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Examen sistemtico de cultivos puros de microorganismos, sea los que se guardan en colecciones o recogidos al azar. La investigacin de poblaciones microbianas mezcladas, sea del suelo, cloacas, heces, aire, polvo, abonos, etc., previa una seleccin y de acuerdo con los mtodos idnticos a los empleados con cultivos puros.
Los mtodos se han dividido en dos grupos, segn sea si el antagonista, cuya capacidad se analiza, y el organismo frente al cual se prueba dicha propiedad, se cultivan al mismo tiempo (implantacin simultnea) o si el organismo de prueba se siembra despus que el antagonista ha desarrollado un cierto tiempo (implantacin sucesiva). Esta distincin, que pudiera parecer trivial a primera vista, es importante en la prctica, porque el primero de los mtodos no puede mostrar efectos positivos si se trata de la produccin de un antibitico incapaz de disolver clulas antagonizadas, excepto que el antagonista crezca mucho ms rpidamente. Por el otro lado, si el organismo de prueba se introduce despus que el antibitico se ha producido, ser posible observar efectos tanto si la sustancia activa bacteriosttica, o sea, simplemente capaz de impedir el desarrollo del germen de prueba, si es bactericida, es decir que mata a los organismos, o bien bacterioltica, con la propiedad de disolver otros microbios. Asimismo pueden subdividirse dichos mtodos de acuerdo a si el antagonista esta presente o ausente mientras el germen de prueba se esta desarrollando. Este echo es de mucha importancia, ya que en determinados casos solo hay resultados positivos (es el caso de sustancias muy inestables) cuando el antibitico se forma continuamente durante el desarrollo del germen de prueba. Organismos de prueba. La eleccin del antagonizado es un punto capital para poder apreciar en un estado inicial de las investigaciones cual es el campo de accin del agente activo que se forma. Hay dos divisiones entre las bacterias comunes respecto a su comportamiento frente a una tcnica de tincin, la de Gram, que permite una separacin de notable utilidad en la clasificacin de los grmenes. Los que retienen el colorante violeta de genciana mordentado con iodo, despus de un lavado con alcohol o acetona, se llaman Gram
positivos, y los que lo pierden en iguales condiciones y pueden ser nuevamente coloreados con otro tinte de contraste, se denominan Gram negativos. Pues bien, esta separacin que pudiera parecer un poco arbitraria, demuestra tener profundas bases en la fisiologa y estructura de las clulas y tambin en cuanto a la sensibilidad frente a distintos antibiticos, pues hay algunos que obran solamente sobre organismos Gram positivos, mientras otros (mucho menores en nmero) exclusivamente lo hacen sobre Gram negativos. Aunque hay un importante grupo que acta, en general sobre ambos grupos de grmenes.
Una de las caractersticas desfavorables de esta tcnica es el echo de que pudiera no existir en la placa un organismo susceptible, por lo que es aconsejable usar un germen de prueba adecuado que pudiera agregarse junto a la suspensin en forma bastante diluida.
Medios de cultivo:
Los medios de cultivo lquidos son soluciones preparadas a base de sustancias que satisfagan los requisitos nutritivos de los microorganismos. A grandes rasgos podemos dividirlos en sintticos, que son aquellos que tienen ingredientes de una composicin perfectamente definida (sales, azucares, aminocidos, etc.) cuya estructura qumica esta claramente determinada, y los no sintticos, que incluyen compuestos de origen natural
(peptonas, extractos de carne, de levadura, de malta, etc.). Al preparar medios para probar la actividad de los grmenes, se procura que estn bien balanceados, o sea que incluyan sustancias que posean carbona y nitrgeno asimilables, sales minerales, vitaminas y otros factores de crecimiento necesarios en cada caso. Algunas veces se emplean estos medios envasndolos en tubos de ensayo, o en otros recipientes de mayor capacidad, pero muchas veces resulta ms cmodo y conveniente solidificarlos mediante el agregado de agar, que en una proporcin de ms o menos 2 % produce una masa firme y elstica susceptible de ser licuada y vuelta a solidificar, muy adecuada para que sobre su superficie o en el interior de la misma, se desarrollen los grmenes. El recipiente clsico para el trabajo en bacteriologa con estos medios de cultivo endurecidos son las placas de Petri, que son unos platillos redondos de vidrio de normalmente unos diez centmetros de dimetro y dos centmetros de altura que generalmente poseen una tapa del mismo material.
