Universidad Autnoma de Baja California Facultad de Medicina y Psicologa

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IT Manejo del Cepario

1. Objetivo:
Definir la metodologa para la obtencin, identificacin, conservacin, uso y manejo microbiolgicas que integran el cepario del Laboratorio 3.

de cepas

2. Alcance:
Aplica al personal involucrado en las actividades del rea de Microbiologa, as como al coordinador, el auxiliar y al personal docente del laboratorio.

3. Definiciones:
Cultivos de referencia: Trmino colectivo que se refiere a cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo. CRC: Cepas de referencia certificadas con certificado biolgico CPC: Cepas DE PROOVEDORES COMERCIALES. CAC: Cepas de aislamientos de cultivos previamente identificadas. CC y V: Control de calidad y viabilidad. IT: Instruccin de trabajo. RPBI: Residuos peligrosos Biolgico Infecciosos.

4. Instruccin:
4.1. Medios de cultivo: Infusin cerebro corazn, agar soya tripticasa, agar Sangre, agar Chocolate. 4.2. Materiales y reactivos: Sistema MicroScan Identificacin bacteriana (Incluye paneles y reactivos), glicerol y otros agentes cri preservadores, materiales para manipulacin de cultivos y/o sistema de identificacin manual. 4.3. Equipo: Incubadora, campana Flujo laminar, refrigerador, congelador, sistema Microscan Dade. TABLA DE CAMBIOS REVISIN
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FECHA
9/03/05 2/02/10 19/05/10 31/01/11

DESCRIPCION
Alta de instruccin de trabajo para el manejo del Cepario en el Laboratorio 3 Cambios en el manejo de cepas de referencia y cepas de trabajo. Se incluye la conservacin en congelacin y refrigeracin, as como el control de calidad, pureza y viabilidad de cepas. Se generan registros. Se modifica texto en el punto 4.6.1 en el inciso b y c Se modifica debido a que se cambiaron los formatos de esta instruccin y se eliminaron los cdigos

ELABOR/MODIFIC
Aux. Pilar Luna Hernndez QFB. Ma Luz Ibarra Arias MC Martha Rosales Aguilar MC Martha Rosales Aguilar

Elabor/Modific: QFB Ma. Luz Ibarra Arias/MC Martha Rosales Aguilar Revis: MC. Martha Rosales Aguilar

31/01/11 31/01/11 31/01/11

Autoriz: Dra. Sara Corts Bargall

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4.4. Introduccin: El laboratorio de microbiologa debe contar con cultivos de referencia. Los cultivos de referencia se utilizan en el laboratorio para: a. Mantener cepas microbiolgicas que se utilizan en prcticas de laboratorio. b. Evaluar la calidad de los medios de cultivo y reactivos. c. Aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo y validacin de mtodos microbiolgicos. La obtencin de cepas microbiolgicas que se utilizan en prcticas de laboratorio pueden ser de diferente procedencia: a. Cepas de una coleccin nacional o internacional de cultivo de referencia reconocida (Ej.ATCC) b. Cepas de proveedores comerciales que comercialicen repiques de cepas de referencia.(CPC) c. Cepas que provienen de aislamientos, previamente probadas y que mantengan su viabilidad y sus caracteres bioqumicas.(CAC) A partir de las cepas de referencia (STOCK) se obtendrn las cepas de reserva (SEMISTOCK) y las cepas de trabajo. 4.5. Observaciones importantes: a. Para prevenir mutaciones, deterioro o alteracin de las caractersticas tpicas de las cepas el nmero de repiques a partir de la cepa de referencia debe ser limitado (En general es aceptado hasta 5 repiques a partir de la cepa de referencia ATCC) b. Se debe realizar pruebas control de pureza y viabilidad a diferentes niveles del proceso. CADA VEZ QUE HAGA UN REPIQUE. c. En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva No deben volver a congelarse. d. El cri vial vencido se elimina del cepario y se registra. e. Cuando se fracciona alcuotas en glicerol, leche u otros agentes crioprotectores, se usan, se descongelan y NO se pueden volver a congelar ni a usar. f. Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se pueden volver a usar. g. La edad del cultivo antes de ser expuesto a bajas temperaturas recomendado para bacterias es 24 hrs. A 37C. h. Atemperar medios de cultivo y cepas antes de su uso. i. Disponga apropiadamente los RPBI. 4.6. Cepas de referencia de una coleccin nacional e internacional reconocida. (CRC o CPC) Al ingreso de una cepa de coleccin Nacional o internacional. (Generalmente el 3er o 4 repique) Obtenga el certificado de origen donde conste el nmero de repique y el origen, entre otros (Vase anexos) y archive apropiadamente. 4.6.1. Procedimiento para reconstituir cepas de referencia. (CRC o CPC) a. Al recibir las Cepas de referencia almacene a T entre 2-8 C . b. Las cepas liofilizadas requeridas para las prcticas debern ser preparadas. Abra el paquete en la campana de flujo laminar y coloque el hisopo de con la cepa en caldo BHI o agua peptonada y deje incubando 24Hrs, si es de las cepas fastidiosas o requiere camara de incubacion de CO2 y deje de 48 a 72 hrs y se observe desarrollo bacteriano. c. De las cepas preparadas en medio liquido realizar el pase a medios slidos; cada cepa deber de inocularse en medios de cultivo nutritivos y/o selectivos de acuerdo a las condiciones de cada Cepa. d. Inocule por DUPLICADO (1) (2) los medios de cultivo e identifique (Genero y especie del microorganismo. tipo (cepa de referencia) y N de coleccin. GC-FR-002 Rev4

