Manual de Garantia Analitica

GARANTIA
DA QUALIDADE ANALTICA
Resduos e Contaminantes em Alimentos
MANUAL DE
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento Secretaria de Defesa Agropecuria (SDA)
GARANTIA
DA QUALIDADE ANALTICA
MANUAL DE
Misso Promover o desenvolvimento sustentvel e a competitividade do agronegcio em benefcio da sociedade brasileira.
BRASLIA - 2011
2011 Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Todos os direitos reservados. Permitida a reproduo desde que citada a fonte. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra do autor. 1a edio - Ano 2011 Tiragem: 1.000 Elaborao, distribuio e informaes: MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO Secretaria de Defesa Agropecuria (SDA) Coordenao-Geral de Apoio Laboratorial (CGAL) Esplanada dos Ministrios, Bloco D, Anexo B, sala 440 CEP 70043-900 - Braslia - DF Telefones: (61) 3218-2535 www.agricultura.gov.br E-mail: cgal@agricultura.gov.br Central de Relacionamento: 0800 704 1995
COORDENAO EDITORIAL: Assessoria de Comunicao Social EQUIPE TCNICA DO PROJETO: Coordenao Angelo de Queiroz Mauricio (CGAL/Mapa) Concepo e Reviso Tcnico-Cientfica Marcelo Cludio Pereira (CGAL/Mapa) Welington Ferreira de Magalhes (DQ/ICEx/UFMG) Consultoria Welington Ferreira de Magalhes (DQ/ICEx/UFMG) Redao, Desenvolvimento e Colaborao Angelo de Queiroz Mauricio (CGAL/Mapa) Beatriz Rauber (Lanagro/RS)
Dario Abbud Righi (CGAL/Mapa) Edna Silvana (Lanagro/PE) Eleonora Vieira dos Santos (Lanagro/MG) Eliene Alves dos Santos (Lanagro/MG) Eugnia Azevedo Vargas (Lanagro/MG) Fabiano Aurlio da Silva Oliveira (Lanagro/MG) Fernando Antunes Lopes (Lanagro/SP) Helena Mller Queiroz (Lanagro/SP) Igor Olivares (Lanagro/SP) Josefa Abucter Lima (Lanagro/MG) Ktia Letcia Carvalho (Lanagro/MG) Lilian Costa (Lanagro/PA) Marcelo Cludio Pereira (CGAL/Mapa) Maria Aparecida Brum (Lanagro/RS) Nlio Fleury Filho (Lanagro/GO) Welington Ferreira de Magalhes (DQ/ICEx/UFMG) Apoio Rede Nacional de Laboratrios Agropecurios
Impresso no Brasil/Printed in Brazil
Catalogao na Fonte Biblioteca Nacional de Agricultura BINAGRI Brasil. Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento. Manual de garantia da qualidade analtica. / Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuria. Braslia : MAPA/ACS, 2011. 227 p. ISBN 978-85-7991-055-5 1. Controle de qualidade. 2. Medicamento. 3. Analise qumica I. Secretaria de Defesa Agropecuria. II. Ttulo. AGRIS Q55, L70 CDU 636.084.41
SUMRIO
Apresentao.............................................................................................7 Prefcio......................................................................................................9 Parte I.......................................................................................................13 Introduo e Requisitos Gerais..........................................................13 I.1 Objetivo................................................................................ 13 I.2 Responsabilidades................................................................. 13 I.3 Evitando Contaminao ........................................................ 13 I.4 Padres de Trabalho (Analticos), de Referncia e MRC............................................................. 14 I.5 Cadeia de Custdia de Padres de Trabalho (Analticos)......... 15 I.6 Preparao, Uso e Armazenamento de Solues Padro........ 15 I.7 Reagentes e suas Solues..................................................... 16 I.8 Recepo, Armazenamento e Preparao de Amostras.......................................................................... 16 I.9 Desenvolvimento e Otimizao do Procedimento Analtico.... 17 I.10 Validao de Procedimentos Analticos ................................. 19 I.11 Condues do Processo de Validao .................................... 22 Parte II......................................................................................................25 Parmetros e Critrios de Aceitao de Desempenho de um Procedimento Analtico........................................................ 25 II.1 Nveis de Interesse Analtico................................................... 25 II.2 Critrios de Desempenho Aplicveis Deteco por EM ....... 26 II.3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho (FT)..................................................................... 28 II.4 Seletividade e Efeito Matriz.................................................... 33 II.5 Veracidade/Recuperao ....................................................... 37 II.6 Preciso................................................................................. 40 II.7 Limites de Deteco (LD), Limite de Quantificao (LQ), Limite de Deciso (CC) e Capacidade de Deteco (CC)..... 42 II.8 Incerteza de Medio Analtica (IMA)..................................... 50 II.9 Estudo de Robustez, Escopo e Portabilidade.......................... 64 II.10 Expresso e Interpretao dos Resultados de Medies.......................................................................... 67 II.11 Relatrio de Validao........................................................... 71 Parte III.....................................................................................................73 Estudos de Estabilidade.....................................................................73 III.1 Estabilidade do Analito na Matriz no Processada...................................................................... 73 III.2 Estabilidade do Analito na Matriz Processada ........................ 74 III.3 Estabilidade do Analito no Extrato ou na Soluo de Abertura de Amostra........................................................ 75
MANUAL DE GARANTIA DA QUALIDADE ANALTICA
III.4 Estabilidade das Solues Padro........................................... 76 III.5 Estabilidade dos Padres de Trabalho e dos Materiais de Referncia no Certificados ............................................. 76 Parte IV....................................................................................................79 A Rotina Analtica e o Controle de Qualidade Analtica (CQA)......79 Parte V.....................................................................................................81 Ampliao do Escopo do Procedimento Analtico Validado: Incluso de Nova Matriz ou Novo Analito em Procedimento Analtico Validado..........................................................................81 V.1 Procedimento de Determinao do Efeito de Matiz para a Incluso de Nova Matriz ou Novo Analito Comparando-se Duas Curvas de Calibrao........................... 82 V.2 Estudo de Veracidade e Preciso para a Incluso de Nova Matriz ou Novo Analito............................................ 84 Parte VI....................................................................................................85 Aspectos Especficos da Validao de Procedimentos Analticos para as Diferentes Categorias de Analitos..................... 85 VI.1 Resduos de Medicamentos Veterinrios ................................85 VI.2 Resduos de Praguicidas (Agrotxicos) ....................................89 VI.3 Contaminantes Inorgnicos ...................................................97 VI.4 Micotoxinas..........................................................................112 ANEXO I......................................................................................................................127 Clculos da Estimativa dos Parmetros da Regresso pelo Mtodo dos Mnimos Quadrados Ordinrios (MMQO)................ 127 ANEXO II................................................................................................131 Qualidade do Ajuste e Verificao da Homoscedasticidade ou Heterocedasticidade da Resposta Instrumental na Regresso pelo MMQO................................................................ 131 ANEXO III...............................................................................................139 Avaliao dos Pontos Duvidosos, Aberrantes, Extremos (outliers) e Critrios de Aceitao para a Linearidade no MMQO................................................................... 139 ANEXO IV...............................................................................................141 Avaliao da Incerteza de Previso da Concentrao do Analito na Curva de Calibrao Clculo de Incerteza de Calibrao no MMQO.................................................................141 ANEXO V................................................................................................143 Planilhas de Clculos no Excel validado..........................................143
MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO
ANEXO VI...............................................................................................145 Clculo da Estimativa dos Parmetros da Regresso pelo Mtodo dos Mnimos Quadrados Ponderados (MMQP).......145 ANEXO VII..............................................................................................149 Qualidade do Ajuste e Verificao da Heterocedasticidade da Resposta Instrumental na Regresso pelo MMQP....................149 ANEXO VIII.............................................................................................151 Avaliao dos Pontos Duvidosos, Aberrantes, Extremos (outliers) e Critrios de Aceitao para a Linearidade no MMQP.................... 151 ANEXO IX...............................................................................................153 Avaliao da Incerteza de Previso da Concentrao do Analito na Curva de Calibrao, Clculo de Incerteza de Calibrao no MMQP..................................................................153 ANEXO X................................................................................................155 Glossrio: Definies, Vocbulos, Termos, Siglas e Abreviaes...155 ANEXO XI...............................................................................................177 Matrizes Representativas (Praguicida e Micotoxinas)...................177 ANEXO XII..............................................................................................179 Planejamento Fatorial para o Estudo de Robustez........................179 Planejamentos Fatoriais Completos............................................. 180 Planejamentos Fatoriais Fracionrios........................................... 190 Critrios de Aceitao, Anlise dos Resultados dos Planejamentos Fatoriais.............................................................. 195 ANEXO XIII.............................................................................................205 Referncias Normativas e Bibliogrficas.........................................205 ANEXO XIV............................................................................................211 Quadros Comparativos: Manual de Garantia da Qualidade Analtica versus outras Referncias Normativas ............................211 Quadros Comparativos....................................................................212 Abrangncia do Manual de Garantia da Qualidade Analtica em Relao aos Parmetros de Validao Preconizados pelas Principais Normas e Referncias Utilizadas.......................... 212
APRESENTAO
Apresentao
Ao longo dos anos nos quais os laboratrios da rede do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (Mapa) tm conduzido seus trabalhos analticos, convivemos com diversos cenrios e perspectivas, enfrentamos vrios desafios, superamos inmeras adversidades e alcanamos importantes vitrias. Contudo, nenhuma vitria foi to significativa quanto a implantao dos conceitos referentes validao de mtodos de ensaio e garantia da qualidade analtica nos trabalhos do dia a dia da Rede Nacional de Laboratrios Agropecurios no que diz respeito rea de resduos e contaminantes em alimentos. Durante muito tempo, os procedimentos de validao e da garantia da qualidade dos resultados ficaram dispersos, cada laboratrio possuindo seus prprios procedimentos em face da vasta gama de guias e documentos internacionais existentes. Com a publicao deste Manual de Garantia da Qualidade Analtica, o Mapa rene, em um nico documento didtico e elucidativo, a bibliografia mais atual referente ao assunto, produzindo um guia de referncia de alto nvel que aponta as tendncias e vanguardas em relao ao controle analtico de perigos qumicos. Este Manual tem por objetivo esclarecer e disseminar conceitos tecnicamente consistentes, bem como instruir os laboratrios, de forma clara e didtica, sobre como realizar um estudo de validao passo a passo e implantar procedimentos de garantia de qualidade de resultados, de modo a permitir uma avaliao objetiva de seu prprio desempenho e de seus mtodos de ensaio. A implantao efetiva dos requisitos e orientaes constantes deste Manual no a maneira mais curta de se fazer as coisas, mas , sem dvida, a garantia inequvoca e inquestionvel da confiabilidade, qualidade e competncia tcnica de qualquer laboratrio que o utilize. A todos os que se dedicaram, contriburam e se empenharam nos incontveis esforos de elaborao do Manual de Garantia da Qualidade Analtica, agradecemos fortemente. Estejam certos de um trabalho bem feito. Angelo de Queiroz Mauricio
ANOTAES
PREFCIO
Prefcio
O resultado de uma medio sempre usado para subsidiar alguma tomada de deciso, seja ela a conformidade de um produto ou servio a alguma especificao, ao requisito de alguma norma nacional ou internacional ou obedincia a alguma lei. Essa tomada de deciso pode tambm constituir o atendimento a algum contrato ou critrio interno ou externo de qualidade. No entanto, o resultado de qualquer medio est sempre sujeito a erros, sejam eles sistemticos ou aleatrios, os quais resultam na perda de sua acurcia. Nesse sentido, necessrio que os laboratrios de ensaios que realizam tais medies disponham de orientaes cientficas e conceitualmente consistentes de como proceder para reduzir os erros e aumentar a confiabilidade dos resultados das medies, reduzindo-se gradualmente os riscos da tomada de deciso. Particularmente no caso das medies analticas, so escassas as publicaes com essas orientaes, especialmente em lngua portuguesa. Soma-se a isso o fato de que so muitas as divergncias conceituais e as desarmonias de vocabulrios entre as publicaes existentes, sendo que vrias no apresentam consistncia estatstica e metrolgica. Considerando a necessidade de se dispor de orientaes harmonizadas e cientificamente consistentes dentro do cenrio nacional de controle de resduos e contaminantes em alimentos, assim como a de atender s crescentes exigncias de qualidade dos resultados analticos de nossos compradores internacionais de alimentos, o Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (Mapa), por intermdio da Secretaria de Defesa Agropecuria (das) e da Coordenao-Geral de Apoio Laboratorial (CGAL), resolveu redigir e publicar este Manual de Garantia da Qualidade Analtica. Ele foi elaborado em ampla consonncia com as mais recentes verses do Vocabulrio Internacional de Metrologia (VIM) e do Guia sobre Terminologia em Qumica Analtica do Codex Alimentarius CAC-GL72/2009, assim como com os requisitos das normas ABNT ISO/IEC 17025/2005 Requisitos Gerais para a Competncia de Laboratrios de Calibrao e Ensaio, ISO 11843-1/1997 Capability of Detection Part 1: Terms and Definitions, ISO 11843-2/2000 Capability of Detection Part 2: Methodology in the Linear Calibration Case, e srie ISO 5725 Accuracy (Trueness and precision) of method measurements and results. Assim, o presente Manual foi idealizado e concebido visando fornecer referncias conceituais consistentes e pormenorizadas dos critrios analticos que devem ser observados pelos laboratrios da Rede Nacional de Laboratrios Agropecurios que prestam servios ao Plano Nacional de
Controle de Resduos e Contaminantes (PNCRC) em Produtos de Origem Animal e Vegetal. Entretanto, esta obra no se circunscreve somente aos laboratrios que trabalham com a determinao de resduos e contaminantes em alimentos, podendo ser aplicada em diversas reas da atividade analtica laboratorial. Elaborado para ser uma ampla fonte de informaes, o Manual de Garantia da Qualidade Analtica dividido em seis partes e 14 anexos, perfazendo um total de 20 sees. A ParteI apresenta os cuidados gerais que devem ser observados em relao qualidade analtica das instalaes, ao recebimento e guarda das amostras e reagentes e ao desenvolvimento, otimizao e conduo do processo de validao dos procedimentos analticos. A ParteII, juntamente com os anexos nela citados, define e descreve os procedimentos de estimao dos parmetros de validao para a avaliao do desempenho de um procedimento analtico, estabelecendo os critrios mnimos de aceitao que devem ser atingidos para que um determinado procedimento analtico seja considerado validado. A ParteIII trata da realizao dos estudos de estabilidade, essencial para que se possa garantir a qualidade do resultado analtico, estimando o tempo mximo que uma amostra pode aguardar anlise sob determinadas condies ou por qual perodo de tempo uma soluo reagente pode ser reutilizada sem comprometer o resultado analtico. A ParteIV contm informaes sobre a rotina analtica e os controles de qualidade analticos que devem ser utilizados para monitorar as corridas analticas, permitindo que o analista possa prover evidncias seguras de que o sistema analtico est operando sobre controle estatstico de qualidade, dentro de faixas consideradas adequadas ao propsito de uso. A Parte V descreve os procedimentos que devem ser observados para a incluso de novos analitos ou matrizes em procedimento j validados para outro(s) analito(s) e matriz(es). A ParteVI abrange as especificidades inerentes a quatro categorias de analitos: 1) Resduos de Medicamentos Veterinrios; 2) Resduos de Praguicida (Agrotxico); 3) Contaminantes Inorgnicos; e 4) Micotoxinas. A proposta disponibilizar informaes minuciosas sobre a determinao desses analitos de maneira concentrada, em uma nica seo. Em relao aos anexos, eles foram elaborados com a finalidade de complementar as informaes apresentadas nas sees anteriores, facilitando o entendimento e a utilizao deste Manual. Os anexos I a IX e XII trazem os detalhes do tratamento estatstico, incluindo planejamentos fatoriais, necessrios para extrair de forma confivel as informaes contidas
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nos resultados das medies, e subsidiam estatisticamente as tomadas de decises nos nveis de confiana desejados. O Anexo X traz um extenso glossrio dos termos usados no manual, auxiliando na sua leitura. Demos preferncia s definies constantes no Vocabulrio Internacional de Metrologia (VIM) ou a aquelas do Codex Alimentarius. Os anexos XI, XIII e XIV apresentam, respectivamente, a bibliografia, uma relao de matrizes representativas e quadros comparativos deste Manual com outros documentos e normas nacionais e internacionais, permitindo uma avaliao de suas correspondncias e respectivas abrangncias. Por fim, entendemos que este Manual configura-se como uma ferramenta til a todos que atuam na rea analtica laboratorial, bem como a estudantes e pesquisadores. No entanto, nenhum documento completo e perfeito, assim, crticas e sugestes de melhoria sero sempre bem-vindas, para que possamos promover o seu contnuo aprimoramento em edies futuras. Marcelo Cludio Pereira Welington Ferreira de Magalhes
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ANOTAES
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Introduo e Requisitos Gerais
PARTE 1
Parte I
Introduo e Requisitos Gerais
I.1 Objetivo
Este Manual foi elaborado com o objetivo de estabelecer parmetros e critrios de aceitao aplicveis validao de mtodos analticos e rotina analtica dos laboratrios pblicos e privados que pertencem ou desejam pertencer Rede Nacional de Laboratrios Agropecurios, credenciados ou autorizados a realizar anlises para o Plano Nacional de Controle de Resduos e Contaminantes. A validao dos procedimentos analticos, segundo os requerimentos deste Manual, visa garantir a qualidade metrolgica dos resultados analticos, conferindo-lhes rastreabilidade, comparabilidade e confiabilidade.
I.2 Responsabilidades
Os parmetros e critrios descritos neste documento devem ser observados por todos os laboratrios pertencentes Rede Nacional de Laboratrios Agropecurios, credenciados para determinao de resduos e contaminantes em produto de origem animal e vegetal. O laboratrio que pretenda solicitar credenciamento ou ampliao de escopo, na rea de resduos e contaminantes, tambm deve atender aos requerimentos presentes neste Manual. Alteraes nos procedimentos, parmetros e critrios estabelecidos podero ser necessrios devido especificidade de determinados procedimentos analticos ou peculiaridade do laboratrio. Nestes casos, modificaes podero ser consideradas desde que sejam adequadamente justificadas, garantindo sua consistncia cientfica e conceitual com os princpios deste Manual e o no comprometimento da rastreabilidade, da comparabilidade e da confiabilidade dos resultados analticos gerados.
I.3 Evitando Contaminao

O laboratrio e as reas afins (recepo, armazenamento de amostras, armazenamento de reagentes, lavagem de vidrarias e instrumentos, sala de preparo e extrao, descarte em geral) necessitam ser planejados tendo em vista diminuir ao mximo a possibilidade de contaminaes.
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Procedimentos operacionais devem ser escritos de forma a padronizar todas as operaes realizadas, contemplando desde a recepo das amostras at a emisso dos resultados. Sempre que possvel, o fluxo de amostras, instrumentos, reagentes e vidrarias deve ser unidirecional. Reagentes e solues de altas concentraes devem ser manipulados em locais distintos daqueles onde so preparadas as solues de baixa concentrao. Na impossibilidade deve ser demonstrada, por intermdio de controles, a ausncia de contaminao cruzada. Especial ateno deve ser dispensada ao sistema de exausto utilizado, de forma a minimizar os riscos de contaminao. O controle de insetos e roedores, no laboratrio e em suas proximidades, somente poder ser efetuado se devidamente autorizado pelo responsvel do laboratrio e deve ser feito sob seu controle, de preferncia, sem a utilizao de substncias qumicas volteis ou altamente impregnantes. Artigos de borracha, plsticos e lubrificantes so fontes frequentes de interferncia e devem ser usados com cautela. Quando necessrio, o selamento de recipientes deve ser feito com PTFE Politetrafluoroetileno (teflon) ou silicone.
I.4 Padres de Trabalho (Analticos), de Referncia e MRC

Na validao devem ser utilizados materiais/padres de referncia certificados e homologados pela Farmacopeia Brasileira ou outras instituies competentes, nacionalmente ou internacionalmente reconhecidas. A utilizao de material/padro de trabalho permitida, desde que o material/padro de trabalho seja devidamente rastrevel a um material/ padro de referncia, que por sua vez tenha sido calibrado com um Material de Referncia Certificado (MRC). Os MRC, materiais/padres de referncia, padres de trabalho (analticos) e demais padres devem ser armazenados em local seco, quando necessrio protegido da luz, de preferncia em baixas temperaturas e sempre sob condies controladas e monitoradas, visando diminuir as taxas de degradao, contaminao ou perdas por evaporao. As condies de armazenamento prescritas pelos fornecedores dos MRC e demais padres devem ser estritamente observadas.
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I.5 Cadeia de Custdia de Padres de Trabalho (Analticos)

Os padres de trabalho (analticos) devem possuir cadeia de custdia, para permitir total rastreabilidade sobre seu uso, qualidade, procedncia e origem. As seguintes informaes devem constar da cadeia de custdia: 1. Cdigo de identificao (CAS); 2. Identificao da substncia (IUPAC, DCB/DCI, nome comum); 3. Procedncia; 4. Origem; 5. Prazo de validade; 6. Pureza; 7. Anlises suplementares; 8. Quantidade adquirida; 9. Quantidade utilizada e destinao; 10. Quantidade restante; 11. Responsvel pelas informaes.
I.6 Preparao, Uso e Armazenamento de Solues Padro

O processo de preparao das solues padro deve ser devidamente registrado, identificando os componentes e as respectivas quantidades. As solues devem ser devidamente rotuladas e datadas, acondicionadas em recipientes adequados e hermeticamente fechados, para evitar perdas de solventes volteis e contaminaes, e armazenadas temperatura adequada, se possvel entre 10C e -18C. A preparao das solues padro deve ser baseada em sua massa, usando balanas com resoluo de pelo menos 0,01 mg, deve-se evitar pesar massas de padres inferiores a 10 mg. A massa de tara (do recipiente de pesagem) nunca deve ser inferior a 0,1g, massa (carga) mnima de calibrao das balanas analticas, que so balanas da classe I (Portaria Inmetro
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n 236 de 1994), pois elas no podem ser calibradas abaixo de cem vezes a sua diviso de verificao. Recomenda-se que logo aps o seu preparo e acondicionamento em frasco adequado, as solues padro sejam pesadas. Recomenda-se que essa pesagem seja refeita antes e aps a utilizao de qualquer volume dessas solues. As datas e valores dessas pesagens e os nomes dos tcnicos que prepararam ou utilizaram a soluo padro devem ser anotados para controle (cadeia de custdia). Solues padro estoque (de referncia) e de trabalho armazenadas devem ser comparadas com solues recm-preparadas, para se averiguar se h diferenas nas concentraes e, dessa forma, estabelecer o prazo de validade de utilizao. O estabelecimento dos prazos de validade deve fazer parte dos procedimentos de validao do mtodo analtico, caso o laboratrio opte por trabalhar com armazenamento de solues. Admite-se que a determinao do prazo de validade seja conduzida de forma concorrente rotina analtica. O laboratrio, para preparo de solues padro, necessita ser climatizado e todas as operaes devem ser realizadas sob uma faixa de temperatura previamente estabelecida.
I.7 Reagentes e suas Solues