P.T. 1 y 2 Antibitico. Ejerce su accin contra la virulencia ya fuere porque inmoviliza el germen o lo destruye, segn el mecanismo de accin bactereosttica o bacterioltica. Poder txico primario. Se define como un veneno procedente del microbio y que acta en forma directa sobre los tejidos circundantes o ms alejados. Toxinas
Endotoxinas Exotoxinas
Las exotoxinas proceden casi siempre de grmenes Gram (+). Ejemplo: Clostridium tetanis que segrega una potente toxina contra el sistema nervioso. En este caso los resultados inmediatos con los antibiticos ser posible, debido a que el tratamiento deber involucrar suero antitxico especifico. Frente a toxinas de incorporacin externa (botulinun) no hay terapia con antibiticos. Las endotoxinas proceden casi siempre de bacterias Gram (-), son de naturaleza liposacrida y poco antignicas. Esta se libra con la destruccin o autolisis del microbio. Ejemplo: Bacilo de Eberth. Su destruccin libera endotoxina tfica. Los microorganismos tambin poseen enzimas avanzar, desviar obstculos y protegerse contra las defensas naturales del cuerpo. 1. Poder txico secundario. Este se manifiesta por las modificaciones introducidas al estado ergiso del organismo. Tericamente, el antgeno microbiano, aparentemente inactivo, o sin efecto visible, produce cambios inmunolgicos, que se manifiestan ante una nueva penetracin antgena, ocasionando hiperactividad orgnica. 2. Reaccin Necrohemorrgica. Fenmeno de Sannarelli - Schavartzman. Esta eventualidad es una respuesta orgnica a las poderes txicos de los microorganismos, pero su gnesis es compleja y no se conoce en su totalidad. Shock infeccioso. Es la muestra clnica de la suma de las acciones de un microorganismo capaz de agredir simultneamente con el poder de virulencia, poder txico y adems provoca reaccin necrohemorrgica. Patogenisidad. Se debe recordar que ciertos microorganismos pueden vivir en el organismo sin provocar enfermedad, en un equilibrio entre el husped y el germen. Pero en ciertas condiciones puede adquirir patogenisidad con capacidad invasora.
Bactereostasis. Inmoviliza vitalmente al germen, mientras se espera que la inmunognesis aporte los elementos defensivos necesarios. Bacteriolasis. Es la destruccin, lisis o muerte del germen.
