Ctedra de Quimica Biolgica Facultad de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales Universidad Nacional de Crdoba

DOCENTES
Profesora Titular: Profesores Adjuntos: Dra Mara Anglica Perillo (Inv. Principal CONICET)) Dr. Daniel A. Garca (Inv.Adjunto CONICET) Dr. Ral H. Marn (Inv.Independiente CONICET) Profesores Asistentes Dra. Dolores Carrer (Inv. Asistente CONICET) Dra. Jackelyn M. Kembro (Investigadora Asistente CONICET) Dra. Vernica Nolan (Inv. Asistente CONICET) Dra. Julieta Mara Sanchez (Inv. Asistente CONICET) Dra. Anahi del V. Turina (Inv. Asistente CONICET) Dr. Eduardo M. Clop (Becario posdoctoral CONICET) Dra. Mariela E. Snchez (Becaria postdoctoral CONICET) Bil. Benjamn Caruso (Becario doctoral CONICET) Colaboradores Bil. Pedro D.Clop (Becario doctoral Foncyt) Bil. Gabriela Reiner (Becaria doctoral CONICET) Bil. Natalia Corvalan (Becaria doctoral CONICET) Ayudante Bil. Nicols Nazar (Becario doctoral CONICET)

PROGRAMA ANALTICO DE QUMICA BIOLGICA.

1. La lgica molecular de la vida Diversidad biolgica y unidad bioqumica. Generalidades sobre metabolismo celular. Obtencin, almacenamiento, liberacin y utilizacin de la energa. Ubicacin subcelular de la actividad metablica; fraccionamiento subcelular por centrifugacin diferencial. Macromolculas y ensambles supramoleculares: caracterizacin; papel del agua, efecto hidrofbico e importancia de las interacciones dbiles (puente de hidrgeno, van del Waals) en su estructura y funcin. Propiedades coligativas de disoluciones acuosas. Superpoblacin molecular: efectos sobre la actividad del agua y sobre la actividad y difusin de los solutos. 2. Evolucin Bioqumica Composicin qumica de la materia viva. Evolucin prebitica. Ribozimas. Evolucin: desde la informacin unidimensional de la secuencia (ADN) a la informacin tridimensional de la funcin (protena). Transferencia de informacin biolgica a nivel molecular (ADN- ARN- Protena; gradientes de carga y de materia) y de la dinmica estructural (cambios conformacionales en protenas, catstrofe microtubular, el citoplama celular como una matriz de percolacin de dimensin fractal). Evolucin de la estructura: molcula, agregados supramoleculares, compartamentalizacin, aparicin de gradientes y de bombas. Mecanismos de transduccin de energa y de seales. Evolucin de la complejidad. Patrones bioqumicos: metabolones. 3. Estructura y funcin de las Protenas Equilibrios cido-base en aminocidos. Unin peptdica. Protenas: estructura primaria, secundaria( hlice, hoja , giros, bucles), terciaria (motivos: patrones de clasificacin estructural) y cuaternaria. Plegamiento: cooperatividad, estabilizacin progresiva. Desplegamiento. Cambios conformacionales y actividad. Aislamiento, purificacin y fraccionamiento de protenas (precipitacin selectiva, cromatografas de intercambio inico, filtracin molecular y de afinidad). Electroforsis: determinacin de la masa molecular, nmero de protmeros y localizacin de puentes disulfuro. Ultracentrifugacin. Secuenciacin de protenas. MALDI-TOFF. Inmunodeteccin y cuantificacin, ELISA, Western blot. Sntesis en fase slida. Determinacin de estructura tridimensional: RMN (unidimensional y NOESY), dicroismo circular, fluorescencia, difraccin de Rayos X. Cuantificacin de protenas. 4. cidos nucleicos y flujo de informacin gentica Estructura qumica de los cidos nucleicos. Bases pricas y pirimdicas. Nuclesidos y nucletidos: nomenclatura. Acido desoxirribonucleico (ADN): estructura primaria, secundaria y terciaria. Estructura de los cidos ribonucleicos: mensajero(ARNm), de transferencia(ARNt) y ribosomal (ARNr). Duplicacin del ADN, Transcripcin de ADN en ARN, Procesamiento del RNA, intrones y exones, Cdigo gentico. Virus: tipos ADN-virus y ARN-virus de uno y de dos filamentos. replicacin. Virus oncognicos. El bacteriofago : mecanismo de integracin al genoma de la celula huesped. Oncogenes. Viroides. Plsmidos. 5. Investigacin en gentica Ingeniera gentica: aplicaciones y obtencin del gen: por corte del ADN con endonucleasas de restriccin, por sntesis orgnica en fase slida y a partir del ARNm. Secuenciacin por interrupcin controlada de la replicacin. Amplificacin: PCR. Tecnologa del DNA recombinante: Unin de segmentos de ADN de distinto origen: mtodo de las colas homopolimricas. Vectores: plsmidos semisintticos y derivados del bacteriofago : caractersticas deseables. Introduccin del vector a la clula husped (transformacin). Seleccin del clon con el ADN recombinante y clonado. Manipulacin de genes de eucariotas, bibliotecas de genes a partir de ARNm. Niveles de expresin gnica, chips de genes (microarrays). Animales transgnicos. Mutagnesis dirigida para producir protenas nuevas. 6. Investigacin en evolucin Relaciones evolutivas a partir de secuencias de protenas. Homologas de secuencias: secuencias alineadas, significacin estadstica (shuffling), matriz de sustitucin, bancos de datos para detectar secuencias homlogas. Estudio de estructuras tridimensionales. Grfico autodiagonal (autoalineamiento) para detectar secuencias repetidas. Relacin estructura/funcin: evolucin divergente y convergente. Construccin de rboles evolutivos. Evolucin molecular en el laboratorio. 7. Bioenergtica Estados de equilibrio y estados estacionarios. Entropa y vida. Bioenergtica: cambios de energa libre de una reaccin. Relacin entre la constante de equilibrio y el cambio de energa libre estandar. Clculo del

4 cambio de energa libre estandar y el cambio de energa libre de una reaccin redox. Reacciones acopladas. Energtica del transporte activo. Compuestos con alto potencial de transferencia de fosfato: factores que influyen en el cambio de energa libre estandar durante la hidrlisis. 8. Enzimologa Enzimas clasificacin y nomenclatura. Ribozimas. Cofactores. Coenzimas: definicin: estructura qumica y clasificacin. Coenzimas de oxido-reduccin: nicotinamida adenina dinucletido (NAD), nicotinamida adenina dinucletido fosfato (NADP), flavina adenina dinucletido (FAD), coenzima Q (CoQ) y cido lipoico. Coenzimas que transfieren grupos fosfato; que transfieren grupos acilo: Coenzima A (Co A). Que transfieren grupros glicosilo. Que intervienen en reacciones de decarboxilacin: piridoxal fosfato y biotina. Otras coenzimas. Vitaminas hidrosolubles que forman parte de coenzimas. Vitaminas liposolubles, estructura y funcin. Estrategias catalticas. 9. Cintica Enzimtica Mecanismo de la actividad enzimtica. Cintica. Reacciones monosustrato: el modelo de MichaelisMenten; determinacin de la Km y Vm por el mtodo deLineweaver-Burk. Activadores e inhibidores. Tipos de inhibicin. Anlogos del estado de transicin. Anticuerpos catalticos (reconocen el estado de transicin). Reacciones bisustrato: de desplazamiento simple y desplazamiento doble. Estrategias reguladoras: enzimas alostricas (cintica y modelos), isozimas, modificacin covalente, escisiones proteolticas. 10. Glcidos y Lpidos Glcidos: Monosacridos, carbohidratos complejos, glicoprotenas, lectinas. Lpidos: lpidos de membranas, balance hidroflico-hidrofbico, estructuras de autoagregacin. 11. Biomembranas Estructura y funcin de la membrana biolgica. El modelo del mosaico fluido. Membranas internas de clulas eucariotas. Membranas de clulas procariotas. Tipos de movimientos de las molculas constituyentes. Difusin (FRAP, SPT). Fluidez (anisotropa) y curvatura. Efectos de factores fsicoqumicos y de la composicin. Protenas de membrana: extrnsecas, ancladas, intrnsecas. Prediccin de secuencias transmembrana a partir de la estructura primaria. Secuencias sealizadotas de direccionamiento de protenas. Fusin de membranas. 12. Transporte Difusin: Difusin facilitada. Transporte activo.:Las bombas de Na+, K+ y Ca2+. Cotransporte y contratransporte. Antibiticos de transporte. Medidas de conductancia: platch clamp. Sinapsis. Potenciales de accin. Canales activados por voltaje. Canales activados por ligando. Nexus o uniones ntimas. 13. Transduccin de la informacin Receptores de superficie. Curvas de saturacin. Receptores ionotrpicos. Receptores 7TM. Segundos mensajeros. Conversacin cruzada. Sistema nervioso. Ultraestructura de la sinapsis. Teora qumica de la transmisin nerviosa. El potencial de membrana. Liberacin, recaptacin y degradacin de los neurotransmisores. Unin mioneural. El receptor nicotnico de acetilcolina: inhibidores. La acetil coilinesterasa: inhibidores. Receptores de otros neurotransmisores. 14. Metabolismo Metabolismo: visin de conjunto. Reacciones aclopladas. El ATP como divisa universal de energa libre. Potencial de transferencia de grupos fosfato. Potencial de fosforilacin. Motivos recurrentes en las vas metablicas. Transportadores activados. Evolucin de las vas metablicas. Oxidaciones biolgicas. Enzimas de oxido-reduccin: Clasificacin y ejemplos. Metabolismo del superxido. Gluclisis : reacciones, consumo y generacin de ATP a nivel de sustrato. Generacin de NADH. Balance energtico. Destinos del piruvato: formacin de acetil-CoA, de etanol y de lactato. Entrada de fructosa y galactosa. Gluconeognesis : reacciones. Ciclo de Cori: rendimiento de ATP del lactato. 15. Ciclo de Krebs Ciclo de Krebs o de los cidos tricarboxlicos (TCA): reacciones, formacin de coenzimas reducida y ATP a nivel de sustrato. Acoplamiento de las reacciones. Interaccin de los metabolismos de glcidos , lpidos y proteinas. rendimiento de ATP en la oxidacin total de glucosa. Ciclo del glioxalato. 16. Fosforilacin oxidativa.

5 Fosforilacin oxidativa. Ubicacin submitocondrial. Cadena Respiratoria Componentes. Niveles de formacin de ATP. La hiptesis quimio-osmtica. Motores moleculares: ATPsintasa. Bioenergtica. Regulacin de la fosforilacin oxidativa. Inhibidores. 17. Metabolismo de glcidos Via de las pentosas-fosfato. Biosntesis del cido ascrbico. Degradacin intracelular del almidn y del glucgeno: reacciones. Digestin. Interconversin de hexosas. Biosntesis del glucgeno, almidn y celulosa: reacciones. Regulacin del metabolismo del glucgeno via AMPc. Biosntesis de disacridos. 18. Fotosntesis Fotosntesis: ecuacin global. Ubicacin del proceso en el cloroplasto, pigmentos. Reaccin de Hill. Las reacciones luminosas: fotosistemas I y II. Cadena transportadora de electrones. Formacin de ATP y NADPH. Bioenergtica. Mecanismo de formacin de ATP. Reacciones enzimticas: ciclo de Calvin. Eficiencia de la fotosntesis. 19. Metabolismo de lpidos Biosntesis y degradacin de los triglicridos, glicerofosfolpidos y esfingolpidos. Biosntesis del colesterol a partir de acetato. Formacin de colecalciferol y cidos biliares Metabolismo de los cidos grasos, degradacin por -oxidacin de cidos grasos saturados de cadena par e impar y de cidos grasos insaturados. Balance energtico. y -oxidacin. Ubicacin subcelular. Biosntesis: sistema del citosol, reacciones. Sistemas microsomal y mitocondrial. 20. Metabolismo de amino cidos Metabolismo de los aminocidos. Ciclo de fijacin del nitrgeno. Degradacin de los aminocidos: reacciones de tipo general: desaminacin por transaminacin, desaminacin oxidativa, desaminacin no oxidativa y descarboxilacin, ejemplos. Transporte del amonaco. Ciclo de la urea: reacciones. Los aminocidos como precursores de otras biomolculas: metabolismo del triptofano, fenilalanina, tirosina, histidina y glutamato. Glutatin. Porfirinas. Biosntesis del Hem. Hemoglobinas A, F y A2. Derivados de la hemoglobina: oxihemoglobina, carboxihemoglobina, metahemoglobina y carbohemoglobina. Degradadcin de la hemoglobina. Formacin de pigmentos biliares. 21. Metabolismo de cidos nucleicos Sntesis de novo de pirimidinas. Biosntesis de bases pricas y desoxiribonucletidos. Sntesis de NAD+, FAD, Coenzima A. Uratos. Replicacin, recombinacin y reparacin del DNA, polimerasas, topoisomerasas y helicasas. Fragmentos de Okazaki. Sntesis de DNA en eucariotas, ciclo celular, telomerasa. Sntesis y maduracin del RNA. El ribosoma como estructura desupramolecular. 22. Metabolismo de protenas Biosntesis de protenas. Codigo gentico: caractersticas. Formacin de aminoacil-ARNt. Mecanismo de la sntesis de protenas: etapas de iniciacin, elongacin y terminacin. Modificaciones posttraduccionales. Antibiticos inhibidores. Endo y Exopeptidasas. Tipos de mutaciones. 23. Integracin metablica y control de la expresin gnica Regulacin metablica. Control de la expresin gentica en procariotas. Oopern lac y opern trp: induccin y represin. Control en eucariotas. Regulacin por modificacin de la actividad de la enzima: activacin por precursor e inhibicin por producto final. Regulacin hormonal. Hormonas de mamferos: bases moleculares del mecanismo de accin. Receptores de hormonas de estructura esteroide, peptdica y derivada de aminocidos. Endocitocis y reciclo de los receptores. Hormonas vegetales y de insectos. 24. Inmunoqumica Inmunoqumica. Induccin de anticuerpos especficos. La unin Ag-Ac. Heterogeneidad de los anticuerpos. Estructura qumica de las inmunoglobulinas. Teoras sobre la formacin de anticuerpos. 25. Bioqumica de sistemas sensoriales Olfato, gusto, visin, audicin y tacto, aspectos bioqumicos. Receptores y mecanismos de transduccin de seales involucrados. 26. Motores moleculares NTPasas de lazo P. Mecanismo de la contraccin muscular, asociacin cclica de la actina y miosina. Microtbulos, tubulina, quinesina y dinena. Movimiento flagelar en bacterias, motor rotativo; quimiotaxis.

PROGRAMA SINTTICO DE QUMICA BIOLGICA .

