un vaso. Despus de enfriarlo, el t se ajust a pH 2.7-3.0 usando cuando los

solo + el caldo de t). El rendimiento calcul como sigue:

de la celulosa

se

Peso Hmedo de Celulosa Bacteriana Rendimiento (%)

= ----------------

(g/L)

10 mL de cido actico al 50 % (v/v). La adicin de cido actico al inicio del proceso de fermentacin, la formacin de mohos y protegi cidos an no haban tenido tiempo de formarse, previno contra microorganislimpio, mas indeseables [14]. De acuerdo con Frank (1995), con el inters de mantener el proceso de fermentacin la acidificacin Finalmente, es absolutamente necesaria. de celulosa (3.0 %
CONTEO

Concentracin

de Sacarosa (giL)

DE BACTERIAS CIDO

ACTICAS Y LEVADURAS

Para determinar

el patrn de crecimiento

de bacterias ci-

do acticas y levaduras en el caldo de t y para comparar las cuentas viables de ambas en las pelculas de celulosa y en el caldo, se hizo un conteo de stas. Se tomaron de O, 2, 4 Y 8 el patrn alcuotas de 1 mL a intervalos das de fermentacin de crecimiento. La determinacin (PDA, Merck, del crecimiento de levaduras y bactede tiempo

fragmentos

de pelcula

p/v en base hmeda) y caldo (10 % v/v) de una muestra de hongo de t se aadieron al caldo de t fro. El vaso limpio que se ajust se llev y en la oscuse cubri con un papel absorbente a cabo a temperatura ambiente

con el fin de determinar

<

<
Z rias cido acticas se real iz usando agar papa-dextrosa Alemania) y agar glucosa-levadura-carboEl medio GYCA RU), 5 g nato de calcio (GYCA), respectivamente.

fuertemente con cinta adhesiva. La fermentacin (30 3C)

ridad. Se us 3 % (p/v en base hmeda) de hongo de t para inocular nuevas fermentaciones.

PREPARACiN DEL CALDO DE T PARA LA FERMENTACiN

consisti en 30 g de glucosa (Fisher Chemicals,

< <

Se prepar t endulzado siguiendo el mismo procedimiento usado para la conservacin del hongo de t previamente descrito, excepto por la concentracin traciones de sacarosa se escogieron experimentos preliminares celulosa producida de sacarosa, ya que segn resultados de la que se utiliz fue de 70, 90 Y 110 giL. Estas conceny segn el peso hmedo de la de 12 cm y altura de

43

en giL. Para realizar los experimentos

se us un vaso de 1 L (dimetro

15 cm) con un tapn de Tefln unido a la parte de abajo (2 cm desde la base) del vaso. Al rededor de 3 % (p/v en base hmeda) de fragmentos de pelcula celulsica % del t previamente anteriormente fermentado y 10 al a partir de la muestra 1 L de caldo de a

activada de hongo de t, se aadieron conteniendo

segundo vaso (duplicado) fermentacin

t; la mezcla se dej fermentando temperatura ambiente (30 3C).

8 das. El proceso de De la misma manera, de sacarosa durante se

esttica se llev a cabo en la oscuridad

se prepararon muestras control que consistan en 1 L de caldo de t con diferentes concentraciones pero sin la adicin del hongo de t y del t fermentado. Cada 24 horas se hacan muestreos por duplicado pes de acuerdo a la siguiente ecuacin: Peso de la celulosa bacteriana (g/l.) = (peso total del vaso conteniendo la celulosa y el caldo de t) - (peso del vaso un periodo de 8 das. La celulosa bacteriana producida

de 'extracto de levadura (Sigma, Gillingham, peptona (Merck, Alemania), (Sigma, Gillingham,

RU), 3 g de de calcio

La celulosa

bacteriana

generada se pes (base hmeda) da de fermentacin. y la profundidad de la celulosa Despus, el del medio de bacteriana se

10 g le carbonato

despus del octavo cultivo evalu.