As especificaes tcnicas dos reagentes analticos devem ser compatveis com a finalidade de seu uso, de forma a evitar a ocorrncia de contaminaes e/ou interaes que venham interferir na qualidade dos resultados analticos. Os reagentes devem ser preferencialmente armazenados em suas embalagens originais, nas condies preconizadas pelo fabricante. O laboratrio deve manter controle efetivo sobre o estoque dos reagentes.
I.8 Recepo, Armazenamento e Preparao de Amostras

As amostras recebidas no laboratrio devem ser avaliadas em relao aos aspectos de inviolabilidade e adequabilidade do recipiente de conteno, identificao, conservao e quantidade encaminhada. Estando as amostras de acordo com os requisitos de recepo, elas devem ser
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cadastradas e receber um cdigo, numrico ou alfanumrico, o qual ser associado, no mnimo, s seguintes informaes: 1. Origem; 2. Data de recepo; 3. Estado de conservao; 4. Quantidade; 5. Tipo de amostra (especificao). Aps a recepo, as amostras devem ser encaminhadas para a preparao, antes da anlise, ou armazenadas de acordo com as suas peculiaridades e requisitos especficos.
I.9 Desenvolvimento e Otimizao do Procedimento Analtico

O desenvolvimento e a otimizao de um procedimento analtico no constituem sua validao e sim a precedem, como mostrado na Figura1. No entanto, quando feito pelo laboratrio, essas atividades trazem muita expertise na execuo do procedimento analtico e muitas informaes teis para o planejamento e conduo da validao. A validao de um procedimento analtico sem sua prvia otimizao intralaboratorial pode resultar no no atendimento aos requisitos de validao, alm de perda de tempo, trabalho e recursos do laboratrio. A otimizao interna do procedimento analtico inclui as calibraes dos instrumentos de medies, a verificao (qualificao) da adequao dos instrumentos de medies e das instalaes do laboratrio ao procedimento analtico, bem como a verificao da adequao dos reagentes e demais insumos analticos, o treinamento dos analistas etc. Na otimizao do procedimento analtico feito um estudo dos efeitos dos diversos fatores experimentais que podem afetar o resultado analtico, procurando-se estabelecer as condies experimentais que produzam um resultado com acurcia adequados ao propsito de uso do resultado analtico. O procedimento de otimizao pode usar os planejamentos fatoriais sequenciais, a metodologia de anlise de superfcie de respostas [4,14,29,30] ou os algoritmos ou mtodos SIMPLEX [4,29,30,37]. As informaes obti-
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das durante a otimizao do procedimento analtico constituem um estudo prvio de sua robustez. Quando for necessrio desenvolver um procedimento analtico para uma combinao analito-matriz (um dado analito em uma dada matriz) de interesse, podemos iniciar por pesquisar se existe algum procedimento j desenvolvido para aquele analito, ou outra substncia com propriedades qumicas semelhantes, na matriz de interesse ou em uma matriz semelhante. Caso exista, usamos esse procedimento sem alteraes para a anlise de um MRC, ou uma amostra de controle, ou uma matriz branca fortificada, da combinao analito-matriz de nosso interesse. Avaliamos ento a veracidade e a preciso, i.e., a exatido ou acurcia desse procedimento. Caso a exatido do procedimento original no atenda ao propsito de uso, procedemos ento a alteraes desse procedimento, visando sua adaptao combinao analito-matriz de nosso interesse. Durante o desenvolvimento e a otimizao de um procedimento analtico, especial ateno deve ser dada a algumas de suas etapas, como discutido a seguir: 1. No processo de extrao, digesto ou abertura a alquota de amostra utilizada deve ser totalmente desintegrada durante. Excetuando os casos onde isso no necessrio ou inapropriado (e.g. determinao de resduos presentes em superfcies). 2. Durante o processo de concentrao, especial ateno deve ser dada etapa de evaporao do solvente, devido ao fato de que alguns analitos podem ser perdidos por arraste. A temperatura de evaporao deve ser a mais baixa possvel e um pequeno volume de solvente, com alto ponto de ebulio, deve ser utilizado de forma a minimizar o arraste. No se recomenda o uso de corrente de ar, pela possibilidade de contaminao, oxidao e introduo de umidade no sistema. 3. A estabilidade do analito sob o processo de extrao, no extrato e sob a temperatura do injetor automtico deve ser considerada e demonstrada durante o desenvolvimento do mtodo. Caso disponvel, a estabilidade do analito poder ser demonstrada por intermdio da apresentao de trabalhos cientficos publicados, os quais devero ser anexados ao dossi de validao.
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I.10 Validao de Procedimentos Analticos

A validao um estudo experimental e documentado que objetiva demonstrar que o procedimento analtico avaliado adequado finalidade proposta, de forma a assegurar a confiabilidade dos resultados obtidos. essencial que a validao seja realizada sobre o procedimento analtico exatamente da forma que ele ser executado na rotina do laboratrio. O planejamento, a preparao e a execuo da validao devem seguir protocolos de validao detalhados contemplando: 1. Adequao ao uso pretendido: finalidade e mbito de aplicao; 2. Responsvel tcnico do projeto; 3. Pessoal tcnico envolvido com as respectivas responsabilidades; 4. Identificao das unidades, equipamentos/instrumentos utilizados; 5. Procedimento Operacional Padro (POP) inicial de execuo do procedimento analtico para pr-validao; 6. Parmetros de desempenho e critrios de aceitao; 7. Experimentos de pr-validao e de validao propriamente dita; 8. Caractersticas de desempenho dos equipamentos/instrumentos; 9. Qualificao dos materiais (padres, reagentes, amostras e alquotas, entre outros); 10. Realizao dos experimentos da pr-validao: dados (registros) e concluso; 11. Realizao dos experimentos da validao: dados (registros) e concluso; 12. POP final e definitivo para a execuo do procedimento analtico na rotina; 13. Relatrio final de validao. Em se tratando de mtodo normalizado, os parmetros crticos (veracidade e preciso) devem ser avaliados com o intuito de demonstrar que os procedimentos preconizados atendem aos critrios de aceitao estabelecidos neste Manual.
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Caso sejam realizadas alteraes no procedimento normalizado, a validao dever ser conduzida na extenso necessria. No mnimo, os estudos de veracidade e de preciso devero ser realizados. Aps o trmino dos estudos de validao, o laboratrio deve deixar IMEDIATAMENTE DISPONVEIS (o que significa produzir e deixar cpia impressa pronta para ser entregue ao Mapa) os seguintes documentos, os quais comporo o chamado Pacote de Validao do laboratrio: 1. O procedimento de validao empregado pelo laboratrio nos estudos, escrito na forma de POP ou documento padronizado do laboratrio; 2. O respectivo relatrio de validao. Neste relatrio devem estar claramente descritos os parmetros de validao estudados e os resultados obtidos, bem como uma avaliao sobre o cumprimento dos critrios de aceitao para cada um dos parmetros estudados. Salienta-se que o relatrio de validao no se resume apenas aos dados brutos, razo pela qual se recomenda a utilizao do modelo de relatrio de validao estabelecido pela CGAL/SDA; 3. Todos os dados brutos referentes a cada um dos ensaios e parmetros estudados durante a validao e constantes do respectivo relatrio. Um fluxograma geral, mostrando as etapas de desenvolvimento e otimizao do procedimento, sua validao, utilizao na rotina de anlises e controle estatstico, mostrado na Figura1. Em relao validao e garantia da qualidade de procedimentos analticos, recomendamos a leitura e consulta das referncias bibliogrficas [34] e [57] do anexo XIII as quais, por sua relevncia e amplitude, constituem-se em contribuies notveis a esta rea do conhecimento, bem como as referncias [10], [15], [16], [29], [33], [34], [35], [36] e [47].
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Figura1 Delineamento experimental, fluxograma das etapas bsicas de desenvolvimento, validao e controle na rotina de um procedimento de anlise qumica
INCIO
Desenvolver o procedimento analtico Otimizar o procedimento analtico
sim
Reotimizar o procedimento analtico.
Validao do procedimento analtico otimizado. Ver Figura 3
Parar o uso do procedimento na rotina. Procedimento validado no
*Rever critrios de validao
no
sim Causa do descontrole encontrada. Procedimento novamente sob controle. sim Utilizao do procedimento analtico na rotina
O procedimento analtico no pode ser usado na rotina
Durante a rotina: 1. Fazer controles peridicos com amostras de controle. 2. Construir cartas de controle.
Procurar a causa da falta de controle estatstico do procedimento
no
Procedimento sobre controle estatstico
sim
FIM Nota: *Desde que os critrios legais de aceitao estabelecidos sejam atendidos. Fonte: Adaptado das refs. [15, 34, 57, 58]
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I.11 Condues do Processo de Validao

A validao de um procedimento analtico constitui o primeiro nvel e primeira ferramenta da garantia da qualidade de um sistema de qualidade laboratorial. Os demais nveis do sistema de qualidade e suas ferramentas so o controle de qualidade interno, a participao em ensaios interlaboratoriais colaborativos e/ou de proficincia, culminando com a acreditao do procedimento analtico validado (Figura2 [34]). Para minimizar a carga de trabalho do processo de validao, recomenda-se que seja adotado um planejamento cuidadoso e estatisticamente consistente, que permita combinar ensaios de forma a determinar diferentes parmetros de validao em um mesmo experimento. A Figura3 mostra um fluxograma alternativo para a conduo do procedimento de validao. Os experimentos de veracidade e preciso podem ser combinados se um MRC ou outro material de referncia ou padro adequado for utilizado nas anlises qumicas, para o levantamento desses parmetros. Se o laboratrio optar por determinar a repetitividade associada a cada combinao de instrumentos analticos, analistas, entre outras; o conjunto desses dados tambm pode ser levado em considerao na estimao da preciso intermediria (reprodutibilidade intralaboratorial). Figura2 A validao de um procedimento analtico no contexto do sistema de gesto da qualidade de um laboratrio
CREDENCIAMENTO Mapa
Ensaios interlaboratoriais Cartas de controle Controle estatstico Validao Procedimento e sistema analtico. Escopo. Adequao ao propsito de uso
Incerteza de medio
Resultado analtico convel, rastrevel e comparvel
Fonte: Adaptado das refs. [34, 59].
22
Figura3 Conduta do procedimento de validao: delineamento experimental, fluxograma alternativo das etapas de validao
INCIO
CCAS: Estudo da Linearidade, Sensibilidade:
Construir a curva de calibrao CCAS: obter as leituras replicadas da resposta instrumental em cada nvel da calibrao
Testar a Homocedasticidade Ver Figura 4 e Anexo II
no
MMQO
sim
MMQP
Calcular os parmetros da regresso: a, b, sa, sb e cov (a,b) Testar a qualidade do ajuste ( Ver Figura 5 ) Decidir por ajuste de reta ou polinmio
no
SELETIVIDADE Testar efeito de matriz ou a incluso de nova matriz
sim
CCMBF ou CCEMBF Repetir o Estudo da Linearidade, Sensibilidade com curvas de calibrao matrizadas a matriz ou nova matriz a incluir
Comparar a curva de calibrao no matrizada CCAS com a curva de calibrao matrizada CCMBF ou CCEMBF
Continuar usando as CCAS na validao e na rotina
no
Efeito de matriz signicativo
sim Usar as CCMBF ou as CCEMBF na validao e na rotina 3
Fonte: Adaptado das refs. [34, 57]
23
3 3
Estudo da Exatido: Determinao da recuperao com MRC ou com forticao de matriz
Estudo da Preciso de Repetitividade e/ou Reprodutibilidade Replicaes do estudo de exatido
Estimar a incerteza de medio Usar o mtodo Bottom-Up ou o mtodo Top-Down
Calcular CC e CC ou LD Usar os dados da curva de calibrao conjunta de trs dias e do clculo de incerteza, ou das 20 replicaes de anlises de forticaes no LMR ou no LMDR
sim
Calcular CC Calcular CCe e CC ou LD ou CC LD

no
Estudo de Robustez Usar um planejamento fatorial dos tratamentos (fatores) que afetam o resultado da anlise ou uma abordagem clssica de variar um fator de cada vez
FIM FIM
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Parmetros e Critrios de Aceitao de Desempenho de um Procedimento Analtico
PARTE 2
Parte II
Parmetros e Critrios de Aceitao de Desempenho de um Procedimento Analtico
II.1 Nveis de Interesse Analtico
Os parmetros e os critrios de validao aplicveis s determinaes dos analitos (resduos ou contaminantes) devem levar em considerao o nvel de concentrao de interesse, ou simplesmente o nvel de interesse limite mximo permitido ou limite mximo de resduo (L) ou teor mximo de contaminante (TMC) ou limite mnimo de desempenho requerido (LMDR), ou o limite de quantificao (LQ) ou assemelhados no qual alguma deciso ser tomada. Para as substncias permitidas (toleradas), devem ser levados em considerao os Limites Mximos Permitidos (LMR ou TMC). Quando no houver LMR ou TMC definidos para os analitos permitidos, deve ser tomado como referncia o valor arbitrado estabelecido nas normativas publicadas pela rea competente do Mapa. Para os analitos banidos ou proibidos, os laboratrios devem utilizar como referncia o Limite Mnimo de Desempenho Requerido (LMDR) estabelecido nas normativas especficas. Quando no houver LMDR definido para o mtodo de quantificao do analito banido ou proibido, deve ser tomado como referncia o valor arbitrado estabelecido nas normativas publicadas pela rea competente do Mapa. Alguns requisitos para tcnicas especficas como espectrometria de massas (EM) devem ser observados durante o processo de validao de um procedimento analtico. So apresentados, a seguir, critrios de desempenho aplicveis tcnica de deteco por espectrometria de massas (EM).
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II.2 Critrios de Desempenho Aplicveis Deteco por EM

Os mtodos de espectrometria de massas (EM) so adequados como mtodos de confirmao, quando usados aps separao cromatogrfica. A deteco por espectrometria de massas deve ser realizada com a utilizao de tcnicas de EM, tais como: registro de espectro total de massa (varrimento total); monitoramento seletivo de ons (MIS) ou tcnicas EM/ EM como monitoramento de reaes mltiplas (MRM) ou ainda EM/EM combinadas com modos adequados de ionizao. Quando a determinao por EM for efetuada por meio de varrimento total, obrigatria a presena no espectro de no mnimo quatro ons com intensidades relativas 10% do pico base. Pelo menos quatro ons devem atender ao critrio das tolerncias mximas permitidas de intensidades relativas de ons, expressas em porcentagem, conforme Tabela1. Quando a determinao for efetuada no modo MIS, o on molecular deve, de preferncia, ser um dos ons diagnsticos selecionados; estes no devem ter exclusivamente origem na mesma zona da molcula. A razo sinal/rudo para cada on diagnstico deve ser maior ou igual 3:1 e as intensidades relativas de ons devem estar de acordo com a Tabela1. Tabela1 Tolerncias mximas permitidas para as intensidades relativas de ons utilizando diversas tcnicas analticas de espectrometria de massas
Intensidade relativa (% do pico de base) >50% 20%-50% 10%-20% 10%
Fonte: Deciso 2002/657/CE Quadro 4 [10].
CG-EM (IE) 10% 15% 20% 50%
CG-EM (IQ), CG-EM/EM, LC/EM, CL-EM/EM (relativa) 20% 25% 30% 50%
Deve-se verificar a variabilidade das intensidades relativas dos ons no padro de calibrao e amostras fortificadas. Sempre que os fragmentos forem medidos com outra tcnica que no a do varrimento total, deve-se usar um sistema de pontos de identificao (Tabela2). Um mnimo de quatro pontos de identificao requerido no caso de confirmao de substncias proibidas e um mnimo de trs pontos de identificao para substncias com Limite Mximo Permitido estabelecido.
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Tabela2 Pontos de identificao de acordo com a tcnica de espectrometria de massas utilizada

Pontos de Identificao Obtidos por on Espectrometria de massas de baixa resoluo 1,0 on precursor (espectrometria de massa de baixa resoluo) 1,0 Produtos de transio (espectrometria de massas de baixa resoluo) 1,5 Espectrometria de massa de alta resoluo 2,0 on precursor (espectrometria de massas de alta resoluo) 2,0 Produtos de transio (espectrometria de massas alta resoluo) 2,0 Tcnica de EM
Fonte: Deciso 2002/657/CE Quadro 5 [10]. Obs.: Cada on s pode ser contabilizado uma vez. Nos produtos de transio esto includos os produtos de segunda e de terceira gerao. A CG-EM com a utilizao da ionizao por impacto eletrnico considerada uma tcnica diferente da CG-EM que utiliza a ionizao qumica. Diferentes analitos podem ser utilizados para aumentar o nmero de pontos de identificao apenas se os derivativos resultarem de reaes com mecanismos diferentes.
A Tabela3 apresenta exemplos de nmero de pontos de identificao utilizando diferentes tcnicas analticas e suas combinaes (n = 1). Tabela3 Pontos de identificao utilizando diferentes tcnicas analticas e suas combinaes
Tcnica (s) CG-EM (IE ou IQ) CG-EM (IE + IQ) CG-EM (IE) + CG-EM (IQ) (2 derivativos) CL-EM CG-EM/EM CL-EM/EM Fonte de Identificao N 2 (IE) + 2 (IQ) 2 (Derivativo A) + 2 (Derivativo B) Pontos de Identificao n 4 4 n 4 4 5 5 5,5 2n 4 4
N 1 precursor + 2 ons produtos 1 precursor + 2 ons produtos 2 ons precursores, cada um com CG-EM/EM um on produto 2 ons precursores, cada um com CL-EM/EM um on produto 1 precursor, 1 on produto e 2 ons CL-EM/EM/EM produtos de primeira gerao EM de alta resoluo N CG-EM e CL-EM 2+2 CG-EM e EM de alta resoluo 2 + 1
Fonte: Deciso 2002/657/CE Quadro 5 [10]. Nota: n = 1.
Detectores seletivos utilizados em CG ou CL, tais como captura de eltrons (ECD), fotomtrico de chama (FPD), de nitrognio e fsforo (NPD), arranjo de diodos (DAD) e de fluorescncia (FL) s oferecem
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seletividade limitada. Seu uso, mesmo em combinao com colunas de diferentes polaridades, pode fornecer somente evidncia confirmatria limitada. Essas limitaes podem ser aceitveis para os resduos frequentemente encontrados, especialmente se alguns resultados forem tambm confirmados atravs de uma tcnica de deteco mais especfica. Tais limitaes no grau de confirmao devem ser mencionadas ao se apresentar os resultados da anlise. A Tabela4 apresenta exemplos de mtodos adequados para anlise confirmatria de substncias. Tabela 4 Exemplos de mtodos adequados para anlise confirmatria de substncias
Tcnica (s) CG ou LC e EM CL/DAD CL/FL TLC bidimensional (espectrofotometria) CG/ECD, NPD, FPD Derivatizao CL/Imunograma CL/UV/VIS (com comprimento de onda nico) Critrio Se o nmero suficiente de ons monitorado Se o espectro UV caracterstico Em combinao com outras tcnicas Em combinao com outras tcnicas Apenas se combinado com duas ou mais tcnicas de separao* Se esta no for o primeiro mtodo de escolha Em combinao com outras tcnicas Em combinao com outras tcnicas
Fonte: Codex Alimentarius Commission Discussion Paper Methods of Analysis for Residues of Veterinary Drugs in Foods-Cx/Rvdf 10/19/60, April 2010. Nota: * Outros sistemas cromatogrficos (aplicando fases estacionrias ou mveis de diferentes seletividades) ou outras tcnicas.
II.3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho (FT)