1. La lgica molecular de la vida 2. Evolucin Bioqumica 3. Estructura y funcin de protenas 4. cidos nucleicos y flujo de informacin gentica 5. Investigacin en gentica 6. Investigacin en evolucin 7. Bioenergtica 8. Enzimologa 9. Cintica Enzimtica 10. Glcidos y lpidos 11. Biomembranas 12. Transporte 13. Transduccin de la informacin 14. Metabolismo 15. Ciclo de Krebs 16. Fosforilacin oxidativa 17. Metabolismo de glcidos 18. Fotosntesis 19. Metabolismo de lpidos 20. Metabolismo de amino cidos 21. Metabolismo de cidos nucleicos 22. Metabolismo de protenas 23. Integracin metablica y control de la expresin gnica 24. Inmunoqumica 25. Bioqumica de sistemas sensoriales 26. Motores moleculares

TRABAJOS PRACTICOS
TP 1: Espectrofotometra. TP 2: Purificacin, cuantificacin y anlisis estructural de protenas TP 3, 4 y 5. Cintica Enzimtica TP 6: Fotosntesis. TP 7: Mecanismos de transduccin de energa

OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA.

Al terminar el curso el estudiante deber: Adquirir una clara comprensin del metabolismo celular a la luz de conceptos de: - Mecanismos de transduccin de energa y de informacin. - Termodinmica, cintica y catlisis de reacciones bioqumicas - Importancia de la compartamentalizacin en la generacin de gradientes qumicos y electroqumicos. - Modulacin dinmica de la estructura y funcin de biomembranas, protenas y de la organizacin compleja del citoplasma - Vas metablicas fundamentales y su integracin - Patrones bioqumicos y su evolucin Desarrollar del pensamiento crtico. Adquirir destreza en el uso de metologas del laboratorio bioqumico

BIBLIOGRAFIA
Bioqumica General - Blanco, A. Qumica biolgica, Ed.El Ateneo, 2006. - Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996*. - Harper, H.A, Manual de Qumica Fisiolgica. Ed. El manual moderno 1980* - Horton, R.H, Moran, L.A., Ochs, R.S., Rawn, J.D., Scrimgeour, K.G. Bioqumica. Ed.Pentice Hall, Hispanoamericana, SA. Mexico, 1995, 1999*. - Lehninger, Albert L.. Principios de bioqumica . 2Ed., Omega, Barcelona, 2001.

7 - Nelson, David L.. Lehninger : principios de bioqumica .3 Ed., Omega, Barcelona, 2001. - Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioqumica, 5 Ed., Revert SA, Espaa, 2003. - Torres, H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioqumica General. Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983*. - Voet D., Voet JG, Pratt C.W. Fundamentos de Bioqumica. La vida a nivel molecular, Ed. Mdica Panamericana. 2006. - Walker, J. M.. Biologa molecular y biotecnologa .2 Ed. Acribia, Zaragoza, 1997. Problemas - Esteban J.M. y Cavanillas J.M.. Problemas de Qumica. Ed. Alhambra. 4a. Espaa. 1976. - Holme, David J. . Resolucin de problemas de bioqumica analtica, Acribia, Zaragoza, 1996. - Segel I.J. Clculos en Bioqumica. Acribia. Saragoza. Espaa. 1972. Bibliografa de consulta sobre temas especficos Qumica General, Qumica Orgnica y Qumica-Fsica - Atkins, P.N y M.J Clugston. Principios de Fisicoqumica. 1986. Addisson-Wesley. Ed. Iberoamericana. Mxico. - Atkins, P.W. Fisicoquimica. Ed. Addison-Wesley Iberoamericana, S.A. Wilmington, Delaware, USA.1991 - Brown, T. L., LeMay, H. E. y Bursten, B.E.. Qumica, La Ciencia Central. Prentice-Hall Hispanoamericana, S.A., Quinta Edicin. 1993. - Morris, J.G. Fisicoqumica para bilogos. Ed. Revert. Barcelona. 2002. - Whitten, W.K y K.D Gailey. Qumica General. Ed. Interamericana. Mxico. 1986. Biofsica-Qumica y Biologa Celular - Alberts, B. . Biologa molecular de la clula , 3 Ed., Omega, Barcelona, 1996-2002. - De Robertis, E.M.F.. Biologa celular y molecular de Eduardo D. P. De Robertis .12 Ed., El Ateneo, Buenos Aires, 1998. - Estrada Cerqueda, C.. Cintica del transporte a travs de membranas, Ed. Blume, Madrid, 1976. - Grigera, J.R. Introduccin a la biofsica del agua, Eudeba, Buenos Aires, 1976. - Maggio B. Introduccin a la biofsico-qumica. Ed.Gonzalez Truccone. Crdoba, Argentina. 1987*. - Vicente Crdoba, C.. Biofsica, Ed.Sntesis, Madrid, 1992 Cintica enzimtica - Segel I.H.. Enzyme kinetics. Behavior and analysis of rapid equilibrium and steady-state enzyme systems. Wiley Classics Library Editions. Wiley Intersci.Pub., New York. 1993*. - Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimologa. Ed Aguilar. 1967. - Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI Fotosntesis - Andreo C., Vallejos R. Fotosntesis. Serie Biologa, monografa no 30 OEA, 1984. - Hall D.O., Rao K. Fotosntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977. - Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977. Anlisis Bioqumico e Instrumental - Gore M.G.. Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Ed. Oxford University Press. Inc. NY. USA. 2000. - Henry RJ, Cannon D.C. y Winkelman J.W. Qumica Clnica: Bases y Tcnicas. Tomo I. 2a Ed. Jims. Barcelona. Espaa.1980*. - Willard H.H. Merritt Jr. .L, y Dean J.A.. Mtodos Instrumentales de Anlisis. Ed. CECSA. Mxico. 1974. - Skoog D.A. y West D.M.. Anlisis Instrumental. Ed.Interamericana. Mxico. 1975. - D'Ocon Navaza, Mara Carmen. Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico, Paraninfo, Madrid, 1999. Bibliografa especializada - Aon M.A. and Cortassa S. Dynamic Biological Organization. Fundamentals As Applied To Cellular Systems. Chapman and Hall, London, UK. 1997*. - Daune, M.. Molecular Biophysics. Structures in motion, Oxford University Press, Oxford. 1999*. - Makishima, Shoji. Pattern dynamics : a theory of self-organization, Ed. Kodansha Scientific, Tokio, 2001.
La bibliografa citada est disponible en la Biblioteca Ricardo Lutti" (Centro) de la FCEFyN, UNC. * disponibles en la Ctedra de Qumica Biolgica.

QUIMICA BIOLGICA (Ciencias Biolgicas) CRONOGRAMA 2011

CLASES TERICAS: Comienzan: 10de marzo Finalizan: 25 de junio

CLASES TERICAS
Semana Com 1,2,4 y 5 Mier.1215-1415 hs (Aula 219) y Viernes 10-12 hs (Aula 218) Com. 3 y6 Mier 8 - 10 hs (Aula 104) y Viernes 14-16 hs (Aula 103) Mircoles TEMA La lgica molecular de la vida Protenas Viernes TEMA Metabolismo. Evolucin Bioqumica Protenas

TRABAJOS PRCTICOS
Laboratorio 13 1o Semana Comisiones 1-2-3 2o Semana Comisiones 4-5-6

1 2

9/03/10 16/03/10

11/03/10 18/03/10

TP 1 Espectrofoto metra TP 1* Espectrofoto metra TP 2 Protenas TP2 Protenas TP3 Cintica I TP3* Cintica I TP4 Cintica II * TP4 Cintica II TP5 Cintica III y Seminario 1 TP5 Cintica III y Seminario 1 TP6 Fotosntesis TP6 Fotosntesis TP7 Transduccin de energa y Seminario 2 TP7 Transduccin de energa y Seminario 2

23/03/10

cidos nucleicos

25/03/10

Feriado Investigacin en evolucin / Bioenergtica Cintica Enzimtica Glcidos / Lpidos Feriado Hormonas/ Transduccin de seales PRIMER EXAMEN PARCIAL Ciclo de Krebs Cadena Respiratoria Metabolismo de lpidos Metabolismo de lpidos Biosntesis de cidos nucleicos Regulacin de la expresion gnica

4 5 6 7 8

30/03/10 06/04/10 13/04/10 20/04/10 27/04/10

Investigacin en gentica Cintica Enzimtica Enzimologa Biomembranas Transporte Gliclisis Gluconeognesis Glucgenolisis Interconversin de hexosas; Va de las pentosas Fotosntesis / Ciclo de Calvin Feriado Metabolismo de aminocidos/ Biosntesis de Nucletidos Biosntesis de protenas

01/04/10 08/04/10 15/04/10 22/04/10 29/04/10

04/05/10

06/05/10

10

11/05/10

13/05/10

11 12 13

18/05/10 25/05/10 01/06/10

20/05/10 27/05/10 03/06/10

14

08/06/10

10/06/10

15

15/06/10

Bioqumica de sistemas sensoriales Inmunoqumica

17/06/10

Integracin metablica

SEGUNDO EXAMEN pruebas TP 24/06/10 yRecuperat. FIRMA REGULARIDAD PARCIAL Recuperatorio 29/06/10 Ex.Parciales * Recuperacin de TP: Comisin 6 recupera TP Espectrofotometra y Cintica I (da y horario a convenir) 16 22/06/10

CONDICIONES PARA EL CURSADO

Correlativas regularizadas: Qumica Orgnica y Fsica I.

TRABAJOS PRCTICOS
Los alumnos debern: - Aprobar antes de comenzar los trabajos prcticos un examen sobre Normas Bsicas De Trabajo y Seguridad en Laboratorios. Los contenidos a evaluar se encuentran en la gua de trabajos prcticos. - Concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, calzado adecuado (cerrado) y cabello recogido. No podr realizar el TP aquel alumno que concurra sin estos elementos mnimos de seguridad personal.

ASISTENCIA: Clases Tericas: no obligatoria Trabajos Prcticos: 80% obligatoria ACTIVIDADES

Clases tericas: Exposicin, Discusin de problemas tericos. Trabajos prcticos: Resolucin de problemas, Trabajos de laboratorio, Seminarios de discusin de trabajos cientficos.

EVALUACIONES
I. Trabajos Prcticos: a) Evaluacin oral durante el desarrollo del TP. Se tendr en cuenta: desempeo, destreza, atencin, participacin, puntualidad, y la presentacin de Trabajos Cientficos (cuando corresponda). b) Una evaluacin escrita al final de cada TP. El resultado de la evaluacin estar disponible en el TP siguiente. II. Exmenes Parciales: Se tomarn 2 (dos) exmenes parciales sobre temas desarrollados en clases tericas y prcticas. CONDICIONES PARA LA REGULARIZACIN - Desempearse satisfactoriamente durante los TP (item a) y - aprobar el 80% de los TP (6 de las 7 evaluaciones escritas de los Trabajos Prcticos (item b) (Las evaluaciones de los TP se aprueban con el 60% de las respuestas correctas o alcanzando el 60% de los contenidos de TP) y - obtener un puntaje mnimo de 4 (cuatro) puntos en los exmenes parciales tericos. CONDICIONES PARA LA PROMOCIN: Correlativas Aprobadas (al comenzar el cursado): Qumica Orgnica y Fsica I Aprobar el 80% de los TP Alcanzar un promedio de 7 puntos entre ambos Exmenes Parciales, con una nota no inferior a 4 puntos. RECUPERATORIOS (al final del cuatrimestre) Se podr recuperar: - Un TP que haya resultado reprobado, para alcanzar las condiciones indicadas ms arriba. En caso de inasistencia, podr recuperarse el TP, slo por causa debidamente justificada (con certificado mdico expedido por Bienestar Estudiantil), en alguna Comisin donde el mismo an no se hubiera dictado. En el caso de inasistencias no habr recuperatorio al final del cuatrimestre. - Un examen parcial (por cualquier razn: inasistencia, reprobado o para aumentar nota).

FIRMA DE REGULARIDADES Se realizar el mismo da y horario del recuperatorio de TP. La firma de libretas se realiz unicamente ese da. El trmite no es personal. EXAMEN LIBRE El alumno que se presente a rendir la materia en condicin de Libre deber avisar con 1 semana de anticipacin, con respecto al turno de examen.

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NORMAS BSICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS

He ledo las NORMAS BSICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS incluidas en la Gua de Trabajos Prcticos de Qumica Biolgica (Ciencias Biolgicas-Facultad de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales-Universidad Nacional de Crdoba) y estoy al tanto de las medidas de seguridad de trabajo en el laboratorio.

Nombre y Apellido: .. DNI: . N de Matrcula:

Firma: ..

Completar, firma, cortar y entregar al Jefe de Trabajos Prcticos.

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NORMAS BASICAS DE TRABAJO Y SEGURIDAD EN LABORATORIOS 1

INDICE 1. ORGANIZACIN DEL TRABAJO 2. HABITOS PERSONALES 3. MANIPULACIN EN LABORATORIOS. 4. MEDIOS DE PROTECCIN 4. ACTUACIN EN CASO DE ACCIDENTES 5. TELFONOS IMPORTANTES Pg. 11 11 12 14 14 15

TEMAS 1. ORGANIZACIN DEL TRABAJO La organizacin del laboratorio, debe ser estudiada a fondo y procurar que sea adecuada para el mantenimiento de un buen nivel preventivo. No debe trabajar nunca una persona sola en el laboratorio fuera de horas habituales, por la noche o en operaciones con riesgo. Cuando se realicen operaciones con riesgo, incluso las personas que no intervengan en ellas deben estar informadas de las mismas. Deber trabajarse en las campanas extractoras siempre que se manipulen productos txicos, inflamables y/o que se desprendan en el proceso. En stas deber comprobarse peridicamente el funcionamiento del extractor, su estado general, el cumplimiento de los caudales mnimos de aspiracin, que su uso sea el adecuado, etc. La programacin de trabajos con productos qumicos, deber ir acompaada de la adopcin de medidas preventivas que se requiera en cada caso. Deber comprobarse la ventilacin general del laboratorio. Los reactivos almacenados en el laboratorio deben preservarse del sol, no guardarse en estanteras altas, cuidar su etiquetado y mantenerlos en las cantidades imprescindibles. No deber haber botellas con lquidos inflamables, incluso las botellas empezadas o los reactivos preparados con mezclas de productos inflamables. Ha de controlarse que las botellas una vez utilizadas, se cierren correctamente. Est prohibido fumar, beber y comer en los laboratorios. Los envases para recuperar se enjuagarn y colocarn, sin taponar, para el posterior proceso de lavado. No se permitir la presencia de personas no autorizadas y debidamente informadas de los riesgos inherentes en el laboratorio. 2. HABITOS PERSONALES Mantener en todo momento guardapolvos, camisas y vestidos abrochados. No abandonar objetos personales en mesas de trabajo o poyatas. No comer o beber en los laboratorios. No guardar alimentos ni bebidas en las heladeras del laboratorio. No fumar en los laboratorios. Llevar recogidos los cabellos. No llevar pulseras, anillos, colgantes o mangas anchas que pudieran engancharse en los montajes. Los guardapolvos no debern llevarse a lugares de asistencia comn como son las bibliotecas,
1 Extrado de Seguridad y condiciones de trabajo en los laboratorios del CSIC-Espaa.