En 1946 se inform que algunos antibiticos, incorporados a los alimentos en muy pequeas proporciones, estimulaban el desarrollo de los pollos (streptomicina y sulfa suxidina). Esto permita dar salida a excesos y desechos de la produccin y obtener un crecimiento acelerado de los animales domsticos con el correspondiente beneficio para los criadores. desde 1950, con la aparicin de las tetraciclinas esta aplicacin de los antibiticos cobr un mayor impulso, tanto que hacia 1955, se estimaba que el 13% de la produccin de antibiticos se destinaba a estimular el desarrollo de distintos animales domsticos, especialmente las tetraciclinas, la penicilina y la bacitracina. Los antibiticos se expenden con tal fin, en concentrados que contienen de 10 a 20 gramos por kilogramo, mezclados usualmente con vitamina B12 y otras. En las granjas se mezcla el concentrado con el alimento o la bebida, de manera que contengan de 2 a 20 p.p.m.. Se usan como estimulantes en el crecimiento de aves, cerdos, ganado bovino, etc.. en los Estados unidos su empleo est sujeto a reglamentaciones especficas. Una vez comprobada la ampliacin bacteriosttica de diversos antibiticos, pronto surgi la esperanza de poder aplicarlos a la preservacin de alimentos frescos perecederos en el caso de que fueran efectivos en dosis pequeas, muy por de bajo de las profilcticas. Se realiz as una experimentacin mltiple en diversos pases, principalmente en los Estados Unidos para estudiar su accin sobre los microorganismos contaminantes de alimentos, particularmente los ms resistentes, y en la preservacin de alimentos como carnes, pescados y mariscos, leche y diversos vegetales. Las primeras experiencias de KAUFMANN y ORDAL con distintos antibiticos sobre el Cl. Botulinum, B. Sporogenes, B thermoacidurens, indicaron poca actividad sobre los dos primeros, aunque su resistencia al calor luego de la experiencia qued disminuida. Tambin BURROUGHS, WHEATON y BEHRER comprobaron poca efectividad de distintos antibiticos sobre el Cl. Botulinum y el Cl, sporogenes, en distintos alimentos (como sopa de pollo , maz, frijoles, coliflor, cebolla, batata, etctera.). La disminucin de la resistencia al calor fue comprobada por OBRIEN, TITUS y otros para el Cl. botulinum y Cl. thermosacchoroliticum, con subtilina y nisina; resultaron sin efecto la gramina, la sterrimina, la amphomicina y la hygromicina. Por su parte KOHLER y otros estudiando la accin de diez antibiticos sobre los microorganismos habituales en carne de pollo cruda, hallaron solamente efectica la clorotetraciclina o aureomicina. Descubrieron que sumerguiendo la carne en salmuera enfriada que contena 10 p.p.m. del antibitico durante 2 horas, sta se mantena despus en buen estado de conservacin durante tres das a 3C y que el antibitico absoprvido por la carne era luego destruido por la coccin. la aureomicina result ms efectiva que la oxitetraciclina y esta ltima aun ms que los otros antibiticos testeados. En lo que respecta a la leche, SHAHANI, GOULD y otros comprobaron que ni la penicilina ni, ni la streptomicina, ni la aureomicina, ni la acromicina, en concentraciones de 1 a 25 p.p.m. tena efecto preservador sobre la leche cruda, pero s lo tenan en el caso de la leche pasteurizada, usndolos en concentracin de 25 p.p.m..
Las dos primeras la preservan durante 7-8 das y la aureomicina y acromicina por 2 a 3 semanas. Sobre los productos de la pesca, susceptibles de sufrir una rpida descomposicin, se han efectuado numerosas experiencias. El doctor TARR y colaboradores, han estudiado la accin preservadora de diversos antibiticos sobre variedad de pescados, ostras, etctera. encontraron la mayor accin preservadora para la aureomicina. Obtuvieron muy buenos resultados para pescados y dudosos para ostras. Tambin LIONEL FARBER, ensayando el efecto preservador sobre pescados y mariscos sumergindolos en salmuera fra con 2 p.p.m. de aureomicina, terramicina y neomicina, comprobaron efectividad en las dos primeras, para pescados aunque dudosas para camarones. Para camarones obtuvieron mejores resultados FLEGER, NOVAK y BAILEY, usando clorotetraciclina, sola o en conjuncin con bisulfito sdico, aplicaron a las colas soluciones en agua fra de 50 p.p.m. de antibitico slo o con 1.ooo a 2500 p.p.m. de bisulfito, las escurrieron y empaquetaron en cajas de cartn, guardndolas a 6C, y observaron que se mantenan bien durante 14 das. El nico inconveniente se dio con las soluciones de antibiticos solo; tomaron color amarillo verdoso, pero al cocerlos se tornaban rojos. Otros investigadores en base a sus experimentos recomendaron la