Linearidade a capacidade de o mtodo produzir resultados diretamente proporcionais concentrao do analito na amostra, dentro de um intervalo especificado. De uma forma mais geral, a linearidade a capacidade de o procedimento analtico produzir curvas de calibrao que podem ser adequadamente ajustadas pela equao de uma reta (funo afim). A sensibilidade do procedimento analtico principalmente determinada pelo gradiente, a inclinao da curva de calibrao. Se a curva de calibrao uma reta, a sensibilidade constante em toda a faixa de traba-
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lho e determinada, principalmente, pela inclinao b da reta de calibrao. Se a curva de calibrao no retilnea, ento a sensibilidade ser a determinada principalmente pela derivada da curva de calibrao. Neste caso, a sensibilidade varivel com a concentrao dentro da faixa de trabalho. Um dos fatores que pode reduzir o tamanho da faixa de trabalho a reduo da sensibilidade (inclinao) da curva de calibrao em algum de seus extremos (o outro fator a incerteza de medio, como ser discutido na posteriormente na II.7.2). Por exemplo, se a curva de calibrao um polinmio de segundo grau com concavidade para baixo, ento a sensibilidade diminui com o aumento da concentrao, e pode ocorrer que acima de uma dada concentrao a inclinao da curva se torne muito pequena, tendendo a zero, formando por exemplo um plateau. Nesse caso pode ocorrer que a faixa de trabalho v do limite de quantificao (LQ), em unidades e de concentrao do analito na amostra de ensaio (no domnio da amostra de ensaio) at uma dada concentrao mxima, que ainda tem incerteza de medio menor que a incerteza mxima aceitvel (Imax), mas cuja sensibilidade se tornou inaceitavelmente pequena. Tendo em vista que o objetivo principal das anlises realizadas para o PNCRC avaliar se as amostras esto ou no violadas, a curva de calibrao deve ser construda de forma que o limite mximo permitido se encontre preferencialmente prximo da regio central da curva de calibrao, o centroide, ou prximo do baricentro, dependendo se a curva de calibrao homoscedstica ou heterocedstica, respectivamente. No caso de substncias banidas, o LMDR deve estar contemplado na curva de calibrao.
II.3.1 Procedimento de Estimao e Critrios de Aceitao da Curva de Calibrao e da Linearidade Trs so os tipos possveis de curva de calibrao que podem ser elaboradas: 1. CCAS Curva de Calibrao do Analito em Soluo: construda a partir dos padres de calibrao do analito puro em solvente. Este tipo de curva de calibrao somente poder ser utilizado se comprovada a inexistncia do efeito de matriz. 2. CCMBF Curva de Calibrao da Matriz Branca Fortificada: construda a partir da matriz branca fortificada com os padres de calibrao do analito puro. 3. CCEMBF Curva de Calibrao do Extrato da Matriz Branca Fortificado: construda a partir do extrato da matriz branca fortificado com os padres de calibrao do analito puro.
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De uma forma geral, o planejamento de elaborao da curva analtica deve contemplar os seguintes critrios: O nmero de nveis de concentrao das solues padro de calibrao, designado por I, deve ser no mnimo cinco, I5. Cada i-simo nvel de concentrao deve ter sua soluo preparada independentemente no mnimo trs vezes, J3. Isso resultar em um nmero total Nx de solues de calibrao independente igual a Nx=IJ. Cada uma das Nx solues de calibrao deve ser medida (injetada, apresentada) no instrumento de medio analtica um nmero L de vezes. Isso resultar em um nmero total de leituras da resposta instrumental igual a Ny=IJL=NxL. Se L=1 ento Nx=Ny. 1. O nmero total de respostas instrumentais Ny deve ser igual ou superior a 30 (Ny30). 2. Todas as Ny leituras instrumentais devem ser feitas aleatoriamente. Dessa forma, as curvas analticas devem ser obtidas a partir de, no mnimo, cinco nveis (I5) de concentrao, preferencialmente distribudos de forma equidistante, se as respostas instrumentais forem homoscedsticas. Todos os i-simos nveis de concentrao da curva de calibrao devem ser preparados em pelo menos trs rplica (J3). Cada j-sima rplica da i-sima concentrao deve ser lida (injetada, inserida, apresentada, colocada) no instrumento de medio analtica no mnimo uma vez (L1). As J replicatas de cada nvel de concentrao devem ser replicatas independentes, e no somente subalquotas de uma mesma soluo de calibrao. Isso significa que as J solues padro de uma mesma concentrao devem ser preparadas independentemente e injetadas no instrumento de medio analtica L vezes cada (L1). As leituras (medidas instrumentais das solues padro de calibrao) devem ser feitas em ordem aleatria, inclusive as leituras das solues padro de calibrao de mesma concentrao, adotando-se os devidos cuidados para evitar contaminaes cruzadas. Os ajustes das curvas de calibrao no devem ser forados a passar pela origem (pelo zero). Se os desvios-padro de repetitividade da resposta instrumental em cada nvel de concentrao (syi) da curva de calibrao no forem estatisticamente iguais, sugerindo heterocedasticidade, significa que os dados da
30
calibrao devem ser tratados pelo Mtodo dos Mnimos Quadrados Ponderados (MMQP) ver Anexo VI. No caso de homoscedasticidade podem ser usados ambos os Mtodos dos Mnimos Quadrados Ordinrios (MMQO) ver Anexo I ou o MMQP. Observao: o MMQO um caso particular do MMQP, assim no caso de homoscedasticidade ambos os mtodos levam ao mesmo resultado. No entanto, como o MMQO um caso particular do MMQP, a utilizao deste ltimo sempre correta e recomendada, eliminando, no caso, a necessidade de se fazer o teste de homoscedasticidade da curva de calibrao. Em ambos os casos, os parmetros da reta de calibrao o intercepto e a inclinao devem ser estimados, assim como suas incertezas 2 (desvios-padro), sa e sb, respectivamente, e a covarincia, sab = cov ( a, b ) , entre eles. A faixa linear de trabalho deve compreender os valores de LMR ou LMDR por meio da equivalncia funcional estabelecida pela curva de calibrao. A avaliao dos parmetros ajustados da curva de calibrao, de sua qualidade e da linearidade deve ser conduzida conforme indicado do AnexoI ao AnexoVI e nos fluxogramas das figuras 4 e 5. Caso seja verificado que a curva de calibrao no estatisticamente bem representada por uma reta (funo afim), pode-se proceder ao ajuste da curva de calibrao outras funes, incluindo os polinmios de ordem superior a um (curva de calibrao polinomial). Deve-se evitar polinmios de graus altos. Polinmios de at terceiro grau devem satisfazer a quase totalidade das situaes experimentais. A soluo analtica geral para a regresso de polinmios de grau um (reta), grau dois (parbola) ou graus maiores pelos mtodos dos Mnimos Quadrados Ordinrios (MMQO) ou Ponderados (MMQP) ou Generalizados (MMQG) envolve clculo matricial [29,31,48,49,50,51]. Ela mais complexa, mas perfeitamente factvel em qualquer computador pessoal. Com essa soluo analtica, alm de obter os valores dos parmetros ajustados, tem-se tambm a matriz das varincias e covarincias dos parmetros ajustados. Os elementos dessa matriz so usados na lei de propagao das incertezas para se estimar a incerteza de calibrao na concentrao do analito interpolada na curva de calibrao.
31
Figura 4 Ajuste da curva de calibrao da resposta instrumental (RI) versus a concentrao das solues padro de calibrao. Procedimento para a escolha da regresso pelo MMQO ou pelo MMQP. Estimao dos parmetros de ajuste suas incertezas e covarincias. Avaliao da qualidade dos dados e do modelo ajustado por inspeo visual (grfica) dos resduos e tratamento de valores extremos (esprios, duvidosos, aberrantes, outliers) Continua na Figura5
INCIO 1
Dados da Curva de Calibrao: Resp. Inst. vs. Conc.
MMQP RI = aw + bw xi Estimao do intercepto aw, da inclinao bw, dos desvios padro saw e sbw, da covarincia cov(aw,bw) e do Coef. Cor. Lin. rw
No MMQO RI = a + b xi Estimao do intercepto a, da inclinao b, dos desvios padro sa e sb, da covarincia cov(a,b) e do Coef. Cor. Lin. r(yi,xi). Inspeo Visual dos Dados e dos Grcos (Curva de calibrao e de resduo)
Homocedasticidade ( = 0,05)
Sim Excluso de Dados (mximo 22,2 % do nmero original de dados sem excluir nvel de concentrao) MMQO ou MMQP RI = a + b xi + cxi2 + Estimao de a, b, c, das varincias sa, sb, sc, das covarincias cov(a,b), cov(a,c), cov(b,c), e do Coef. Cor. do ajuste ou Coef. de Determinao R = r(yi,yicalc).
Outliers ( =0,05) No
Sim
Ajuste de polinmio
Sim
Falta de ajuste
No Reduzir a faixa de calibrao ou alterar condies de deteco ou o procedimento analtico. No 1
32
Figura 5 Avaliao da qualidade do ajuste: Teste r para a linearidade entre x e y no caso da reta. Teste de r para a linearidade entre y e ycalc no caso de ajuste polinomial
2
Calcular tR = tr ou tRw = trw
No
Reta
Sim
Calcular tr ou trw
tR ou tRw > t ,
tr ou trw > t ,
Sim
No
Reduzir a faixa de calibrao ou alterar condies de deteco ou o procedimento analtico
No
Sim
1 Ajuste da curva de calibrao adequado
Fim
II.4 Seletividade e Efeito Matriz

A seletividade a extenso na qual um procedimento analtico pode determinar analito(s) particular(es) em mistura(s) ou matriz(es) sem a interferncia de outros componentes de comportamento semelhante. Portanto, a capacidade do procedimento analtico de discriminar entre a substncia a analisar e substncias anlogas (ismeros, metablitos, produtos de degradao, substncias endgenas, componentes da matriz, isbaros e componentes que possam gerar interferncia poliatmica, entre outras). A verificao da seletividade do procedimento analtico deve ser realizada a partir da comparao entre os sinais (resposta instrumental) advindos do processamento da matriz, do extrato/digerido da matriz fortificada e do analito puro em solvente.
33
Algumas tcnicas instrumentais, como espectrometria de massas acoplada cromatografia, podem ser altamente seletivas, garantindo uma identificao inequvoca do analito e nenhum ou quase nenhum efeito de matriz. Efeito Matriz um estudo de seletividade que objetiva averiguar possveis interferncias causadas pelas diversas substncias que compem a matriz amostral, gerando, basicamente, fenmenos de diminuio ou ampliao do sinal instrumental ou resposta instrumental. O estudo de efeito matriz no necessita ser realizado no caso de se utilizar uma curva de calibrao CCMBF E CCEMBF.
II.4.1 Procedimento de Determinao do Efeito Matriz Preparar uma curva de calibrao CCAS com no mnimo cinco nveis I de concentrao (I5), usando solues padro de calibrao, no matrizadas, de analito puro em solvente puro. Analisar, usando a CCAS, amostras elaboradas no mnimo em trs nveis de fortificao, de tal forma que o limite permitido se encontre preferencialmente na regio central dos nveis. Um mnimo J de seis rplicas (J6) por nvel de fortificao de: 1. Analito em solvente puro (amostra no matrizada); 2. Analito em matriz branca ou em extrato/digerido de matriz branca (amostra matrizada). Aps as anlises replicadas dessas amostras matrizadas e no matrizadas, realizadas usando a CCAS, proceder avaliao dos resultados das concentraes do analito obtidas nas vrias fortificaes analisadas como indicado a seguir.
II.4.2 Procedimentos de Avaliao e Critrios de Aceitao do Efeito Matriz Utilizando os dados obtidos dos experimentos, usando a CCAS, de anlise do analito em solvente e dos extratos/digeridos de matriz branca fortificados: aplicar o teste F (Fischer-Snedecor), de homogeneidade de varincias, para verificar se as varincias das amostras no matrizadas e matrizadas podem ser consideradas estatisticamente iguais, em cada nvel i de fortificao. Para tanto, aplicam-se os seguintes clculos para cada nvel i de concentrao (fortificao), comparando-se amostras no matrizadas com aquelas matrizadas:
34
Fcalc ,i = si2,1
Onde:
s2
i ,2
(1)
e so as varincias das sextuplicatas das amostras no matrizadas e matrizadas, em cada nvel de concentrao, com a maior varincia no numerador.
Ao mesmo tempo, obtm-se o valor crtico tabelado de Fcrit,a,ni1,ni2, com ni,1= ni,115 graus de liberdade no numerador e ni,2= ni,215 graus de liberdade no denominador. Adotar um nvel de significncia a=0,05 (5%) ou nvel de confiana 1a=0,95 (95%). Se em um dado nvel de concentrao i o valor de Fcalc,i for menor que o Fcrit,a,ni1,ni2, as varincias desse nvel de concentrao podem ser consideradas iguais, ou seja, a matriz no tem efeito importante sobre a preciso do mtodo nesse nvel de fortificao i considerado. Nesse caso, os desvios-padro desses dois grupos de anlises podem ser agrupados e a igualdade das mdias dos dois conjuntos de amostras pode ser testada com a distribuio t de Student: comparao das mdias de concentrao do nvel i. Desse modo, calculam-se: 1. e = mdias das concentraes do analito em amostras com matriz (extrato/digerido de matriz branca fortificado) e sem matriz (analito puro em solvente puro), respectivamente, em cada nvel de concentrao (fortificao).
2. si,1 e si,2 = desvios-padro das concentraes do analito no i-simo nvel de fortificao. 3. O valor da estatstica tcalc,i:
Onde:
(2)
(n =
i ,1
1) si2,1 + ( ni ,2 1) si2,2
(n
i ,1
+ ni ,2 2 )
(3)
ni,1 e ni,2 = so os nmeros de replicatas nas amostras 1 e 2 (no matrizada e matrizada ou vice-versa).
35
O valor crtico tabelado de tcrit,a,n obtido, para cada nvel i, a partir da tabela da distribuio de Student para (ni= ni,1+ni,22) graus de liberdade e nvel de significncia a=0,05 (5%) ou nvel de confiana 1a=0,95 (95%). Se em um dado nvel de concentrao i o valor de Fcalc,i for maior que o Fcrit,a,ni1,ni2, as varincias no podem ser consideradas estatisticamente iguais no nvel de fortificao i considerado. Verifica-se ento o efeito de matriz com a distribuio t de Student, usando a seguinte equao:
(4) Neste caso, para a obteno do valor crtico tabelado tcrit,a,n, o nmero de graus de liberdade para cada nvel i igual a:
(5) Se o valor de tcalc,i calculado pela eq.(2) ou pela eq.(4), conforme o caso, for menor que o tcrit,a,n, pode-se concluir que a matriz no afeta o ensaio no i-simo nvel de fortificao. Se o valor de tcalc,i calculado pela eq.(2) ou pela eq.(4), conforme o caso, for maior que o tcrit,a,n , pode-se concluir que a matriz tem um efeito estatisticamente significante sobre o resultado. Para aceitao da no existncia de efeito matriz, no deve haver efeito matriz em nenhum nvel de concentrao das fortificaes.
II.4.3 Procedimento Alternativo para Determinao do Efeito Matriz Outro procedimento, mais simples, para verificar a existncia do efeito de matriz, consiste em comparar os interceptos e as inclinaes de um par de curvas de calibrao. As curvas de calibrao devem ser construdas a partir de solues de calibrao de analito puro em solvente puro (CCAS) e de solues de
36
calibrao matrizadas obtidas da fortificao de extrato/digerido de matriz branca (CCEMBF). Ambas as curvas de calibrao devem contar com no mnimo cinco (I5) nveis de concentrao, um mnimo de trs (J3) repreparos independentes das solues de calibrao e Ny30. As comparaes estatsticas dos pares de interceptos e inclinaes so feitas como mostrado na Parte V Ampliao do Escopo do Procedimento Analtico Validado: Incluso de Analito ou Matriz em Procedimento Analtico Validado. Caso os resultados desses procedimentos indiquem a presena de efeito matriz, o analito deve ser quantificado na rotina, adotando-se uma das possibilidades a seguir: 1. Usar solues de calibrao obtidas de material de refern cia certificado. 2. Usar solues de calibrao obtidas da matriz branca fortificada ou extrato de matriz branca fortificado com o analito. 3. Promover mudanas no procedimento analtico de forma a eliminar o efeito de matriz, alterando, por exemplo, o pr-tratamento da amostra ou a separao do analito ou as condies e a deteco do analito. 4. Analisar as amostras de ensaio pelo mtodo de adio.
II.5 Veracidade/Recuperao
O vocabulrio internacional de metrologia define a veracidade como: grau de concordncia entre a mdia de um nmero infinito de valores medidos repetidos e um valor de referncia. A veracidade a concordncia entre a mdia de um nmero suficientemente grande de resultados de um ensaio e o valor de referncia aceito convencionalmente como verdadeiro. A veracidade est inversamente relacionada ao erro sistemtico ou correo ou ao fator de correo. A determinao da veracidade deve ser feita por intermdio de ensaios de recuperao utilizando-se material de referncia certificado MRC. Caso no haja MRC disponvel, a determinao da recuperao deve ser feita por intermdio de matriz branca fortificada. Na falta de uma matriz branca pode-se usar uma amostra de ensaio com baixa concentrao do analito.
37
No se deve confundir a recuperao com a eficincia de extrao ou de digesto da amostra. A recuperao mede a tendncia total do procedimento analtico e, portanto, uma expresso de sua veracidade. A recuperao tem por objetivo corrigir o resultado da anlise dos erros sistemticos oriundos dos efeitos de extrao ou digesto e das perdas advindas de todas as etapas da marcha analtica, realizadas at a leitura da resposta instrumental, tais como limpeza (clean-up), diluies ou pr-concentrao, derivatizaes, secagens. Para corrigir o resultado pela recuperao, pode-se usar o fator de recuperao, frec, cujo inverso o fator de correo de recuperao, FCrec=1/frec, e , portanto, um fator multiplicativo; ou usar uma correo de recuperao, Crec, que uma parcela aditiva. O fator de recuperao frec, ou o fator de correo da recuperao FCrec ou a correo de recuperao Crec deve ser inserido na funo de medio (modelo de medio) ou equao do mensurando para fins da estimao da incerteza de medio, mesmo se a correo de recuperao no for efetuada.
II.5.1 Procedimento de Determinao da Veracidade/ Recuperao Analisar seis rplicas de Material de Referncia Certificado (MRC) ou de matriz branca, antes e aps fortificao com os padres de calibrao, em no mnimo trs nveis de concentrao (alta, mdia e baixa). Para as substncias permitidas, os limites de interesse estabelecidos (LMR/TMC) devem se encontrar preferencialmente na regio central dos nveis de concentrao da curva de calibrao. Para as substncias banidas, o LMDR deve estar prximo ao Menor Nvel Calibrado (MNC). Quando a recuperao obtida a partir de fortificaes de matriz branca, o fator de recuperao frec calculado pela equao: Onde: cf = teor medido aps fortificao da matriz branca; cnf = teor medido na matriz branca no fortificada, i.e., antes da fortificao; (6a)
38
cad = teor do analito puro adicionado matriz branca.
Quando a recuperao obtida a partir do uso do MRC, o fator de recuperao calculado por meio da equao:
(6b) Onde: cmed = teor medido na anlise do MRC; cMRC = teor declarado no certificado do MRC.
Dependendo se o estudo de determinao da recuperao foi feito com Matriz branca fortificada ou com MRC, a correo de recuperao Crec calculada pelas seguintes equaes, respectivamente: (6c) (6d) Para corrigir o resultado usando o fator de recuperao, multiplica-se o resultado no corrigido pelo fator de correo de recuperao, igual ao inverso do fator de recuperao. Independentemente se o fator de recuperao foi obtido atravs de fortificao ou com MRC:
FCrec=1/frec ou FCrec=1/frec,MRC (6e)

Calcular o fator recuperao mdio e/ou a correo de recuperao mdia e o coeficiente de variao (CV) em cada nvel de concentrao do estudo de veracidade/recuperao.
II.5.2 Critrios de Aceitao da Veracidade/Recuperao A veracidade do procedimento analtico medida pela eq.(6a) ou eq.(6b) deve estar compreendida dentro de intervalos especificados por norma, legislao especfica, contrato com o cliente, ou na falta desses, especificados internamente no laboratrio ao redor de 100%, de acordo com as respectivas faixas de concentraes. Excepcionalmente, valores fora das faixas especificadas podero ser aceitos desde que devidamente justificados. A Tabela5 apresenta os critrios de aceitao para a veracidade, aplicveis anlise de resduos e contaminantes em produtos de origem animal.
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Tabela5 Faixas de Aceitao do Fator de Recuperao acima e abaixo de 100%

Concentrao (C) c 1 mg/kg 1 mg/kg < c < 10 mg/kg c 10 mg/kg
Fonte: Deciso 2002/657/CE, Quadro 2.
Intervalos (%) -50 % a +20% -30 % a +10 % -20 % a +10 %
II.6 Preciso
a estimativa da disperso de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres, em condies definidas. As trs maneiras de express-la so por meio da repetitividade, da preciso intermediria (ou reprodutibilidade interna ou reprodutibilidade intralaboratorial) e da reprodutibilidade. Sendo que a reprodutibilidade de um procedimento analtico somente pode ser estimada mediante a participao de um ensaio interlaboratorial colaborativo (EC), raramente disponvel.
II.6.1 Repetitividade a preciso intracorrida, ou seja, o grau de concordncia entre os resultados de medies sucessivas, efetuadas sob as mesmas condies de medio (ver definies no AnexoX).
II.6.2 Preciso Intermediria ou Reprodutibilidade Intralaboratorial Tambm denominada reprodutibilidade interna, refere-se preciso intermediria avaliada sobre a mesma amostra, amostras idnticas ou padres, utilizando o mesmo mtodo, mesmo laboratrio, mas alterando algumas condies, tais como: dias de anlise, analistas, equipamentos e condies ambientais, entre outras, se necessrio.
II.6.3 Procedimento de Determinao da Repetitividade Preparar e analisar um conjunto de amostras constitudas de matrizes brancas fortificadas ou de MRCs, no mnimo em trs nveis de concentrao, com as substncias a analisar, de tal forma que os limites permitidos se encontrem preferencialmente na regio central dos nveis de concentrao e o LMDR seja contemplado, conforme se trate de substncias permitidas ou banidas.
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Para cada nvel, a anlise deve ser realizada em, pelo menos, seis rplicas independentes. Calcular a concentrao determinada para cada amostra replicada. Calcular as concentraes mdias, os desvios-padro de repetitividade (sr) e os coeficientes de variao de repetitividade (%) das amostras fortificadas em cada nvel de concentrao.
II.6.4 Procedimento de Determinao da Preciso Intermediria ou Reprodutibilidade Intralaboratorial Preparar e analisar um conjunto de amostras constitudas de matrizes brancas fortificadas ou de MRCs, no mnimo em trs nveis de concentrao, com as substncias a determinar, de tal forma que os limites permitidos se encontrem preferencialmente na regio central dos nveis e concentrao e o LMDR seja contemplado, conforme se trate de substncias permitidas ou banidas. Para cada nvel de concentrao, a anlise deve ser realizada em, pelo menos, seis rplicas independentes. Repetir estes passos pelo menos mais duas vezes em dias diferentes, variando sempre que possvel os operadores, os instrumentos, as condies ambientais, lotes de reagentes e solventes, entre outros fatores experimentais. Assim o estudo da preciso intermediria constitui-se essencialmente de repetidos estudos de repetitividade em diferentes condies experimentais dentro de um laboratrio. Calcular a concentrao detectada para cada amostra replicada. Calcular a concentrao mdia, os desvios padro de reprodutibilidade (sR) e os coeficientes de variao para cada nvel de concentrao das amostras fortificadas, combinando todos os resultados de cada nvel.
II.6.5 Critrios de Aceitao da Preciso Em condies de repetitividade, o coeficiente de variao deve tipicamente situar-se abaixo de dois teros dos valores apresentados na Tabela6 conforme a faixa de concentrao. No caso de anlises repetidas de uma amostra em condies de reprodutibilidade intralaboratorial, o coeficiente de variao intralaboratorial da mdia no deve exceder aos valores da Tabela6.
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Tabela6 Critrios de Aceitao da Reprodutibilidade

