PRACTICA N 1 Determinacin de aminocidos terminales con grupo alfa amino libre Mtodo de Sanger.

Gutirrez Gutirrez Joab Yosafat Nava Rodrguez Mario Eduardo Grupo: 4QM2 Seccin: 3 Laboratorio: 5

INTRODUCCIN Este mtodo consiste en la degradacin repetitiva de los pptidos a partir de una reaccin con el grupo amino terminal libre y con fenilisotiocianato (PITC) en condiciones alcalinas suaves formando feniltiocarbamilo, el producto es entonces tratado con cido fluorhdrico para liberar el aminocido que ha reaccionado del resto de la cadena peptdica mediante la formacin de un derivado de tiazolinona, el cual es convertido a un derivado ms estable (un aminocido PHT) por la adicin de TFA. Como consecuencia el pptido tiene ahora un nuevo residuo amino terminal listo para repetir el ciclo. La identificacin de los PHTaminocidos es usualmente llevada a cabo por RPHPLC. Los pptidos que ya han sido liberados de la columna y que son analizados por esta metodologa no presentan ninguna consideracin especial, no as cuando el pptido analizado aun se encuentra adherido a la columna. Debido a que este mtodo requiere del grupo amino libre, los grupos protectores utilizados en la sntesis para proteger al -amino deben ser removidos o de otra forma no ser posible analizar el pptido sintetizado mediante la degradacin de Edman. Con respecto a los grupos protectores de las cadenas laterales, stas slo tendrn un efecto durante la identificacin del aminocido, ya que los grupos protectores tienden a hacer las cadenas laterales ms hidrofbicas; por la tanto el gradiente utilizado para eluir los PTH-aminocidos en RP-HPLC deben extenderse, aunque esto no sucede si tales grupos protectores son derivados de Boc, pues los aminocidos sern desprotegidos por el uso de TFA durante la fase final. Los residuos de cistena no pueden ser detectados por este mtodo a menos que sean modificados, usualmente se utiliza acrilamida o bromopropilamina para derivatizarlos. Cuando el anlisis es hecho en la resina, estos residuos pueden ser muy problemticos, pues muchos de los

grupos protectores utilizados para cistena durante la sntesis no son estables a la qumica de Edman. La glutamina se cicla en condiciones cidas para formar una estructura de piroglutamato, lo que hace que el pptido sea bloqueado y el anlisis de la secuencia no pueda llevarse a cabo. OBJETIVO Utilizar el mtodo de Sanger para identificar los aminocidos que contienen el grupo alfa-amino terminal de las cadenas de la molcula de hemoglobina. RESULTADOS Calcular Rf Distancia recorrida de Fase mvil = 17cm Distancia recorrida del producto= 31.5cm Compuesto DNP-ALA DNP-GLU DNP-VAL DNP-PHE Frmula PROBLEMA 0.52 0.92 Rf 0.66 0.79 0.74 0.65

DNFB

0.53

Sustitucin

Rf = 0.52

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El mtodo de Sanger es tardado, laborioso y adems solo podemos determinar el aminocido terminal. CONCLUSIN Se llevo a cabo el mtodo de Sanger para determinar el aminocido terminal de la cadena de la hemoglobina, aunque tericamente se sabe que es la Valina no pudimos comprobarlo debido a la gran cantidad de contaminantes que posea nuestro problema. PREGUNTAS EXTRAS Cul fue la protena que utilizo Sanger? Insulina Fig.1.1 Esquema de la Cromatografa en papel ANLISIS DE RESULTADOS En el esquema de la cromatografa podemos observar que los patrones de los aminocidos se ven con una sola banda a cierta distancia, en el problema se observan 2 bandas una a nivel del DNFB y otra ms arriba de los patrones de los aminocidos. DISCUSIN DE RESULTADOS La Valina es el aminocido terminal de las 4 cadenas de aminocidos que posee la hemoglobina, tericamente el aminocido problema que debimos observar en la cromatografa, debi de haber sido la Valina pero comparando el Rf de la primera franja de nuestro problema no concuerda con el Rf de la Valina patrn, esta tiene una correlacin mayor con el Rf del DNFB lo cual nos dice que existe contaminante del DNFB, esto podra deberse a que la extraccin con el ter no fue tan satisfactoria, se encuentra una segunda banda a un Rf mayor al de los patrones esto podr deberse a otro contaminante en el problema. Diferencias con el mtodo de Edman El mtodo de Edman se diferencia de el mtodo de Sanger por el uso de diferentes reactivos y en base a eso el mtodo de Edman logra reaccionar con el grupo amino terminar y el reactivo de Edman puede seguir reaccionando con el prximo grupo amino terminal del aminocido siguiente y as hasta terminar con el pptido o protena, en caso de Sanger solo se puede determinar el grupo amino terminal de el pptido. Por qu no se utiliza NaOH? No se utiliza el NaOH porque al reaccionar con el reactivo de Sanger el hidrxido es demasiado bsico y por lo tanto solo se llevara acabo una sustitucin del Flor del compuesto por el ion hidroxilo. BIBLIOGRAFA

GRANT Gregory A., Crankshaw Mark W., Gorka John.; Edman sequencing as tool for characterization of syntretic peptides. Methods in Enzimology. (1997). Pags. 289:395414