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cafeteras, salas de reuniones, comedores etc. No es aconsejable guardar la ropa de calle en la mesada del laboratorios, para lo cual deber disponerse de armarios o lugares especficos fuera del rea de trabajo. Es recomendable usar gafas de seguridad cuando se manipule con productos qumicos lquidos de cualquier tipo en ebullicin. Si la naturaleza del trabajo lo requiere, el personal del laboratorio deber utilizar los medios de proteccin adecuados. No utilizar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidentes por salpicaduras de productos qumicos o sus vapores, al pasar por detrs de las lentes, podran provocar lesiones en el ojo antes de retirarlas. En estos casos se recomienda el uso de gafas graduadas. Si un producto qumico salpica a los ojos, utilizar inmediatamente un lavaojos y lavarlos durante 15 minutos sin interrupcin. Actuar con urgencia en menos de 10 segundos. No dirigir una corriente de alta presin directamente al ojo porque podra lesionarse. Es necesario mantener los ojos abiertos con ayuda de los dedos para el lavado debajo de los prpados. Lavarse las manos: antes de abandonar el laboratorio, siempre que se quiten los guantes protectores y despus de toda operacin que haya comportado el posible contacto con material irritante, custico, txico o infeccioso. Para secarse las manos, en vez de toallas es preferible el uso de papel desechable o secadores de aire. La persona que al trmino de la jornada sea la ltima en abandonar el laboratorio deber asegurarse que los procesos que no queden en funcionamiento, las conducciones de agua y gas estn cortadas, la energa elctrica desconectada y que el local se encuentra en un estado que excluya el riesgo de incendio. 3. MANIPULACIN EN LOS LABORATORIOS Laboratorios con riesgo qumico Toda persona que manipule un producto qumico, deber tener conocimiento de sus caractersticas fsico-qumicas y toxicolgicas. Debern conocerse, como mnimo, las frases de riesgo y seguridad (R y S) de los productos. Como norma general, cualquier manipulacin de una sustancia qumica deber realizarse dentro de las vitrinas de laboratorio. No llenar los tubos de ensayo ms de la mitad de su volumen total. Calentar los tubos de ensayo de lado y utilizando las pinzas. Utilizar en todo momento gradillas y soportes. Tomar los tubos de ensayo con los dedos, nunca con las manos. No llevar tubos de ensayo ni productos en los bolsillos. No calentar nunca un recipiente totalmente cerrado. Cuando se caliente, dirigir siempre la abertura en direccin contraria a uno mismo y a las dems personas cercanas. Transportar los productos en bandejas o recipientes para evitar derrames en caso de roturas. No oler productos qumicos si no se est debidamente informado. No tocar con las manos ni probar los productos qumicos. En caso de producirse una contaminacin se limpiar la zona y no podr utilizarse hasta tener seguridad de su descontaminacin utilizando los productos adecuados en cada caso y que deben conocerse previamente. No tocarse ninguna parte del cuerpo, material o instrumental con los guantes contaminados. En el caso de que esta circunstancia hubiera ocurrido, limpiar con los productos adecuados y eliminar los elementos utilizados en la limpieza, como residuos txicos. No efectuar pipeteos con la boca. Se realizar con peras de goma para pipetas o pipetas de seguridad. No trabajar separado de la mesa. Para el encendido de mecheros, utilizar encendedores piezoelectricos; no emplear fsforos ni encendedores de bolsillo. Los mecheros no debern dejarse encendidos sin vigilancia.

 Asegurarse del enfriamiento de los materiales antes de aplicar directamente las manos para tomarlos. Al finalizar una tarea u operacin, recoger materiales, reactivos, equipos, etc., evitando las acumulaciones innecesarias y dejando la zona de trabajo en las debidas condiciones de limpieza. Al terminar el trabajo, asegurarse de la desconexin de los aparatos, agua, gases, etc. Emplear y almacenar sustancias inflamables en las cantidades imprescindibles. Deber ponerse especial cuidado en cerrar botellas y frascos inmediatamente despus de su utilizacin. No transportar frascos o recipientes tomados por la tapa o tapn. Siempre que sea posible se trabajar en bandejas con el fin de confinar un posible derrame. Ser muy conveniente forrar con papel de filtro dichas bandejas. Siempre que sea necesario, debern utilizarse guantes especficos para los productos que se manipulan. Los guantes y todo material contaminado con productos txicos y /o infecciosos debern descontaminarse y/o esterilizarse antes de ser eliminados. Cuando no se utilicen guantes en la manipulacin de sustancias qumicas, las manos debern lavarse frecuentemente. Al finalizar la sesin de trabajo, es aconsejable un lavado cuidadoso antes de abandonar el laboratorio. Las puertas de los laboratorios debern permanecer cerradas durante la jornada de trabajo. Deber mantenerse la limpieza y el orden en los laboratorios en todo momento. Debern mantenerse libres los espacios de trabajo, as como las zonas de paso y salida de los recintos. No utilizar nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento. Antes de comenzar un experimento asegurarse de que los montajes y aparatos estn en perfectas condiciones de uso. Ante cualquier mnima duda consultar con el responsable del trabajo. Los trapos o materiales ensuciados con aceite o sustancias inflamables debern colocarse en recipientes cerrados que debern vaciarse diariamente y su contenido ser neutralizado. Las instalaciones, aparatos e instrumentos destinados a reparacin, debern enviarse limpios, sin trazas de sustancias qumicas nocivas. Antes de utilizar sustancias inflamables deberemos asegurarnos de que no hay cerca mecheros encendidos, calentadores etc. No debe dejarse sin vigilancia ningn tipo de reaccin qumica. Al finalizar un experimento los productos debern etiquetarse y colocarse en lugar seguro. Las sustancias cuya disolucin sea exotrmica, debern disolverse por porciones, agitando y enfriando continuamente. Durante la destilacin de sustancias inflamables de bajo punto de ebullicin, deber controlarse la llegada de agua al refrigerante y alejar del aparato cualquier otra materia inflamable. Cuando se derrame alguna sustancia combustible se proceder a: - Apagar el mechero, si ha lugar. - Cortar la corriente elctrica en el exterior del laboratorio. - Asegurar una ventilacin eficaz. - Se absorber el lquido con un cuerpo poroso que posteriormente se depositar en un lugar sin peligro. - Se eliminar como residuo txico. Las sustancias qumicas debern estar colocadas en recipientes con materiales adecuados y etiquetados debidamente. Los recipientes debern estar cerrados. Los recipientes que contengan lquidos debern estar protegidos contra la accin directa de los rayos solares o contra el calentamiento. Los metales alcalinos como sodio o potasio debern conservarse con una capa protectora de un solvente con un punto de ebullicin elevado (petrleo, aceite de parafina) y el fsforo blanco con una capa de agua. Los productos incompatibles debern guardarse separadamente. Los recipientes que contengan productos agresivos no debern almacenarse a una altura

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superior a sesenta y cinco cm. Y sern recipientes de pequea capacidad para su fcil manejo. 4. MEDIOS DE PROTECCIN El trabajo en laboratorios requiere la utilizacin de guardapolvos, que en trabajos con riesgo deber considerarse el tejido de los mismos. Los guardapolvos debern tener los puos ajustados a las muecas. Asimismo, debern estar cerrados en la parte delantera y en el cuello. Tener siempre a disposicin las gafas de seguridad. Es recomendable el uso permanente de las mismas. Estas sern de uso personal. Utilizar los guantes adecuados para cada tarea que requiera el uso de tales prendas. Conocer la proteccin brindada por los distintos equipos de proteccin individual para las vas respiratorias. Conocer la aplicacin de los productos de primeros auxilios del botiqun y los mecanismos para recibir posibles ayudas exteriores. Mantener en condiciones de uso las duchas de emergencia y lavaojos. Conocer y ensayar el funcionamiento de equipos extintores. 5. ACTUACIN EN CASO DE ACCIDENTES 5.1 Derrames . Lquidos inflamables Absorber con carbn activado productos especficos. Alejar cualquier foco de calor. . cidos Neutralizar con bicarbonato o emplear productos especficos comercializados para su neutralizacin o absorcin. Si por casualidad se ha producido un derrame sobre la piel, el remedio inmediato sera exponer la zona afectada al chorro de agua del grifo durante cinco o diez minutos. Las duchas de emergencia sern utilizadas en los casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande. Es necesario quitar la ropa contaminada de la persona afectada mientras est bajo la ducha. Si se produjesen quemaduras se precisar la asistencia mdica. No utilizar cremas ni pomadas grasas en las quemaduras graves. .Bases Emplear productos especficos comercializados para su neutralizacin y absorcin. .Otros lquidos no corrosivos ni inflamables Absorber con aserrn. 5.2. Salpicaduras. En piel y ojos Deben lavarse con abundante agua (si es en los ojos, mediante un lavaojos). No intentar neutralizar. Acudir al mdico con prontitud. En la ropa Debe quitarse rpidamente la ropa, lavndola, o colocarse bajo la ducha, segn la magnitud de la impregnacin. Si hay contacto con la piel, lavar la zona afectada y acudir al mdico. 5.3. Cortes Se debern lavar con abundante agua corriente durante diez minutos como mnimo. Si son pequeos y dejan de sangrar en poco tiempo, Lavar con agua y jabn y taparlos con una venda o apsito adecuados. Si son grandes y no dejan de sangrar, se requiere asistencia mdica inmediata. 5.4. Ingestin Si es un cido o una base. Beber abundante agua, salvo que la sustancia ingerida reaccione con

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ella. No provocar el vmito, salvo indicacin expresa. Disponer de informacin sobre los productos que se manipulan, consultando a un servicio de informacin toxicolgica cuando sea posible. Si la persona est inconsciente, Ponerlo en posicin inclinada con la cabeza de lado y estirarle la lengua hacia fuera. Taparlo para que no coja fro. Acudir al mdico con una etiqueta del producto. 5.5. Inhalacin Conducir a la persona afectada a un lugar con aire fresco. Al primer sntoma de dificultad respiratoria, iniciar la respiracin artificial boca a boca. Tratar de identificar el vapor txico. 5.6. Incendio Dar la alarma inmediatamente Apagar los fuegos pequeos tapndolos sin utilizar agua. Escoger adecuadamente el tipo de extintor, recordando el modo de empleo y la duracin de la carga. No utilizar nunca sobre una persona. Si prende fuego la ropa: -Tenderse en el suelo y rodar sobre si mismo para apagar las llamas. No correr ni intentar llegar a una ducha de emergencia salvo que est muy cercana. -Se le cubrir con una manta apagafuego, llevarle a una ducha de emergencia o hacerle rodar por el suelo. Una vez apagado el fuego, mantener a la persona tendida procurando que no coja fro y proporcionarle asistencia mdica. Si se evacua el laboratorio, cerrar las puertas al salir. .Comportamiento ante un incendio en un local donde existan botellas de gases La elevada temperatura provoca un aumento de la presin interna de la botella pudiendo explotar. Las botellas que puedan activar el fuego no debern abrirse, cerrando las que estn en servicio. Siempre que se pueda se desalojaran de la zona del incendio y si se han calentado se refrigeraran con chorro de agua fra para disminuir la presin interna, avisando de ello al suministrador. En caso de intervenir el Cuerpo de Bomberos se les advertir de la presencia de stas indicndoles, cuantas son, donde estn y contenido. 6. TELFONOS IMPORTANTES En todos los laboratorios debe haber un listado telefnico con los Centros de URGENCIA que enumeramos a continuacin, el cual ser de conocimiento general. ECCO (visitantes y alumnos) BOMBEROS SEGURIDAD INTERNA ART 4466666 100 4334408 4686868

(Doc. y Bec. SeCyT) Provincia ART 0-800-333-1333 (Becarios CONICET) La Caja 0-800-888-0200

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TRABAJO PRACTICO N 1
ESPECTROFOTOMETRA
Los problemas y la gua de estudio debern ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En caso de necesitar aclarar dudas los docentes estarn disponibles en sus horarios de consulta, en la ctedra. Los alumnos sern evaluados al final del TP (evaluacin escrita) y durante el desarrollo de la experiencia prctica (evaluacin oral), sobre los contenidos que se encuentran en la gua de TP. Debern concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

OBJETIVOS:
Conocer los fundamentos tericos y las aplicaciones de la espectrofotometra. Comprender las propiedades que deben reunir los mtodos experimentales de anlisis. Adquirir destreza en el manejo del espectrofotmetro. Valorar la importancia del dominio de tcnicas auxiliares para poderlas aplicar con criterio ante los problemas planteados.

TEMAS PARA REPASAR:

Disoluciones. Estequiometra. Luz. Teora ondulatoria. Teora cuntica. Ondas electromagnticas. longitud, frecuencia, perodo de una onda y unidades en que se miden. Relacin entre velocidad, longitud de onda y frecuencia. Energa de ondas electromagnticas.

PROPIEDADES DE LOS MTODOS QUMICOS DE ANLISIS

Exactitud: es el grado en que la medida promedio se aproxima al valor real. La determinacin de la exactitud se logra comparando los resultados observados con el valor real. Precisin: se relaciona con el error debido al azar, la variacin de los resultados obtenidos con una tcnica cuando la misma muestra se analiza repetidamente. Expresa la reproducibilidad de una medicin. Cuanto menor sea la variacin observada, mayor es la precisin. Todo mtodo exacto es preciso, pero un mtodo preciso no es necesariamente exacto. Sensibilidad: es la variacin mnima en la cantidad de un compuesto que puede ser detectada, o la mnima cantidad significativamente diferente del blanco. Especificidad: es la propiedad del mtodo de medir slo la especie qumica en estudio, sin la interferencia de otras que puedan estar presentes.

ERRORES EN LAS MEDICIONES DE LABORATORIO

Error: es la diferencia entre el valor observado y el real, es decir, la combinacin del error sistemtico y el error debido a la falta de precisin. Los errores pueden dividirse en dos clases: 1) errores determinados, 2) errores indeterminados. Errores determinados: son aquellos cuya magnitud puede determinarse: a) errores instrumentales y debidos a aparatos y reactivos: balanza y pesas, aparatos volumtricos, material de vidrio calibrado, reactivos, etc.; b) errores operativos: son de naturaleza fsica, asociados con manipulaciones en un anlisis. c) errores personales: errores operativos del analista. d) errores del mtodo: tienen origen en las propiedades qumicas y fisicoqumicas del sistema analtico. Errores indeterminados o aleatorios: son pequeas fluctuaciones en los sucesivos valores de una cantidad medida. No son evitables ni previsibles por parte del observador. Pueden tratarse por mtodos estadsticos. Dada una cantidad de datos el analista puede estimar la incertidumbre introducida por errores aleatorios y concluir con respecto al efecto de esos errores en un resultado analtico.

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ESPECTROFOTOMETRA
La espectrofotometra es una tcnica que permite medir la absorcin de radiacin electromagntica, ultravioleta y visible de numerosas especies qumicas inorgnicas y orgnicas, para su anlisis cuali y cuantitativo. Las molculas son capaces de absorber radiaciones electromagnticas. Tanto la longitud de onda de la radiacin absorbida como la eficiencia con que se absorbe, dependen de: la estructura de la molcula y el medio en que se halla.