RU), 20 g de agar (Merck, Alemania), RU) el cual se en autoclave, y

efecto del rea superficial sobre la produccin

30 mL de etanol al 95 % (R&M Chemicals, aadi hasta que el medio fue esterilizado agua destilada hasta un volumen Despus de realizar diluciones

final de 1 L [2].
EFECTO DE LA PROLONGACIN DEL PROCESO

en serie (preparadas con (0.1 mL)

DE FERMENTACIN SOBRE EL RENDIMIENTO DE CELULOSA BACTERIANA

agua peptonada estril al 0.1 %) se esparcieron croorganismos deseados. Para las pelculas

en cada uno de los dos medios para el conteo de los micelulsicas, estril al aproximadamente 8 de fermentacin. pus se homogeniz 20 g de muestra fue retirada slo el da 180 mL de agua peptonada en una mezcladora

Se prepar caldo de t con una concentracin a intervalos de 3 das iniciando cin y terminando prolongacin el vigsimo de la fermentacin

de sacarosa

de 90 giL en 7 vasos de 1 L. La celulosa bacteriana se pes al tercer da de fermentaprimer da. El efecto de la sobre el rendimiento de

0.1 % se aadi a la muestra de celulosa bacteriana y desWaring durante Las colonias se 9 minutos. La suspensin obtenida se us para contar las

la celulosa bacteriana se observ despus.

ANLISIS ESTADSTICO

bacterias cido acticas y las levaduras. contaron despus de que se incubaron madoras de colonia por mililitro comparacin

a 30C

por 3 das

Se real iz un anl isis de varianza usando el software SPSS 11.4 (SPSS, Ine. Chicago, IL, EUA) para comparar el efecto de la sacarosa y el tiempo de fermentacin dimiento de la celulosa microbiana. sobre el renSe us la prueba de deiS %.

[22]. El conteo de clulas se expres como unidades for(UFC!mL). Se realiz una de las cuentas de levaduras y bacterias ci-

do acticas en el caldo de t y en las pelculas de celulosa despus del octavo da de fermentacin.

DETERMINACIN DEL pH

diferencias mnimas significativas de Duncan para comparar los promedios

un nivel de significancia

44

El pH de las muestras se monitore potencimetro electrnico

diariamente

con un

RESULTADOS

Y DISCUSIN

(Cyberscan-2500

Eutech Insuna cantidad

INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIN DE SACAROSA SOBRE EL RENDIMIENTO DE CELULOSA BACTERIANA

truments, Singapur). Para tomar la medida, tratando de no interrumpir ya que perturbaciones formacin

conocida (5 mL) de las muestras se tom cuidadosamente el curso de la fermentacin, podran interrumpir la importantes

Casi todos

los microorganismos

vivos

requieren

una

de la capa de celulosa.

fuente de carbono para su crecimiento Adems, el carbono es un componente el protoplasma "madre" tancias que constituyen

y su metabolismo. de todas las sus[9]. De acuerdo (iniciador) de cede una fuente

EFECTO DEL REA SUPERFICIAL Y LA PROFUNDIDAD DEL MEDIO DE CULTIVO SOBRE LA PRODUCCIN DE CELULOSA BACTERIANA

con Frank (1995), el cultivo

lulosa bacteriana depende de la provisin de sacarosa de carbono (azcar, principalmente puede producir mismo. Anteriormente, celulosa en cantidades

Se prepar caldo de t con una concentracin

sacarosa), ya que no adecuadas por s los efec-

de 90 g/l, en contenedores con las siguientes dimensiones: a) Vaso de 100 mL (dimetro, d = 5 cm; altura, h = 5.1 cm; superficie de contacto, a = 78.4 cm") b) Vaso 500 mL (d = 10 cm; h = 6.4 cm; a = 78.5 crn-) c) Cilindro de medicin redondo de 1000 mL (d de 1500 mL (d 17 cm; h 17 cm; h = I = 17 6.6 cm; a = 29.2 cm") d) Contenedor e) Contenedor 6.6 cm; a = 227.0 cm-) rectangular de 700 mL (longitud, cm; ancho, w = 11.5 cm; h = 5.4 cm; a = 130.5 cm").