Concentrao (c) c < 1 mg/kg 1 mg/kg c < 10 mg/kg 10 mg/kg c < 100 mg/kg 100 mg/kg c < 1 mg/kg 1 mg/kg c <10 mg/kg 10 mg/kg c < 100 mg/kg 100 mg/kg c < 1 g/kg 1 g/kg c < 10 g/kg 10 g/kg c < 100 g/kg 100 g/kg c < 1 kg/kg Coeficiente de Variao (CV) (%) 35 30 20 15 10 7.3 5,3 3,7 2,7 2,0
Nota: CV = uc(canal)/canal, isto , o coeficiente de variao igual incerteza combinada da concentrao do analito dividido pela prpria concentrao do analito.
II.7 Limites de Deteco (LD), Limite de Quantificao, (LQ), Limite de Deciso (CC) e Capacidade de Deteco (CC)
II.7.1 Limite de Deteco (LD) Esse termo definido no VIM como: Valor medido, obtido por um dado procedimento de medio, para o qual a probabilidade de declarar falsamente a ausncia de um componente em um material b, sendo a a probabilidade de declarar falsamente a sua presena (ver AnexoX). Essa definio completamente equivalente definio de limite mnimo detectvel da varivel lquida de estado da norma ISO 11843 [24, 25] e com a definio de Capacidade de Deteco (CCb) para substncias banidas da Deciso 2002/657/CE [10]. Assim, o valor de CCa calculado no nvel de concentrao zero (como no caso de uma substncia banida) o limite de deteco, mesmo para as substncias toleradas, e essa a abordagem que recomendamos.
II.7.2 Limite de Quantificao (LQ) O VIM no define esse termo. Vrias definies e diferentes procedimentos so apresentados na literatura e em diferentes normas internacionais (ver AnexoX). A grande maioria das definies de LQ da literatura consistente com a seguinte definio: O limite de quantificao a menor concentra-
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o ou teor que pode ser quantificada com a maior incerteza aceitvel ou Incerteza Mxima Aceitvel (Imax). Portanto, para se determinar o LQ preciso estabelecer primeiramente, seja por lei ou resoluo legal de organismo normalizador nacional, por norma nacional ou internacional, por acordo contratual ou informal com o cliente ou, na falta das alternativas anteriores, por deciso interna do laboratrio, qual a Imax para cada combinao analito-matriz do escopo analtico. Essa abordagem por critrio ou baseada nos riscos. Para calcular o LQ usando a Incerteza Mxima Aceitvel, procede-se ao clculo da incerteza da medio analtica, conforme mostrado na seo 8 Incerteza de Medio Analtica, da Parte II, para concentraes cada vez mais baixas do analito, a partir do nvel mais baixo calibrado, at se encontrar a concentrao que atinge a Imax. Esse mesmo procedimento pode ser usado para estabelecer o limite superior de concentrao (csup,Imax), acima do nvel mais alto calibrado, a partir do qual a Imax ultrapassada. Lembrar que a incerteza de medio sempre aumenta medida que nos distanciamos do baricentro da curva de calibrao. Dessa forma possvel estabelecer uma faixa de trabalho usando critrios estatsticos e metrolgicos. Nesse sentido, a faixa de trabalho (FT) estatisticamente definida pelo intervalo de concentrao dentro do qual a incerteza de medio inferior ou igual Incerteza Mxima Aceitvel (Imax): LQFTcsup,Imax Os conceitos de limite de deciso e limite mnimo detectvel da varivel lquida de estado foram introduzidos pela norma ISO 11843 [24,25] com o objetivo de propor um mtodo para determinar o limite a partir do qual um sistema de medio pode ser declarado diferente do seu estado bsico.
II.7.3 Limite de Deciso (CC) e Capacidade de Deteco (CC) So parmetros definidos na Deciso 2002/657/CE [10] que medem o desempenho do procedimento analtico, levando em considerao a incerteza da medio no nvel de concentrao no qual se toma alguma deciso, o chamado nvel de interesse.
II.7.4 Procedimento de Determinao do CC De acordo com a srie de normas ISO 11843 [24,25], os clculos do CC devem ser realizados, preferencialmente, utilizando a curva de calibrao adequada para o procedimento analtico, conforme escolha feita
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nas sees 3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho e 4 Seletividade e Efeito Matriz, da Parte II.
II.7.5 Limite de Deciso (CC) para Substncias Permitidas ( = 5%) Usando os dados dos pontos de trs curvas de calibrao, adequadas ao procedimento analtico com nveis de concentrao em torno da concentrao do limite definido (ver as sees 3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho e 4 Seletividade e Efeito Matriz, da Parte II) e medidas em trs dias diferentes, calcular: Onde: CCa: o valor da concentrao do analito correspondente ao CCa nas unidades de concentrao do resultado final. LMR: a concentrao do LMR nas mesmas unidades de concentrao do resultado final.
cLMR: a incerteza combinada na concentrao do analito no nvel do LMR, levando em considerao a incerteza de amostragem, se disponvel; a incerteza de reprodutibilidade intralaboratorial; a incerteza de recuperao e a incerteza de calibrao no nvel de concentrao do LMR obtida da curva de calibrao conjunta de trs dias.
(7)
Para determinar
ucLMR procede-se da seguinte forma:
1. Construir uma curva de calibrao conjunta de trs dias, juntando em uma nica curva de calibrao todos os pontos de trs curvas de calibrao obtidas em trs dias diferentes, consecutivos ou no. 2. Ajustar a essa curva de calibrao conjunta de trs dias a reta de calibrao pelo MMQO ou MMQP, conforme necessrio (ver seo 3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho, da Parte II, e Anexo I a Anexo IV ou Anexo VI a AnexoIX). 3. Calcular usando uma ou outra das equaes eq.(A.IV.1a), calib eq.(A.IV.1b) ou eq.(A.IV.1c) do AnexoIV no caso de ajuste pelo MMQO; ou as equaes eq.(A.IX.1a), eq.(A.IX.1b) ou eq.(A. IX.1c) do Anexo IX no caso de ajuste pelo MMQP. Nessas equaes fazer x* = xLMR e y* = ycalcLMR. ycalcLMR a resposta instrumental calculada para xLMR na curva de calibrao conjunta de
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trs dias. Tambm os demais parmetros dessas equaes o intercepto, a inclinao, suas incertezas ou desvios padro e a covarincia cov(a,b) so aqueles obtidos na curva de calibrao conjunta de trs dias. 4. Calcular cLMR= (canal) usando a eq.(15) como mostrada c no item 8.2 Clculo da Incerteza pela Metodologia Top-Down, da Parte II. 5. Usar na eq.(15) urepro=sreproLMR. Caso o laboratrio no queira utilizar os dados da curva de calibrao conjunta, poder utilizar o CC calculado a partir dos resultados de anlise de pelo menos 20 matrizes brancas fortificadas na concentrao do LMR, por tipo de matriz analisada no escopo do procedimento validado. Dessa forma, CC ser calculado por: (8) Onde: sreproLMR: o desvio-padro amostral das concentraes determinadas dessa srie de 20 anlises no nvel de concentrao do LMR, em condies de preciso intermediria ou reprodutibilidade intralaboratorial.
Para obter sreproLMR, podem ser usados os dados do ensaio de reprodutibilidade interna do laboratrio. A partir desses dados pode-se obter um modelo matemtico da reprodutibilidade intralaboratorial em funo da concentrao, por meio de um ajuste pelo mtodo dos mnimos quadrados (linha de tendncia no Excel).
II.7.6 Limite de Deciso (CC) para Substncias Banidas ( = 1%) Usando os dados dos pontos de trs curvas de calibrao adequadas ao procedimento analtico, com nveis de concentrao em torno da concentrao do LMDR definido (ver as sees 3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho e 4 Seletividade e Efeito Matriz, da Parte II), e medidas em trs dias diferentes, calcular: Onde: CC: o valor de concentrao do analito correspondente ao CC nas unidades finais de concentrao do resultado final. (9)
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uc0: a incerteza combinada na concentrao do analito no nvel de
concentrao zero, levando em considerao a incerteza de amostragem, se disponvel; a incerteza de reprodutibilidade intralaboratorial; a incerteza de recuperao e a incerteza de calibrao no nvel de concentrao zero, ou seja, o desvio-padro do intercepto obtido da curva de calibrao conjunta de trs dias. Para determinar
1. Construir uma curva de calibrao conjunta de trs dias, juntando em uma nica curva de calibrao todos os pontos de trs curvas de calibrao obtidas em trs dias diferentes, consecutivos ou no. 2. Ajustar a essa curva de calibrao conjunta de trs dias a reta de calibrao pelo MMQO ou MMQP, conforme necessrio (ver seo 3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho, da Parte II, e Anexo 1 a Anexo IV ou AnexoVI a AnexoIX). 3. Calcular = obtendo a raiz quadrada do valor da varicalib a ncia do intercepto obtida pela eq.(A.I.11) do AnexoI, no caso de ajuste pelo MMQO, ou da eq.(A.VI.13), do AnexoVI, no caso de ajuste pelo MMQP. 4. Calcular = (c ) usando a eq.(15) como mostrada no c0 c anal item 8.2 Clculo da Incerteza pela Metodologia Top-Down, da Parte II. Usar na eq.(15) urepro=sreproLMDR. Caso o laboratrio no queira utilizar os dados da curva de calibrao conjunta, poder utilizar o CC calculado a partir dos resultados de anlise de pelo menos 20 matrizes brancas fortificadas na concentrao do LMDR ou inferior o CC esperado, por exemplo, por tipo de matriz analisada no escopo do procedimento validado. Dessa forma, CC ser calculado por: Onde: sreproLMDR: o desvio-padro amostral das concentraes do analito dessa srie de 20 anlises no nvel de concentrao do LMDR ou inferior, em condies de preciso intermediria ou reprodutibilidade intralaboratorial. (10)
uc0 procede-se da seguinte forma:
Para obter sreproLMDR, podem ser usados os dados do ensaio de reprodutibilidade interna do laboratrio. A partir desses dados, pode-se obter um modelo matemtico da reprodutibilidade intralaboratorial em funo da concentrao, atravs de um ajuste pelo mtodo dos mnimos quadrados (linha de tendncia no Excel).
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II.7.7 Procedimento de Determinao do CC De acordo com a srie de normas ISO 11843 [24,25], os clculos do CC devem ser realizados, preferencialmente, utilizando os procedimentos da curva de calibrao adequada para o procedimento analtico, conforme escolha feita nas sees 3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho e 4 Seletividade e Efeito Matriz.
II.7.8 Capacidade de Deteco (CC) para Substncias Permitidas ( = 5%) Uma vez calculado CC para as substncias permitidas, usando os dados dos pontos de trs curvas de calibrao adequadas ao procedimento analtico, com nveis de concentrao em torno da concentrao do LMR definido (ver as sees 3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho e 4 Seletividade e Efeito Matriz) e medidas em trs dias diferentes, calcular:
(11) Onde:
ucLMR: a incerteza padro combinada no nvel de concentrao
do LMR da curva de calibrao conjunta de trs dias, cujo clculo mostrado anteriormente.
De acordo com a Figura3, na Deciso 2002/657/CE [10], na eq.(11), deveria aparecer ucCCb, a incerteza padro combinada da concentrao do analito na capacidade de medio. Porm, seu valor, particularmente no MMQO, muito prximo daquele de uxLMR que adotamos para simplificar o procedimento. De forma anloga, caso o laboratrio no queira utilizar os dados da curva de calibrao conjunta, poder utilizar o CC calculado a partir dos resultados de anlise de pelo menos 20 matrizes brancas fortificadas na concentrao do LMR, por tipo de matriz analisada no escopo do procedimento validado. Dessa forma, CC ser calculado por:
(12) Onde: sreproLMR: o desvio-padro amostral das concentraes do analito dessa srie de 20 anlises no nvel de concentrao do LMR, em condies de preciso intermediria ou reprodutibilidade intralaboratorial.
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De acordo com a Figura3, na Deciso 2002/657/CE [10], as matrizes brancas deveriam ser fortificadas no CC cujo valor em geral muito prximo do LMR. Na eq.(12) tambm deveria aparecer sreproCCb, o desvio-padro de reprodutibilidade intralaboratorial na capacidade de medio. Porm seu valor, particularmente no MMQO, muito prximo daquele de sreproLMR que adotamos para simplificar o procedimento. Para obter sreproLMR podem ser usados os dados do ensaio de reprodutibilidade interna do laboratrio. A partir desses dados pode-se obter um modelo matemtico da reprodutibilidade intralaboratorial em funo da concentrao, por meio de um ajuste pelo mtodo dos mnimos quadrados (linha de tendncia no Excel).
II.7.9 Capacidade de Deteco (CC) para Substncias Banidas ( = 5%) Uma vez calculado CC para as substncias banidas, usando os dados dos pontos de trs curvas de calibrao adequadas ao procedimento analtico, com nveis de concentrao em torno da concentrao do LMDR definido (ver as sees 3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho e 4 Seletividade e Efeito Matriz), medidos em trs dias diferentes, calcular:
Onde:
(13)
uc0: a incerteza combinada na concentrao do analito no nvel de
concentrao zero, levando em considerao a incerteza de amostragem, se disponvel, a incerteza de reprodutibilidade intralaboratorial, a incerteza de recuperao e a incerteza de calibrao no nvel de concentrao zero, ou seja, o desvio-padro do intercepto, obtido da curva de calibrao conjunta. Para determinar
1. Construir uma curva de calibrao conjunta de trs dias, juntando em uma nica curva de calibrao todos os pontos de trs curvas de calibrao obtidas em trs dias diferentes, consecutivos ou no. 2. Ajustar a essa curva de calibrao conjunta de trs dias a reta de calibrao pelo MMQO ou MMQP, conforme necessrio (ver seo 3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho, da Parte II, e Anexo I a Anexo IV ou Anexo VI a AnexoIX).
uc0 procede-se da seguinte forma:
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3. Calcular = obtendo a raiz quadrada do valor da varicalib a ncia do intercepto obtida pela eq.(A.I.11) do AnexoI, no caso de ajuste pelo MMQO, ou da eq.(A.VI.13), do Anexo VI, no caso de ajuste pelo MMQP. 4. Calcular = (c ) usando a eq.(15) como mostrada no c0 c anal item 8.2 Clculo da Incerteza pela Metodologia Top-Down, da Parte II. Usar na eq.(15) urepro=sreproLMDR. Caso o laboratrio no queira utilizar os dados da curva de calibrao conjunta, poder utilizar o CCb calculado a partir dos resultados de anlise de pelo menos 20 matrizes brancas fortificadas na concentrao do LMDR ou inferior, o CC, por exemplo, por tipo de matriz analisada no escopo do procedimento validado. Dessa forma, calcular:
(14) Onde: sreproLMDR: o desvio-padro amostral das concentraes do analito dessa srie de 20 anlises no nvel de concentrao do LMDR ou inferior, em condies de preciso intermediria ou reprodutibilidade intralaboratorial.
De acordo com a Figura3, na Deciso 2002/657/CE [10] as matrizes brancas deveriam ser fortificadas no CCb cujo valor em geral muito prximo e abaixo do LMDR. Tambm, na eq.(14) deveria aparecer sreproCCb, o desvio-padro de reprodutibilidade intralaboratorial na capacidade de medio. Porm seu valor, particularmente no MMQO, muito prximo e maior que aquele de sreproLMDR, que adotamos para simplificar o procedimento. Para se obter sreproLMR, podem ser usados os dados do ensaio de reprodutibilidade interna do laboratrio. A partir desses dados pode-se obter um modelo matemtico da reprodutibilidade intralaboratorial em funo da concentrao, mediante um ajuste pelo mtodo dos mnimos quadrados (linha de tendncia no Excel).
II.7.10 Critrios de Aceitao do CC e CC CC e CC devem ser inferiores ao Limite Mnimo de Desempenho Requerido (LMDR), no caso de substncias banidas. Para as substncias com LMR definidos, CCa e CCb so sempre maiores que o LMR, devendo ser o mais prximo possvel dele.
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CCb no deve ultrapassar mais de duas vezes o valor em frao da unidade do CV da Tabela6, conforme a faixa de concentrao do analito, multiplicado pelo LMR:
II.8 Incerteza de Medio Analtica (IMA)

