Terapia gnica en el tratamiento de fibrosis qustica Resumen La fibrosis qustica (FQ) es una enfermedad gentica, hereditaria, autosmica y recesiva

de las glndulas mucosas y sudorparas que afecta principalmente los pulmones. La FQ se trata de un defecto en el gen CFTR; responsable de dicha enfermedad. El gen CFTR codifica la sntesis de una protena transportadora de iones cloruro (Cl-). En pacientes con FQ, el gen CFTR no est presente o en cantidades mnimas. Debido a esto, ocurre una falla en el transporte de los iones cloruro a travs de smosis resultando en escasez de molculas de agua en las clulas y una produccin anormal y excesiva de mucosa.La terapia gnica es particularmente efectiva en desrdenes monognicos tales como la FQ por lo que est enfermedad puede ser tratada con la insercin de un gen normal para sustituir a uno anormal. La terapia gnica presenta dos mtodos sistemticos, la transferencia in vivo y ex vivo. Esta ltima no es la ms indicada para tratar la FQ debido al sistema complejo de ductos en el sistema respiratorio. La FQ es candidata a tratamiento pulmonar por terapia gnica in vivo a travs de mtodos virales y no virales tales como complejos ADNliposoma y adenovirus. Cada uno de estos involucra nuevos hallazgos, progresos, ventajas y desventajas de su uso en pacientes con FQ.

Introduccin

En 1972, Friedmann y Roblin publican un artculo titulado "Terapia gnica para enfermedades genticas humanas?" en el cual citan a Rogers S. por proponer que se usase ADN exgeno sano para reemplazar ADN defectuoso individuos que sufrieran de un defecto gentico o enfermedad gentica (Medical News Online, s.f.). Con esta idea comenz la travesa de la terapia gnica, al insertar genes normales en anormales para tratar o prevenir enfermedades. Adems, se descubri que el agente de transferencia de genes (GTA, por sus siglas en ingls) se tiene que elegir cuidadosamente segn el tipo de la clula objetivo y la enfermedad presentada. La terapia gnica es principalmente una alternativa para enfermedades monognicas que actualmente no tienen opciones de tratamiento

satisfactorias. La FQ cumple con estos criterios, por lo que es apta para el tratamiento con fibrosis qustica (Middleton & Alton, 1998).Se esperaba la terapia gnica FQ progresara rpidamente debido a la facilidad del acceso no invasivo a los pulmones mediante aerosoles. Sin embargo, la entrega del gen a las clulas blanco permanece hoy en da una tarea difcil (Williams-Jones, 2012). La FQ es una enfermedad hereditaria autosmica recesiva de las glndulas mucosas y sudorparas que afecta principalmente los pulmones. El responsable de la FQ es el gen CFTR (acrnimo del ingls Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator o regulador de la conductancia transmembrana de la FQ), est localizado en el brazo largo del cromosoma 7 y fue uno de los primeros en ser localizado (1989) y secuenciado por mapeo gentico. El gen CFTR codifica la sntesis de una protena integrada por 1.480 aminocidos que transporta iones cloruro (Cl-) a travs de las clulas epiteliales y que al mismo tiempo controla la regulacin de otros transportadores (Barret et al, 2012). En las personas con FQ, el gen CFTR est ausente o bien se encuentra en proporciones sensiblemente menores a las habituales. Debido a que el agua sigue por smosis a los iones cloruro, la ausencia de Cl por la falla en su transporte da como resultado una replecin agua y la produccin anormal de moco viscoso. El moco obstruye los pulmones, causando problemas respiratorios y facilitando el crecimiento bacteriano. Eso puede conducir a problemas como infecciones pulmonares repetidas y daos pulmonares. (MedlinePlus, S.f.). La terapia gnica en pacientes con FQ pretende corregir el gen afectado dentro de las clulas a travs de medios virales y/o no virales; teniendo como objetivo corregir del 6% al 10% de las clulas para que la secrecin de Cl se vea reflejada(Middleton & Alton, 1998).