ya se haban estudiado concentraciones

tos de los azcares, como la sacarosa, lactosa, glucosa y fructosa a diferentes el metabolismo (50-150 g/L) sobre de del hongo de t y sobre la formacin preliminares bacteriana

etanol y cido lctico [31]. En el presente estudio, los resultados de nuestros experimentos que la concentracin t afecta la sntesis de la celulosa estos resultados son similares de 90 giL produjo el mayor revelaron (Tabla 1), Y de sacarosa presente en el caldo de a los que antes reportaron rendimiento (66.7
%) de

Masaoka et al. (1993). La sacarosa a una concentracin

celulosa; e incrementar gradual en el rendimiento. con una publicacin disminucin concentracin

la concentracin

de sacarosa de una disminucin va acorde por Embuscado conforme la

es posible, por lo que el pH juega un rol importante crecimiento microbiano y en la sntesis de celulosa

en el bac-

110 g/l, a 250 g/L dio como resultado anterior realizada

Este descubrimiento

teriana [34]. La Figura 1 muestra los cambios en el pH en los caldos de t fermentados a diferentes concentraciones de la fermentacin. y en los caldos de t control de sacarosa durante el curso

et al. (1994), en donde el uso de azcar result en una

en la produccin de celulosa de sacarosa aumentaba. Por tanto, se ne-

En general, los cambios del pH en los

cesita un nivel adecuado de azcar para una produccin ptima de celulosa bacteriana. Segn estos descubrimientos preliminares (Tabla 1), para nuestra investigacin se usaron concentraciones La concentracin nor rendimiento fermentacin de ms productos de sacarosa de 70, 90 Y 110 giL.

Figura 1. Cambios en los valores de pH para los caldos de t fermentados y el control con diferentes concentraciones de sacarosa durante el proceso de fermentacin. Caldo de t control 70 g/L Caldo de t control 90 g/l, Caldo de t control 110 g/L Caldo de t fermentado Caldo de t fermentado Caldo de t fermentado 70 g/L 90 g/l, 110 g/L

de sacarosa de 110 g/l, gener el mede celulosa bacteriana. durante La produccin el curso de la
3 2.95 2.9 .2.85 2.8 2.75 pH 2.7 2.65 2.6 2.55 -{

metablicos

cuando una cantidad

sustancial de azcar llevaran a una son de

*'

est presente en el sustrato puede expl icar este resultado, en donde ms productos inhibicin de producto las velocidades celulares crticos eliminacin equilibrar metablicos [14].Otra posible explicacin

desiguales en el transporte de materiales (nutrientes) y la tasa de utilizacin (2000), la tasa de dainas debe por tan-

los mismos. De acuerdo con Caldwell la produccin

de sustancias potencialmente

de celulosa bacteriana,

to, a mayor cantidad de sacarosa en el caldo de t, mayor es el impedimento para la sntesis de celulosa bacteriana.

--. --- ---.

O 2

'-......

CAMBIOS EN EL =H DURANTE LA SNTESIS DE CELULOSA BACTERIANA

2.5 2A5

,-7 8

45
9

De acuerdo con Madigan et al. (1997), cada microorganismo tiene un rango tpico de pH en el que su crecimiento

Tiempo (Das)

Tabla 1. Efecto de diferentes concentraciones Concentracin de sacarosa (giL) 50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250
'Los valores son los promedios de un triplicado significativas (p < 0.05),

de sacarosa sobre el rendimiento

de celulosa bacteriana despus de 8 das de fermentacin.

Peso hmedo de celulosa bacteriana 23.95'0.21 30.80b0.57 60.00' 0.28 29.55b0.92 24.25' 1.34 25.60' 1.56

(giL)

Rendimiento 47.9" 44.0' 66.7h 26.9" 18.7d 17.1d 15.0' 13Ab 12.0b 11.0ab 9.9'
presentan diferencias

2S.5S' 1.63 25A5' 1.63 25.30' 25AO' 24.85'

de mediciones.