En el proceso de absorcin de la radiacin, un fotn incidente cede su energa a una molcula, lo que da lugar a la excitacin de la misma que pasa a un nivel de energa superior:
h. A A*

A = molcula absorbente A* = molcula absorbente en estado de excitacin energtica. h. = energa de un fotn donde h = Constante de Planck y = frecuencia de radiacin. Los estados excitados de los tomos o molculas son de vida media corta (10-9 s) y, en consecuencia, la molcula en estado excitado vuelve rpidamente al estado fundamental. Comunmente, la energa es liberada al medio como calor, pero en ciertos casos la especie qumica excitada puede sufrir un cambio (reaccin fotoqumica) o emitir parte de la energa absorbida como radiacin electromagntica de longitud de onda mayor a la incidente (fluorescencia o fosforescencia).

LEYES DE LA ABSORCION
Cuando la luz atraviesa una muestra, slo una fraccin de ella es transmitida. La proporcin de luz transmitida se denomina Transmitancia (T) y se calcula de la siguiente manera: T = I / I0 Donde I = la intensidad de luz transmitida por la muestra I0 = la intensidad de luz incidente La transmitancia toma valores entre 0 1. Tambin se expresa como porcentaje si se multiplica por 100 y sus valores estn en el rango de 0-100%: %T = (I / I0 ) x 100 La relacin (I / I0 ), tambin puede ser expresada como luz absorbida en lugar de luz transmitida. En ese caso nos referimos a la Absorbancia (A) de una muestra. La Absorbancia es adimensional, vara en el rango de 0 - y se define como: A = log 1/T = log10 (I0 / I) Por sustitucin se comprueba que la absorbancia y el porcentaje de transmitancia estn relacionados mediante la siguiente expresin: A = log (100 / %T) A = 2 - log( % T)

19 LEY DE LAMBERT: La fraccin de luz absorbida por un medio transparente es independiente de la intensidad de luz incidente, y cada capa sucesiva del medio, absorbe una fraccin igual de la luz que pasa a travs de l. Esto lleva a un decaimiento exponencial de la intensidad de luz a lo largo del paso ptico en la muestra, que puede ser expresado matemticamente como sigue: Log10 (I0/I) = A = K b Donde b = la longitud del paso ptico de la cubeta de espectrofotometra y K es una constante del medio, que fue descifrada por Beer.

LEY DE BEER: La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero de molculas de cromforo que la luz atraviesa. La constante K, es proporcional a la concentracin de cromforo (c) : K = a c , donde a es la absortividad o coeficiente de absorcin, una propiedad del cromforo en s misma. La absortividad a es una constante que depende de: la longitud de onda de la luz incidente, la identidad de la sustancia analizada y del medio en que sta se encuentre (pH, solvente e interaccin con otras sustancias) La constante a representa la probabilidad de absorcin a una longitud de onda determinada.

La LEY DE LAMBERT Y BEER queda resumida entonces, en la expresin: Log10 (I0/I) = a c b A=acb Cuando el paso ptico est expresado en cm y la concentracin en M, la absortividad se denomina -1 -1 coeficiente de extincin molar o absortividad molar (), entonces sus unidades son M cm . Cuando b=1 cm, la absorbancia se denomina Densidad ptica (DO)

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE SOLUTO EN UNA SOLUCIN

Dadas una disolucin de concentracin desconocida a la que llamaremos problema y otra disolucin de concentracin conocida a la que llamaremos testigo, aplicando la ley de Lambert y Beer a cada disolucin se obtienen las siguientes expresiones: Ap=a.b.cp At=a.b.ct

Dado que el problema y el testigo son disoluciones de una misma sustancia cuyos valores de absorbancia se determinan a la misma , los valores de absortividad sern iguales. Adems, dado que se utiliza la misma cubeta para medir la A, los valores de b tambin sern iguales. En consecuencia, dividiendo miembro a miembro Ap.ct a.b.cp Ap/ At = __________ podemos simplificar a y b, y al despejar queda: cp= At a.b.ct donde Ap= absorbancia del problema. At= absorbancia del testigo. cp = concentracin del problema. ct = concentracin del testigo.

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CURVA DE CALIBRACIN
Una curva de calibracin es un grfico de A o %T en funcin de la concentracin de soluto; su empleo es necesario en los trabajos cuantitativos en los que hay que calcular la concentracin del absorbente. En general se grafica A en funcin de la concentracin (Fig.1a) pero, hay instrumentos que slo miden %T (Fig.1b). En ste caso, deben transformarse las lecturas de %T en valores de A, mediante el empleo de la ecuacin A = 2 - log( % T). Alternativamente, puede trazarse el grfico de %T en funcin de la concentracin en papel semilogartmico (Fig.1c). De otro modo, resultara difcil, utilizando un nmero limitado de puntos obtenidos experimentalmente, comprobar grficamente si la lectura sigue o no la ley de Lambert y Beer (relacin lineal entre absorbancia y concentracin). . Papel semilogartmico
a b c

Concentracin (mg/ml)

%T

Concentracin (mg/ml)

%T

Concentracin (mg/ml)

Fig.1: Curvas de Calibracin Por consideraciones del error fotomtrico, debe procurarse que los puntos situados entre valores de A de 0,1 y 1,0 (10% y 80% T) sean representados de la forma ms exacta posible al trazar la grfica. Las escalas del sistema de registro del aparato son: lineal para %T y logartmica para A: por ste motivo, el error en las lecturas de %T es constante en toda la escala, lo cual no ocurre con la A. Sin embargo, debido a que A y concentracin se relacionan proporcionalmente, en la prctica se lee A. En equipos con visores digitales, es posible trabajar con disoluciones con 0,1>A>1,0, como se indica ms arriba. En los equipos donde los valores de A se determinan de acuerdo a la posicin de una aguja que se mueve sobre una escala (galvanmetro), la aplicacin de esta tcnica se limita a muestras que produzcan lecturas comprendidas entre 0,1 y 0,3, dado que en este rango de valores an es posible interpolar datos en la escala logartmica. Valores menores pueden estar por debajo de la sensibilidad del equipo y, a valores mayores, las menores divisiones de la escala son muy pequeas y la apreciacin de las lecturas resulta poco precisa.

ESPECTRO DE ABSORCIN
Las soluciones absorben energa preferentemente en una ms regiones del espectro electromagntico, siendo la absorcin inferior o nula en las dems regiones. Se denomina Espectro de absorcin a la representacin grfica de la probabilidad de absorcin en funcin de la longitud de onda. El espectro de absorcin se determina midiendo la absorbancia a distintas longitudes de onda para establecer la longitud de onda de mxima absorcin ( max). En el siguiente ejemplo, la max es aproximadamente 420nm (indicada por la fecha).
0.20

0.15

Fig. 2. Espectro de Absorcin

Absorbancia

0.10

0.05

max
350 400 450 500

0.00 300

Long onda (nm)

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ESPECTROFOTMETRO
Las mediciones de absorbancia se realizan en un espectrofotmetro, que bsicamente consta de una fuente de luz, un monocromador para seleccionar la longitud de onda, una cubeta transparente para contener la muestra, un detector de intensidad luminosa y un sistema de registro (Fig. 3).

Sistem a de Registro

Fig. 3. Esquema de un espectrofotmetro

MEDICION DE LA ABSORBANCIA
1) Si tenemos una solucin coloreada de concentracin desconocida, la denominamos tubo problema. Podemos conocer su concentracin midiendo la absorbancia en un espectrofotmetro a una longitud de onda apropiada. 2) Previamente a la lectura, el aparato es llevado a cero de absorbancia con un tubo que contiene solvente sin la sustancia problema y se denomina blanco. Este tubo puede contener varias sustancias, adems de disolvente, a la misma concentracin en que se encuentra en el tubo problema, excepto la sustancia que se desea cuantificar. Por ej. si la sustancia coloreada problema se encuentra disuelta en agua conteniendo NaCl al 1% e KOH al 2%, el tubo blanco contendr NaCl al 1% e KOH al 2% en agua, sin la sustancia en estudio. La finalidad de usar el tubo blanco es descontar la absorcin de sustancias que no sean especficamente la sustancia problema y as poder medir la absorbancia propia de la sustancia en estudio. 3) Un tercer tubo que denominamos testigo corresponde a una solucin de concentracin conocida de la sustancia en estudio. Se prepara disolviendo una cantidad conocida de soluto en un volumen conocido de solvente conteniendo las mismas sustancias que la solucin problema: por ej. NaCl al 1% e KOH al 2% para el caso que se est analizando. Se lee en el espectrofotmetro, llevado previamente a cero de absorbancia con el blanco, de la misma forma que se hizo con el tubo problema. Finalmente, la concentracin del tubo problema se puede calcular mediante la interpolacin del valor de absorbancia en una curva de calibracin (para lo cual es necesario la preparacin de varios tubos testigos) o mediante la comparacin con un testigo. 4) Lo descripto en los puntos anteriores es vlido para medir la concentracin de sustancias incoloras siempre que estas sustancias sean capaces de reaccionar con otras, dando productos de reaccin coloreados y que el color finalmente obtenido sea proporcional a la concentracin de la sustancia en estudio. El tubo blanco, el cual no contiene la sustancia que desarrolla color, deber ser tratado de forma similar al tubo problema y a los testigos, es decir tendr los mismos reactivos y se los procesar de forma similar y paralela a los otros tubos. Hay sustancias incoloras que tienen la propiedad de absorber la luz ultravioleta; en estos casos pueden ser cuantificadas sin tratamiento previo, midiendo la absorbancia a una comprendida entre 200 y 400 nm (correspondiente al rango de luz ultravioleta).

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GUIA DE ESTUDIO
1. Observe el esquema del espectro electromagntico de la Fig.4 y compare c (velocidad), (longitud de onda), (frecuencia) y energa de la radiacin electromagntica indicada. 2. Defina luz blanca y luz monocromtica. 3. Qu efecto produce la absorcin de la luz por una molcula? 4. Existe alguna restriccin con respecto a la longitud de onda de la luz que una sustancia puede absorber? 5. Cul es la utilidad de un espectro de absorcin? 6. Concepto de ley de Lambert y Beer. 7. Definicin de absorbancia y transmitancia. 8. Cmo se preparan y qu utilidad tienen los tubos blanco, testigo y problema? 9. Cmo construye y qu utilidad tiene una curva de calibracin ? 10. Cmo elige la longitud de onda de trabajo? 11. Cul es el fundamento qumico del mtodo de Biuret para cuantificar protenas?

Fig. 4: Espectro Electromagntico

Color Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo

(m)

x 10

(Hz) x 10

-17

E = h. E= h.c

3.90 4.55 4.55 4.92 4.92 - 5.77 5.77 5.97 5.97 6.22 6.22 7.80

7.69 6.59 6.59 6.10 6.10 5.70 5.70 5.03 5.03 4.82 4.82 3.84

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PROBLEMAS
1- Una disolucin de protenas de concentracin desconocida, se diluye 5 veces con agua destilada. A partir de esta dilucin, se vuelve a diluir 3 veces con agua destilada. Esta ltima dilucin di por mtodo Biuret una absorbancia de 0,12 (testigo de concentracin = 4 mg/ml, di 0,25 de absorbancia). Cul es la concentracin de la solucin original de protenas? R = 28,8 mg/ml. 2- Una solucin de protenas de concentracin desconocida, di por mtodo de Biuret una A = 0,09 (testigo de concentracin 4mg/ml di A = 0,25 ).De dicha solucin se desea tomar 100 g. Qu volumen de dicha solucin se debe pipetear? R = 69 l. 3- Interprete el significado de las sig. curvas de calibracin para la cuantificacin de protenas por el mtodo de Biuret. Cul de ellas corresponde a un esquema de trabajo correcto?
2 1 Absorbancia

Concentracin (mg/ml)

4- Los datos de la Tabla 1 corresponden a absorbancias de una solucin de flunitrazepam 25 M en etanol 3% V/V y en tris HCL 50 mM, pH 7,4 medidos a diferentes longitudes de onda:
A 210 0.2 220 0.604 250 0.446 260 0.407 270 0.320 280 0.286 290 0.272 320 0.250 330 0.190 340 0.120 350 0.070 360 0.040 370 0.020

a) Grafique el espectro de absorcin y coloque el ttulo correspondiente. b) Qu longitud de onda elegira para realizar una curva de calibracin? c) Cmo se prepar el tubo blanco? d) Es necesario descontar el blanco cada vez que se cambia la longitud de onda? Si-No. J.S.R. 5- El siguiente es un protocolo de trabajo para la cuantificacin de ADN en base a su contenido de desoxirribosa empleando el reactivo de difenilamina.

Blanco NaCl 1M ADN 100 g/ml en Nacl 1M ADN [ ] desc en NaCl 1M difenilamina Volumen final 2ml 1ml

Testigo

Problema

1 ml

24 a) Complete los espacios en blanco. b) Por qu coloca NaCl 1M y no agua destilada en el blanco? c) Cmo realizara una curva de calibracin si slo cuenta con una solucin de ADN de 100 g/ml? d) Qu precauciones debe tener al elegir las concentraciones de los testigos? e) Cmo corregira este protocolo en los casos en que: 1-la absorbancia del problema sea >> 0,3 y 2- la absorbancia del problema sea << 0,1 ? f) Por qu deben tener todos los tubos igual volumen final? 6- Calcular la absorbancia que corresponde a cada uno de los siguientes valores de transmitancia: a) 0% b) 0,2% c) 0,8% d) 1,52% e) 68%.

7- Calcule el coeficiente de extincin molar del p-nitrofenol si A = 0,2 y la concentracin es 11.428 -1 -1 moles/l, = 410 nm y b = 1 cm. R = 17.500 M cm . 8- Se cuantific una solucin de tirosina por absorcin al UV. Esta solucin dio A = 0,16; calcule la concentracin nM de tirosina considerando que dicha solucin haba sido diluida primero 3 veces y -1 -1 4 luego 2 veces ms. = 14.000 M cm , = 274 nm. R = 6,85.10 nM. 9- Una solucin de una sustancia de PM 600 a una concentracin de 40 g/ml tiene A = 0,3 a 540 nm, -1 medida en una cubeta de 1 cm de paso ptico. Calcule el coeficiente de extincin molar. R = 4.500 M -1 cm 10- Una solucin contiene dos flavonoides: flavonoide 1 (F1) y flavonoide 2 (F2). Se quiere cuantificar ambos sin una purificacin previa. Analizando la Fig. 6 se observa que entre 220 nm y 420 nm sus espectros se superponen, por lo tanto la cuantificacin de cualquiera de ellos interfiere con la del otro. A longitudes de onda superiores a 420 nm slo absorbe F1. Calcule la concentracin molar de F1 y F2 en sa solucin sabiendo que:
Testigo de F1 Testigo de F2 c2 = 15 M A350 = 0,3 Solucin problema (mezcla de F1/F2) c1 = ? A350 = 0,45 A450= 0,3 c2 = ?

F1 Absorbancia

c1 = 15 M A350 = 0,05 A450 = 0,15

F2

Respuesta: concentracin de F1=30 M. concentracin de F2=17,5 M.