Transferencia de genes in vivo y ex vivo

La terapia gnica incluye dos mtodos generales de transferencia de genes; in vivo y ex vivo. La terapia gnica ex vivo implica obtener clulas del organismo generalmente de la mdula sea; estas mismas son cultivadas en un medio estril, transfiriendose el gen de manera in vitro. Las clulas modificadas con el gen a transferir son regresadas a tejidos especficos del paciente. Sin embargo, debido a la estructura compleja de ductos en el

sistema respiratorio, la estrategia ex vivo no es la ms indicada para la FQ (Middleton & Alton, 1998). Por el otro lado se tiene una terapia gnica in vivo la cual implica transferir el gen con un sistema viral o no viral. En ambos sistemas se tiene un ADN plsmido conformado de tres partes: el ADN complementario (cADN) y los segmentos 5 y 3 del ADN. El segmento 5 es un promotor de secuencia, es decir, regula la transcripcin del gen introducido mientras que el segmento 3 influye en la separacin del RNA y en los procesos post-translacionales (Middleton & Alton, 1998). Se ha demostrado que se pueden transportar copias del gen CFTR cultivadas in vitro y administradas a travs de los ductos respiratorios tales como cavidades nasales o bronquiales, ya sea por sistemas adenovirales, liposomas o complejos liposoma-ADN, sin embargo, cada mtodo de terapia gnica posee resultados pero con un gran nmero de limitaciones, por lo tanto, se necesita evaluar cada sistema gnico para asegurar un tratamiento seguro para el paciente (Middleton & Alton, 1998).

Vectores virales

La aplicacin de vectores virales comienza poco tiempo despus de la clonacin del gen CFTR en 1989 (Griesenbach & Alton, , 2011). Por definicin, los adenovirus son dobles hebras de ADN que al adherirse a la clula a travs de receptores de protenas sobre sta misma, forma un endosoma que explota dentro de la clula y se desplaza por el citoplasma hasta el ncleo. (Middleton & Alton, 1998). Los adenovirus fueron los primeros virus en ser estudiados, obteniendo resultados alentadores en tejidos pulmonares y nasales en pruebas pre-clnicas. Sin embargo, la ausencia de receptores de adenovirus en la superficie de las clulas epiteliales de las vas respiratorias disminuye considerablemente la eficacia de la transfeccin (Griesenbach et al., 2004). Aunado a esto, el uso de adenovirus est limitado debido a la accin de los macrfagos y la respuesta inmunolgica humoral. De hecho, tras la aplicacin trimestral de adenovirus con CFTR en pacientes con FQ, se demostr que tras la tercera dosis, ya no se reconoca el ARNm del gen CFTR (Harvey et al., 2002). Por lo tanto, el uso de vectores adenovirales est limitado debido a una baja tasa de transfeccin y la incapacidad de ser aplicado repetitivamente en forma de tratamiento.

A diferencia de los adenovirus, los virus adeno-asociados se caracterizan por tener una mayor evasin del sistema inmune y una larga duracin de expresin. Se ha propuesto que este virus no infecta clulas dendrticas presentadoras de antgenos; por lo que no activa la respuesta humoral. Adems, se han realizado pruebas clnicas en pacientes con FQ usando el vector AAV-CFTR de AmpliPhi, el cual est basado en el virus AAV2. Este vector se caracteriza por contener por completo el ADN complementario del gen CFTR. Desafortunadamente, los vectores adeno-asociados cuentan con una baja capacidad de almacenamiento (menos de 5 kb), por lo que no es posible aadir otros elementos (Griesenbach et al., 2004). Sin embargo, se han desarrollado tcnicas como el trans-splicing y la recombinacin homloga para superar este problema, el cual consiste en dividir el ADNc y los elementos reguladores requeridos para despus empaquetarlos en dos virus, los cuales, al ser introducidos a la misma clula, son recombinados para generar el gen inicial. Se podra esperar una disminucin en la transfeccin pero tras realizarse experimentos en ratones, se encontr una diferencia mnima (Halbert et al., 2002). Hay una amplia variedad de isoformas de los virus adeno-asociados, siendo los virus del tipo AAV5 y AAV6 los que presentan una cpside que penetra ms eficientemente las clulas epiteliales. Sin embargo, estos tipos muestran un rendimiento menor que el tipo AAV2. Recientemente se revel la estructura atmica de la cpside AAV2, por lo que puede esperarse una mayor comprensin de los virus que permita la ingeniera de cpsides especializadas (Aslanidi et al., 2013). Los virus ARN negativos son otros posibles vectores en esta terapia. Los virus tipo 1 de la parainfluenza murina o virus Sendai, el virus sincitial respiratorio (VSR) y el virus tipo 3 de la parainfluenza humana han demostrado una transfeccin efectiva en la membrana apical de las clulas epiteliales mediante el uso de cido silico y colesterol; los cuales son expresados abundantemente en la superficie apical de estas clulas (Ferrari et al., 2003). Estos virus tienen un genoma negativo y se replican en el citoplasma. No necesitan un ADN intermediario y no entran en el ncleo (Griesenbach et al., 2004).