1.56 1.98 lA8

Los promedios de una misma columna con diferente superndice

caldos de t fermentados con concentraciones disminuy gradualmente conforme

de sacarosa avan-

Con respecto al pH, conforme avanzaba con una concentracin es un indicador

una disminucin la fermentacin

gradual

ocurra

de 70, 90 Y 110 giL mostraron una_tendencia similar: el pH la fermentacin zaba. Estos resultados son coherentes con algunos descubrimientos anteriores [17, 11]. De acuerdo con Hwang et

en el caldo de t graduales en el pH

de sacarosa de hasta 90 giL. Este de celulosa bacteriana.

de que los cambios

tienden a aumentar la produccin reduccin

al. (1999), la conversin de glucosa en cido glucnico

result en una disminucin fermentacin. mas control no mostraron gura 1). Esta observacin significativa del pH durante la consistente (FiEn contraste, los valores de pH en los sisteuna tendencia sugiere que en ausencia del 10 y la inoculacin con el podra nunca ocurrir en los hubo un mayor

De acuerdo con Embuscado el al. (1994), se observa una en el pH del medio al final de la fermentacin; sta continuaba, la productividad de celulosa bacteriana se vea obstaculide sacarosa de 110 giL. Sede azcar tiende a disminuir introduce cony que bacteriano sin embargo, conforme de la generacin

zada con una concentracin con altas concentraciones drsticamente, diciones la produccin desfavorables

% del t previamente fermentado hongo de t, la fermentacin

gn Ishihara et al. (2002), el pH de un medio de cultivo lo que como consecuencia para el crecimiento de celulosa.

caldos de t control. Como consecuencia, que llevaron a cabo la fermentacin.

nmero de levaduras y colonias de bacterias cido acticas Como resultado, el

Se report anteriormente la fermentacin

<
Z

pH se mantiene oscilando en los caldos de t control. La adicin del hongo de t junto con el t previamente fermentado (10 %) no slo asegur un rpido comienzo [33], sino que tambin evit la forma-

la rpida cada del pH durante mentaba la produccin era principalmente

no aupero esto de

de celulosa bacteriana, [7,33].

debido al aumento en el contenido

cidos orgnicos como metabolitos

< <

de la fermentacin

cin de moho y lo protegi en contra de microorganismos indeseables [14]. Estas observaciones firmadas por Greenwalt fueron despus conet al. (2000), quienes reportaron el riesgo de que hubiera una microorganismo de

De acuerdo con el Manual de Bergey de Bacteriologa terminativa cimiento de Acetobacter el crecimiento un crecimiento

De-

[5], el pH ptimo que se requiere para el crespp. se encuentra entre 5.4 y 6.3; tambin puede darse a un pH de 4.0-4.5 y mnimo puede ocurrir a un pH de 7.0-8.0;

que al disminuir t previamente contaminacin

el pH del caldo de t con la adicin de fermentado, por parte de cualquier

46

sin embargo, los resultados del presente estudio indicaron que las bacterias cido acticas fueron capaces de crecer y producir celulosa a un pH

deterioro poda reducirse.

<

3.0. Esta discrepancia en los de la microflora

resultados puede deberse a la variabilidad

normal encontrada en diferentes hongos de t [11].

PERFILES DE LAS BACTERIAS CIDO ACTICAS Y LEVADURAS VIABLES EN EL CALDO DE T DURANTE LA SNTESIS DE CELULOSA BACTERIANA.