preservacin de pescados por uno de los siguientes mtodos: a) Usar hielo al que se le ha incorporado oxitetraciclina en la proporcin de 5 p.p.m., con lo que se prolonga la frescura en un 150%. b) Sumergir o rociar el pescado con solucin de 25 p.p.m. del antibitico; se obtiene una preservacin por el triple de tiempo que sin el antibitico. Para distribuir homogeneamente el antibitico en el hielo se ha ensayado la carragenina y la carboximetilcelulosa; se prepara primero una solucin concentrada del antibitico y agente disperzante y estabilizante y luego se le agrega el agua para diluir y helar. Para carnes rojas, de ganado, el doctor DEATHERAGE de Ohio asegura que la aureomicina se mostr efectiva frente a 81 de los 92 microorganismos que usualmente alteran la carne cruda y hall que las carnes tratadas con ese antibitico se mantenan sin alteracin despus de nueve das a temperatura ambiente. La carne puede ser tratada de diferentes maneras, sea la res, o en trozos. Para la res la solucin de antibitico isotnica en sal puede ser bombeada por la cartida del animal poco antes de sacrificarlo, para que se distribuya por su cuerpo, o por inyeccin. Tambin se puede rociar exteriormente para evitar la proliferacin de microorganismos sobre la superficie de la carne. Se ha comprobado tambin que la adicin de 3 a 5 p.p.m. de acromicina prolonga la conservacin de las salchichas de cerdo. Para vegetales se recomend en un primer momento la inmercin por 15 segundos en solucin de 25 p.p.m. de acromicina, retirarlos despus y escurrir el lquido, sin
lavarlos; posteriormente, cuando se dispuso de la niastatina, se aconsej usar una mezcla de clorotetraciclina y nistatina, con lo que se logra preservar la frescura por varios das a una temperatura de alrededor de 10C.
En resumen.
Se encontr que el uso de antibiticos en alimentos resulta til para disminuir el peligro de alteracin de carne roja cruda, pescados crudos, colas de camarones, ave eviserada entera o en trozos, cruda y vegetales. Retarda el desarrollo de bacterias patgenas y de la flora normal resistente al calor con alimentos como flanes, queso y leche, matando clulas vegetativas y esporas, y reduce el tiempo de proceso por calor en el canning, por accin sinrgica con el calor, al afectar la resistencia trmica. De lo expuesto se deduce que los antibiticos aplicados a los alimentos en muy pequeas dosis, inferiores a las profilcticas, pueden prolongar por varios das el buen estado de los alimentos frescos, pero con auxilio de la baja temperatura, sin llegar a un refrigerado intenso; no sirven para una preservacin permanente. Ahora bien, Es posible utilizar los antibiticos sin peligro para los consumidores? nos encontramos ante un problema semejante al de los preservadores qumicos aunque, en este caso, se trata de sustancias menos peligrosas y se emplean en menor proporcin. Pero, recordemos que su accin es principalmente bacteriosttica y no universal, es decir, que existe el peligro de que se encuentren presentes bacterias resistentes a su accin que se desarrollan en el alimento o cuando sta se mezclan con otros en la cocina familiar, para el consumo. Tambin existe la posibilidad de que los sensibles, pasado el efecto inhibidor de los antibiticos (cuya accin es relativamente breve) vuelvan a su accin y a tornar peligroso al alimento contaminado. Adems hay que tener en cuenta el peligro de la sensibilidad personal a los antibiticos, bastante comn para algunos y menor para las tetraciclinas y cloromicetina. Teniendo en cuenta lo dicho las autoridades sanitarias se han mostrado reticentes en lo que se vincula con su tolerancia en alimentos y solamente ha sido permitida su adicin en algunos casos en los que se han demostrado que no quedan en el alimento cuando ste es ingerido. Los primeros pases que aceptaron su empleo para aves crudas evisceradas y siempre que no contengan ms de 7 p.p.m. (que es destruida por la coccin) fueron Canad y los Estados Unidos. En los Estados Unidos cuando se aprob la adicin de aureomicina a las aves crudas (30 de noviembre de 1955), la FOOD AND DRUG ADMINISTRATION expres sus puntos de vista frente al empleo de antibiticos en la preservacin de alimentos, los cuales pueden ser enunciados as: 1) Constituye un riesgo para la salud pblica, pues se consumo puede provocar la aparicin de microorganismos resistentes a los mismos. 2) La presencia de antibiticos en los alimentos para uso humano, o su adicin directa o indirecta a tales alimentos, pueden considerarse como una adulteracin segn el significado de la seccin 402 del FOOD, DRUG and COSMETIC ACT.