0
200 300 400 500 600 Longitud de onda (nm)

25 EJERCITACION ADICIONAL 1- Calcule el nmero de moles, micromoles y milimoles que hay en 2g de NaOH (PM=40). 2- Qu cantidad de glucosa (PM=180) tiene que pesar para preparar 200 ml de una solucin 0,05 M? R = 1,8 g. 3- Qu volumen de una solucin 10 mM se puede preparar con 1 g de glucosa (PM=180). R = 555,6 ml. 4- Si tiene 3 litros de una solucin de NaOH 0,5 M, Cuntos moles y que concentracin molar poseen los siguientes volmenes: a) 50 ml; b) 0,25 ml; c) 1 litro. R: a) 0.025 moles, 0.5 M; b) 1.25 x 10-4 moles, 0.5 M; c) 0.5 moles, 0.5 M 5- Qu molaridad tiene una solucin que contiene 60 gr de NaOH (PM=40) por litro? R: 1.5 M. 6- Qu cantidad de NaOH (PM=40) estan contenidos en 3 litros de una solucin 2.5 M ? R: 300gr. 7- Una solucin de cido sulfrico al 98% P/P, cuya densidad es 1.8 g/cm3, qu molaridad tiene? R: 18 M. 8- Cul ser la molaridad de una solucin de cido clorhdrico (PM=36.5) al 37% P/P cuya densidad es 3 1.19 g/cm ?. R: 12 M 9- Cmo procedera para preparar 2 litros de una solucin de ClK 10 mM a partir de una solucin 3 M ? R: tomar 6.67 ml (3 M). colocarlos en un matraz de 2 litros enrasar con agua destilada. 10- Se quieren preparar 6 litros de una solucin 0.25 M de cido sulfrico a partir de una solucin 63% P/P 3 (densidad=1.7 g/cm ). Qu volumen debe tomar?. R: 137,28 ml. 11-Los siguientes son los resultados de la cuantificacin de H2SO4 en una misma muestra realizado por un mtodo "A" por cuatro analistas diferentes: a- 50,00 % P/P, densidad= 1,3952 g/ml b- 70,00 % P/V c- 7,00 M d- 7100 mM De acuerdo al enunciado anterior diga: a- Cmo procede para comparar los resultados anteriores? b- Que puede decir acerca de la precisin del mtodo empleado en la cuantificacin? DATOS: PM H2SO4 = 98,08 12-Se desea investigar los efectos de flunitrazepam sobre el comportamiento de ratas en situacin de "stress". Para ello cuenta con dos lotes de cinco ratas de 300 g cada una. El lote N1 (experimental) es inyectado con una solucin de flunitrazepam 67M en cloruro de sodio 0,8775 % P/V (solucin fisiolgica). a) Cmo procede para preparar 100 ml de dicha solucin ? b) Cul es la utilidad del segundo lote de ratas? Con qu inyecta esas ratas? Cmo prepara esa solucin? c) Si la dosis de flunitrazepam cuyo efecto se desea investigar es 70 g/kg de peso corporal, qu volumen debe inyectar a cada animal?. DATOS: flunitrazepam = droga slida , PMflunitrazepam = 313,3 PACl = 35,5 PANa = 23 13En el siguiente grfico se muestran espectros de absorcin de varias sustancias. Cul de las longitudes de onda indicadas elegira para luego trabajar con un fotocolormetro y cul para trabajar

26 con un espectrofotmetro? Estos espectros fueron obtenidos con un espectrofotmetro o con un fotocolormetro? Podria obtener un espectro como el B si slo dispusiera de un fotocolormetro para analizar su muestra?
0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 300 450 600 750 Long Onda (nm) A

Absorbancia

14- La siguiente tabla corresponde a absorbancias de soluciones estndares de albmina srica bobina:
[Albmina] (Mx103) 0.2 0.5 1.25 3.12 7.81

A 0.033 0.081 0.195 0.440 0.703

a) Se cumple la ley de Lambert y Beer en este intervalo de concentraciones? b) Si no fuera as.Cul es el lmite superior de concentracin del rango lineal? c) Determinar la concentracin de albmina cuya absorbancia medida en las mismas condiciones experimentales es 0,116.

15- Se desea investigar el contenido de glucosa en sangre despus de la administracin por va oral de 0,5 g de dicho compuesto. Se trabaj con un grupo de 20 ratas de 2 meses de edad, peso promedio 300 g. Se tomaron muestras de sangre a 0, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos despus de la ingestin y se determin en suero la cantidad de glucosa por un mtodo fotocolorimtrico, expres como el valor promedio en mg % P/V de glucosa en sangre. (Tabla 4). En otro experimento se tom otro grupo de 20 ratas con las mismas caractersticas y sometidas al mismo tratamiento que las anteriores. Una hora antes del experimento fueron inyectadas por va endovenosa con 200 l de una solucin 20 M de Glucagn (el glucagn es una hormona pancretica que incrementa el nivel de glucosa por la estimulacin de la degradacin de glucgeno en higado) (Tabla 5). a) Identifique para cada experimento la variable dependiente y la independiente. J.S.R b) Grafique los resultados y coloque ttulo a los mismos. c) Indique la ecuacin matemtica a la que se ajustan los datos. TABLA 4
mg % p/v glu/sangre 70 105 122 140 175 210 tiempo min 0 30 45 60 90 120 140 175 195 210 260 290

TABLA 5
mg % p/v glu/sangre tiempo min 0 30 45 60 90 120

16Postule dos modelos de experimentacin donde pueda identificar variables dependientes e independientes.

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PARTE PRACTICA CUANTIFICACIN DE ALBMINA POR EL MTODO DE BIURET

FUNDAMENTO DEL MTODO DE BIURET (Gornall, A.G et al., 1949, J. Biol. Chem., 177-766):
Las sustancias que contienen dos -CONH2 (amida); -CH2NH2 (amina); -C(NH)(NH2) (diamina); o -CSNH2 (tioamida), unidos, sea directamente entre s, o a travs de un tomo de carbono o nitrgeno; y las estructuras peptdicas que contengan como mnimo dos enlaces peptdicos, en presencia de Cu++y en solucin alcalina, forma un complejo de color violeta, el complejo de Biuret.
O C NH RC H O C NH RC H Cu2+ HN H CR C HN H CR O C O

Violeta-prpura El mtodo de biuret desarrollado por Gornall et al. permite cuantificar soluciones que contengan entre 1 y 10 mg de protenas por mililitros. M ATERIALES Y MTODOS: Reactivo de biuret: Disolver 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) y 6g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado en 500ml de agua destilada. Agitando constantemente, aadir 300ml de Na(OH) al 10%. Diluir hasta 1 litro con agua destilada y guardar en frasco de plstico. Solucin testigo: Albmina bovina a una concentracin de 5mg/ml en agua destilada. Protocolo: En el tubo blanco colocar 1 ml de agua destilada; en el tubo testigo colocar 1 ml de solucin testigo de albmina; en el tubo problema colocar 1 ml de la solucin problema. Agregar a cada uno de los tubos 4 ml de reactivo de biuret, agitando y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Con el tubo blanco llevar a cero de absorbancia al fotocolormetro (550 nm). Luego leer el tubo problema y el tubo testigo. En el trabajo prctico se prepararn varios tubos testigos a los fines de construr una curva de calibracin RESULTADOS
Tubo T1 T2 T3 P Absorbancia [Proteinas] (mg/ml

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DISCUSIN

BIBLIOGRAFA
- Problemas de Qumica. J.M. Esteban y J.M. Cavanillas. Ed. Alhambra. 4a. 1976. Espaa. - Clculos en Bioqumica. I.J.Segel. Ed. Acribia. Saragoza. Espaa. 1972. - Mtodos instrumentales de anlisis. H.H. Willard,.L.Merritt Jr., y J.A.Dean. Ed. CECSA. Mxico. 1974. - Anlisis Instrumental. D.A. Skoog y D.M. West. Ed.Interamericana. Mxico. 1975. - Qumica Clnica: Bases y Tcnicas. R.J. Henry, D.C. Cannon y J.W. Winkelman. Tomo I. 2a Ed. Jims. Barcelona. Espaa.1980. - Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3 Ed. NY. USA.2000 - Spectrophotometry and Spectrofluorometry A practical Approach. Edited by Michael G. Gore. Ed. Oxford University Press. Inc. NY. USA. 2000.

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TRABAJO PRACTICO N 2
PURIFICACIN, CUANTIFICACIN Y ANLISIS ESTRUCTURAL DE PROTENAS
Los problemas y la gua de estudio debern ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En caso de necesitar aclarar dudas los docentes estarn disponibles en sus horarios de consulta, en la ctedra. Los alumnos sern evaluados al final del TP (evaluacin escrita) y durante el desarrollo de la experiencia prctica (evaluacin oral), sobre los contenidos que se encuentran en la gua de TP. Debern concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

OBJETIVOS
- Conocer los fundamentos tericos de las tcnicas utilizadas en la purificacin y caracterizacin de protenas. - Valorar la importancia del dominio de diferentes tcnicas y del conocimiento acerca de las caractersticas particulares de la protena a purificar, para poder aplicarlos con criterio. - Adquirir y aplicar herramientas tericas para la resolucin de los problemas planteados.

TEMAS PARA REPASAR

123456Estructura de Protenas. Abreviaturas de los nombre de los aminocidos: cdigo de 1 y 3 letras. Equilibrio Acido-Base de amino cidos y de protenas. Coeficiente de sedimentacin. Enzimas proteolticas. Concepto Actividad especfica Temas 2-6 del programa de la materia.

INTRODUCCIN
Las protenas constituyen uno de los grupos de molculas biolgicas ms importantes en cuanto a su diversidad de funciones: catlisis, estructural, de movimiento, de almacenamiento o de respuesta inmune entre otras. Las protenas son macromolculas lineales constituidas por la unin de aminocidos. Estas estructuras lineales se pliegan adquiriendo una estructura tridimensional (estructuras secundaria y terciaria) particular que determinar su funcin. La secuencia de aminocidos de la protena (estructura primaria) est determinada a su vez por la informacin gentica contenida en la secuencia de nucletidos de los cidos nucleicos de un organismo (en general el ADN, en el caso de algunos virus es ARN). La protemica, ciencia que relaciona las protenas con sus genes, estudia el conjunto de protenas (proteoma) que se expresan en la clula a partir del genoma en un momento dado. Esto permite tener una imagen de todas las protenas expresadas en un determinado momento y bajo determinadas condiciones ambientales. Permite identificar aquellas protenas cuya presencia, ausencia o alteracin est relacionada con diferentes condiciones metablicas y/o patolgicas, correlacionandolas con diferentes estadios fisiolgicos o patolgicos. La enorme complejidad del proteoma de los organismos vivos obliga al empleo de diversas tcnicas para separar las protenas. Muchas de estas tcnicas, como la cromatografa lquida y la electroforesis entre otras, permiten tanto la separacin de protenas (purificacin) como su caracterizacin. Durante la separacin de las protenas es importante poder cuantificar el rendimiento del proceso de purificacin de las protenas de inters, para lo que se utilizan diferentes tcnicas espectroscpicas (fluorescencia, espectrofotometra). El anlisis de la estructura y de la actividad de las protenas nos permitir relacionar cambios en estos dos parmetros con condiciones fisilgicas o patolgicas.

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TCNICAS UTILIZADAS EN EL ESTUDIO DE PROTENAS:

PURIFICACIN 1- Fraccionamiento subcelular por centrifugacin diferencial y por gradiente de sacarosa. 2- Precipitacin salina. 3- Dilisis. 4- Cromatografa de filtracin por gel. 5- Cromatografa de intercambio inico. 6- Cromatografa de afinidad. 7- Cromatografa lquida de alta presin. 8- Electroforesis en geles. 9-Isolelectroenfoque y electroforesis bidimensional. CUANTIFICACIN 1-Espectrofotometra ANALISIS DE ESTRUCTURA 1- Espectrofluorimetra ANALISIS DE ACTIVIDAD 1- Actividad enzimtica 2- Unin de radioligandos 3-Formacin de complejo Ag-Ac 4- Conductancia a iones

2- Espectrofluorimetra 3- Elisa

2- Dicroismo circular 3- RMN 4- FTIR 5- MALDI-MS 6- Secuenciacin 7-Perfil hidroptico 8-Difraccin de rayos X 9- Comparacin de secuencias.

PROBLEMAS
1Forma y Dimensin (a) La tropomiosina, una protena muscular de 70 kDa, est formada por un superhelicoide de -hlices con dos hebras. Calcular la longitud de la molcula. (b) Suponer que un segmento protico de 40 residuos se pliega en una estructura -antiparalela de dos hebras con un giro en horquilla de 4 residuos. Cul es la longitud mxima de este motivo? La ubicacin lo es todo. Las protenas transmembranas contienen a menudo -hlices. Teniendo en cuenta que el interior de las membranas es muy hidrofbico, predecir qu tipo de aminocidos habra en estas hlices. Porqu una -hlice es especialmente adecuada para encontrarse en el entorno hidrofbico del interior de una membrana? Especies menores. En un aminocido como la alanina la forma principal a pH 7 en disolucin es la zwitterinica. Suponiendo un valor de pKa de 8 para el grupo amino y un valor de pKa de 3 para el cido carboxlico, calcular la proporcin entre la concentracin de la forma neutra del aminocido y (con el cido carboxlico protonado y el grupo amino neutro) y la forma zwitterinica a pH 7. Cuales de los siguientes aminocidos tendr mayor tendencia a encontrarse en el interior de una protena y cuales en su superficie? JSR - valina: (-CH-(CH3)2) + - lisina: (-CH2-CH2-CH2-CH2-NH3 ) - asprtico: (-CH2-COO-) - asparragina: (-CH2-CONH2) - leucina: (-CH2-CH1-(CH3)2) Mensaje oculto. Traducir la siguiente secuencia de aminocidos en cdigo de una letra: Leu-Glu-AlaArg-Asn-Ile-Asn-Gly-Ser-Cys-Ile-Glu-Asn-Cys-Glu-Ile-Ser-Gly-Arg-Glu-Ala-Thr. Concentrado en la concentracin. Una disolucin de una protena cuya secuencia incluye tres residuos de triptofano (trp), sin residuos de tirosina, ni de fenilalanina, tiene una absorbancia de 0,1 a 280 nm en una celda de 1 cm de paso ptico. Obtener la concentracin de la protena en unidades de

2-

3-

4-

5-

6-

31 molaridad. Si la protena tiene una masa molecular de 100 kDa, hallar la concentracin en -1 -1 miligramos de protena por mililitro de disolucin. trp =3400 cm .M . 7Movimiento lento. La tropomiosina, una protena muscular de 93 kDa , sedimenta ms lentamente que la hemoglobina (65 kDa). Sus coeficientes de sedimentacin respectivos son 2,6 S y 4,31 S. Cul es la carcteristica estructural responsable de su lentitud en la sedimentacin? Esferas que sedimentan Cual es la dependencia entre el coeficiente de sedimentacin S de una protena esfrica y su masa? Cunto ms rapidamente sedimentar una protena de 80 kDa que una de 40 kDa? Determinacin del tamao. Las movilidades electroforticas relativas de una protena de 30 kDa y una de 92 kDa utilizadas como estndar en un gel de SDS-poliacrilamida son, respectivamente, 0,8 y 0,41. Cul es la masa aparente de una protena que tiene una movilidad de 0,62 en este gel?