El hongo de t (celulosa bacteriana/cultivo

madre) es una y viabil idad

mezcla de cultivos compuestos por bacterias cido acticas y levaduras [7, 10], por tanto, la concentracin de cada una puede variar de lote a lote. Las bacterias cido acticas pueden sintetizar una red de celulosa flotante que mejora la asociacin formada entre bacterias y hongos [4], y las clulas de levaduras convierten sa y glucosa para generar etanol [31]. La Figura bacterias 2a muestra cido los cambios en las cuentas de la sacarosa en fructo-

acticas

para diferentes viables

concentracioaumentaron

nes de sacarosa durante En general,

el curso de la fermentacin. celular de bacterias

las cuentas de clulas

del da O al da 8. La concentracin

cido acticas en el caldo de t con 90 giL de sacarosa

aument de forma consistente tavo da de fermentacin. (1995), esta concentracin el crecimiento rido que cuando el cultivo,

con el tiempo hasta el ocpor Frank

apropiada para que las levaduras generaran nuevas clulas; adems se ha reportado [14] que cuando se les da a las levaduras cantidades adecuadas de nutrientes, nicamente se desarrollan pocos productos metablicos.

Segn lo reportado

de sacarosa es favorable para una cantidad ptima

de bacterias cido acticas y se ha sugeest disponible de nutrientes (caldo de t) para metabl icos Por tanto, las conen el t con una de bacterias

de azcar en la solucin se desarrollan

menos productos

durante el proceso de fermentacin. diciones ambientales concentracin tenido mucho cido acticas. gener el mayor de clulas viables rimento. que prevalecieron

Figura 2. Cambios en IdS cupntds rnirrobianas para (a) bacterias cido acticas y lb) para levaduras en los calcios de' t con diferentes concentraciones de sacarosd durante la fermentacin. Las bacterias v IdS levaduras 110 fueron detectables en los caldos de t control. Los datos son los promedios DE (n ~ 10).

de sacarosa de 90 giL puede no haber efecto sobre el crecimiento Como resultado, rendimiento de bacterias de celulosa. la sacarosa a 90 giL Las cuentas 50 (a)

11

Sacarosa Sacarosa Sacarosa

110 giL 90 giL 70 giL

cido acticas en el t

con sacarosa a 70 giL fueron Sin embargo,

las menores en este expecelulares de avanzaba conforme

~
::>

45

las concentraciones

40 U u.

bacterias cido acticas aumentaron la fermentacin de carbono

desde el da O hasta el da 8. En este lo suficiente insuficido acticas funbacteriana.

S ~

35 30 25 20 15 10 5
_DI

caso, el t con 70 giL de sacarosa provey para que las bacterias la poblacin cionaran apropiadamente, ciente para aumentar

~ r.r.

.!:2 cu -o cu

= ~ u

pero fue una cantidad

-;:

.-:

_-m--------------~

< <

3
La Figura 2b muestra los cambios observados en las cuentas de levaduras para diferentes concentraciones durante la fermentacin. de sacarosa Estos resultados son similares a y siguie-

~r
o

2
Tiempo

6
(Das)

de fermentacin

47

los de Chen y Liu (2000). Las cuentas de clulas viables aumentaron durante el curso de la fermentacin embargo, las concentraciones y el crecimiento fermentacin, producir ron la misma tendencia que las bacterias cido acticas. Sin celulares de levaduras fueron en general mayores que las de las bacterias cido acticas, de levaduras fue ms rpido que el que se las levaduras hidrolizaron la sacarosa a gludio para el caso de las bacterias. En la etapa inicial de la cosa o fructosa, las cuales fueron utilizadas despus para etanol y dixido de carbono [12, 15]. Segn lo reportado por Frank (1995), la actividad metabl ica de las bacterias cido acticas es menor que la de las levaduras porque la fuente de nutrientes de las bacterias tena que ser inicialmente utilizada y producida por las levaduras. Por ejemplo, las bacterias cido acticas en el caldo de t con una concentracin estado desnutridas, en degeneracin, de sacarosa de 70 giL pudieron haber exhaustas y famlicas, lo que result pero no formar nuevas c-

(b)
140 120
~ 11 Sacarosa Sacarosa Sacarosa

110 giL 90 giL 70 giL

~
U 100
u.

::> "O

.!:2

~ ~ cr.