O Vocabulrio Internacional de Metrologia (VIM) [22,28] define a incerteza como um parmetro no negativo que caracteriza a disperso dos valores atribudos a um mensurando, com base nas informaes utilizadas. A incerteza (preciso) e a tendncia (veracidade) constituem as duas mais importantes caractersticas (parmetros) metrolgicas e de qualidade de um resultado de medio, permitindo a comparabilidade e a avaliao da conformidade do resultado de medio em relao a normas, a limites legais ou contratuais ou a valores de referncias [16,18]. Portanto, a incerteza a principal caracterstica metrolgica do resultado de uma medio para se estabelecer e se verificar o atendimento ao critrio de adequao ao uso pretendido [35,36] A incerteza de medio deve ser relatada juntamente com todo resultado de medio. Um resultado de medio no est completo se faltar alguma expresso de sua incerteza. A ISO 17.025 [23] preconiza que a incerteza de medio seja avaliada ou que pelo menos seus principais componentes sejam estimados. A incerteza final do resultado de uma medio, obtida de uma combinao das incertezas de mltiplas fontes, chamada de Incerteza Padro Combinada, sendo representada pelo smbolo uc(y). Onde y representa o mensurando, o resultado analtico. As fontes que mais contribuem para a incerteza combinada do resultado analtico so: 1. As incertezas de amostragem, subamostragem e de preparo de amostras de anlise; 2. A incerteza de reprodutibilidade ou de preciso intermediria (ou reprodutibilidade intralaboratorial), urepro ou uprecint; 3. A incerteza relacionada com a estimao da recuperao, caso o resultado seja corrigido por ela, ou com a faixa permitida de variao da recuperao, se o resultado no for corrigido pela recuperao, urecup.
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4. A incerteza de previso da curva de calibrao do instrumento de medio analtica, ucalib. (ver exemplo na Figura8 e na Figura9). A incerteza de previso da curva de calibrao constituda das incertezas devido: 1. indicao da resposta instrumental para a amostra; 2. Ao intercepto da reta de calibrao; 3. inclinao da reta de calibrao; e 4. covarincia entre o intercepto e a inclinao da reta de calibrao. A primeira dessas quatro contribuies a maior delas, enquanto a covarincia negativa entre o intercepto e a inclinao da curva de calibrao a nica contribuio que leva a uma reduo da incerteza combinada da concentrao do analito, no caso da curva de calibrao ser uma reta. Existem duas metodologias para estimar a incerteza de medio, denominadas de Bottom-Up e Top-Down. Essencialmente, no h diferenas significativas no processo de clculo de incerteza dessas duas metodologias. Elas consistem em combinar, por meio da lei de propagao das incertezas, as fontes significativas de incerteza identificadas para o procedimento de medio. A diferena entre essas duas metodologias est no grau de detalhamento e aprofundamento do clculo e no sentido lgico desse clculo As quatro etapas bsicas dessas metodologias para o clculo da incerteza, esquematizadas no fluxograma da Figura6, so: 1. Especificar o mensurando; 2. Identificar as fontes de incerteza; 3. Quantificar ou estimar as incertezas de cada fonte de incerteza; 4. Calcular a incerteza padro combinada. A essas quatro etapas bsicas podemos adicionar outras duas etapas acessrias: 1. Calcular a incerteza expandida; e 2. Realizar uma anlise crtica da incerteza de medio estimada e, se necessrio, sua re-estimao ou a de algum componente significativo. Na etapa1 de especificao do mensurando, escrevemos a equao do mensurando que relaciona as grandezas de entrada obtidas de medi-
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es diretas com a grandeza de sada (ver exemplo na Figura6). Um detalhado procedimento de medio deve ser estabelecido nessa etapa. Na etapa2 de identificao das fontes de incerteza, recomenda-se a elaborao um diagrama de causa e efeito ou diagrama de Ishikawa, para representar visualmente as interaes das fontes de incerteza identificadas (ver Figura8). A exaustiva anlise do procedimento de medio, um amplo conhecimento cientfico e a experincia do processo de medio e das caractersticas fsico-qumicas do mensurando so imprescindveis para o bom xito da etapa2. Na etapa3 procede-se a uma valorao das incertezas de cada componente de incerteza elencado na etapa2. Para tanto, utiliza-se a estimao do Tipo A, baseada na anlise estatstica de medies repetidas feitas durante o processo de medio do mensurando; ou a estimao do Tipo B, que se baseia em outras informaes que no aquelas utilizadas na estimao do Tipo A, tais como caractersticas do instrumento de medio fornecidas por seu fabricante, certificados de calibrao ou de MRC, classe de exatido de instrumentos e padres e outras medies no ligadas diretamente do mensurando, como aquelas da validao de procedimento analtico. Na etapa4 de clculo da incerteza combinada recomendvel a elaborao de uma planilha eletrnica de clculos, especialmente no caso da metodologia Bottom-Up, para permitir o uso adequado da lei de propagao das incertezas, combinando corretamente os valores das incertezas padro das fontes de incertezas quantificadas na etapa3 (ver Figura10). recomendvel a construo de um histograma de causa e efeito ou histograma de Yshikawa ou de espinha de peixe (ver Figura9), apresentando as fontes que mais contribuem para a incerteza combinada do mensurando. Esse histograma auxilia na interpretao dos resultados e no planejamento de melhorias no procedimento de medio, bem como na aquisio de novos equipamentos.
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Figura6 Fluxograma das quatro etapas bsicas do procedimento de clculo para a estimao da incerteza de medio
INCIO
Especicar o Mensurando
Etapa 1
Declarar claramente o que est sendo medido, incluindo a equao do mensurando, que a relao matemtica entre o mensurando e as grandezas de entrada das quais ele depende, e o procedimento de medio. As informaes, quanto especicao do mensurando, devem constar nos POPs ou em outras descries do procedimento analtico.
Etapa 2
Identicar as Fontes de Incerteza
Listar as possveis fontes de incerteza. Isso incluir as fontes que contribuem para a incerteza das grandezas de entrada da equao do mensurando estabelecida na Etapa 1, mas pode tambm incluir outras fontes, como aquelas decorrentes de hipteses qumicas e das grandezas de inuncia.
Quanticar as Incertezas
Etapa 3
Medir ou estimar a incerteza padro associada a cada fonte potencial de incerteza identicada. Geralmente possvel estimar ou determinar uma nica contribuio de incerteza associada a diversas fontes distintas agrupadas entre elas. tambm importante considerar se os dados disponveis abrangem sucientemente as fontes de incerteza, e programar cuidadosamente experimentos e estudos adicionais para assegurar que todas as fontes sejam adequadamente consideradas e estimadas.
Etapa 4
Calcular a Incerteza Combinada
As informaes obtidas na etapa 3 consistiro de diferentes contribuies quanticadas para incerteza total, sejam associadas a fontes individuais ou aos efeitos combinados de diversas fontes. As contribuies tm que ser expressas como desvio-padro e combinadas conforme a lei de propagao das incertezas, para se ter uma incerteza padro combinada. O fator de abrangncia apropriado pode ser aplicado para se chegar a uma incerteza expandida.
Consideremos o exemplo da anlise do metal cdmio em uma dada amostra por absoro atmica. O procedimento dessa anlise consiste basicamente na pesagem da alquota de anlise, abertura da amostra com mistura de cidos a quente, seguida de diluies ou pr-concentrao da soluo de abertura e, finalmente, a injeo da soluo diluda no espectrmetro. Os dados da curva de calibrao (ver Exemplo A.5 do Guia EURACHEM de clculo de incerteza) ajustados pelo MMQP levou aos seguintes valores para os parmetros da reta de calibrao: a=3,4276x10-3, sa = 4,090 x 10-4, b = 2,5555 x 10-1 kg/mg, sb = 1,3984 x 10-3 kg/mg e cov(a,b)=-4,1109x10-7kg/mg.
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A faixa para o fator de recuperao permitida para o ensaio de 90% a 110%, ou frecmin=0,9 e frecmax=1,1. Uma dada amostra foi analisada duas vezes K = 2, dando uma resposta instrumental mdia RIamos = 0,19, com desvio-padro de s(RIamos)=3,5271x10-3. A concentrao do analito na curva de calibrao , portanto, canalCC=0,73009mg/kg (Figura7). A soluo de abertura da amostra passou por uma pr-concentrao antes de sua leitura na absoro atmica, tal que 100ml da soluo de abertura foi evaporada at atingir 10 mL. Logo houve um fator de pr-concentrao de 10vezes. Logo a concentrao do analito na amostra de ensaio canal=0,07009mg/mol (Figura7). Nesse nvel de concentrao do analito na amostra, a incerteza de reprodutibilidade interna do procedimento estimada em urepro=srepro=3,6504x10-3mg/kg. A Figura7 mostra a equao do mensurando e o clculo da concentrao do analito na curva de calibrao e sua concentrao na amostra de ensaio.
II.8.1 Clculo da Incerteza pela Metodologia Bottom-Up A metodologia Bottom-Up aquela preconizada pelo BIPM, pela ISO e outras instituies internacionais de padronizao, mediante o Guia para a Expresso da Incerteza de Medio, conhecido como ISO-GUM [38,39]. Ela tambm indicada pela EURACHEM [16]. Nessa metodologia, procura-se fazer a combinao exaustiva de todas as fontes de incerteza do procedimento de medio. Partindo-se das fontes de incerteza de todas as medies diretas das grandezas de entrada presentes na equao do mensurando e das grandezas de influncia, constri-se um diagrama de causa e efeito, como aquele mostrado na Figura8 para o exemplo da anlise de cdmio por espectroscopia de absoro atmica. A Figura9 apresenta a planilha eletrnica (Excel) detalhada para combinar as incertezas de todas as fontes de incerteza representadas na Figura8. Essa planilha est disponvel, juntamente com este Manual, no stio eletrnico do Mapa na internet.
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Figura7 Exemplo de Funo de medio ou equao do mensurando para a concentrao de um metal determinada pela espectroscopia de absoro atmica (EAA)
canal ccalc canalCC Aamostra
Concentrao do analito na amostra de ensaio analisada. Unidades: mg/kg Concentrao calculada do analito na amostra de ensaio sem correes. Unidades: mg/kg Concentrao do analito interpolada na curva de calibrao. Unidades: mg/L Absorvncia mdia da amostra de reinjeo em duplicatas. Unidades: adimensional
a Intercepto da reta de calibrao obtido do ajuste pelo mtodo dos mnimos quadrados ponderado. Unidades: adimensional b Inclinao da reta de calibrao, sensibilidade, obtida do ajuste pelo mtodo dos mnimos quadrados ponderado. Unidades: L/mg cov(a,b) Covarincia entre o intercepto e a inclinao da reta de calibrao obtida do ajuste pelo mtodo dos mnimos quadrados ponderado absoluto. Unidades: kg/mg Vfabert mbruta mtara Volume final da soluo de abertura/extrao/digesto da amostra. Unidades: mL Massa bruta do recipiente de pesagem e da amostra seca. Unidades: g Massa de tara do recipiente de pesagem vazio. Unidades: g
Volume inicial, alquota, da soluo de abertura da amostra para sua primeira diluio. Vidil1 Unidade: mL Vfdil1 Volume final da primeira diluio da soluo de abertura da amostra. Unidade: mL Volume inicial, alquota, da soluo de abertura da amostra para sua segunda diluio. Vidil2 Unidade: mL Vfdil2 Creproint Volume final da segunda diluio da soluo de abertura da amostra. Unidade: mL Correo nula de reprodutibilidade interna ou de preciso intermediria. Unidades: mg/kg
Fator de correo unitrio de recuperao, FCrecup = 1/frec, se no se faz a correo pela recuperFCrecup ao, caso contrrio ele diferente de um. Unidade: adimensional
A Dose Semanal Admissvel Provisria DSAP de massa corprea adotada em 2 de junho de 1995 pelo Comit Cientfico da Alimentao Humana CCAH : DSAP = 7 g/kg http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/reports/ scf_reports_36.pdf. Isso significa 0, 070 mg para uma pessoa de 100 kg.
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Figura8 Exemplo de um diagrama de causa e efeito ou diagrama de Ishikawa para o clculo de incerteza de uma determinao de Cd por espectroscopia de absoro atmica (EAA)
Vfabert
C calib C vartemp C repet C resol
Tempo Analistas Ambiente Abertura de mostra
C calib
C Resol
mamost
C calib
C calib
mbruta
mtara
U(C anal )
a
Aemis
b Cov(a,b)
Vidil1 Vidil2
FC recup
C reproint
C EAA
Calibrao do EAA
Apad C pad
Vfdil1 Vfdil2
FC dil
C calib C vartemp C repet C resol
Nota: Aemis=Aamostra que aparece na equao do mensurando (Figura7).
Figura9 Histograma mostrando a incerteza combinada da concentrao de Cd determinada por EAA e as suas maiores contribuies positivas, conforme calculado pela planilha mostrada na Figura8.
0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0 Aamostra a b FCrecup Creproint uc(y)
A contribuio de incerteza para o fator de correo de recuperao foi calculada supondo uma faixa permitida para o fator de recuperao de 90% a 110%. Se essa faixa fosse de 95% a 105% essa contribuio passaria a ser 0,0021ng/kg, a segunda maior, e a incerteza combinada de Canal seria 0,0044 mg/kg.
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Figura10 Exemplo de uma planilha de clculo de incerteza simples para a determinao de Cd por espectroscopia de absoro atmica (EAA)
Os dados da curva de calibrao mostrados na Tabela A.II.1 foram ajustados pelo MMQP e levam aos parmetros acima.
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II.8.2 Clculo da Incerteza pela Metodologia Top-Down A metodologia Top-Down consiste em usar a incerteza de reprodutibilidade, obtida em ensaios colaborativos, ou a incerteza de preciso intermediria (reprodutibilidade intralaboratorial), obtida em estudo de validao interna, ou ainda de dados de controle de qualidade de longo prazo, como uma estimao da incerteza do resultado analtico. A essa fonte de incerteza pode-se adicionar algumas outras fontes significativas. A incerteza combinada do resultado final da concentrao do analito na amostra uc(Canal), pode por exemplo ser obtida pela combinao das quatro maiores fontes de incerteza citadas, atravs da expresso dada pela eq.(15) (ver Figura11 na Tabela7 e a Figura12):
(15) Onde: canal a concentrao do analito na amostra de ensaio. canalCC a concentrao do analito interpolada na curva de calibrao. urepro a incerteza de reprodutibilidade obtida dos dados de participao em ensaios colaborativos (reprodutibilidade) ou dos dados de preciso intermediria uprecint (ou reprodutibilidade intralaboratorial), conforme sua disponibilidade. ucalib a incerteza devida previso da concentrao do analito na curva de calibrao. urec a incerteza associada estimao da recuperao ou com a faixa permitida da recuperao, conforme o resultado seja, respectivamente, corrigido ou no por ela. uamostragem a incerteza devida ao processo de amostragem que leva amostra que chega ao laboratrio. Ela a maior fonte de incerteza do resultado analtico, mas em geral desconhecida. Neste caso, assumir o valor zero e reportar que a incerteza declarada no leva em considerao a incerteza de amostragem. ccalib = canal/canalCC o coeficiente de sensibilidade para a incerteza de calibrao, obtido da equao do mensurando escrita como uma funo da concentrao do analito interpolada na curva de cali-
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brao. Este coeficiente de sensibilidade decorre do fato de que as unidades de concentrao da curva de calibrao podem no ser as mesmas do resultado, assim como da existncia de outras medies (massas, volumes etc.), alm da resposta instrumental do instrumento de medio analtica. crec o coeficiente de sensibilidade associado ao fator de correo da recuperao FCrec=1/frec, que neste caso igual concentrao do analito calculada ccalc e no corrigida pelo fator de recuperao. Se na equao do mensurando for usada uma correo de recuperao (Crec) e no o fator de correo da recuperao (FCrec) esse coeficiente de sensibilidade ser unitrio crec=1.
Em geral, as incertezas associadas aos processos de amostragem, subamostragens e preparo de amostra no tm sido consideradas nos clculos de incerteza de resultados analticos devido grande dificuldade para a obteno dos dados necessrios para a estimao das incertezas dessas fontes. de reconhecimento internacional que a incerteza de amostragem em amostras representativas da populao (amostras no representativas causam erros sistemticos nos estimadores estatsticos e devem ser reamostradas) a maior fonte de incerteza do resultado analtico [17]. Em geral, a amostragem no responsabilidade do laboratrio de anlise qumica, o qual no costuma ter controle sobre ela. No entanto, o laboratrio deve descartar toda amostra recebida que no atenda aos requisitos mnimos de qualidade estabelecidos neste Manual, na seo 8 Recepo, Armazenamento e Preparao de Amostras, da Parte I. A eq.(15) se baseia na aplicao da lei de propagao das incertezas sobre a equao de medio simplificada:
Onde:
(16)
ccalc a concentrao do analito obtida nos clculos feitos com os valores medidos na anlise sem correes. Camostragem a correo nula de amostragem. Crepro a correo nula de reprodutibilidade intralaboratorial ou preciso intermediria, mas sua incerteza no nula.
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Ccalib a correo nula de calibrao do instrumento analtico, mas sua incerteza no nula. ccalib = canal/canalCC o coeficiente de sensibilidade para a incerteza de calibrao obtido da equao do mensurando escrita como uma funo da concentrao do analito interpolada na curva de calibrao. Crec a correo de recuperao, que pode ser nula ou no, dependendo, respectivamente, se a recuperao no ser usada ou ser usada para corrigir o resultado. FCrec o fator de correo da recuperao, que est relacionado ao fator de recuperao frec pela relao FCrec=1/frec. Se a recuperao no for usada para corrigir o resultado, ento frec=FCrec=1. A relao entre a correo de recuperao e o fator de recuperao dada pela equao:
(17) A incerteza de calibrao ucalib, que aparece na eq.(15) calculada a partir da incerteza da resposta instrumental para a amostra (uRIamostra), da incerteza do intercepto (ua=sa) ou (saw), da incerteza da inclinao (ub=sb) ou (sbw) e da covarincia entre o intercepto e a inclinao cov(a,b) ou cov(aw,bw) da reta de calibrao (vide anexosI e VI), atravs da eq.(18), a seguir, que a equao E3.3 do Guia EURACHEM/CITAC QUAM2000 [10]:
(18) A incerteza de recuperao urec, que aparece na eq.(15) depende se o resultado ser corrigido ou no pela recuperao. Se o resultado final da concentrao for corrigido pela recuperao, ento a incerteza da medio da correo de recuperao urec=u (Crec) ser aproximada pela incerteza da reprodutibilidade intralaboratorial urec=srepro. Se uma faixa para a correo de recuperao (Crec) ou para o fator de recuperao (frec) permitida e o resultado no corrigido pela recuperao, ento a incerteza da recuperao feita por uma estimao do TipoB, atravs da eq.19, quando se usa a correo de recuperao Crec, ou atravs da eq.20, quando se usa o fator de recuperao frec ou o fator de correo da recuperao FCrec, respectivamente.
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(19) ou
(20)
Figura11 Exemplos de utilizao da metodologia Top-Down para o clculo da incerteza combinada da concentrao de Cd determinada por EAA
(a)
(b)
Notas: (a) Clculo da incerteza levando em considerao apenas a incerteza de preciso intermediria e a incerteza no fator de correo da recuperao. Seu valor, 0,005576mg/kg, corresponde a 98% da incerteza 0,005689mg/kg, calculada na metodologia Bottom-Up, na planilha mostrada na Figura9. Cenrio (c) na Tabela7. (b) Clculo da incerteza levando em considerao a incerteza de preciso intermediria, a incerteza no fator de correo da recuperao e a incerteza de previso na curva de calibrao. Seu valor 0,0056692mg/kg corresponde a 99,7% da incerteza 0,005689mg/kg, calculada na metodologia Bottom-Up, na planilha mostrada na Figura9. Cenrio (b) na Tabela7. Obs.: Os dados numricos foram extrados de clulas da planilha apresentada na Figura8.
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Tabela 7 Clculo da incerteza combinada da concentrao de Cd determinada por EAA pela metodologia Top-Down
Cenrios (a) (b) (c) (d) (e) Incertezas (contribuies) / mg/kg Amostragem Repro int Recup Calib 0,005 0,00365 0,004215 0,0010234 0 0,00365 0,004215 0,0010234 0 0,00365 0,004215 0 0 0,00365 0,00365 0,0010234 0 0,00365 0 0,0010234 Inc. Comb. 0,007559 0,005669 0,005576 0,005262 0,00379
Notas: (a) A incerteza de amostragem a maior fonte de incerteza e a incerteza de recuperao aquela devida faixa permitida de recuperao. Resultado no corrigido pela recuperao. (b) A incerteza de amostragem no computada e a incerteza de recuperao aquela devida faixa permitida de recuperao. Resultado no corrigido pela recuperao. (c) As incertezas de amostragem e de calibrao do instrumento analtico no so computadas e a incerteza de recuperao aquela devida faixa permitida de recuperao. Resultado no corrigido pela recuperao. (d) A incerteza de amostragem no computada e a incerteza de recuperao aquela estimada como sendo igual incerteza de reprodutibilidade interna. Resultado corrigido pela recuperao. (e) As incertezas de amostragem e de recuperao no so computadas. Obs.: As colunas 2 a 5 mostram as contribuies para a incerteza combinada da concentrao do analito na amostra de ensaio, devido s quatro fontes de incerteza mais expressivas nos ensaios de anlises qumicas: a de amostragem, a de reprodutibilidade interna, a de recuperao e a de calibrao do instrumento de medio analtica em diferentes cenrios.
Figura12: Clculo da incerteza combinada da concentrao de Cd determinada por EAA pela metodologia Top-Down
0,008 0,007 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0 Amostrag Repro int (a) (b) Recup (c) (d) Calib (e) Inc comb
Obs.: As contribuies para a incerteza combinada da concentrao do analito na amostra de ensaio se devem s quatro fontes de incerteza mais expressivas nos ensaios de anlises qumicas para cinco cenrios, conforme dados da Tabela7.
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II.8.3 Critrios de Aceitao da Incerteza de Medio importante enfatizar que cada resultado analtico tem sua prpria incerteza, uma vez que as fontes de incerteza no so sempre as mesmas, pois no mnimo a incerteza de calibrao muda a cada nova calibrao realizada, seja aquela do instrumento analtico como o espectrmetro ou o cromatgrafo etc., sejam aquelas dos instrumentos de medio de massa (balana) de volume (bureta, pipetas etc.). Tambm variam continuamente as fontes de incerteza, relacionadas s grandezas de influncia, especialmente aquelas envolvendo condies ambientais e experimentais da batelada de anlises. Alm do mais, a incerteza de um resultado analtico em geral uma funo (dependente) do prprio valor da concentrao do analito (heteroscedasticidade). Quando essa dependncia funcional (uc vs. canal) de proporcionalidade ou uma reta em uma dada faixa de concentrao do analito, ento o coeficiente de variao (CV) ou incerteza relativa constante. Porm, essa constncia de CV pode no existir, especialmente se a faixa de concentrao validada do analito de algumas ordens de grandeza. Dessa forma, recomenda-se que os clculos de incerteza sejam feitos a cada batelada de anlises. No entanto, o laboratrio pode desenvolver estratgias para reduzir a carga trabalho desses clculos, por exemplo, por meio do modelamento funcional da incerteza de medio com a concentrao u(canal)=f(canal). Vale lembrar que, neste caso, o modelo desenvolvido deve ser periodicamente revalidado e pode ser constitudo, por exemplo, de um polinmio, um crescimento exponencial ou outra funo qualquer ajustada aos dados acumulados de uc vs. canal. A incerteza combinada padro ou a expandida do resultado da anlise qumica no deve exceder o limite mximo de incerteza estabelecido por legislao ou norma especfica. Na falta do valor do limite mximo de incerteza, relatado no pargrafo anterior, um dos quatro critrios a seguir dever ser usado conforme as faixas de concentraes do analito estabelecidas na Tabela6: 1. Se a incerteza padro combinada do resultado de anlise for calculada incluindo a preciso intermediria (incerteza ou desvio-padro de reprodutibilidade intralaboratorial), ento a incerteza padro combinada relativa no deve exceder em mais de um tero (1/3) os valores da Tabela6:
(21) 2. Se a incerteza padro combinada do resultado de anlise for calculada incluindo a incerteza ou o desvio-padro de preciso de repetitividade (no incluindo a incerteza ou o desvio-padro de reprodutibilidade intralaboratorial), ento a incerteza padro
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combinada relativa no deve exceder em mais de um tero (1/3) os valores da incerteza (preciso) de repetitividade; logo, ela no deve ser maior que oito nonos (8/9) dos valores da Tabela6:
(22)
3. Se a incerteza padro combinada do resultado de anlise for calculada incluindo uma incerteza do Tipo B associada a uma faixa de recuperao permitida, quando essa recuperao no usada para corrigir o resultado da medio, ento a incerteza combinada padro relativa no deve exceder em mais de dois teros (2/3) os valores da Tabela6:
(23)
4. Se a incerteza padro combinada do resultado de anlise for calculada incluindo a preciso de reprodutibilidade (incerteza ou desvio-padro de reprodutibilidade ou incerteza de ensaios interlaboratoriais colaborativos), ento a incerteza padro combinada relativa no deve exceder mais de duas vezes os valores da Tabela6:
(24)
II.9 Estudo de Robustez, Escopo e Portabilidade

O estudo da robustez de um procedimento analtico procura avaliar o quo sensvel o resultado analtico a variaes nas condies experimentais do procedimento analtico, os chamados fatores ou tratamentos ou grandezas de influncia [22]. A robustez no uma grandeza fsica ou qumica, assim no se pode atribuir-lhe um valor numrico. Para avaliar a robustez, verifica-se experimentalmente se a variao de cada fator estudado tem efeito significativo sobre a qualidade metrolgica do resultado analtico. Se nenhum dos fatores estudados e plausveis de afetar o resultado da medio tiver efeito significativo, o procedimento analtico considerado robusto. Um procedimento robusto produz resultados mais reprodutveis ao longo do tempo e, principalmente, apresenta maior portabilidade para outro laboratrio dentro da organizao, no pas ou at no exterior.
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A portabilidade a caracterstica de um procedimento analtico que permite sua transferncia para outro local, sem perda de suas caractersticas metrolgicas e de desempenho analtico. Por isso, a implementao de um novo procedimento analtico reconhecidamente robusto se torna uma tarefa grandemente facilitada, e produzir resultados to confiveis quanto no laboratrio original onde foi desenvolvido e/ou validado. Assim, a robustez pode ser um dos fatores importantes a considerar, aps a veracidade e a preciso, quando da escolha de um procedimento analtico novo para o laboratrio. Para o estudo de robustez feita a anlise de um MRC, ou um padro, ou uma matriz branca fortificada, ou um extrato de matriz branca fortificada, ou uma Amostra de Controle de Qualidade (ACQ), em no mnimo dois nveis para cada fator que pode afetar o resultado da anlise. recomendvel replicar os experimentos. As diferenas entre os nveis estudados dos fatores devem representar a variabilidade com a qual esses fatores podero variar durante a rotina de anlises do laboratrio. Avalia-se a variao de uma funo resposta, ou simplesmente resposta, do procedimento analtico em funo das variaes nos fatores que podem influenciar a resposta do procedimento analtico. Como o objetivo da validao demonstrar a adequao ao propsito de uso do resultado analtico, a funo resposta a estudar deve contemplar as caractersticas metrolgicas do resultado analtico, como a sua veracidade (erro sistemtico ou tendncia ou correo ou recuperao) ou a sua preciso intermediria ou, preferencialmente, uma combinao dessas duas caractersticas metrolgicas, tal como a soma do erro sistemtico com a preciso intermediria. As informaes do desempenho do procedimento analtico obtidas durante a fase de desenvolvimento, ou de otimizao, ou de pr-validao, so de grande valia na escolha dos fatores a estudar durante essa fase. Alguns dos fatores que podem afetar o resultado analtico so: condies de armazenamento, condies ambientais e/ou de preparao da amostra, origem e estabilidade dos reagentes, composio da amostra, tamanho (massa ou volume) da amostra, as condies de pH, temperatura, tempo, composio da mistura de solventes ou reagentes para a abertura/ extrao/digesto/limpeza/derivatizao da amostra e regulagens (set up) do instrumento de medio analtica, entre outras. As etapas do estudo de robustez so: 1. Identificar os possveis fatores que possam influenciar os resultados.
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2. Variar levemente cada fator em pelo menos dois nveis (tratamentos). Essas variaes devem ser da mesma ordem daquelas que podem ocorrer durante o uso do procedimento analtico na rotina. 3. Realizar um teste de robustez utilizando a abordagem clssica, variando um fator de cada vez, ou utilizando a abordagem do planejamento fatorial completo ou fracionrio (ver AnexoXII). Essa ltima abordagem prefervel, uma vez que exige menor nmero de experimentos, mais rpida, eficiente e econmica. 4. Identificados na etapa anterior os fatores que tm efeitos mais significativos sobre o resultado da medio analtica, um novo estudo mais detalhado realizado apenas com esses fatores mais significantes. O objetivo estabelecer a faixa de variao aceitvel desses fatores, de forma que no comprometa a veracidade e a preciso do resultado analtico. 5. Os fatores que afetam significativamente o resultado analtico e as faixas permitidas de suas variaes devem ser explicitamente identificados no procedimento de anlise, ressaltando-se os cuidados especiais com esses fatores. Caso seja verificado atravs do estudo de robustez que a funo resposta do procedimento analtico no influenciada ou fracamente influenciada por pequenas variaes dos fatores, as condies experimentais, o procedimento analtico classificado como: Procedimento analtico robusto e adequado para as anlises de rotina. Neste caso, relatar apenas as restries de variabilidade das condies experimentais que mais influenciam o resultado analtico, estabelecendo as suas variaes permitidas para uso do procedimento analtico na rotina. Caso seja verificado pelo estudo de robustez que a funo resposta do procedimento analtico fortemente influenciada por pequenas variaes dos fatores, as condies experimentais, o procedimento analtico poder ser classificado em uma das seguintes classes: 1. Procedimento analtico no robusto e inadequado para as anlises de rotina. 2. Procedimento analtico de uso restrito neste caso devero ser detalhadamente relatadas as restries de variabilidade e de controle das condies experimentais que sero permitidas para uso do procedimento analtico. 3. Procedimento analtico no robusto e inadequado para as anlises de rotina na faixa de variao estudada dos fatores de influncia. O escopo do procedimento analtico consiste na relao dos fatores e nas faixas de variao autorizadas para cada fator, que estabelece as
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condies dentro das quais o procedimento analtico pode ser usado de forma a produzir resultados metrologicamente corretos e confiveis. O escopo em parte determinado pelo estudo de robustez, uma vez que este determina as condies de uso confivel do procedimen to analtico. Durante a validao do procedimento analtico, pode-se fazer um estudo de robustez simplificado, apenas identificando os fatores que mais influenciam o resultado analtico e determinando as faixas de variao desses fatores. O estudo de robustez mais abrangente e detalhado dos fatores que mais influenciam o resultado analtico pode ser feito concomitantemente com o uso do procedimento analtico na rotina.
II.10 Expresso e Interpretao dos Resultados de Medies

Os resultados das concentraes de cada analito em cada amostra devem ser acompanhados de suas incertezas e da unidade de medio conforme o formato: Nome ou smbolo do mensurando=(valor da concentrao do analitoincerteza)unidades. Os resultados devem tambm conter, conforme o caso, a seguinte expresso ou assemelhada: O valor numrico aps o sinal refere-se incerteza padro combinada. Exemplos de resultado de anlise, conforme dados da Figura10 e da Tabela7: 1. Concentrao de cdmio = (0,0730 0,0057) mg/kg, no corrigida pela recuperao, em que o valor numrico aps o sinal refere-se incerteza padro combinada no considerando a incerteza de amostragem. 2. Concentrao de cdmio = (0,0730 0,012) mg/kg, no corrigida pela recuperao, na qual o valor numrico aps o sinal refere-se incerteza expandida para uma probabilidade de abrangncia de 95% e fator de abrangncia k=2,1098, no considerando a incerteza de amostragem. 3. Concentrao de cdmio=(0,0730 0,0076)mg/kg, no corrigida pela recuperao, em que o valor numrico aps o sinal refere-se incerteza padro combinada, considerando a incerteza de amostragem.
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4. Concentrao de cdmio = (0,0695 0,012) mg/kg, corrigida pelo fator de recuperao frec=1,05 (105%), em que o valor numrico aps o sinal refere-se incerteza expandida para uma probabilidade de abrangncia de 95% e fator de abrangncia k=2, no considerando a incerteza de amostragem. A interpretao de um resultado de medio, quando de sua comparao com um valor de referncia ou com limites mnimos e/ou mximos estabelecidos e consequente, a tomada de deciso deve levar em considerao a sua incerteza de medio. Neste sentido, Regras de deciso devem ser previamente estabelecidas por lei, norma, contrato ou acordo entre as partes envolvidas. O estabelecimento das Regras de deciso deve levar em considerao as especificaes para o produto e a probabilidade de se tomar decises erradas; a probabilidade de falsa rejeio (falsa no conformidade, falso no conforme, falso positivo) ou a probabilidade de falsa aceitao (falsa conformidade ou falso negativo). Isto , essas regras dependem de o fornecedor ou o comprador correrem riscos. Algumas possibilidades de Regras de deciso contemplando bandas de segurana ou de salvaguarda [18] so representadas na Figura13. Outras possibilidades mais complexas de Regras de deciso podem ser estabelecidas, por exemplo, incluindo a necessidade de mais medies, ou a comparao com outra especificao alternativa, definindo valor mximo para a incerteza de medio etc. Um rgo oficial fiscalizador pode adotar a posio de comprador ou de vendedor conforme a deciso a tomar. Por exemplo: em autuaes, o rgo fiscalizador pode adotar a posio de um comprador, evitando punir injustamente o fiscalizado, se outros riscos mais importantes no precisam ser considerados. No entanto, quando a tomada de deciso visa reduzir os riscos dos consumidores, o rgo fiscalizador deve adotar a posio de vendedor, adotando a menor regio de conformidade, como por exemplo, na Figura 13.2(d), na Figura 13.2(e) ou na Figura 13.3(g), conforme o caso.
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Figura13.1 Interpretao de um resultado de medio em diferentes possibilidades de comparaes