Vectores no virales

Los vectores no virales presentan ciertas ventajas sobre los virales, como una baja inmunogenicidad y produccin a gran escala. A su vez, existen tambin desventajas, tales

como un bajo nivel de transfeccin y mala expresin del gen (Pringle et al., 2009) Algunos vectores no virales incluyen una mezcla sinttica de liposomas catinicos y neutros que forman de manera espontnea vesculas que se adhieren al ADN cargado positivamente. Estudios recientes demuestran que la mezcla liposmica no simplemente se adhiere al ADN por atraccin de cargas opuestas, sino que estas mismas envuelven al ADN y lo colapsan en resortes compactados formando un complejo llamado ADN-liposoma (Middleton & Alton, 1998). El complejo GL67A es el nico ATG no viral de los lpidos catinicos que se ha propagado correctamente por el aire hacia los pulmones de los pacientes en la fase I de ensayos clnicos. A los pacientes, se les detect el vector derivado de ARNm del transgn en cuatro de nueve muestras extradas mediante broncoscopia. Recientemente, una clnica en Reino Unido ha iniciado un estudio para evaluar el rendimiento del GL67A en unin con plsmidos libres de sitios CpG. Muchos grupos de investigacin han modificado poliplejos, como la polilisina y la polietilenimina (PEI) mediante la adicin de azcares, tomando en cuenta que las clulas epiteliales expresan lectinas que posteriormente se enlazan con los carbohidratos para formar glicoconjugados (Pringle et al., 2009). Se ha demostrado que glicoconjugados con lactosa han sido eficientes en cultivos celulares pero su eficacia in vivo queda por comprobarse. Por ejemplo, el uso de clulas cultivadas de cloroquina, combinadas con el pptido E5CA, dio como resultado el aumento de la transferencia del complejo de polilisina lactosilada 10.000 veces en comparacin con la transferencia sin aditivos (Kollen et. al., 1999).Tambin existen nanopartculas que pueden fungir como vectores, tal como la molcula de un plsmido, compactada con polilisina sustituida con polietilenglicol, de apenas 12-15 nm de dimetro. Esta nanopartcula se aplic a 12 individuos para estudios de salud, obteniendo una modificacin parcial del canal de cloro en 7 de ellos (Griesenbach et al., 2004). A su vez, otros grupos se enfocan en optimizar los plsmidos como vectores de transferencia. Se ha demostrado que la reduccin de los sitios CpG en el ADN de los plsmidos ayuda a reducir la respuesta inmunolgica. Se observaron menos cambios en parmetros de toxicidad en la sangre y niveles reducidos de citosinas inflamatorias tras una reduccin del 80% de estos sitios en el ADN (Yew et al., 2000). Debido a que estos

vectores no virales tienen una baja eficacia en la transfeccin, se estn desarrollando tcnicas fsicas como electroporacin, magnetismo y ultrasonido para aumentar los mecanismos de transferencia (Griesenbach et al., 2004). De igual forma, la transferencia de complejos de polilisina con cloroquina aadidos al medio de transfeccin arroj un 20% de eficacia en la transfeccin del gen, pero cuando la cloroquina se combin con glicerol el porcentaje de eficacia aument en un 70% de lo reportado por estudios en los vectores virales (Kollen et. al., 1999).

Conclusin

A pesar de que se diseen nuevos vectores virales y no virales constantemente, el mayor obstculo es la readministracin, que es un requisito para tratar la FQ siendo esta una enfermedad crnica que necesita de un tratamiento prolongado. Por el otro lado, en los vectores no virales el problema reside en la eficacia de los mismos. En cuanto a nuevas vertientes, se tienen expectativas sobre la adicin de energa fsica (magnetofeccin y sonoporacin) para la transferencia de genes de pulmn. Asimismo, nuevos diseos de plsmidos promotores de larga duracin, optimizador de codones, entre otros, marcan un progreso hacia estudios clnicos. A su vez, el mecanismo de cmo un plsmido de ADN es tomado por las clulas epiteliales principales y el movimiento a travs del citoplasma hacia el ncleo deben ser estudiados ms a fondo. Igualmente, se debe estudiar la funcin de la circulacin de clulas madre para la repoblacin del pulmn, as como la identificacin de clulas madre residentes (Griesenbach et al, 2006). Los estudios en cada uno de los sistemas para transferencia gnica arrojan datos en los que es posible transferir genes al tejido epitelial de los ductos respiratorios para corregir y tratar la FQ. Cada sistema de transferencia tiene su nivel de eficiencia, al igual que ventajas, desventajas, riesgos y dudas. Es por este ltimo que nuevas formas de transferencia gnica tienen que ser mejoradas e implementadas en estudios clnicos en pacientes con FQ (Middleton & Alton, 1998).

Referencias:

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