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e. f.

g.

Incube por 24 hrs., en el ambiente apropiado de acuerdo al microorganismo y las condiciones especificadas en el certificado de origen. ( Ej. 37C ambiente Co2) (Vase anexos) Despus del desarrollo bacteriano utilice cultivo (1) para realizar las pruebas de pureza y viabilidad (caractersticas de las colonias, reaccin Gram. y pruebas bioqumicas que apliquen) Registre resultados en el formato L3-FR-005 (Registro de control de calidad, pureza y viabilidad de cepas) Utilice cultivo 2 para inocular los medios de cultivo de reserva o stock.

4.6.2. Cepas que provienen de aislamientos de cultivos (CAC) (Cepas previamente seleccionadas que pueden ser utilizadas en prcticas de laboratorio) a. Seleccione y prepare el o los medios de cultivo de acuerdo a la Cepa. b. Inocule por DUPLICADO (1) (2) los medios de cultivo e identifique (Genero y especie del microorganismo y su procedencia. (ej. sec. herida, otico etc.) c. Incube por 24 hrs., en el ambiente apropiado de acuerdo al microorganismo. d. Despus del desarrollo bacteriano utilice cultivo (1) para realizar las pruebas de pureza y viabilidad (caractersticas de las colonias, reaccin Gram. y pruebas bioqumicas que apliquen) e. Registre resultados en el Formato L3-FR-005, (Registro de control de calidad, pureza y viabilidad de cepas) f. Utilice cultivo (2) para inocular los medios de cultivo de reserva (stock) 4.7. Procedimiento para obtencin de cepas de reserva (stock) a. Prepare medio de cultivo de acuerdo a la cepa. ( BHI, Agua peptonada) b. Inocule la cepa (caja 2) e incube a 37C por 24hrs. c. Identifique apropiadamente. d. Transfiera la cepa(s) en medios de cultivo en tubo con BHI o agua peptonada (2.0 ml/ tubo) hasta alcanzar la turbidez similar al tubo 3 del Nefelmetro de MacFarland. e. Obtenga un mnimo de 4 tubos por cepa y etiquete apropiadamente. f. Adicione agente crioprotector: glicerol (Relacin 1 inoculo por 1 de glicerol) u otros agentes. g. Selle apropiadamente cada uno de los tubos. h. Almacene en congelacin ( entre -20C y -70C ) i. Registre como cepa de reserva stock en el formato L3-FR-003 (Catalogo de Cepas Microbiolgicas) 5.3. Procedimiento para obtencin de cepas semistock. a. Las cepas semistock se preparan a partir de las cepas congeladas. b. Seleccione y atempere uno de los tubos de cepa stock. c. Registre la baja en el formato L3-FR-003 (Catalogo cepas microbiolgicas) d. Inocule por duplicado (1) (2) en medio(s) de cultivo apropiado (BHI, AST distribuido en tubo inclinado, Agar chocolate, Agar sangre ) e. Incube a T 37 C en el ambiente apropiado ( aerobio, CO2) f. Uutilic cultivo (1) para realizar las pruebas de pureza y viabilidad ( caractersticas de las colonias, reaccin Gram. y pruebas bioqumicas que apliquen) g. Registre resultados en el Formato L3-FR-005, (Registro de control de calidad, pureza y viabilidad de cepas) h. Utilice cultivo (2) para preparar tubos semistock (un mnimo de 4) i. Etiquete apropiadamente cada uno de los tubos (anexo 1) j. Aada agente crioprotector a los cultivos (con excepciones) y Almacene en Refrigeracin 2-8 C. k. A partir de estos cultivos prepare las cepas de trabajo.