80 60

= ~ u
-o

'"

2
Tiempo

4'

6
(Das)

de fermentacin

por lo que slo podan llevar a cabo su Para una concentracin las concentraciones de sacarosa en el t de 110 g/L. y de levaduras aumentalas sin embargo,

trabajo normal de fermentacin

lulas suficientes [14]. Las cuentas de levaduras viables en el caldo de t con 90 giL de sacarosa aumentaron conforme la fermentacin lo hizo. Al igual que las bacterias cido acticas, la fuente de carbono provista por 90 giL de sacarosa fue

celulares

ron del da O al da 4 de fermentacin;

cuentas viables de levaduras disminuyeron

para el da 8.

Segn lo que propone acumulacin

Caldwell

(2000),

cuando

se les la sin im-

a la acumulacin micrografas

de sustancias inhibitorias bacteriana

[9]. Como rese retras. Las

provee a los microorganismos portancia fisiolgica

un exceso de nutrientes,

sultado, la sntesis de celulosa 3) muestran la distribucin

resultante de sustancias inhibidoras suprime el crecimiento

realizadas por escaneo de electrones (Figura general de las bacterias y leva-

de levaduras.

Por tanto, la sacarosa a 110 giL dio el menor rendimiento

...... o ......

duras en la matriz de la celulosa bacteriana.

Figura 3. Micrografia de escaneo de electrones de (al bacterias cido acticas (ampliacin: 3,000 x) y (b) levaduras (ampliacin: celulosa 1,000 x) embebidas dentro de la red de celulosa.

de celulosa bacteriana .
PERFILES DE LAS BACTERIAS CIDO ACTICAS Y LAS LEVADURAS VIABLES EN LAS PELCULAS DE CELULOSA BACTERIANA

'" 15
.S! u

(a)
en la red de celulosa [1]. Por tanto, este estu-

La distribucin

de microorganismos

bacteriana es altamente compleja

dio se llev a cabo para investigar las cuentas de clulas viables tanto de las bacterias cido acticas como de las levaduras, en la celulosa bacteriana producida dos de t con diferentes concentraciones tipos de microorganismos celulosa bacteriana, cin. Las concentraciones embebidos en los calde sacarosa. La

Tabla 2 muestra las cuentas de clulas viables de ambos en las pelculas de obtenidas el da ocho de fermentacelulares de levaduras fueron por

en general ms altas que las de las bacterias cido acticas. Estos resultados son similares a los reportados Chen y Liu (2000). La celulosa bacteriana obtenida a partir

del caldo de t con 90 giL de sacarosa, fue la que tuvo el mayor nmero tanto de levaduras como de bacterias cido acticas. Ya que el nmero de ambos microorganismos aument consistentemente durante todo el curso de la ferde sustancias
EFECTO DEL REA SUPERFICIAL Y LA PROFUNDIDAD DEL MEDIO DE CULTIVO SOBRE LA PRODUCCiN DE

48

mentacin en el medio con fuentes de carbono ptimas, y que adems estaba libre de la acumulacin txicas, la sntesis de celulosa bacteriana fue mejor. Las cuentas de levaduras y bacterias cido acticas viables en la pel cu la de cel u losa bacteriana generada a parti r del caldo de t con 110 giL de sacarosa fueron bajas. Segn se explic anteriormente, exceso de nutrientes fue el menos favorecido ello, conforme la fermentacin proceda, las ms este ambiente con tanto para

CELULOSA BACTERIANA

De acuerdo con Iguchi et al. (2000), en un cultivo esttico la celulosa bacteriana se forma en la interface aire-lquido, ya que las bacterias aerbicas producen las inmediaciones te investigacin de la superficie. celulosa slo en Por tanto, la presen-

las levaduras como para las bacterias cido acticas. Por el crecimiento debido de ambos microorganismos se vio obstaculizado

se real iz para ver la infl uencia del rea del medio de cultivo en la for-

superficial y la profundidad

macin de pelculas de celulosa.

Tabla 2. Cuentas de bacterias cido acticas y de levaduras de celulosa bacteriana obtenidas el octavo da de fermentacin'.