8-

9-

10- Una asociacin nueva? El gen que codifica una protena que tiene un nico puente disulfuro experimenta una mutacin que sustituye un residuo de serina por uno de cistena. Se quiere comprobar si el apareamiento de los sulfhidrilos en este mutante es el mismo que en la protena original. Proponer un experimento que resuelva esta cuestin. 11- Elegir la columna. El octapptido AVGWRVKS se digiri con tripsina. (a) Sera el intercambio inico o la exclusin molecular la tcnica ms apropiada para separar estos productos? Explicarlo (b) Suponer que el pptido se digiere con quimiotripsina. Cul sera la tcnica de separacin ptima? Explicarlo 12- Haciendo ms enzima? Durante la purificacin de una enzima un investigador realiza un paso de purificacin que produce un incremento en la actividad total dando un valor mayor que el que est presente en el extracto crudo. Explicar como se puede incrementar la actividad total. 13Problema de purificacin de protenas. Completar la siguiente tabla Procedimiento de purificacin Extracto puro Precipitacin con (NH4)2SO4 Cromatografa DEAEcelulosa Cromatografa de exclusin molecular Cromatografa de afinidad Protena total (mg) 20 000 5000 1500 500 45 Actividad total 4.000000 3.000000 1.000000 750 000 675 000 Actividad especfica Nivel de purificacin 1 Rendimiento (%) 100

14- Estructura cuaternaria. Una protena se purific hasta la homogeneidad. La determinacin del peso molecular por cromatografa de exclusin molecular da 60 kDa. La cromatografa en presencia de urea 6 M da una especie de 30 kDa. Cuando se repite la cromatografa en presencia de urea 6 M y mercaptoetanol 10 mM, aparece una especie molecular nica de 15 kDa. Describir la estructuira de la molcula. 15- Estructura terciaria. La secuencia de la protena FABP contiene slo un residuo triptofano, ubicado en su interior hidrofbico. El siguiente grfico muestra la emisin de fluorescencia de FABP cuando es excitada a 280 nm, a pH fisiolgico (a) y a pH cido (b). Qu conclusiones se pueden obtener acerca del efecto del pH sobre la estructura tridimensional de la protena?

a)
0.000
310 320 330

0.012

0.012

Intensidad de fluorescencia (UA)

intensidad de fluorescencia (UA)

0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000

pH 7

0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000

pH 2.5

a)
longitud de onda (nm)

b)
longitud de onda (nm)

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450

16- Transiciones hlice-ovillo. a) las medidas de NMR han demostrado que la poli-L-lisina es un ovillo estadstico a pH 7 pero se vuelve -hlice cuando el pH se eleva por encima de 10. Explicar esta transicin conformacional dependiente del pH. b) Predecir la dependencia del pH en la transicin hlice ovillo del poli-L-glutamato. 17- Secuencia de protenas I. Determinar la secuencia de un hexapptido basndose en los siguientes datos. Nota: Cuando no se conoce la secuencia, los aminocidos se separan con una coma. (ver datos en la Tabla de ruptura especfica de los polipptidos, al final de la gua).

Composicin de aminocidos Anlisis N-terminal del hexapptido Digestin por tripsina Digestin por carboxipeptidasa Digestin por quimiotripsina

(2R,A,S,V,Y) A (R,A,V) y (R,S,Y) no hay digestin (A,R,V,Y) (R,S)

18-

Secuencia de protenas II. Determinar la secuencia de un pptido de 14 aminocidos en base a los siguientes datos.

Composicin de aminocidos Anlisis N-terminal del pptido Digestin por carboxipeptidasa Digestin por tripsina Digestin por quimiotripsina Anlisis N-terminal del pptido Tratamiento con bromuro de ciangeno

(4S,2L,F,G,I,K,M,T,W,Y) S L (3S,2L,F,I,M,T,W) y (G,K,S,Y) (F,I,S) (G,K,L) (L,S) (M,T) (S,W) (S,Y) (F,I,S), S (2S,F,G,I,K,L,M*,T,Y) (2S,L,W)

in

32

33

DATOS 1 residuo de -hlice contribuye con 1.5 a la longitud total de la -hlice. 1 residuo de hoja plegada contribuye con 3.5 a la longitud total de la estructura . 1 residuo = 110 D

Ruptura especfica de los polipptidos Reactivo - Ruptura qumica Lugar de ruptura Bromuro de ciangeno O-Iodobenzoato Hidroxilamina 2-Nitro-5tiocianobenzoato Ruptura enzimtica tripsina clostripana Proteasa de Staphylococcus Lado carboxilo de los residuos metionina Lado carboxilo de los residuos triptofano Enlaces asparragina-glicina Lado amino de los residuos cistena

trombina quimiotripsina Carboxipeptidasa A

Lado carboxilo de los residuos lisina y arginina Lado carboxilo de los residuos arginina Lado carboxilo de los residuos aspartato y glutamato (el glutamato solo en ciertas condiciones) Lado carboxilo de los residuos arginina Lado carboxilo de los residuos tirosina, triptofano, fenilalanina, leucina y metionina. Lado amino del aminocido C-terminal (salvo arginina, lisina y prolina)

BIBLIOGRAFA
- Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3 Ed. NY.

USA.2000
- Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioqumica, Ed. Revert SA, 5Ed. Espaa 2003.

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TRABAJO PRCTICO N 3
CINTICA ENZIMTICA I

En la primera semana (Cintica Enzimtica I) se discutirn los aspectos tericos y, en la segunda y tercera semana (Cintica Enzimtica II y III) se desarrollar la parte experimental. Los alumnos sern evaluados al finalizar cada T.P de cintica (I, II y III) acerca de todos los apectos tericos del tema y de los fundamentos de las tcnicas utilizadas. Debern concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

OBJETIVOS
- Conocer el mecanismo por el cual transcurren las reacciones catalizadas por enzimas. - Comprender como influyen el tiempo de incubacin, la concentracin de enzima, la concentracin de sustrato, temperatura, pH, y la presencia de inhibidores sobre la velocidad inicial y la concentracin de producto formado en reacciones catalizadas por enzimas Michaelianas. - Interpretar el significado de las constantes cinticas KM y Vmax. - Valorar la importancia del trabajo prolijo y ordenado para la obtencin de resultados confiables.

TEMAS PARA REPASAR

- Soluciones amortiguadoras, - pH, - Fotocolorimetra.

INTRODUCCIN
Las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza protica. Una determinada enzima (E) se combina con un determinado sustrato (S) formando un complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el producto (P) y enzima libre (E):

E+S

ES

E+P

La mayora de las reacciones biolgicas transcurren lentamente si no son catalizadas; las enzimas hacen que el equilibrio de esas reacciones sea alcanzado rpidamente. Varios factores como a) el tiempo de incubacin; b) la concentracin de enzima; c) la temperatura del medio; d) el pH y e) la concentracin de sustrato influyen en el transcurso de la reaccin.

a) TIEMPO DE INCUBACIN: en la Fig. 1 se observa la variacin de las concentraciones de complejo enzimasustrato (E-S), de sustrato [S] y de producto [P], en funcin del tiempo. La velocidad inicial (Vo) corresponde a la velocidad medida dentro de un lapso de tiempo lo suficientemente corto como para que la cantidad de sustrato consumido sea despreciable respecto a la cantidad de sustrato inicial (en la prctica menos del 5% del total). La velocidad se expresa como la cantidad de producto formado por unidad de tiempo (por ej. moles/min).

35 [P] [S] [E] [ES] Fig.1. Variacin de la concentracin de las especies qumicas que participan en una reaccin catalizada por enzimas, en funcin del tiempo. [E]: concentracin de enzima; [S]: concentracin de sustrato; [ES]: concentracin [P]: de complejo enzima-sustrato; concentracin de producto.

tiempo

b) CONCENTRACIN DE LA ENZIMA: Velocidad en funcin de la concentracin de enzima. La concentracin de enzima ptima se elige un rango de concentracin de enzima tal que la velocidad inicial (Vo) sea directamente proporcional a la concentracin de la enzima

Fig 2. V elocidad de reaccin vs concentracin de enzima

E Concentracin de enzima ptima c) EFECTO DE LA TEMPERATURA DE INCUBACIN: Dentro de ciertos lmites, la velocidad de reaccin aumenta con la temperatura. En general la velocidad se duplica a cada incremento de unos 10C y viceversa. Existe una temperatura ptima, por encima de esta, la velocidad decrece rpidamente por desnaturalizacin de la enzima. La temperatura de mxima actividad no corresponde necesariamente a la temperatura de mxima estabilidad. Fig.4. Actividad enzimtica vs temperatura % Actividad mxima

Temperatura d) EFECTO DEL PH DEL MEDIO DE INCUBACIN: Cambios moderados en el pH afectan el estado inico de la enzima y con frecuencia tambin del sustrato. En general , la actividad ptima se encuentra entre pH 5 y pH 9 como la tripsina. ver Fig.5., sin embargo algunas enzimas como la pepsina Fig.6 tiene su ptimo a valores de pH bastante alejados de dichos lmites. A valores extremos de pH se produce desnaturalizacin de la enzima.

36 Actividad Actividad

10

pH

pH

A partir de estos grficos se puede determinar las constantes cinticas que caracterizan a una enzima: KM (constante de Michaelis) y Vmax (velocidad mxima), para un sustrato y en condiciones determinadas. KM: este valor corresponde a la concentracin de sustrato necesaria para alcanzar una velocidad igual a la mitad de la Vmax Vmax: es la velocidad que se alcanza cuando la enzima est saturada con sustrato (a altas concentraciones de sustrato). e) EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO: Variacin de la velocidad inicial en funcin de la concentracin de sustrato. Si aumenta la concentracin de S, mientras permanecen constantes las dems condiciones, V0 crece hasta un valor mximo. La velocidad crece hasta que la enzima es saturada por el S y se alcanza la velocidad mxima (Vmax).

Vo (a) Vmax 1 Vmax

1 Vo

(b)

Vmax
2

[S]

1 KM

1 [S]

Fig.6 (a) Curva de MichaelisMenten de Vo en funcin de la concentracin de S; (b) Grfico de Lineweaver-Burk o de dobles recprocas.

GUA DE ESTUDIO
1. Catalizadores. 2. Enzimas. Caractersticas. Sitio activo de una enzima: caractersticas. Cofactor. Coenzima. Holoenzima. 3. Clasificacin de enzimas. 4. Ubicacin de las enzimas en la clula. 5. A que se llama sustrato y producto?. 6. Mecanismo de accin de las enzimas. 7. Alteran las enzimas el equilibrio de la reaccin? 8. Cmo se mide la concentracin de una enzima?. 9. Qu es la actividad especfica de una enzima y en qu unidades se expresa?. 10. Factores que influyen en una reacin catalizada por enzimas.

37 11. Funcin de Michaelis Menten. Representacin grfica. 12. Velocidad inicial. Velocidad mxima. Unidades. 13. Porqu se debe trabajar a velocidad inicial? 14. KM. Unidades. Cmo se determina? 15. Ecuacin de Lineweaver-Burk. Representacin grfica. 16. Inhibicin reversible e irreversible, concepto. Inhibidores competitivos y no competitivos, concepto. Cmo se diferencian? cmo son las curvas de las directas e inversas de la velocidad en funcin de la concentracin de sustrato?. 17. Reacciones bisustrato. 18. Enzimas alostricas. Modelos.

PROBLEMAS
1. Explique el siguiente grfico
V

Tiempo

2. a. Grafique velocidad en funcin de concentracin de sustrato b. Grafique la inversa de velocidad en funcin de la inversa de la concentracin de sustrato.Identifique en cada una de estas curvas Km y Vm. 3. Qu relacin existe entre Km y la afinidad de una enzima por un determinado sustrato? 4. Cundo la concentracin de sustrato es igual a Km, Como es la velocidad inicial? 5.Qu relacin exste entre Km y sustrato cuando la reaccin catalizada por la enzima alcanza el 80% de la Vm? 6. Para medir la actividad cataltica de la fosfatasa cida de higado de rata, la preparacin enzimtica fue obtenida homogenizando 0.5 g de hgado en 10 ml de buffer. Se incubaron 0.2 ml de la preparacin ++ enzimtica a pH 5 y 37C en presencia de Ca durante 6', en un volumen de 0.4 ml de sustrato. Para detener la reaccin se agreg 3,4 ml de NaOH. Calcule los moles de producto formado por min. y por mg -1 -1 de tejido, sabiendo que la absorbancia fue 0.2, : 17500 M cm . 7. Se incubaron 200 l de una preparacin enzimtica (0,3 mg protenas/ml) en presencia de 0,5 ml del sustrato correspondiente y de 0,5 ml de buffer pH 5, durante 15 min. a una temperatura constante de 37C. La reaccin se detuvo por dilucin del incubado hasta un volumen final de 10 ml con NaOH 0,1 M. La absorbancia de esta solucin fue 0,215. Calcular los moles de producto formado por min. y por mg de protenas. Solucin testigo 2 M Abs. 0,15.

8. La trehalasa cataliza la hidrlisis de la trehalosa, en determinadas condiciones (pH 7, 30C). Una muestra de trehalasa presenta un valor de Vm de 1.5 mol de glucosa formada por minuto por mg de

38 protena. Cul ser el valor de Vm para la misma preparacin enzimtica pero en presencia de de 5 mmoles de trehalosa 6-fosfato el cual es un inhibidor competitivo con Ki = 2mmol/ml? 9. Pseudomonas aeruginosa cultivada en un medio de acetato posee una enzima que puede hidrolizar la propionamida. CH3CH2CONH2 + H2O -----------------> CH3CH2COOH + NH3 los estudios de velocidad inicial en los que se midio la produccin de amonaco a partir de la propionamida o a pH 7 y 37 C demostraron que la urea inhibe esta reaccin. Examinando los efectos de dos concentraciones diferentes de urea sobre un rango de concentraciones de propionamida se obtuvieron los siguientes resultados:

[Propionamida]

VELOCIDAD INICIAL (moles de NH3 liberados/min/mg de protena) SIN INHIBIDOR CON INHIBIDOR (Urea) 1mmol/ml 2 mmol/ml 76 95 123 188 277

5 6.7 10 20 50

160 194 263 400 576

111 140 183 279 400

Determinar la Km para las diferentes condiciones. Acta la urea como un inhibidor competitivo o no competitivo?

10. A partir de los siguientes datos de una reaccin enzimtica, determinar a) tipo de inhibicin b) KM del sustrato.

Concentracin de S (mM)

VELOCIDAD (g de producto formado/hora) Sin inhibidor Con inhibidor 6 mM 88 121 149 257 313

2 3 4 10 15

139 179 213 313 370

11. Se ha aislado una enzima dimrica que contiene dos centros de activos idnticos. La unin del sustrato a un centro activo disminuye la afinidad por el sustrato del otro centro activo. Qu modelo alostrico se ajusta mejor a esta cooperatividad negativa (concertado o secuencial)?

39

TRABAJO PRCTICO N 4
CINTICA ENZIMTICA II

PARTE PRACTICA I ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA CIDA DE HGADO

OBJETIVOS
- Medir la formacin de producto en funcin del tiempo de incubacin. - Determinar la variacin de la velocidad inicial en funcin de la concentracin de la enzima. Es decir, se determinarn las condiciones ptimas de tiempo de incubacin y de concentracin de enzima, las que sern usadas durante el trabajo prctico siguiente para determinar KM y Vmax.