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5.4. Procedimiento para obtencin de cepas de trabajo. a. Introduccin: Para la preparacin de cepas de trabajo destinadas a prcticas de laboratorio deber de considerarse el nmero, seleccin, evaluacin y preparacin de las cepas de acuerdo al calendario de prcticas y a las indicaciones del coordinador del laboratorio 3. b. Las cepas de trabajo se preparan a partir de las cepas semistock refrigeradas (2-8 C) c. Seleccione uno de los tubos de cepa semistock. d. Registre la baja en el formato L3-FR-004 (Control de manejo de cepas) e. Inocule en medio de cultivo apropiado (BHI, AST, Agar chocolate, Agar sangre), de acuerdo a las especificaciones del Manual de prcticas de Laboratorio de Microbiologa Medica (L3MN3-002) f. Identifique e incube a T 37 C en el ambiente apropiado (aerobio, CO2) por 24 Hrs. g. Utilic uno de los cultivos para realizar las pruebas de pureza y viabilidad (caractersticas de las colonias, reaccin Gram. y pruebas bioqumicas que apliquen) l. Registre resultados en el Formato L3-FR-005 (Registro de control de calidad, pureza y viabilidad de cepas) h. Prepare la cantidad de cepas necesarias de acuerdo al manual de prcticas de microbiologa mdica (L3-ML-002 y) y/o a la solicitud del coordinador de laboratorio.

5. Registros.
IDENTIFICACIN L3-FR-003 (Catalogo de cepas microbiolgicas) L3-FR-004 (Control de manejo de cepas) L3-FR-005 (Registro de control de calidad, pureza y viabilidad de cepas) ALMACENAMIENTO Y PROTECCIN RECUPERACIN TIEMPO DE RETENCIN 1 ao DISPOSICIN. Destruccin mecnica

Archivero del responsable Por Cdigo y fecha de laboratorio en archivo Archivero del responsable Por Cdigo y fecha de laboratorio en archivo Archivero del responsable Por Cdigo y fecha de laboratorio en archivo

1 ao

Destruccin mecnica

1 ao

Destruccin mecnica

6. Referencias.
a. b. c. d. e. L3-ML-003. Manual de laboratorio de microbiologa bsica AD-PR-004. Procedimiento de prevencin y gestin integral de los residuos. MGC seccin 7.5.1. Control de la produccin y de la prestacin del servicio NOM-087-ECOL-SSA1-2002 Norma ISO 17025

7. Anexos.
a. Datos para el Registro e Identificacin de cepas de referencia Gnero y especie del microorganismo TIPO y N de coleccin. N de lote.

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Fecha de recepcin. Control de calidad de la cepa de referencia Conforme (SI/NO). Fecha de caducidad de la cepa. Personal responsable

b.

c.

d.
CEPA DE REFERENCIA

Reconstitucin (Slo se acepta un nico repique)

*
OBTENCIN DE LAS CEPAS DE RESERVA

*
CONSERVACIN MEDIANTE DISTINTOS MTODOS (Liofilizacin, nitrgeno lquido, ultracongelacin rpida, etc.) Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento Descongelacin / reconstitucin Se subcultiva una sola vez.

*
CEPAS DE TRABAJO (Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento)

UTILIZACIN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS, VALIDACIN DE MTODOS Y CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD

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