3) Esto no ser obstculo para el establecimiento de tolerancia para antibiticos, bajo las estipulaciones de la seccin 408 del ACT, cuando se pueda tener una adecuada evidencia de la utilidad de los mismos y de la seguridad de los residuos. En Canad se aprob poco despus el empleo de clorotetraciclina en peces enteros y colas de camarn sin pelar, hasta 5 p.p.m.. En los Estados unidos slo en 1959 (el 14 de abril) se estableci igual tolerancia, haciendo hincapi en que se prohiba en filetes y tajadas de pescados, y en colas de camarn peladas. El permiso se di bajo la evidencia de que el antibitico se fija en la piel, la cual es desechada antes de consumir el alimento o bien el antibitico es destrudo durante la coccin. Otro problema creado por el uso de antibiticos es el analtico, ya que, estn o no tolerados, siempre existe la posibilidad de su empleo, y lo peor es el riesgo de uso abusivo, en adiciones sucesivas, para prolongar la preservacin del alimento, con la consiguiente acumulacin, que aumenta el riesgo para el consumidor. Su poca estabilidad, el hecho de que por lo general son afectados por los disolventes de extraccin y finalmente las cantidades tan pequeas en que se usan, dificultan la determinacin del antibitico agregado. La necesidad de su control y valoracin en medicamentos ya haba exigido la preparacin de mtodos adecuados, que se han ido adecuando y perfeccionando, de manera que hoy en da se dispone de numerosos mtodos analticos de suficiente sensibilidad para las determinaciones de antibiticos. En la valoracin se emplean preferentemente mtodos microbiolgicos, cuyo fundamento es la sensibilidad de ciertos microorganismos para los diversos antibiticos, aplicndose distintas tcnicas, que se basan en respuesta afirmativa o negativa ,o graduada; aquellos pueden demandar unos minutos, ciertas horas o hasta una noche entera de inoculacin, los ms comunes. Los hay por dilucin en medio lquido, usando diferentes mtodos para determinar el efecto, como:
y por turbidimetra. Hay mtodos por frenado del desarrollo de esporas de hongos;bacteriolticos, por cultivo de tejidos, por reduccin de nitratos a nitritos, de la reductasa, uno manomtrico, etctera..
El uso de antibiticos en conjuncin con el fro y radiaciones ha inspirado al doctor NIVEN en 1956 en un nuevo procedimiento combinado para conservar alimentos que se puede esquematizar as: 1)Aplicacin de antibiticos para reducir la poblacin bacteriana, en conjuncin con refrigeracin para reducir la velocidad de reacciones autolticas y qumicas, ms la accin de fungicidas para evitar mohos; 2) Empaquetado en recipientes al vaco, flexibles o rgidos, para reducir cambios oxidativos(podra ser con adicin de un antioxidante); 3) Calentamiento por microondas para inacvtivar y reducir la velocidad de actividad autoltica; 4) Aplicacin de radiaciones en dosis bajas para obtener esterilizacin superficial, con o sin inclusin de sustancias qumicas para evitar los cambios de aroma; 5) Aplicacin de baja temperatura en almacenado, para reducir las reacciones autoqumicas.