FUNDAMENTO DE LA REACCIN
La fosfatasa cida de hgado cataliza la siguiente reaccin: p-nitrofenilfosfato + H2O p-nitrofenol + PO4
3-

HO P O OH O

OH

O-3

Enzima H+
+

+ Enz + PO4
O2N

OH

+ H2O

O2N

O2N

p-nitrofenilfosfato

p-nitrofenol

p-nitrofenolato

El sustrato p-nitrofenilfosfato disdico, es una reactivo artificial que tiene la propiedad de ser hidrolizado por esta enzima del hgado y de otros tejidos, por ello puede ser usado para estudiar dichas enzimas. La reaccin es medida siguiendo la cantidad de producto formado, el p-nitrofenol, el cual se puede medir mediante fotocolorimetra en un medio alcalino a 410 nm (Coeficiente de extincin molar: 17500) (ref. Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan vol. XXXI).

MATERIALES Y MTODOS
Preparacin de la enzima: Homogeneizar (en homogeneizador a embolo) 0.25 g de hgado en 15 ml de agua destilada. Dejar en bao de hielo durante 10 min. En esas condiciones hipo-osmticas, se rompen los lisosomas que contienen la enzima, la cual queda soluble. Luego llevar la suspensin a 30 ml con buffer actico- acetato de sodio, pH 5, y 0,2 M. La suspensin queda con una concentracin de 1 mg de protena por ml.

40 Sistema de incubacin: Contiene cantidades variables de los siguientes componentes: Sustrato: p-nitrofenilfosfato, 25 mM. PM 371,12. Buffer: acido actico- acetato de sodio, pH 5, 0,1 M. Enzima: homogeneizado de hgado 1 mg de protena / ml. Activador: Cl2Ca 11 mM. Inactivador: NaOH 0.1 M. Recomendaciones: Colocar en un tubo todos los componentes menos la enzima. La reaccin comienza con el agregado de la enzima y la incubacin a 37C. Mezclar rpidamente y continuar la incubacin durante un tiempo que se indicar en cada caso. La reaccin se detiene por el agregado de 5 ml de NaOH 0.1 M. El lcali, por un lado inactiva a la enzima y por otro da el medio alcalino necesario para que el producto (p-nitrofenol) desarrolle color. Es importante hacer en cada caso un tiempo de cero de incubacin, este tubo contiene lo mismo que los tubos problema pero con la enzima agregada despus del NaOH. Este tubo se usa como blanco para el fotocolormetro.

PROTOCOLO A) CURVA DE TIEMPO :

Tubo N 1 2 3 4 5 blanco
o

sustrato l 100 (5 mM) 100 100 100

Cl2Ca l 100 100 100 100 100 100

buffer l 250 250 250 250 250 250

enzima l 100 (0,1 mg prot) 100 100 100 100 100

tiempo (min) 10 15 20 25 30 0

100 100

Incubar a 37C. Al cabo del tiempo de incubacin frenar la reaccin agregando 5 ml de NaOH 0.1 M. En el blanco la enzima debe aadirse despus del alcali. Leer en el fotocolormetro a 410 nm y calcular los moles de producto formado. RESULTADOS Tubo N 1 2 3 4 5
o

Absorbancia

moles de P

moles de P/min

41 GRFICO

CONCLUSIONES

B- CURVA DE CONCENTRACIN DE ENZIMA

Tubo N 1 2 3 4 5 blanco
o

Sustrato (l) 100 (5 mM) 100 100 100

Cl2Ca (l) 100 100 100 100 100 100

Buffer (l) 300 250 200 150 100 100

enzima (l) 50 (0,05 mg prot) 100 (0,1 ) 150 (0,15 ) 200 (0,2 )

tiempo (min) SEGN LO DETERMINADO EN: A

100 100

250 (0,25 ) 250 ( )

Incubar a 37C durante el tiempo determinado en A. Frenar la reaccin agregando 5 ml de NaOH 0.1 M. En el blanco la enzima debe aadirse despus del lcali. Leer en el fotocolormetro a 410 nm y calcular los moles de producto formado.

42 RESULTADOS Tubo N 1 2 3 4 5
o

Absorbancia

moles de P

moles de p/min

GRFICO

CONCLUSIONES

43

TRABAJO PRCTICO N 5
CINTICA ENZIMTICA III

PARTE PRCTICA II ESTUDIO SOBRE LA FOSFATASA CIDA DE HGADO

OBJETIVO
- Determinar los valores de KM y Vmax de la fosfatasa cida de hgado.

PROTOCOLO PREPARACIN DEL SISTEMA DE INCUBACIN:

Tubo 1 2 3 4 5 blanco sustrato (l) 50 (2,5 mM) 100 (5 mM) 150 (7,5 mM) 200 (10 mM) 250 (12,5 mM) 100 Cl2Ca (l) 100 100 100 100 100 100 Buffer (l) 250 200 150 100 50 200 enzima (l) SEGN LO ESTIMADO EN: B tiempo (min) SEGN LO ESTIMADO EN: A

Incubar a 37C segn el tiempo determinado en A. Luego agregar a cada tubo 5 ml de NaOH 0.1 M. En el blanco la enzima se aade despus del alcali. Leer en el fotocolormetro a 410 nm y calcular los moles de P formado. ANLISIS DE DATOS: a) Calcular las inversas de la concentracin de sustrato indicadas en la tabla. b) calcular las inversas de moles de producto formados en cada tubo. c) graficar 1/Vo en funcin de 1/[S]. d) Determinar los valores de KM y Vmax. RESULTADOS: Curva de Saturacin Tubo N 1 2 3 4 5
o

Absorbancia

moles de P

moles de P/min

44

Curva de dobles recprocas Tubo N 1 2 3 4 5

o

1/V

1/[S]

45 CONCLUSIONES

DISCUSIN DE TRABAJOS CIENTFICOS

GUA DE ESTUDIO.

Trabajo cientfico: Jung G.Y. and Stephanopoulos G. (2004). A functional protein chip for pathway optimization and in vitro metabolic engineering. Science 304: 428-431. 1. Escriba la cita bibliogrfica completa (busque en bases de datos tales como PubMed). 2. Optimizacin de vas metablicas: a) cul es su inters?, b)dnde reside su dificultad?, cmo puede encararse?. 3. Qu son los microarreglos?, en qu contexto se comenzaron a desarrollar?. 4. Cul es el objetivo del presente trabajo? 5. Cul es la estrategia experimental elegida? (palabras clave: fusin RNA-protena, polilisina, DNA, hibridizacin). 6. Cules son las dos reacciones acopladas que se usan para poner apunto el sistema experimental?. Cul es la utilidad del DNA marcado con fluorescena?. Cmo se detecta el producto de estas reacciones acopladas?. Describa los experimentos realizados para poner a punto la tcnica (Figs. 1 y 2). 7. Qu es la trehalosa y cul es su importancia? 8. Cul es la va metablica a cuyo estudio se aplica la tcnica desarrollada? 9. Describa la Fig. 3. 10.Cules son las conclusiones alcanzadas respecto al funcionamiento de esta va metablica? Es posible generalizar estas conclusiones a otras vas metablicas?.

BIBLIOGRAFA
. Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioqumica, Ed. Revert SA, 5Ed. Espaa 2003. . Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3Ed. NY. USA. 2000. . Harper H.A, Manual de qumica fisiolgica. Ed. El manual moderno 1980 . Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimologa. Ed Aguilar. 1967. . Morris J., Fisicoqumica para bilogos. . Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996. . Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA. Mxico, 1995. - Methods Enzimology ed. Colowick-Kaplan Vol. XXXI.

46

TRABAJO PRCTICO N 6
FOTOSNTESIS
Los problemas y la gua de estudio debern ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En caso de necesitar aclarar dudas, los docentes estrn disponibles en sus horarios de consulta en la ctedra. Los alumnos sern evaluados al final del TP (evaluacin escrita) y durante el desarrollo de la experiencia prctica (evaluacin oral), sobre los contenidos que se encuentran en la gua de TP. Debern concurrir con guardapolvo, gafas, guantes, cabello recogido y calzado cerrado.

OBJETIVOS
- Valorar la importancia de la fotosntesis como proceso necesario para la vida en el planeta - Conocer los procesos bioqumicos y termodinmicos involucrados en el proceso. - Comprobar algunos aspectos de la fotosntesis por medio de experimentos.

TEMAS PARA REPASAR

- Termodinmica de las reacciones redox.

INTRODUCCIN
La fotosntesis es un proceso que puede tener lugar tanto en clulas de plantas y como de bacterias verde-azules; por medio de este proceso estos organismos son capaces de utilizar la luz solar como fuente de energa para efectuar la sntesis de ciertos compuestos. La ecuacin global de la fotosntesis es : Luz 6 CO2 + 6 H2O -----------------> C6H12O6 + 6O2 Puede resolverse en dos procesos caracterizados por el tipo de reacciones que se realizan en cada uno, estas son: reacciones dependientes de la luz (o reacciones claras): la energa luminosa es captada por los pigmentos y la transforman en ATP y NADPH y simultaneamente se libera oxgeno molecular. Reacciones de fijacin del carbono (o de fase oscura): llamada as porque no es necesaria la luz para llevarse a cabo; aqu el ATP y el NADPH se emplean como fuentes de energa y poder reductor, respectivamente, y se produce la reduccin del CO2 y la sntesis de glucosa. Fotlisis del agua: Esta reaccin se conoce como reaccin de Hill: H2O + A ----------------> AH2 + 1/2 O2 El estudio del transporte electrnico inducido por la luz comienza con el descubrimiento de R.L Hill: "La iluminacin de cloroplastos en presencia de aceptores electrnicos artificiales provocaba el desprendimiento de oxgeno y la simultnea reduccin del aceptor. En la fotosntesis normal el aceptor es el NADP pero en la reaccin de Hill se utiliza un aceptor artificial por ejemplo, un colorante que al reducirse se decolora.

47

GUIA DE ESTUDIO
1. Concepto de fotosntesis. 2. Concepto de reacciones dependientes de la luz y de fijacin del carbono. 3. Formas de captacin y transferencia de Energa. 4. Fuerza electrn-motriz. 5. Fuerza protn motriz 6. Potencial redox. 7. Diferencia entre mitocondrias y cloroplastos. 8. Dadores y aceptores de electrones. 9. Importancia de la reaccin de Hill. 10. Diferencias entre fosforilacin a nivel de sustrato, fosforilacin oxidativa y fotofosforilacin. Ejemplos.

Rol Dual de citocromo b6f (cytochrome b6f) y citocromo c (cytochrome c) en cianobacterias como ejemplo de transporte electrnico y fosforilacin en la fotosntesis y en la cadena respiratoria. Estos organismos utilizan citocromo b6f, citocromo c y plastoquinonas para la fosforilacin oxidativa y la + fotofosforilacin. (a) En la fotofosforilacin los electrones fluyen desde el agua al NADP (b) En la fosforilacin oxidativa los electrones fluyen desde el NADH al O2. Ambos procesos son acompaados por el movimiento de protones a travs de la membrana.

Figura tomada de: Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3Ed. NY. USA. 2000.

48

Integracin de fotosistemas I y II en el cloroplasto.

Este esquema en Z muestra el transporte de electrones transferidos desde el agua (abajo a la izquierda) + hacia el NADP ( a la derecha) en la fotosntesis no cclica. La posicin en escala vertical de cada portador de electrones refleja su potencial de reduccin estandar. Para elevar la energa de electrones derivados + del agua al nivel energtico requerido para reducir NADP a NADPH, Los electrones deben ser impulsados por fotones absorbidos en PSI (Photosystem I o Fotosistema I) y PSII (Photosystem II o Fotosistema II) (ver flechas anchas). Un fotn es requerido por un electrn de cada Fotosistema. Luego de la excitacin los electrones de alta energa fluyen corriente abajo a travs de una cadena transportadora. Los protones se mueven a travs de las membranas tilacoidales durante la lisis del agua y durante el transporte de electrones a travs del complejo citocromo b6f (o cytochrome b6f) generando un gradiente de protones que es central para la formacin de ATP. La flecha punteada indica la va cclica de la transferencia de electrones, donde solo esta involucrado PSI, los electrones regresan por una va cclica al + PSI, en lugar de reducir NADP a NADPH.

Direccin del flujo de electrones

Adaptado de : Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3Ed. NY. USA. 2000.

49

PARTE PRACTICA

Mecnica del TP:

1) Determinar el o los objetivos de cada experiencia prctica. 2) Enunciar la o las hiptesis que se pondrn a prueba con cada una de las experiencias. 3) Elaborar un protocolo de trabajo tomando en cuenta la informacin disponible en la Gua de TP. 4) Desarrolar la experiencia y registrar los resultados. 5) Discutir y fundamentar adecuadamente los resultados obtenidos. Las preguntas que se encuentran en la guia deben ser usadas para orientar la discusin de los diferentes aspectos del problema que se aborda con cada una de las experiencias. 6) Exponer los resultados de la experiencia prctica utilizando un lenguaje adecuado, detallando claramente: Objetivos, Hiptesis, Materiales y Mtodos, Resultados y Discusin. 7) Evaluacin escrita al final del TP.

EXPERIENCIA N 1: Fotosntesis y luz. Liberacin de oxgeno y fijacin de CO2.

MATERIALES Material vegetal: un trozo de Elodea Solucin de bicarbonato de sodio al 1% P/V. Tubos de ensayo, tapones de goma atravesados por un tubo de 0,5 cm de dimetro, pipetas de 0,2 ml. Fuente de luz blanca. Soportes y gradillas. PROCEDIMIENTO: 1. Disponer los elementos en la manera indicada en la Fig.1, teniendo en cuenta que desde el tubo de ensayo hasta la pipeta graduada el sistema debe estar lleno de solucin de bicarbonato de sodio al 1%. 2. Marcar el nivel del lquido contenido en la pipeta. 3. Medir el pH de la solucin de bicarbonato de sodio 4. Conectar la fuente de luz a 10 cm de distancia y observar la base del tallo de Elodea. 5. Controlar el pH de la solucin a los 45 min de iniciada la experiencia.

Fig.1

Equilibrio del CO2 en agua: H2O + CO2 H2CO3 HCO3 + H CO3 + H

+ = +

50 a) b) c) d) e) Por qu utiliza una solucin de bicarbonato de sodio en lugar de agua? Cmo es la reaccin de la que participa el dixido de carbono disuelto en agua? Qu efecto produce el desprendimiento de oxgeno en el sistema? Qu sucedera en el sistema si modificara la distancia entre la planta y la lmpara? Cambi el pH?

EXPERIENCIA N 2: Consumo de CO2

MATERIALES: Material vegetal: Elodea Dos tubos de ensayo Solucin de rojo de fenol Fuente de luz blanca. Papel de aluminio. PROCEDIMIENTO: 1. Colocar 10 ml de solucin de rojo de fenol en dos tubos de ensayo e insuflar aire con una pipeta hasta que la solucin vire de color rojo a color amarillo. 2. Introducir en cada tubo de ensayo un trozo de Elodea. 3. Exponer un tubo a la luz y cubrir el otro con papel de aluminio (oscuridad). 4. Observar los tubos a los 45 min de iniciada la experiencia.