(a) Vref - U < Res < Vref Vref Regio de rejeio ou de desigualdade ou de no conformidade Res < Vref - U Regio de aceitao ou de igualdade ou de conformidade Vref - U < Res < Vref + U Res = Vref Regio de rejeio ou de desigualdade ou de no conformidade Res > Vref + U Vref < Res < Vref + U Res
Lmax + U (b) L max Regio de aceitao ou de conformidade Res < Lmax + U Regio de rejeio ou de no conformidade Res > Lmax + U U
Res
Lmin - U (c) U Lmin Regio de aceitao ou de conformidade Res > Lmax + U
Res
Regio de rejeio ou de no conformidade Res < Lmin- U
Notas: A incerteza expandida U igual a mltiplo k da incerteza padro combinada u do resultado analtico: U = ku. Em geral, k = 2. (a) Igualdade entre o resultado Res e um valor de referncia Vref. (b) Comparao do resultado Res com um limite mximo Lmax, minimizando o risco de falso conforme do comprador. (c) Comparao do resultado Res com um limite mnimo Lmin, minimizando o risco de falso conforme do comprador.
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Lmax - U (d) U Lmax Regio de rejeio ou de no conformidade Res > Lmax + U
Res
Regio de aceitao ou de conformidade Res < Lmax + U
Lmin + U (e)
U Lmin Regio de rejeio ou de no conformidade Res < Lmin - U Regio de aceitao ou de conformidade Res > Lmax + U
Res
Notas: A incerteza expandida U igual ao mltiplo k da incerteza padro combinada u do resultado analtico: U = ku. Em geral k = 2. (d) Comparao do resultado Res com um limite mximo Lmax, minimizando o risco de falso conforme do vendedor. (e) Comparao do resultado Res com uma faixa, intervalo, com limite mnimo e mximo, minimizando o risco do vendedor.
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Lmin- U (f) U Regio de rejeio ou de no conformidade Res < Lmin - U Lmin Regio de aceitao ou de conformidade Lmin - U < Res < Lmax + U Lmax U Lmax + U Res Regio de rejeio ou de no conformidade Res > Lmax + U
Lmin + U (g) L Regio de rejeio ou de no conformidade Res < Lmin - U U

min
Lmax - U U Lmax Regio de rejeio ou de no conformidade Res > Lmax + U Res
Regio de aceitao ou de conformidade Lmin - U < Res < Lmax + U
Notas: A incerteza expandida U igual a mltiplo k da incerteza padro combinada u do resultado analtico: U = ku. Em geral k = 2. (f) Comparao do resultado Res com uma faixa, intervalo, com limite mnimo e mximo, minimizando o risco de falso conforme do comprador. (g) Comparao do resultado Res com uma faixa, intervalo, com limite mnimo e mximo, minimizando o risco de falso no conforme do vendedor.
II.11 Relatrio de Validao

Aps a validao, um documento deve ser redigido no qual os desempenhos alcanados pelo procedimento validado so relatados. Esse documento deve conter o maior nmero possvel de informaes de forma a permitir uma forte evidncia para demonstrar a qualidade do procedimento validado e sua adequao ao uso pretendido. Algumas das informaes que devem constar deste relatrio final de validao so: 1. Identificao do Laboratrio, local, perodo de realizao dos experimentos de validao, data de sua concluso, incluindo a confeco do relatrio final; 2. Nomes e assinaturas do gerente da qualidade, gerente tcnico, aprovao do documento, relao dos tcnicos que participaram da validao.
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3. A identificao do(s) analito(s) validados e a sua forma de apresentao nas matrizes validadas e.g., slida/naturalmente contaminada/solvel em/suspenso em/digervel em/incluso em/resduo de/contaminao de/metablico de/subproduto de/degradao de etc. e, quando apropriado, incluir a especificao, por exemplo: arsnico total, metil mercrio, Cr(III), FeO. 4. Declarao do uso pretendido, estabelecendo requisitos de tendncia e incertezas mximas aceitveis. Por exemplo: A anlise de triagem de micotoxinas com teor entre 0,1 a 50 ng/g em sementes alimentcias com faixa de recuperao permitida entre 60% e 120% e incerteza expandida relativa mxima de 25%. 5. Especificar a faixa de concentrao validada de cada analito (e.g., 0500 ng/g) para cada matriz do conjunto de matrizes validadas e explicitamente especificadas. 6. Um protocolo descrevendo equipamentos, materiais, reagentes, calibrao dos instrumentos de medio analtica qualificados para o procedimento analtico validado. 7. Recomendaes de segurana necessrias para equipamentos e pessoas. 8. Procedimento analtico final e definitivo, no qual, alm de todas as etapas detalhadamente descritas, devem estar relatadas todas as recomendaes de cuidados especiais em relao ao controle e s faixas aceitveis dos fatores que tm efeito significativo no resultado analtico, conforme detectado no estudo de robustez. Por exemplo: i - Extrao temperatura (605)C por (505) min sob agitao vigorosa; ii - Fluxo de gs carreador de (8010) mL/minuto etc. 9. Os registros, as anlises estatsticas e o status do critrio de aceitao para cada parmetro de desempenho estudado. 10. Uma declarao relativa ao atendimento ou no do uso pretendido. Evidentemente, outras informaes podem estar presentes nes se relatrio.
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Estudos de Estabilidade
PARTE 3
Parte III
Estudos de Estabilidade
Os procedimentos apresentados objetivam determinar a estabilidade das solues padro, dos analitos nas matrizes de origem animal ou vegetal e dos padres de trabalho. A estabilidade do analito nas mais diversas situaes deve ser determinada de modo a reproduzir as reais condies de armazenamento, manuseio e anlise; levando-se em considerao a matriz especfica na qual o analito dever ser pesquisado. Dados de publicaes cientficas podem ser utilizados para demonstrar a estabilidade do analito em soluo e/ou na matriz, desde que haja similaridade entre as condies estabelecidas no estudo e no laboratrio em questo. Os estudos de estabilidade tambm podem ser realizados em parceria por laboratrios da Rede Brasileira de Laboratrios Agropecurios, e os dados decorrentes podero ser utilizados para demonstrar a estabilidade do analito nas diversas situaes. Para tanto, necessrio que haja similaridade entre as condies do analito nos laboratrios que realizam os estudos. As estabilidades dos padres de calibrao e padres internos, em soluo, devem ser avaliadas. Os dados podem ser apresentados graficamente, de forma a facilitar a avaliao. Admite-se um padro como estvel quando for observada uma degradao mxima de at 5% em relao a uma referncia recm-preparada.
III.1 Estabilidade do Analito na Matriz no Processada

O estudo visa a demonstrar a estabilidade dos analitos nas matrizes no perodo entre o recebimento da amostra e o incio da anlise. O perodo de tempo estudado deve ser superior ao tempo mximo previsto de armazenamento para o incio da anlise da amostra. Este estudo deve, preferencialmente, ser realizado com o uso de matrizes naturalmente contaminadas.
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sugerido que o estudo de estabilidade na matriz no processada seja realizado de forma exploratria, conforme demanda do Mapa. Para tal, o laboratrio deve reservar amostras naturalmente contaminadas, armazenando-as sob temperaturas de congelamento e analis-las em no mnimo seis rplicas, periodicamente, em intervalos de tempo predeterminados. O analito considerado estvel por um intervalo de tempo, enquanto os resultados dessas anlises indicarem igualdade estatstica com o primeiro resultado do incio do estudo. Pode-se usar o teste hiptese de t de Student, usando as equaes eq.(1) a eq.(5), como mostrado no item 4.2 Procedimentos de Avaliao e Critrios de Aceitao do Efeito Matriz, da Parte II, para se verificar essa igualdade de resultados. Neste caso, os desvios-padro (varincias) no numerador e no denominador que aparecem nas equaes (1), (3), (4) e (5) so aqueles obtidos das anlises replicadas em dois momentos diferentes do estudo de estabilidade. O estudo pode no ser realizado devido sua impraticabilidade para algumas matrizes.
III.2 Estabilidade do Analito na Matriz Processada

O estudo visa a demonstrar a estabilidade dos analitos nas matrizes no perodo entre o processamento da amostra e o incio da anlise. A estabilidade do analito na matriz processada deve ser realizada sempre que o laboratrio adote a prtica na qual a amostra no analisada imediatamente aps o processamento. O perodo de tempo estudado deve ser superior ao tempo mximo previsto de armazenamento para o incio da anlise da matriz processada. Devem-se tomar amostras de matriz branca homogeneizada. O material deve ser dividido em alquotas, cada uma fortificada com a substncia a ser avaliada. Armazenar as alquotas sob as condies nas quais o laboratrio as armazena, no perodo entre o processamento da amostra e o incio da anlise.
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Analisar seis rplicas das alquotas armazenadas, periodicamente, em intervalos de tempo predeterminados, e definir o tempo mximo de estabilidade dos analitos estudados procedendo a testes t como na seo 1 Estabilidade do Analito na Matriz no Processada, da Parte III. No necessrio provar a estabilidade dos analitos na matriz processada caso o laboratrio inicie a anlise da amostra imediatamente aps seu processamento.
III.3 Estabilidade do Analito no Extrato ou na Soluo de Abertura de Amostra

O estudo visa a demonstrar a estabilidade dos analitos nos extratos no perodo entre a extrao/digesto da amostra e o incio da anlise instrumental. A estabilidade do analito no extrato deve ser realizada sempre que o laboratrio adote a prtica na qual o extrato no analisado imediatamente aps a extrao/digesto. O perodo de tempo estudado deve ser superior durao da corrida analtica ou ao tempo mximo previsto de armazenamento e corrida analtica. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da anlise dos extratos imediatamente aps a extrao/digesto ou abertura de amostra. Devem-se tomar extratos de matriz branca. O extrato deve ser adicionado com a substncia a ser avaliada em uma concentrao que contemple a faixa de trabalho. Armazenar os extratos sob as condies nas quais o laboratrio os armazena, no perodo entre a extrao/digesto da amostra e a anlise instrumental. Analisar no mnimo seis rplicas dos extratos armazenados periodicamente, em intervalos de tempo predeterminados, e definir o tempo mximo de estabilidade dos analitos estudados procedendo a testes t como na seo 1 Estabilidade do Analito na Matriz no Processada, da Parte III. No necessrio provar a estabilidade dos analitos caso o laboratrio inicie a anlise da amostra imediatamente aps a extrao/digesto.
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III.4 Estabilidade das Solues Padro

A estabilidade das solues padro deve ser demonstrada sempre que no houver alguma referncia prvia para o seu prazo de validade. A estabilidade da soluo padro deve ser estudada nas condies e no perodo de armazenamento nos quais a soluo padro armazenada no laboratrio. Recomenda-se comparar a resposta instrumental gerada por uma soluo padro armazenada com a resposta instrumental gerada por uma soluo padro recm-preparada (a partir de um padro dentro do prazo de validade). O estudo deve ser realizado em todos os tipos de soluo padro, partindo da soluo padro estoque, passando pela soluo padro intermediria, at a soluo padro de trabalho. Caso o estudo de estabilidade seja feito em uma soluo diluda, essa estabilidade pode ser considerada para solues mais concentradas, desde que ambas sejam armazenadas sob as mesmas condies. O procedimento o mesmo da seo anterior, comparando-se com testes t os sinais de sextuplicatas obtidos em diferentes perodos de armazenamento com o sinal da soluo recm-preparada.
III.5 Estabilidade dos Padres de Trabalho e dos Materiais de Referncia no Certificados

Padres de trabalho e materiais de referncia no certificados podero ter o prazo de validade expandido, desde que seja realizado o monitoramento contnuo de sua estabilidade, conforme recomendado a seguir. Para monitoramento contnuo da estabilidade desses padres deve-se elaborar uma planilha ou grfico-controle para cada padro, constando o registro da relao de reas (ou alturas) dos picos obtidos cromatograficamente, entre o padro em estudo e um padro de referncia. Dessa forma, os seguintes passos devem ser seguidos e registrados: 1. Injetar no cromatgrafo uma soluo contendo um padro de referncia e o padro de trabalho utilizado na rotina do laboratrio, ambos dentro do prazo de validade indicado pelo fornecedor. 2. Registrar em um grfico-controle a relao das reas (ou alturas) entre os dois picos gerados.
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3. Quando o padro de trabalho utilizado na rotina expirar o prazo de validade, realizar o mesmo estudo descrito acima, utilizando sempre o padro de referncia dentro da validade. Caso a diferena entre as reas seja inferior a 5%, uma nova data de validade poder ser estabelecida para o padro em estudo. Sugere-se expandir a validade por mais trs meses, repetir os procedimentos descritos acima e, caso a relao das reas continue inferior a 5%, expandir a validade por mais trs meses. E assim proceder, sucessivamente. O padro de referncia pode ser o mesmo utilizado como padro interno (surrogate) ou como controlador do equipamento. Por exemplo, quinalfos ou propoxur para cromatografia lquida e bromofs ou clorpirifos metlico para cromatografia gasosa. O padro de referncia utilizado no estudo deve sempre estar dentro do seu prazo de validade.
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ANOTAES
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A Rotina Analtica e o Controle de Qualidade Analtica (CQA)
PARTE 4
Parte IV
A Rotina Analtica e o Controle de Qualidade Analtica (CQA)
Como a validao no garante que o desempenho do mtodo na rotina analtica do laboratrio permanecer o mesmo perpetuamente, faz-se necessrio monitorar as corridas analticas para garantir que os resultados continuem vlidos no decorrer do tempo, de acordo com o que foi estabelecido durante a validao. Todos os procedimentos adotados na rotina analtica devero ser respaldados pelos estudos de validao do procedimento analtico. A curva de calibrao utilizada na rotina deve conter pelo menos cinco nveis (incluindo, quando necessrio, o zero), devendo esta ter a mesma faixa de trabalho estudada na validao do mtodo. No mnimo uma Amostra Controle de Qualidade (ACQ) Branca de Matriz deve estar presente por batelada de amostras. As ACQ de Matriz Branca Fortificada devem simular nveis de concentrao de interesse. Para tal, fortificaes devem ser feitas em nvel baixo, mdio e alto, sendo que o LMR/TMC deve estar representado em um desses nveis ou prximo a eles. No mnimo uma ACQ de Matriz Branca Fortificada deve estar presente por batelada de amostra. Os nveis de fortificao devem ser periodicamente alternados para que o estudo contemple os trs nveis em um curto intervalo de tempo. Com esse objetivo, as ACQs devem ser intercaladas entre as amostras. Cada corrida analtica deve ter a seguinte composio: 1. Branco de reagente; 2. Curva de calibrao; 3. Amostras; 4. ACQs (matriz branca fortificada e matriz branca), intercalados s amostras. Os resultados das ACQ serviro de base para aceitao ou rejeio da batelada analtica.
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Para tanto: 1. As ACQ devem ser incorporadas em intervalos regulares, dependendo do nmero total de amostras da batelada. 2. Os dados devem, preferencialmente, ser registrados graficamente para uma melhor visualizao dos resultados. Os resultados obtidos nas ACQs correto podem ser utilizados para estimar continuamente a preciso intermediria ou reprodutibilidade intralaboratorial e a incerteza do procedimento analtico, bem como os valores de CC e CC. Os critrios de aceitabilidade dos resultados das ACQs so os mesmos de quando da validao e esto estabelecidos nas sees especficas. Adicionalmente, a cada quatro meses, os laboratrios devero realizar uma verificao de desempenho (internal check samples) por intermdio de amostras rigorosamente elaboradas e distribudas para serem analisadas junto com as amostras da rotina analtica. O objetivo estabelecer um controle interno e independente, ou seja, sem o conhecimento prvio dos analistas diretamente envolvidos nas anlises. Os resultados das medies de amostras de ensaio de rotina oriundos de curvas analticas obtidas a partir de padres de calibrao em soluo, ou a partir de extrato de matriz branca fortificado com os padres de calibrao, podem ser corrigidos com a mdia das correes de recuperao ou a mdia dos fatores de recuperao obtidos naquela batelada de anlises no nvel de concentrao mais prximo do resultado da amostra de ensaio de rotina. A correo de recuperao ou o fator de recuperao mdios da batelada de anlises no nvel de concentrao mais prximo do resultado da amostra de ensaio dever sempre ser relatado juntamente com o resultado da medio. O laboratrio deve fazer uso, o mais abundantemente possvel, de cartas de controle para mostrar de forma visual e rpida que o sistema de medio analtica est sob controle estatstico. Recomenda-se que no mnimo sejam feitas cartas de controle do intercepto e da inclinao das curvas de calibrao da rotina, cartas de controle das recuperaes obtidas nas ACQ e da preciso de repetitividade e/ou preciso intermediria (reprodutibilidade intralaboratorial). A critrio do laboratrio, outras cartas de controle podem ser elaboradas, por exemplo, com os valores de LD, LQ, CC CC, da resposta instrumental do instrumento analtico em algum controle, da rea, da intensidade ou largura a meia altura de um dado pico cromatogrfico de controle, entre outros.
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Ampliao do Escopo do Procedimento Analtico Validado
PARTE 5
Parte V
Ampliao do Escopo do Procedimento Analtico Validado: Incluso de Nova Matriz ou Novo Analito em Procedimento Analtico Validado
No caso de procedimento analtico j credenciado, o laboratrio poder solicitar ao Mapa a extenso de escopo incluindo novo analito ou matriz. Entende-se aqui como nova matriz, por exemplo, tecidos diferentes de uma mesma espcie (e.g., fgado e rim bovino) ou o mesmo tecido de espcies diferentes (e.g., rim bovino e rim suno) ou at tecidos diferentes de espcies diferentes (e.g., rim bovino e fgado suno). No contexto deste Manual, chamaremos de novo analito ou de nova matriz aquele(a) que se deseja incluir no escopo do procedimento analtico originalmente validado, e de velho analito ou de velha matriz aquele(a) que foi usado(a) na validao original do procedimento analtico. Para incluir novos analitos, em procedimento analtico mono ou multirresduo validado, os parmetros de validao devem ser definidos para os novos analitos e o desempenho do procedimento analtico, em relao aos demais analitos, necessita ser reavaliado de forma a demonstrar que a incluso do novo analito no altera o desempenho geral do procedimento analtico para os velhos analitos. Para a incluso de nova matriz ou novos analitos, os seguintes estudos devem ser apresentados: Linearidade; Seletividade/Efeito Matriz; Veracidade/Recuperao e Preciso, de forma a comprovar que a incluso de nova matriz no altera o desempenho do mtodo. A determinao de CC e CC e da incerteza de medio deve ser refeita para a nova combinao matriz-analito. As curvas de calibrao envolvidas nesses estudos devem contemplar uma faixa de calibrao que inclua os nveis de interesse (LMR ou TMC ou LMDR ou LQ) de ambas as matrizes ou, alternativamente, os nveis de concentrao do analito na nova matriz podem ser diludos ou pr-concentrados at atingirem a faixa de calibrao na velha matriz. Para a incluso da nova matriz, o estudo comparativo do efeito de matriz entre as duas curvas de calibrao envolvendo a nova matriz e a velha matriz semelhante ao estudo apresentado na seo 4 Seletividade e Efeito Matriz, da ParteII.
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Para tanto, aplica-se o teste t para os parmetros a e b das duas curvas analticas para cada analito do escopo do mtodo validado.
V.1 Procedimento de Determinao do Efeito de Matiz para a Incluso de Nova Matriz ou Novo Analito Comparando-se Duas Curvas de Calibrao
Duas matrizes brancas ou extratos de matrizes brancas devem ser fortificadas em pelo menos cinco nveis de concentrao, obtendo-se cinco ou mais nveis de calibrao. Os nveis de concentrao devem contemplar os respectivos nveis de interesse do analito estabelecidos para cada matriz. A injeo (leitura) no instrumento de medio analtica deve ser feita em pelo menos seis rplicas por nvel de concentrao em ordem aleatria. Aps a realizao das duas curvas de calibrao, aplicar o teste t de Student para verificar a igualdade estatstica dos interceptos a1 e a2 e das inclinaes b1 e b2 das curvas de calibrao com a velha e a nova matriz da seguinte forma: Aplicar o teste F (Fischer-Snedecor), homogeneidade de varincias, para verificar se as varincias dos interceptos da curva de calibrao (de calibrao) da velha e da nova matriz so estatisticamente iguais, calculando-se: Onde: e so as varincias dos interceptos da curva de calibrao (de calibrao) da velha e da nova matriz com a maior varincia no numerador. (25)
Ao mesmo tempo obtm-se o valor tabelado de Fa,crit,a,n1,n2 com n 1 = Nx1 1 graus de liberdade no numerador e n 2 = Nx2 1 graus de liberdade no denominador. Adotar um nvel de confiana de 95%. Se Fa,calc for menor que o Fa,crit,a,n1,n2 as varincias podem ser consideradas iguais. Neste caso, os desvios-padro dos dois interceptos so agrupados para formar o desvio-padro agrupado sa,p, e a igualdade dos dois interceptos testada com a distribuio t de Student, comparao de mdias. Desse modo, calculam-se:
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Onde:
(26)
(27) e Nx1 e Nx2 so os nmeros de nveis de concentrao independentemente replicados das curvas analticas (de calibrao) na velha e na nova matriz.
O valor tabelado de ta,a,n obtido a partir da tabela da distribuio de t de Student para n= Nx1+Nx22 graus de liberdade e o nvel de significncia desejada a=0,05 (5%) ou nvel de confiana 1a=0,95 (95%). Se Fa,calc for maior que o Fa,crit,a,n1,n2 tabelado as varincias no podem ser consideradas estatisticamente iguais. Verifica-se ento o efeito de matriz com a distribuio t de Student, usando a seguinte equao:
(28) Neste caso, para a obteno do valor crtico tabelado ta,crit,a,n o nmero de graus de liberdade igual a:
(29) Se o valor de ta,calc for menor que o ta,crit,a,n, pode-se concluir que as curvas analticas com as duas matrizes tm o mesmo intercepto. Se o valor de ta,calc for maior que o ta,crit,a,n pode-se concluir que as curvas analticas com as duas matrizes tm interceptos diferentes. Repetir os testes F e t para as inclinaes b1 e b2, usando-se as mesmas equaes eq.(25) a eq.(29) anteriormente citadas, apenas trocando as letras a por letras b.
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Se os interceptos a1 e a2 das curvas analticas (de calibrao) da velha e da nova matriz forem iguais entre si e o mesmo ocorrer com as inclinaes b1 e b2, ento pode-se incluir a nova matriz no escopo do mtodo validado e at mesmo usar a curva de calibrao na velha matriz para quantificar o analito na nova matriz. Isto , no h um efeito de matriz significativo diferenciando a nova matriz da velha matriz. O estudo do efeito de matriz para a incluso de novos analitos semelhante ao descrito nos pargrafos anteriores dessa seo para a incluso de nova matriz, mas agora comparando a curva de calibrao contendo os novos analitos juntamente aos velhos analitos com a curva de calibrao contendo apenas os velhos analitos. Sendo as duas curvas de calibrao na mesma matriz da validao original para os velhos analitos. Procede-se ento aos testes F e t das equaes eq.(25) a eq.(29). Se no houver diferena significativa entre os interceptos a1 e a2, assim como entre as inclinaes b1 e b2 entre as curvas de calibrao contendo apenas os velhos analitos e a curva de calibrao contendo simultaneamente os novos e os velhos analitos, ento no h efeito de matriz devido incluso dos novos analitos.
V.2 Estudo de Veracidade e Preciso para a Incluso de Nova Matriz ou Novo Analito
Tendo sido aprovada a incluso da nova matriz ou dos novos analitos atravs da comparao de suas curvas de calibrao, procede-se ento aos estudos da veracidade e da preciso para cada analito novo e velho na nova e na velha matriz, conforme mostrado nas sees 5 Veracidade/ Recuperao e 6 Preciso, da Parte II. Esses novos estudos de veracidade e preciso devero ser feitos em pelo menos trs nveis de concentraes diferentes (baixa, mdia alta) da faixa de trabalho, e no LMR/TMC, ou nos LMR/TMC, se forem distintos nas diferentes matizes. Se os critrios de veracidade e preciso estabelecidos nas sees 5 Veracidade/Recuperao e 6 Preciso, da Parte II, forem atendidos para a nova matriz ou para os novos analitos em todos os nveis estudados, as incluses desejadas ao escopo do procedimento analtico podero ser solicitadas ao Mapa. Se a veracidade e a preciso dos analitos na nova matriz forem iguais ao da velha matriz, ento a anlise de rotina dos analitos na nova matriz poder ser feita com a curva de calibrao da velha matriz.
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Aspectos Especficos da Validao de Procedimentos Analticos para as Diferentes Categorias de Analitos
PARTE 6
Parte VI
Aspectos Especficos da Validao de Procedimentos Analticos para as Diferentes Categorias de Analitos
Nesta parte, trataremos das especificidades que devem ser prioritariamente observadas na validao dos procedimentos analticos e durante as determinaes de rotina dos resduos de Medicamentos Veterinrios, Praguicidas e Contaminantes Orgnicos e Inorgnicos. Todos os critrios descritos nesta seo devem ser estimados levando-se em considerao as Partes de II a V deste Manual.
VI.1 Resduos de Medicamentos Veterinrios