Sacarosa
70 90 110
'Los valores son los promedios de un triplicado significativas (p < 0.05),

Bacterias cido acticas (xl0' UFClmL)

15.80 0.84
b

Levaduras (xl0 UFClmL)

17.60b1.14 36.00' 1.58 15040' l. 14
presentan diferencias

23AO'2.70 14.60' 1 14
de mediciones. Los promedios de una misma columna con diferente superndice

Segn Frank (1995), cuando el cultivo teriana flota en la superficie, hasta que la superficie capa ms superficial teriana producida primero de la solucin

de celulosa

bac-

medio. A estas profundidades, men mayor de medio de cultivo la formacin

los cultivos produjeron

con un volums celulosa de 34.2 cm, inclu-

crece hacia afuera se cubre por com-

bacteriana. Sin embargo, a una profundidad so con un volumen contraron

pleto; despus de esto, aumenta en espesor. As pues, la siempre se considera que es la ms de celulosa baccon diferentes volmenes nueva. La Tabla 3 muestra la cantidad en cultivos y reas superficiales;

de celulosa fue muy baja (21.3 gil),

de 1000 mL. Estos datos concuerdan

con los reportados por Okiyama que un contenedor

et al. (1992), quienes enen columna slo dixi[32] y mayor el Estos resul-

profundo

segn lo observado,

la produccin del hongo de t que se tenga

generaba una pequea cantidad de celulosa. do de carbono,

de celulosa bacteriana aument con el aumento del rea superficial. Ya que el proceso metablico cuidado de asegurar un suministro depende del aire fresco, es muy importante

tados pueden expl icarse as: las clulas producen el cual es atrapado en la pelcula sea el medio de cultivo, mientras ms profundo cantidad de dixido crecimiento

suficiente de oxgeno. muestran que el

de carbono se acumula en la pelcude pelcula se inhiben debido

la. Cuando el interior de la pelcula es menos aerbico, Los resultados de la Tabla 3 claramente contenedor de contacto (227.0 cm") produjo lulosa bacteriana (104.8 gil). contenedor cilindro y la formacin redondo de 1500 mL con la mayor superficie la mayor cantidad de cePara concluir, el rea superficial del cultivo (proporcin Seguido de ste, estuvo el a que las bacterias cido acticas son aerobias estrictas.

del rea

rectangular con un rea de contacto de 130.5

supericial:profundidad) la produccin utilizado

jug un papel impor-

crn-. misma que gener 66.9 giL de celulosa bacteriana. El de 1000 mL con un rea de 29.2 cm? rindi nien la formacin Made ceque el volumen camente 21 .3 giL de cel u losa bacteriana. Por tanto, el rea superficial jug un papel ms significativo de celulosa que el volumen saoka et al. (1993) tambin del cultivo no tena influencia bacteriana continua propusieron del medio de cultivo. sobre la produccin

tante en la formacin de celulosa. Por tanto, para aumentar de celulosa bacteriana, el medio de cultivo tendra que ser superficial con una apertura para la fermentacin

y tendra que ocurrir en un contenedor muy amplia.

z
EFECTO DE LA PROLONGACiN DE LA FERMENTACiN SOBRE EL RENDIMIENTO DE CELULOSA BACTERIANA

lulosa; ellos tambin reportaron que una capa de celulosa no logra formarse en un recipiente con las paredes cnicas, como por ejemplo en un matraz. El efecto de la profundidad produccin del medio de cultivo sobre la

49

Para estudiar la productividad rante la fermentacin

de la celulosa bacteriana duse midi el rendimiento

prolongada

de la celulosa generada por el caldo de t con 90 giL de sacarosa durante un periodo de 21 das de fermentacin. La Figura 4a muestra los cambios en el espesor de la pelcula de celulosa conforme progresaba la fermentacin; otro lado, la Figura 4b muestra el rendimiento losa bacteriana mientras la fermentacin 21 das. Ambos, el espesor y el rendimiento bacteriana, aumentaron con el tiempo continuaba por por de la celu-

de celulosa bacteriana se examin fermentancon diferentes volde celulosa. Cuando no era ampliamente del volumen del La Tabla 3 muestra la influencia

do el hongo de t en contenedores menes y profundidades. de la profundidad la profundidad de celulosa en la produccin

del medio de cultivo dependa principalmente

diferente (por ejemplo,

5.1 cm a 6.6 cm), la produccin

de la celulosa

de fermentacin.