Fig. 2

CO 2

Rojo

a) b) c) d) e)

Qu funcin cumple el Rojo Fenol? Por qu el color vira a amarillo cuando se insufla dixido de carbono? Cul es la fuente de dixido de carbono? Cambi el pH? Que sucedera en el sistema en ausencia de luz?

51

EXPERIENCIA N 3: Fotlisis del agua. Reaccin de Hill.

MATERIALES: Material vegetal: hojas de Palam-palam o de espinaca (50 g) Solucin de NaCl 0,035 M. Solucin de NaCl 0,35 M. -4 Solucin de 2,6-diclorofenolindofenol 2,5 x 10 M o Licuadora (tanto el vaso de la licuadora como las soluciones deben mantenerse en fro (0-4 C) Aislamiento de cloroplastos Homogeneizar en licuadora 50 g de material vegetal en 100 ml de NaCl 0,35 M durante 1 min. Filtrar por gasa doble, recoger en un vaso y mantener en bao de hielo. Tomar 30 ml del homogeneizado y centrifugar a 1000 rpm durante 5 min. Decantar y eliminar el precipitado de restos celulares. Centrifugar el sobrenadante a 4000 rpm durante 10 min. Separar el sobrenadante y resuspender el precipitado de cloroplastos en NaCl 0,035 M (1 ml). Mantener en bao de hielo.

PROCEDIMIENTO:

2,6 di-Cl-fenolindofenol

f) g) h) i) j)

Porqu utiliza NaCl 0.35 M para realizar el homogeneizado? Porqu utiliza NaCl 0.035 M para resuspender los cloroplastos? Qu funcin cumple el 2,6-diclorofenolindofenol? Cmo podra demostrar la produccin de oxgeno? Cmo podra mejorar esta experiencia?

52

PROBLEMAS
1. Interprete el siguiente grfico en el que se observan varios factores que afectan la velocidad de la fotosntesis: * Velocidad de fotosntesis 1 2 3

Efecto de la intensidad de luz a: 1. 25 C y CO2 0,4% o 2. 15 C y CO2 0,4% o 3. 25 C y CO2 0,01%

o

Intensidad de la luz incidente

Qu indica la zona marcada con *?

2. Explique las causas de las interconversiones entre RuDp (ribulosa 1,5-bisfosfato) y PGA (3fosfoglicerato) en experimentos de fotosntesis, cuando varan la intensidad de iluminacin y la concentracin de CO2. Luz
Oscuridad 1% CO2 0,003% CO2

Concentracin

PGA

RUDP

RUDP
Tiempo (min) Tiempo (min)

PGA

3. Calcular G para la reduccin del NADP por Ferrodoxina.

o +

4. Calcular la fuerza electron-motriz expresada en voltios, registrada por un electrodo sumergido en una + o solucin que contiene las siguientes mezclas de NAD y NADH a pH=7 y 25 C, con referencia a una semicelda de 0,00V: + a) NAD 1 mM y NADH 10 mM + b) NAD 1 mM y NADH 1 mM + c) NAD 10 mM y NADH 1 mM 5. Ordenar las siguientes sustancias segn su tendencia creciente a ceder electrones: a)clorofila del fotosistema I, b) plastoquinona, c) ferredoxina, d) agua, e) Feofitina (pheo),

6. Ordenar las siguientes sustancia segn su tendencia creciente a aceptar electrones: + a)clorofila del fotosistema II, b) P680*, c) NADP , d) plastocianina. 7. Suponiendo que se necesitan 8 cuantos de luz para la incorporacin de una molcula de CO2 en molculas de glcidos por medio de la fotosntesis, calcule la eficiencia termodinmica en condiciones estndar, para la sntesis de 1 mol de glucosa, si la longitud de onda de la luz utilizada es a) 400 nm y b) 750 nm. (Energa necesaria para la sntesis de glucosa = 686 Kcal).

53 8. Cul es la diferencia entre las cadena transportadoras de electrones que tienen lugar en mitocondrias y en cloroplastos? Calcule el G para la transferencia de electrones que ocurre en ambos casos y justifique los resultados. 9. El aparato fotosinttico del alga verdeazulada contiene grandes cantidades de ficoeritrina y ficocianina, adems de la clorofila A. La ficoeritrina tiene una absorcin mxima entre 480 y 680 nm; la ficocianina a 620 nm. Sugerir la misin de estos pigmentos.

10. Observe y analice el siguiente grfico. Indique el tipo de fotofosforilacin y justifique su respuesta.

- - - moles de oxgeno liberado ___ moles de fosfato esterificado

Tiempo

11. Observe y analice el siguiente grfico. Indique el tipo de fotofosforilacin y justifique su respuesta.

- - - moles de oxgeno liberado ___ moles de fosfato esterificado

Tiempo

DATOS DE POTENCIAL REDOX: Para resolver los problemas. + Agua: +0,82 V NADP : -0,324 V Ferredoxina: -0,4 V P700: +0,4 V P680: +0,95 V P680*: -0,95 V Feofitina (Pheo): -0.75 V Plastoquinona: +0,1 V + Plastocianina: +0.13V NAD : -0.32V

54

BIBLIOGRAFA
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3Ed. NY. USA. 2000. . Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioqumica, Ed. Revert SA, 5Ed. Espaa 2003. . Hall D.O., Rao K. Fotosntesis. Ed. Omega, Barcelona, 1977. . Tribe M y Whitaker P. Cloroplastos y motocondrias. Ed.Omega, Barcelona, 1977. . Andreo C., Vallejos R. Fotosntesis. Serie Biologa, monografa n 30 OEA, 1984. . Molt A.S. et al. 1951, Plant Physiology, 26, 164-175. . Torres H.M., Carminatti H. Y Cardini E. Bioqumica General Ed. El Ateneo, Bs.As. 1983. . Harper H.A, Manual de qumica fisiolgica. Ed. El manual moderno 1980 . Morris J., Fisicoqumica para bilogos. . Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996. . Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA. Mexico, 1999.
o

55

TRABAJO PRACTICO N 7
MECANISMOS DE TRANSDUCCIN DE ENERGA
Los problemas y la gua de estudio debern ser resueltos por los alumnos antes de concurrir a la clase. En caso de necesitar aclarar dudas los docentes estrn disponibles en sus horarios de consulta, en la ctedra. Los alumnos sern evaluados al final del TP (evaluacin escrita) y durante la discusin del trabajo cientfico (evaluacin oral), sobre los contenidos que se encuentran en la gua de TP.

OBJETIVOS
- Reconocer la aplicabilidad de las leyes de la fsicas a los sistemas biolgicos. - Analizar fenmenos biolgicas desde un punto de vista termodinmico. Fotosntesis, respiracin y motores moleculares como ejemplos.

TEMAS PARA REPASAR:

Energia libre de Gibbs; reaciones de oxido reduccin; transferencia de energia en la fotosintesis; cadena respiratoria; fuerza proton motriz; motores moleculares.

GUIA DE PROBLEMAS
1- Condiciones estndar frente a la vida real. La aldolasa cataliza la siguiente reaccin en la gliclisis: aldolasa Fructosa 1,6-bifosfato
0

dihidroxiacetona fosfato + gliceraldehdo 3-fosfato

-1 -1.

El G para esta reaccin es de + 5,7 kcal.mol , mientras que elG en la clula es -0,3 kcal.mol Calcular la relacin entre reactantes y productos en el equilibrio y en condiciones intracelulares. Utilizando los resultados obtenidos explicar: cmo puede resultar esta reaccin endergnica en condiciones estandar y exergnica en condiciones intracelulares?

2- No siempre es lo mismo. Las concentraciones de ATP, ADP y Pi difieren segn el tipo de clula, consecuentemente la liberacin de energa libre para la hidrlisis de ATP ser tambien diferente segn el tipo de clula. Utilizando los datos de la tabla siguiente, calcular G para la hidrlisis de ATP en las 0 clulas de msculo, hgado y cerebro. Teniendo en cuenta que el G para esta reaccin es de - 7,3 -1 kcal.mol , ATP (mM) 3,5 8,0 2,6 ADP (mM) 1,8 0,9 0,7 Pi (mM) 5,0 8,0 2,7

Hgado Msculo Cerebro

3- Fuerza cida: El pK de un cido es una medida de su potencial de transferencia de grupos protnicos. 0 a) Establecer una relacin G y pK. 0 b)Cul es el G para la inizacin del cido actico, si su pK es de 4,8?

56 4- Los opuestos se atraen. El grfico siguiente muestra como el G para la hidrlisis de ATP vara en 2+ 2+ funcin de la concentracin de Mg (pMg=log 1/[ Mg ]). 2+ a) Cmo afecta el descenso de [Mg ] al G para la hidrlisis de ATP? b) Cmo se puede explicar este efecto?
0

36 35

8.4 8.2 8.0 7.8 7.6

-G (kj.mol )

-1

34 33 32

7.4 31 30 2 3 4 5 6 7 8 7.2

pMg2
5- Cambio de divisas. Para una fuerza protn-motriz de 0,2 V (negativa en el lado de la matriz). Cul es el valor mximo del cociente [ATP]/ [ADP] [Pi ] compatible con la sntesis de ATP? Calcular el valor de este cociente de tres maneras, suponiendo que el nmero de protones translocados por cada ATP formado es dos, tres, y cuatro respectivamente. La temperatura es de 25C.

6- Cruce de caminos. Es posible determinar el lugar exacto donde acta un inhibidor de la cadena respiratoria gracias a la tcnica de punto y corte. Britton Chance diseo elegantes mtodos espectroscpicos para determinar el cociente entre las formas oxidada y reducida de cada uno de los transportadores. Este clculo es posible porque cada uno de los estados tiene un espectro de absorcin caracterstico, tal y como se ilustra en el grfico adjunto para el caso de citocromo c. Si usted se encuentra en posesin de un inhibidor y descubre que al aadirlo a mitocondrias que respiran, los transportadores localizados entre el NADH y QH2 se encuentran ms reducidos y los transportadores localizados entre el fitocromo c y el O2 se encuentran ms oxidados cmo acta el inhibidor?

-G (kcal.mol )
-1

57 7- Distancia. Supongamos que la transferencia de energa entre dos molculas de clorofila a distantes entre s 10 tiene lugar en 10 picosegundos. Supongamos que la distancia se incrementa hasta 20 manteniendo constantes el resto de los factores. Cunto tardar en ocurrir la transferencia de energa? 8- Se dice que es lenta? A su mxima velocidad una molcula de quinesina se desplaza con una velocidad de 6400 por segundo. Teniendo en cuenta que el tamao de la regin motriz del dmero de quinesina es de 80 , calcular su velocidad en unidades de su tamao por segundo. Segn esta relacin cul sera la velocidad correspondiente de un automvil que tuviera una longitud de 3 metros? 9- Levantamiento de pesos. Un nico dominio motor de la miosina puede desarrollar una fuerza de aproximadamente 4 piconewtons (4pN) Cuntas veces puede levantar su peso un dominio motor de -2 miosina? Tener en cuenta que 1 newton = 1 kg fuerza (1kg masa m.s ). Considerar que la masa molecular del dominio motor es de 100 kDa. 10- Las helicasas como motores. Las helicasas tales como la PcrA pueden utilizar una hebra sencilla de ADN como gua. En cada ciclo la helicasa se desplaza una base en el sentido 3-5. Teniendo en cuenta que la PcrA en presencia de un molde formado por una hebra sencilla de ADN puede hidrolizar ATP con una velocidad de 50 molculas por segundo (se hidroliza una molecula por ciclo) y que la longuitud de una base de ADN es 3,4 . Cmo es esta velocidad comparada con la velocidad de la quinesina que es de 6400 por segundo?A qu se puede deber la diferencia de velocidad entre estos dos motores moleculares?. 11- Nuevamente se mueve. Cuando a las bacterias tales como E. coli se las mantiene en ayunas durante un perodo de tiempo suficiente, dejan de moverse. Sin embargo, cuando estas bacterias inmviles se colocan en un medio cido nuevamente comienzan a moverse. Aportar una explicacin teniendo en cuenta el mecanismo de movimiento del flagelo de una bacteria. 12- Arrastrar cargas. Considrese la actividad de una nica molcula de quinesina que transporta una vescula a lo largo de un microtbulo. La fuerza necesaria para arrastrar una partcula esfrica de radio a con una velocidad en un medio de viscosidad es: F= 6 a x -1 Supongamos que una esfera de 2 m de dimetro se transporta con una velocidad de 0,6 m. s en un -1 -1. medio acuoso con una viscosidad de = 0.01 g.cm . s -2 a) Cunta es la fuerza desarrollada por la quinesina? Expresar el valor en dinas (1 dina= 1 g.cm. s ) b) Cunto trabajo realiza en un segundo? Expresar el valor en ergios (1 ergio=1 dina cm). c) Un motor de quinesina hidroliza aproximadamente 80 molculas de ATP por segundo. Cunta es la energa asociada a esta hidrlisis de ATP expresada en ergios? Comparar este valor con el trabajo realizado. 13- Dos soluciones de igual volumen estn separadas por una membrana permeable a los iones K y Cl pero no a los iones P . Las concentraciones iniciales se indican a continuacin: [K ] = 0.05 M [Cl ] = 0.05 M
+ + -

[K ] = 0.15 M [P ] = 0.15 M

Calcule las concentraciones a ambos lados de la membrana, una vez que se establece el equilibrio. Qu lado de la membrana tiene carga positiva? Calcule el potencial de Nernst a travs de la membrana 0 si la temperatura es de 37 C. 14- Una solucin 0.10M de palmitato de sodio se separa de un volumen igual de solucin 0.20M de cloruro de sodio mediante una membrana permeable a los iones sodio y cloruro, pero no a los iones palmitato. Calcule las concentraciones finales y el potencial de Nernst de 298 K, suponiendo comportamiento ideal.

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DISCUSIN DE TRABAJOS CIENTFICOS

GUA DE ESTUDIO.

Trabajo cientfico: Yasuda, R., Noji, H., Kinosita, K., & Yoshida M.. (1998). F1-ATPase Is a Highly Efficient Molecular Motor that Rotates with Discrete Steps. Cell. 93: 11171124.

1. Cal es la funcin del ATP sintetasa? Cmo es su estructura? Cul es la funcin de cada una de las subunidades? 2. Qu fenmeno se observa si la parte F1 se encuentra en ausencia de la parte F0 en un medio que contiene ATP? 3. Cmo se logra experimentalmente observar la rotacin del F 1-ATPase? 4. Explicar brevemente los resultados que se observa en la Figura 2a y 2b. 5. A cul de los experimentos que se realizaron en los T.Prcticos de la materia, se asemeja el experimento del grfico 2b.

BIBLIOGRAFA
. Lehninger Principles of Biochemistry. David L. Nelson & Michael M. Cox. Worth Publishers. 3Ed. NY. USA. 2000. . Stryer L, Berg, JM y Tymoczko, JL. Bioqumica, Ed. Revert SA, 5Ed. Espaa 2003.