VI.1.1 Validaes (Requisitos Mnimos e Critrios de Aceitao) A validao de procedimentos analticos para determinao de medicamentos veterinrios e contaminantes orgnicos em matrizes de origem animal dever ser conduzida observando-se os seguintes parmetros de desempenho e os seus respectivos critrios de aceitao: 1. Seletividade; 2. Efeito Matriz; 3. Linearidade; 4. Recuperao/Veracidade; 5. Preciso (Repetitividade); 6. Preciso (Reprodutibilidade Intralaboratorial); 7. Limite de Deciso (CC) e Capacidade de Deteco (CC); 8. Robustez.
VI.1.2 Seletividade Analisar um nmero apropriado de amostras brancas e averiguar a presena de qualquer interferente (pico cromatogrfico, sinal, trao de on) na regio de interesse que se espera a eluio do analito.
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Fortificar amostras em branco representativas em uma concentrao relevante com substncias que possam interferir na identificao e/ou na quantificao da substncia a analisar.
VI.1.2.1 Critrios de Aceitabilidade da Seletividade O sinal interferente deve ser < 30% do sinal na concentrao do Menor Nvel Calibrado.
VI.1.3 Efeito de Matriz Aplicar os procedimentos de avaliao e os critrios de aceitao da seo 4 Seletividade e Efeito Matriz, da Parte II deste Manual. Curvas de calibrao em soluo de analito em solvente puro (CCAS) s podero ser utilizadas se for demonstrada a no existncia de efeito de matriz.
VI.1.4 Linearidade Construir uma curva de calibrao com no mnimo cinco nveis de concentrao, compreendendo 1, 1,5 e 2,0 vezes o LMDR ou 0,5, 1,0 e 1,5 vez o LMR, em cinco ou mais replicatas. A linearidade deve ser avaliada pela inspeo visual do grfico gerado pela regresso linear e pela avaliao estatstica dos resduos, desde que o coeficiente de correlao ou determinao esteja dentro de critrios aceitveis. A curva de calibrao no deve ser forada a passar pela origem. Calcular o coeficiente de correlao ou determinao.
VI.1.4.1 Critrios de Aceitabilidade O modelo matemtico utilizado para descrever a curva de calibrao deve ser adequado.
VI.1.5 Preciso (Repetitividade e Reprodutibilidade Intralaboratorial) Aplicar os procedimentos de avaliao e critrios de aceitao da seo 6 Preciso, da Parte II deste Manual.
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VI.1.6 Veracidade/Recuperao Com os dados obtidos no ensaio de reprodutibilidade intralaboratorial, calcular a recuperao mdia, por nvel de fortificao.
VI.1.6.1 Critrios de Aceitabilidade A recuperao mdia deve estar compreendida nos intervalos especificados na Tabela5 ao redor de 100%, de acordo com as respectivas concentraes.
VI.1.7 Robustez Um estudo de robustez deve ser realizado demonstrando a estabilidade do mtodo sob diferentes condies, diferentes fabricantes de insumos e colunas cromatogrficas, dentre outras variaes.
VI.1.8 Limite de Deciso (CC) e Capacidade de Deteco (CC) Calcular os valores de CC e CC com os dados obtidos durante a validao do mtodo. Os valores de CC e CC devem incluir a incerteza do mtodo no LMR/LMDR. O clculo dos valores de CC e CC deve ser realizado a partir da anlise de amostras fortificadas sob condies de reprodutibilidade. O laboratrio deve garantir que a incerteza do procedimento analtico (desvio-padro) seja considerada nos clculos de CC e CC. Trs abordagens podem ser utilizadas para calcular os valores de CC e CC: 1. Resultados obtidos nos ensaios de repetitividade e reprodutibilidade intralaboratorial; 2. Resultados obtidos nas CCMBF em dias diferentes; 3. Resultados obtidos a partir de 20 amostras brancas fortificadas no LMR. recomendado que periodicamente os valores de CC e CC sejam atualizados ou confirmados com dados da rotina.
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VI.1.8.1 Critrios de Aceitao do CC e CC CC e CC devem ser inferiores ao Limite Mnimo de Desempenho Requerido (LMDR), no caso de substncias banidas.
VI.1.9 Estudos de Estabilidade A estabilidade dos analitos utilizados nas anlises deve ser demonstrada, simulando as condies s quais o laboratrio submete as amostras/padres. Os estudos de estabilidade podem ser realizados ao longo dos ensaios de rotina.
VI.1.9.1 Critrio de Aceitao Os analitos sero considerados estveis quando for observada uma degradao mxima de at 5%, em relao a uma referncia recm-preparada.
VI.1.10 Extenses de Escopo: Incluso de Novos Analitos ou de Novas Matrizes Novos analitos ou matrizes que sero includos num mtodo previamente validado necessitam ser validados usando os mesmos parmetros e critrios definidos anteriormente. De maneira alternativa, a validao de um novo analito ou matriz pode ser realizada de forma concorrente durante as anlises de rotina. Para a avaliao da linearidade do novo analito ou matriz devem ser adotados os mesmos parmetros utilizados na validao do mtodo. Amostras de Controle de Qualidade (ACQ) podem ser utilizadas para avaliao da preciso e da veracidade/recuperao do mtodo na validao concorrente. Para tal, fortificar ACQs em 0,5, 1 e 1,5 vez o LMR ou 1, 1,5 e 2 vezes o LMDR com o analito de interesse. Repetir o processo em dias diferentes, sob condies de reprodutibilidade intralaboratorial, at que se obtenham seis anlises por nvel. Calcular a recuperao mdia e o coeficiente de variao por nvel fortificado. Calcular os valores de CC e CC com os dados obtidos.
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Os valores de recuperao mdia e de coeficiente de variao obtidos devem estar dentro dos intervalos aceitveis utilizados na validao do mtodo para o analito ou a matriz original.
VI.1.11 Curvas de Calibrao e Amostras de Controle de Qualidade (ACQs) na Rotina Analtica Todos os procedimentos adotados na rotina analtica devero ser respaldados pelos estudos de validao do mtodo. A curva de calibrao utilizada na rotina deve conter pelo menos cinco nveis (incluindo o zero), devendo esta ter a mesma faixa de trabalho estudada na validao do mtodo. Os valores de recuperao obtidos pelos ACQs devem estar dentro dos limites estabelecidos na Tabela5 ao redor de 100%, de acordo com as respectivas concentraes.
VI.2 Resduos de Praguicidas (Agrotxicos)

Devido grande diversidade de agrotxicos empregados na agricultura, os procedimentos analticos multirresduos so especialmente recomendveis quando se trata de identificao e quantificao de resduos em matrizes vegetais. Quando o mtodo for aplicvel a mais de uma matriz, de um mesmo grupo ou de grupos distintos de produtos, seu credenciamento poder ser solicitado apenas com os dados da validao obtidos com a matriz representativa. Entretanto, durante a rotina analtica, uma validao simultnea ou concorrente deve ser conduzida objetivando avaliar o comportamento do mtodo para as demais matrizes do grupo componente do escopo, de forma a garantir que o mtodo aplicvel de maneira integral a todas as matrizes que fazem parte do escopo. De maneira sistemtica, os parmetros que impactam na qualidade analtica precisam ser monitorados, conforme descrito na Parte IV A Rotina Analtica e o Controle de Qualidade Analtica, de modo a garantir durante a rotina analtica que o mtodo continua operando dentro dos parmetros preconizados. Caso seja observada uma tendncia significativa ou sistemtica de desvio dos parmetros, procedimentos devem ser adotados no intuito de se identificar e corrigir as causas provveis do desvio.
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VI.2.1 Matrizes Representativas Para utilizao de matriz representativa, os seguintes critrios devem ser observados: 1. No mnimo uma matriz representativa por grupo de produtos deve ser avaliada durante a validao, fato indispensvel ao credenciamento de determinado procedimento analtico. 2. Quando um mtodo for implementado na rotina para uma variedade de matrizes de um mesmo grupo, dados complementares devero ser coletados de forma a consolidar a validao concorrente para todas as matrizes do grupo credenciado/ autorizado por intermdio da matriz representativa. 3. Na seleo da matriz representativa, devem ser utilizados os critrios estabelecidos na Tabela A.XI.1 (CAC/GL 40-1993, Rev.1-2003), anexa. 4. Matrizes representativas podem ser utilizadas na validao de mtodos mono e multirresduos.
VI.2.2 Analitos Representativos 1. Todos os analitos contemplados pelo escopo do mtodo necessitam ser validados. 2. Preferencialmente, cada batelada de amostras a ser analisada deve ter uma curva de calibrao contemplando todos os analitos do escopo do mtodo. Na impossibilidade desse procedimento, a curva de calibrao deve ser construda utilizando pelo menos o nmero mnimo determinado de analitos representativos. 3. A escolha desses analitos representativos deve ser feita muito cuidadosamente, de modo a prover evidncia de que representa o escopo do ensaio. Dessa forma, a escolha deve ser feita de acordo com a probabilidade de se encontrar determinados resduos na amostra e com as caractersticas fsico-qumicas dos analitos, optando-se pelos analitos mais crticos (e.g., com resposta mais crtica e varivel). 4. O nmero mnimo de curvas de calibrao dos analitos a serem determinados deve ser 15 analitos mais 25% do total envolvido no escopo do mtodo. Por exemplo, para um mtodo que possui em seu escopo 100 analitos, a curva de calibrao deve ser feita com pelo menos 40 analitos representativos.
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5. Se o escopo do mtodo for igual ou inferior a 20 analitos, ento todos os analitos devem ser calibrados. 6. Sempre que uma substncia ultrapassar seu LMR (no conformidade) e no fizer parte dos analitos representativos calibrados e dos estudos de recuperao da batelada, o resultado dever ser considerado uma tentativa at a sua calibrao. Assim, uma nova calibrao deve ser feita, contemplando os analitos no conformes, alm de um estudo de recuperao do analito na matriz da respectiva amostra.
VI.2.3 Validaes (Requisitos Mnimos e Critrios de Aceitao) A validao de procedimentos analticos para determinao de agrotxicos em matrizes de origem vegetal e animal dever ser conduzida atendendo aos critrios mnimos dos seguintes parmetros de desempenho: 1. Seletividade (interferentes); 2. Efeito Matriz; 3. Linearidade; 4. Recuperao/Veracidade; 5. Preciso (Repetitividade e Reprodutibilidade intralaboratorial); 6. Limite de Quantificao; 7. Limite de Deteco; 8. Robustez; 9. Incerteza de Medio.
VI.2.4 Seletividade (Interferentes) Analisar no mnimo seis amostras brancas, preferencialmente de seis fontes distintas, e verificar as possveis interferncias (sinais e picos no tempo de reteno em que se prev a eluio do analito).
VI.2.4.1 Critrios de Aceitabilidade O sinal do interferente deve ser < 30% do sinal na concentrao do Menor Nvel Calibrado.
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VI.2.5 Efeito Matriz Aplicar os procedimentos de avaliao e critrios de aceitao da seo 4 Seletividade e Efeito Matriz, na Parte II deste Manual. Curvas de calibrao em soluo s podero ser utilizadas se demonstrada a ausncia de efeito matriz.
VI.2.6 Linearidade Construir uma curva de calibrao com no mnimo cinco nveis de concentrao, compreendendo os valores de LQ e preferencialmente o LMR, em cinco ou mais replicatas. Calcular o coeficiente de correlao ou determinao e as porcentagens dos resduos individuais da curva.
VI.2.6.1 Critrios de Aceitabilidade Os resduos de regresso individuais no devem ser maiores que 20% em relao resposta obtida na curva de calibrao. Quando esses pontos se aproximam ou excedem o LMR (Limite Mximo de Resduo), esse valor no deve ser maior que 10%. Um valor de resduo, em cada nvel, acima de tais limites pode ser rejeitado por um teste de outlier, desde que o coeficiente de correlao ou determinao permanea dentro dos critrios de aceitabilidade do laboratrio.
VI.2.7 Veracidade/Recuperao e Preciso (Repetitividade e Reprodutibilidade Intralaboratorial) Realizar a fortificao de, no mnimo, cinco replicatas de amostras em dois nveis de concentrao: em um nvel baixo que corresponda ao Limite de Quantificao (LQ) e em um nvel mais alto, preferencialmente no LMR. Para a determinao da reprodutibilidade intralaboratorial (preciso intermediria), repetir os procedimentos acima, no mnimo em mais duas ocasies (em condies de reprodutibilidade). Calcular as porcentagens de recuperao e coeficientes de variao (CV) das replicatas por nvel de concentrao.
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VI.2.7.1 Critrios de Aceitabilidade O procedimento analtico deve ser capaz de recuperar, em cada nvel de fortificao e para cada matriz representativa, de 70% a 120% em mdia para todos os analitos, com uma preciso de CV 20%. Excepcionalmente, quando a recuperao baixa, porm consistente (i.e., demonstra boa preciso) e a razo para isso bem estabelecida (e.g. devido distribuio do agrotxico no processo de partio), uma recuperao abaixo de 70% pode ser aceitvel. Entretanto, um mtodo mais exato deve ser usado, se praticvel. A reprodutibilidade intralaboratorial deve ser 20 %, excluindo qualquer contribuio devida heterogeneidade da amostra.
VI.2.8 Limites de Quantificao O limite de quantificao do procedimento analtico definido como o nvel mais baixo no qual foi demonstrado que os critrios de veracidade e preciso foram atendidos, desde que a relao sinal/rudo seja superior a seis (S/R 6).
VI.2.9 Limites de Deteco Limite de deteco do equipamento definido como a concentrao do analito que produz um sinal de trs vezes a razo sinal/rudo do equipamento. Para determinar o limite de deteco, diluir o padro, a critrio do analista, at um nvel de concentrao detectvel. Injetar em triplicata e utilizar o valor mdio. Estimar a concentrao correspondente a um sinal equivalente a trs vezes o rudo.
VI.2.10 Robustez A robustez do mtodo deve ser demonstrada por intermdio de: 1. Estudos de pr-validao e otimizao do mtodo; 2. Monitoramento por intermdio dos resultados das amostras controle e verificaes de desempenho do sistema. Outros estudos podem ser realizados, desde que devidamente embasados.
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VI.2.11 Incerteza de Medio A incerteza de medio deve ser estimada segundo procedimento estabelecido na seo 8 Incerteza de Medio Analtica (IMA), da Parte II, deste Manual.
VI.2.11.1 Critrios de Aceitabilidade A incerteza de medio expandida (U) relativa dever ser inferior ou igual a 50% (nvel de confiana de 95%).
VI.2.12 Estudos de Estabilidade (Orientao Geral) O estudo de estabilidade deve simular as condies nas quais o laboratrio submete as amostras/padres (e.g. se o laboratrio armazena as amostras congeladas por 24 horas, ele deve provar a estabilidade dos analitos nas amostras nesse perodo, nas mesmas condies). Os estudos de estabilidade podem ser realizados de forma concorrente aos ensaios de rotina.
VI.2.13 Extenses de Escopo (Novos Analitos) Quando se desejar incluir novos analitos a um mtodo previamente validado, o laboratrio deve utilizar os mesmos parmetros e critrios definidos anteriormente para garantir sua adequao (validao) aps a incluso. De maneira alternativa, a validao de novo analito pode ser realizada de forma concorrente, por intermdio do uso de amostras de controle de qualidade durante as anlises de rotina (e.g. com cada lote de amostras da rotina, um ou mais produtos da categoria so fortificados na concentrao do LQ e em um nvel maior preferencialmente prximo ao Limite Mximo de resduo. Determinar a recuperao e ocorrncia de alguma interferncia no branco de amostra correspondente. Aps a coleta de cinco dados por nvel de fortificao, calcular a recuperao mdia e a reprodutibilidade intralaboratorial (CV), sendo que estes valores devem atender aos critrios descritos na validao.
94
VI.2.14 Calibraes Analticas e Recuperao (Rotina Analtica) Todos os procedimentos adotados na rotina analtica devero ser respaldados pelos estudos de validao do mtodo. Todo resultado acima do LQ deve ser quantificado com o uso de curva de calibrao e recuperao obtidas de uma matriz do mesmo grupo, preferencialmente da mesma matriz da amostra quantificada.
VI.2.14.1 Calibrao Utilizando um nico Nvel de Concentrao A resposta da amostra necessita estar dentro de 20% da resposta do padro de calibrao, nos casos em que o LMR ultrapassado. Se o LMR no for excedido, a resposta da amostra deve estar dentro de 50% da resposta do padro de calibrao.
VI.2.14.2 Calibrao por Interpolao de Dois Nveis de Concentrao Calibrao deve ser feita em triplicata. A diferena entre os dois nveis no pode ser maior que um fator 4. As respostas mdias, obtidas de determinaes em replicatas para cada nvel, devem indicar linearidade aceitvel de resposta, com o maior fator no representando mais de 120% do mais baixo fator de resposta (110%, nos casos em que o LMR alcanado ou excedido).
VI.2.14.3 C alibrao Utilizando Trs ou Mais Nveis de Concentrao Neste caso uma funo de calibrao pode ser utilizada para o clculo da concentrao, dentro da faixa contemplada pelo maior e menor valor da curva de calibrao. A curva no deve ser forada a passar pela origem. A linearidade deve ser definida pela inspeo visual do grfico gerado pela regresso linear simples e/ou pela avaliao estatstica dos resduos de regresso, desde que o coeficiente de correlao ou determinao esteja dentro dos critrios de aceitabilidade preconizados.
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Se algum resduo de regresso, de cada nvel de concentrao, exceder 20% ( 10% no LMR ou acima dele), uma calibrao alternativa deve ser utilizada. Geralmente, o uso de uma regresso linear ponderada recomendado.
VI.2.14.4 Frequncia Mnima de Calibrao na Rotina Analtica

Todos os Outros Analitos do Escopo do Mtodo Dentro de um Programa A cada batelada de anlise Contnuo de Anlise a cada trs trs meses Pelo menos um ponto de Pelo menos um ponto de calibrao deve contemcalibrao deve contemplar o LQ plar o LQ Analitos Representativos Frequncia Mnima de Calibrao
VI.2.14.5 Determinao da Recuperao na Rotina Analtica Os nveis de fortificao para determinao das recuperaes dos analitos devero estar na faixa de calibrao (e.g. no LMR), ou dentro de um nvel de relevncia para as amostras analisadas. Esse nvel de fortificao deve ser alternado ao longo do tempo. Sempre que possvel, a recuperao dos analitos do escopo deve ser determinada em cada batelada de anlise. Entretanto, a frequncia mnima aceitvel :
Analitos Representativos Frequncia Mnima de Determinao da Recuperao 10% dos Analitos representativos (pelo menos cinco em cada batelada de anlises). Todos os Outros Analitos do Escopo Dentro de um programa contnuo, para incluir todos os outros analitos, no mnimo a cada 12 meses, mas preferencialmente a cada seis meses.
VI.2.14.5.1 C ritrios de Aceitao do Desempenho de Recuperao na Rotina Analtica A recuperao mdia calculada a partir de um grupo de produtos (diferentes matrizes). Limites aceitveis para uma nica recuperao devem normalmente estar na faixa da recuperao mdia 2 x %DPR e podem ser ajustados usando dados de reprodutibilidade intralaboratorial (recuperao de rotina) ou repetitividade (validao inicial).
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Entretanto, uma faixa generalizada de 60 a 140% pode ser usada na anlise de rotina de multirresduos. Recuperao fora dessa faixa usualmente requer reanlise do grupo, mas pode ser admitida em certos casos justificados. Todavia, recuperaes consistentemente elevadas devem ser investigadas. Se uma tendncia significativa ocorrer na recuperao ou se resultados potencialmente inaceitveis (DPRs maiores que 20%) forem obtidos, as causas devem ser investigadas.
VI.3 Contaminantes Inorgnicos