Tabla 3. Eecto del rea superficial Y la proundidad

sobre la produccin

de celulosa bacteriana-.

Profundidad (cm)
5.1 34.2 6.4 5.4 6.6

rea superficial (cm2)

19.60 29,20 78,50 130.50 227.00

Relacin rea superficial:profundidad

3,80 0,90 12,30 24,20 34.40

(cm)

I
I

Peso hmedo de la pelcula (gil)

7,00' 21.30b

41.00' 66.90d 104,80'

presentan diferencias

1 i

'Los valores son los promedios de un triplicado significativas (p < 0,05),

de mediciones,

Los promedios de una misma columna con diferente superindice

El rendimiento duccin

de celulosa

aument

progresivamente con una proper-

Se han observado

perfiles similares en experimentos

rea-

durante todo el curso de la fermentacin,

lizados por otros investigadores que el espesor y el rendimiento muchsimo la formacin alcanz un mximo

[8, 27]. Ellos reportaron de la celulosa aument de por

mxima de 199.3 giL Y con un espesor de 20 De acuerdo y

mm despus de 18 das (Figura 4b); la produccin maneci constante a partir de ese momento. de fermentacin los metabolitos

despus de pocos das hasta que la velocidad tras de 2 semanas. El mecanismo ha sido descrito a detalle de celulosa

con Frank (1995), este patrn se dio porque al da 17-18 la glucosa en reserva casi se termin haban alcanzado su mxima produccin.

Yamanaka et al. (1989) y por Yoshinaga et al. (1997). En la etapa inicial, la bacteria aumenta su poblacin y produce usando el oxgeno disuelto cierta cantidad de celuloslo las bacterias su actividad en la regin pero alcanza

Por tanto, slo se observ un aumento en el rendimiento de la celulosa bacteriana de 2.5 %.

Figura 4. Cambios en (a) el espesor)' (b) el rendimiento de celulosa bacteriana durante la prolongacin de la fermentacin de los caldos de t por un periodo de 21 das.

sa en la fase lquida,

segn se observa por la turbidez. pueden mantener

Cuando se termina el oxgeno disuelto, cercanas a la superficie para producir superficial lizar una divisin (a)
25

celulosa. Aunque

las bacterias pueden rea-

celular rpida, la poblacin

no aumenta exponencialmente, de equilibrio

1-.
-l

cierto nmero
Celulosa bacteriana

ya que la mayora de ellas

estn ocluidas en la pelcula de celulosa y son llevadas al fondo. Aquellas bacterias debajo de la superficie no estn muertas sino dormidas, por lo que pueden ser reactivadas [37]. y usadas como semilla para un nuevo cultivo

20

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15

o ..,
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U.I

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Q.

10

CONCLUSIONES
Los resultados del presente estudio demostraron que se

50

logr producir celulosa bacteriana durante un proceso esttico de fermentacin 8 das. La concentracin

del t negro durante un periodo de

de sacarosa, que fue usada como influy de manera importande celulosa. Los viables (de bacterias de celulosa metacon la actividad

O O 5 10 15 (Das) 20

fuente principal
Tiempo de fermentacin

de carbono,

te en el rendimiento

de la produccin

perfiles de las cuentas microbianas bacteriana, revelaron fueron su relacin

(b)
250 ---k200 Celulosa bacteriana

cido acticas y levaduras) con la produccin blica simbitica, t fermentados

en donde las cuentas en los caldos de relativamente mayores que aqu-

llos en la capa de celulosa. Tomado de: Intemational Food Research tournsl.

150

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O O 5 10 15 (Das) 20 Tiempo de fermentacin