VI.3.1 Validao (Requisitos Mnimos e Critrios de Aceitao) Os parmetros a serem calculados durante o processo de validao de mtodos para a determinao de contaminantes inorgnicos em atendimento s demandas do PNCRC so: 1. Linearidade; 2. Seletividade e Efeito Matriz; 3. Limite de deteco; 4. Limite de quantificao; 5. Preciso (repetitividade e reprodutibilidade intralaboratorial); 6. Recuperao/veracidade; 7. Robustez; 8. Incerteza de Medio. Antes do processamento dos dados obtidos durante a validao, recomenda-se avaliar os desvios-padro relativos entre as leituras de cada replicata e a existncia de valores dispersos (outliers).
VI.3.2 Linearidade A maioria dos equipamentos de medio existentes estabelece a sua faixa dinmica linear. necessrio, entretanto, verificar at que ponto a faixa de concentrao do analito coincide com a faixa dinmica linear e assegurar que nenhum outro fenmeno tenha impacto indesejvel na resposta. A faixa de trabalho e a curva de calibrao devem ser estabelecidas a partir das concentraes nas quais a linearidade constatada.
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A linearidade obtida por padronizao interna e externa, formulada como expresso matemtica usada para o clculo da concentrao do analito a ser determinado na amostra real. A equao da reta que relaciona a resposta instrumental medida com a concentrao do analito : Y = a + BC Onde: A = Absorvncia; b = Inclinao da curva de calibrao (sensibilidade); c = Concentrao/massa; a = Interseo com o eixo y, quando c = 0. (30)
Os padres utilizados na construo da curva de calibrao em espectrometria atmica devem ser preparados numa soluo que corresponda tanto quanto possvel da soluo da matriz a analisar (por exemplo, relativo concentrao de cido ou composio). O trabalho em condies de atomizao isotrmica (por exemplo, tubo de grafite aquecido transversalmente com plataforma de Lvov integrada) reduz a influncia da matriz na atomizao do analito quando combinada com o uso de modificador qumico e com corretor de fundo Zeeman. A ausncia de interferncias deve ser demonstrada para a adoo da padronizao externa.
VI.3.2.1 Procedimento de Estimao da Linearidade Na construo da curva de calibrao devem-se usar seis replicatas de cada nvel e, pelo menos, cinco nveis de concentrao. Cada uma das replicatas deve ser lida trs vezes. Sempre que possvel, empregar os nveis equivalentes ao TMC na construo da curva de calibrao. Nos casos em que a faixa de concentrao do analito no coincidir com a faixa linear do equipamento, deve-se adequar a faixa capacidade de medio do equipamento. O primeiro ponto da curva de calibrao deve corresponder ao valor do limite de quantificao. O limite superior da curva geralmente restringido pela resposta do equipamento. Quando possvel, o nvel de 2,0 TMC dever ser includo.
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As solues padro devem ser preparadas e a curva de calibrao deve ser construda da mesma forma como sero empregadas na rotina. Verificar a ausncia de valores discrepantes para cada nvel de concentrao, utilizando testes estatsticos apropriados. Recomenda-se o emprego do teste de Dixon. Para tanto, os seguintes passos devem ser observados: 1. Ordenar os valores em ordem crescente, isto : x1 < x2 < x3 <...< xn-1 < xn; 2. Supor a hiptese de que o menor valor, x1, e o maior valor, xn, so possveis valores dispersos (outliers); 3. Selecionar o risco desejado de falsa rejeio (5%) ou o nvel de confiana (95%) ; 4. Empregar as seguintes equaes, de acordo com o tamanho da amostra:
n 3n7 8 n 10 11 n 13 14 n 25 Razo t10 t11 t21 t22 xn suspeito (xn xn-1)/(xn x1) (xn xn-1)/(xn x2) (xn xn-2)/(xn x2) (xn xn-2)/(xn x3) x1 suspeito (x2 x1)/(xn x1) (xn x1)/(xn-1 x1) (x3 x1)/(xn-1 x1) (x3 x1)/(xn-2 x1)
5. Comparar as razes calculadas com os valores da tabela de Dixon. Verificar a homoscedasticidade, a independncia e a normalidade da distribuio dos resduos. Recomenda-se o emprego dos testes: Levene, Durbin-Watson e Anderson-Darling, respectivamente. Os testes de Dixon, Levene e Durbin-Watson so aplicveis apenas quando os dados so normais. Alternativamente, quando possvel, a avaliao dos resduos pode ser realizada a partir dos dados obtidos de, no mnimo, quatro curvas de calibrao construdas em dias diferentes. Dessa forma, a avaliao da linearidade refletir de maneira mais fidedigna a rotina analtica. Nesse caso, o nmero de replicatas e leituras podero ser os mesmos utilizados na rotina. Verificar a homoscedasticidade (homogeneidade das varincias dos resduos) dos dados, empregando o teste de Levene. Dada a varivel Y, com m nveis, dividida em j subgrupos, onde nj o nmero de replicatas do nvel u, calcular o valor de F:
99
(31) Onde:
Verificar a se os resduos so independentes (aleatrios) pelo emprego do teste de Durbin-Watson. Calcular o valor de D:
(32)
Verificar se os resduos possuem distribuio normal pelo emprego do teste de Anderson-Darling:
1. Ordenar os resduos. 2. Calcular a probabilidade acumulada do resduo padronizado:
100
Onde:
3. Calcular as quantidades:
4. Calcular o valor de A:
Onde:
5. Calcular a estatstica AA:
6. Calcular o valor do p-teste:
(33)
VI.3.2.2 Critrios de Aceitao da Linearidade O desvio-padro relativo mximo entre as replicatas deve ser estabelecido a partir de dados histricos, dados fornecidos pelo fabricante do equipamento ou em consonncia com a tcnica utilizada. A partir do teste de Dixon, se o valor encontrado para a razo for maior que o valor tabelado, ento a suposio de outlier existe e o valor discrepante deve ser descartado. Para a avaliao da varincia dos resduos usando o teste de Levene, se: Fc Ft, os resduos so homocedsticos Fc > Ft, os resduos so heterocedsticos
101
Dado o teste de Durbin-Watson, os resduos sero independentes se D 1,5. Dado o teste de Anderson-Darling os resduos possuem distribuio Normal, se: p-valor < 0,05 os resduos so normais p-valor 0,05 os resduos no so normais
Descartados os valores discrepantes e, em se tratando da varincia homognea dos resduos e distribuio normal dos dados (resduos aleatrios). Definir a equao da regresso linear e o coeficiente de determinao, R , a partir do mtodo dos mnimos quadrados ordinrios.
2
O valor mnimo de R2 deve ser 0,995. Caso esse valor no seja obtido, aplicar o teste t para R2 descrito no Anexo III deste Manual.
VI.3.3 Seletividade e Efeito Matriz Realizar os procedimentos descritos na seo 4 Seletividade e Efeito Matriz, da Parte II deste Manual, para a estimao do efeito matriz. Os experimentos para avaliao da seletividade devem ser conduzidos, no mnimo, para os nveis: 0,2 e 1,0 TMC. Recomenda-se o uso do analito em solvente puro e do analito em matriz branca. Dessa forma, parte do experimento poder ser utilizada para a extenso de escopo.
VI.3.3.1 Critrios de Aceitao da Seletividade e Efeito Matriz A variao mxima permitida entre a mdia do valor obtido para cada nvel das amostras fortificadas e as solues padro no deve ser superior a 10%. Caso os critrios de aceitao no sejam alcanados, a linearidade, a veracidade e a preciso estaro seriamente comprometidas, sendo neste caso necessrio que a curva de calibrao seja construda a partir de amostras brancas fortificadas aps a digesto.
VI.3.4 Limite de Deteco Limite de deteco o teor mnimo a partir do qual possvel deduzir a presena do analito com certeza analtica razovel (95% de confiana).
102
VI.3.4.1 Procedimento de Avaliao do Limite de Deteco Realizar a anlise de, no mnimo, 21 replicatas da matriz branca e utilizar os valores obtidos para calcular: LD = 3 s Onde: s = desvio-padro da mdia dos ensaios com matriz branca (n > 20). (34)
Neste caso, matriz branca aquela que apresenta concentrao que no interfere nos resultados das determinaes, podendo considerar, mas no se limitar a: 1. Concentrao de um composto na matriz que resulte em um sinal do equipamento muito abaixo ao sinal no LQ; 2. Ausncia do sinal.
VI.3.4.2 Critrios de Aceitao do Limite de Deteco O LD deve ser menor que um dcimo do TMC, exceto se o TMC de chumbo for inferior a 100 g kg-1. Neste caso, o LD deve ser menor que um quinto do TMC.
VI.3.5 Limite de Quantificao Teor mnimo medido a partir do qual possvel medir o analito com certeza estatstica razovel (95% de confiana). Se a veracidade e a preciso so constantes em uma gama de concentraes centrada no limite de deteco, o limite de quantificao numericamente igual a seis ou dez vezes o desvio-padro da mdia de ensaios em branco (n > 20).
VI.3.5.1 Procedimento para avaliao do Limite de Quantificao Utilizar os resultados obtidos no ensaio de LD e calcular: LQ = 10 s Onde: s = desvio-padro da mdia dos ensaios com matriz branca (n > 20). (35)
103
VI.3.5.2 Critrios de Aceitao do Limite de Quantificao O LQ deve ser menos de um quinto do TMC, exceto se o TMC de chumbo for inferior a 100 g kg-1. Neste caso, o LQ deve ser igual a menos de dois quintos do TMC. A confirmao do valor do LQ deve ser realizada, no mnimo com seis replicatas, a partir da matriz branca fortificada no respectivo nvel do LQ. Os resultados devem alcanar valores de recuperao de acordo com a Tabela:
c (g kg-1) 1 > 1 a 10 10
(CE 657/2002)
Intervalo - 50% a + 20% - 30% a + 10% - 20% a + 10%
VI.3.6 Preciso A preciso do mtodo avaliada por meio da repetitividade e da reprodutibilidade intralaboratorial (ou preciso intermediria).
VI.3.6.1 Procedimentos para Avaliao da Repetitividade Preparar, no mnimo, seis replicatas de matrizes brancas fortificadas em dois nveis de concentrao: 0,2 1,0 TMC. Realizar o experimento, no mnimo, por duas vezes em condies de repetitividade. Calcular, a partir dos resultados obtidos, a concentrao de cada amostra, a concentrao mdia para cada nvel de adio, o desvio-padro (sr) e o desvio-padro relativo em condies de repetitividade (RSDr). Calcular o desvio-padro relativo terico para cada nvel de concentrao utilizando a equao de Horwitz: RSDHorwitz=2(1 0,5 logC) Onde: C: a frao mssica expressa sob a forma de uma potncia de dez. C: Concentrao (g kg-1) 10-9 (36)
Calcular o valor de HORRAT em condies de repetitividade, HORRATr , segundo a equao:
104
Onde: PDPRR : (desvio-padro relativo predito) = 2 C-0,15 C = Concentrao (g kg-1) 10-9
(37)
Calcular o limite de repetitividade r, segundo a equao: r = 2,8 x Sr (38)
VI.3.6.1.1 Critrios de Aceitao da Repetitividade No caso de anlises de amostras em condies de repetitividade, o desvio-padro relativo (DPRr) da mdia deve ser menor que dois teros do valor do DPRHorwitz. Os valores HORRATr devem ser inferiores a 1. VI.3.6.2 Procedimentos para Avaliao da Reprodutibilidade Intralaboratorial ou Preciso Intermediria Preparar, no mnimo, seis replicatas de amostras em dois nveis de concentrao: 0,2 1,0 TMC. Repetir o experimento por pelo menos duas vezes, em dias diferentes, em condies de reprodutibilidade. Calcular a concentrao obtida para cada replicata e a concentrao mdia, o desvio-padro, o desvio-padro relativo de cada dia e o desvio-padro relativo global para cada nvel. Calcular o valor de HORRAT em condies de reprodutibilidade intralaboratorial, HORRATR, segundo a equao:
Onde: PRSDR (desvio-padro relativo predito) = 2 C-0, 15 C = Concentrao (g kg-1) 10-9
(39)
105
Calcular o limite de reprodutibilidade R, segundo a equao: R = 2,8 x sR (40)
VI.3.6.2.1 Critrios de Aceitao para Reprodutibilidade Intralaboratorial No caso de anlises de matrizes brancas fortificadas em condies de reprodutibilidade intralaboratorial, o desvio-padro relativo (DPR) intralaboratorial dos resultados no deve exceder o valor de DPRHorwitz. Os valores HORRATR devem ser inferiores a 1. VI.3.7 Procedimentos para Estimao da Veracidade/Recuperao utilizando Material de Referncia (MR) ou o Material de Referncia Certificado (MRC) O MRC ideal deve apresentar concentraes similares ao TMC na matriz de interesse. Quando um MRC apropriado no est disponvel, podem ser utilizados materiais de referncia (MR) obtidos a partir de ensaios de proficincia. No caso do emprego do MR, utilizar a incerteza do valor estimado por consenso. Analisar, no mnimo, seis replicatas das amostras de MR/MRC em conformidade com as instrues para o mtodo. Calcular a mdia, o desvio-padro e o desvio-padro relativo. Calcular a veracidade pela:
(41) A veracidade verificada comparando-se a mdia dos resultados obtidos para o MR/MRC, com o valor aceito como verdadeiro, m, conforme procedimento a seguir: Calcular a incerteza do processo de medio (expressa pelo seu desvio-padro), D, pela equao:
(42)
106
Onde: sL a incerteza do MR/MRC informada e s o desvio-padro das medidas.
VI.3.7.1 Critrios de Aceitao da Veracidade Empregando MRC/MR Se de adequada. Se de adequada. , o processo de medio apresenta a veracida , o processo de medio no apresenta a veracida-
VI.3.8 Procedimentos para Estimao da Preciso (Repetitividade) utilizando Material de Referncia (MR) ou o Material de Referncia Certificado (MRC) A repetitividade de um processo de medio obtida a partir de um MR ou MRC avaliada comparando-se o desvio-padro das medidas (s) com o valor requerido do desvio-padro intralaboratrio (swo).
O swo pode ser calculado a partir da frmula:

Onde: m o valor de concentrao estabelecido para o MR/MRC e RSD o desvio-padro relativo aceitvel para a faixa de frao mssica que compreende m, de acordo com a Tabela:
c (g kg-1) 10 a 100 > 100 a 1000 1000
(CE 657/2002)
(43)
DPR (%) 20 15 10
Calcular a seguinte razo:
(44)
107
E comparar com o respectivo valor tabelado, de acordo com a equao:
(45)
Observao: Na tabela, usar o valor da rea de probabilidade de 1 - 0,95, ou seja, 0,05 (ou 0,95 quantil da distribuio x2).
VI.3.8.1 Critrios de Aceitao da Preciso (Repetitividade) Calculada com o Uso de MR e MRC , o processo de medio apresenta a preciso intralaSe boratorial requerida. , o processo de medio no apresenta a preciso inSe tralaboratorial requerida. Quando os MRCs no estiverem disponveis, aceita-se que a veracidade das medies seja avaliada por meio da recuperao de quantidades conhecidas do analito adicionadas s matrizes brancas. Chama-se ateno para o fato de que quando, ao contrrio da contaminao natural, o analito adicionado no se encontra ligado quimicamente matriz real, os resultados obtidos com esse mtodo so menos fiveis.
VI.3.9 Procedimentos para a Avaliao da Recuperao/Veracidade Utilizar os dados obtidos no ensaio de repetitividade. Calcular a recuperao mdia em cada nvel, segundo estabelecido na seo 5 Veracidade/Recuperao, da Parte II deste Manual.
VI.3.9.1 Critrios de Aceitao da Recuperao Os critrios de aceitao esto estabelecidos na seo 5 Veracidade/ Recuperao, da Parte II deste Manual.
VI.3.10 Procedimentos para a Avaliao da Robustez Para avaliao da robustez do mtodo, recomenda-se o teste de Youden. Planejamentos fatoriais fracionrios alternativos so descritos no Anexo XII, deste Manual.
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Selecionar os fatores a serem avaliados, seus valores nominais (descritos no mtodo) e os respectivos valores de variao, preenchendo uma tabela de acordo com o exemplo:
Fator Massa de amostra (g) Volume de HNO3 (concentrado) (mL) Volume de HCl (concentrado) (mL) Temperatura de aquecimento (C) Tempo de aquecimento (h) Continer Agitao Nominal 5,00 15,0 5,0 100 1,0 Cadinho Sim Variao 7,50 12,0 4,0 120 1,5 Bquer No
Executar o ensaio com as combinaes da Tabela a seguir em duplicata e aleatoriamente, inclusive entre as replicatas de cada combinao.
Valor do fator A/a B/b C/c D/d E/e F/f G/g Resultado Observado 1 A B C D E F G S 2 A B c D e f g T Combinao para os ensaios 3 4 5 6 A A a a b b B B C c C c d d d d E e e E f F F f g G g G U V W X 7 a b C D e f G Y 8 a b c D E F g Z
Calcular a mdia e a varincia (s2) para cada combinao de ensaio. Para determinar o efeito da variao de um fator, encontrar os quatro valores correspondentes s letras maisculas e subtrair dos quatro os valores correspondentes s letras minsculas, segundo a equao: (46)
Calcular o efeito para todos os fatores e construir um grfico de barras horizontais com os resultados, usando o mdulo dos valores. Estimar a varincia de todos os efeitos empregando a equao:
Onde:
(47)
ni = ni 1 o nmero de graus de liberdade de si2; a estimativa da varincia do i-simo ensaio.
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Calcular o erro padro do efeito aplicando a equao:
(48) Multiplicar o valor do erro puro por 2,306 (valor do t de Student para oito graus de liberdade, com 95% de confiana, realizados em duplicata) para traar a linha de significncia dos efeitos no grfico de barras. Calcular se h diferena estatstica significativa (95%) entre os valores dos resultados obtidos para maisculas e minsculas, empregando o teste F. Calcular o desvio-padro dos efeitos (sDi) pela frmula:
(49) Onde: D1 valor do efeito (ou diferena). VI.3.10.1 Critrios de Aceitao da Robustez Se o valor de algum efeito ultrapassar a linha de significncia do grfico de barras, pode-se consider-lo significativo e recomenda-se implantar um controle nesta etapa do processo. Caso seja necessrio, recomenda-se aprofundar o estudo sobre a influncia dos fatores significativos, realizando-se um planejamento fatorial completo para eles. O mtodo ser robusto se Ftabelado for maior que Fcalculado; O SDi deve ser menor que o desvio-padro obtido em condies de reprodutibilidade intralaboratorial. Sempre que o SDi for significativamente maior que o desvio-padro do mtodo, em condies de reprodutibilidade intralaboratorial, pode deduzir-se que o conjunto dos fatores tem influncia no resultado, mesmo que cada fator isoladamente no influencie significativamente, e que o mtodo no suficientemente robusto face s alteraes ensaiadas; Observao: A avaliao entre o SDi e o desvio-padro do mtodo em condies de reprodutibilidade pode ser realizada pelo teste F.
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VI.3.11 Procedimentos para a Avaliao da Incerteza de Medio Recomenda-se estimar a incerteza de medio segundo procedimento estabelecido na seo 8 Incerteza de Medio Analtica, da Parte II deste Manual.
VI.3.11.1 Critrios de Aceitao da Incerteza de Medio Os procedimentos analticos aplicados ao controle oficial devem produzir resultados cujas incertezas de medio padro sejam inferiores incerteza de medio padro mxima calculada por meio da seguinte frmula:
Onde:
(50)
Uf = incerteza de medio padro mxima (g kg-1). LD = limite de deteco do mtodo (g kg-1). c = corresponde concentrao em causa (g kg-1). = um fator numrico cuja utilizao depende de c. Os valores de a serem utilizados se encontram na tabela a seguir:
c (g kg-1) 50 51 a 500 501 a 1.000 1.001 a 10.000 > 10.000 0,2 0,18 0,15 0,12 0,1
VI.3.12 Procedimentos para Extenso de Escopo (Novas Matrizes) Para a incluso de novas matrizes em procedimentos analticos validados devem ser avaliados, no mnimo, os parmetros: Seletividade/Efeito Matriz, Veracidade/Recuperao e Repetitividade. Os estudos devem ser conduzidos nos nveis de 0,2 e 1,0 TMC referentes matriz nova.
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Para a avaliao da Seletividade/Efeito Matriz, realizar os procedimentos descritos na seo 4 Seletividade e Efeito Matriz, da Parte II deste Manual. Neste caso, as comparaes devem ser realizadas entre analito na matriz branca nova e analito na matriz branca velha. Recomenda-se que os experimentos conduzidos na extenso de escopo sejam efetuados na matriz velha e nova simultaneamente, ou seja, no mesmo dia. Com os dados obtidos a partir do procedimento de Seletividade/Efeito Matriz, avaliar os parmetros Veracidade/Recuperao e Repetitividade. Para fins da extenso de escopo, a avaliao da Repetitividade poder ser realizada em apenas um dia. Observao: Em alguns casos, mesmo os experimentos sendo conduzidos em sua totalidade como proposto acima, recomenda-se a avaliao da exatido com o uso de MRC/MR referente matriz nova. Tal recomendao visa garantir que a aplicao do procedimento analtico no influenciada pelas espcies qumicas (orgnicas e inorgnicas) presentes em amostras naturalmente contaminadas, ou mesmo possveis interaes entre o analito e a matriz. Um exemplo de procedimento analtico que apresenta forte influncia das espcies qumicas a determinao de arsnio total em pescados.
VI.3.12.1 Critrios de Aceitao da Extenso de Escopo (Novas Matrizes) Utilizar o critrio de aceitao para o parmetro Seletividade/ Efeito Matriz descrito na seo 4 Seletividade e Efeito Matriz, da Parte II deste Manual. Para os demais parmetros, utilizar os critrios estabelecidos nesta seo.
VI.4 Micotoxinas
Devido ocorrncia natural de diferentes micotoxinas em um mesmo produto de origem vegetal ou animal, os procedimentos analticos multitoxinas so preferencialmente recomendveis. Quando o procedimento analtico for destinado aplicao a mais de uma matriz, de uma mesma classe ou de classes distintas de produtos, seu credenciamento poder ser solicitado apenas com os dados da validao obtidos para a matriz representativa. Entretanto, validaes curtas devem ser conduzidas objetivando avaliar o comportamento do procedimento analtico para as demais matrizes do grupo componente do escopo, de forma a garantir que o procedimento analtico seja aplicvel integral-
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mente a todas as matrizes integrantes do escopo, conforme procedimentos descritos neste item. De maneira sistemtica, os parmetros que impactam na qualidade analtica precisam ser monitorados, conforme descrito na Parte IV A Rotina Analtica e o Controle de Qualidade Analtica, de modo a garantir durante a rotina analtica que o procedimento analtico continua operando dentro dos parmetros preconizados.
VI. 4.1 Matrizes Representativas Para utilizao de matriz representativa, os seguintes critrios devem ser observados: 1. No mnimo uma matriz representativa por grupo de produtos deve ser avaliada durante a validao. Tal fato indispensvel ao credenciamento para determinado procedimento analtico. 2. Quando um procedimento analtico for implementado na rotina para uma variedade de matrizes de um mesmo grupo, dados complementares devero ser coletados de forma a consolidar a validao concorrente para todas as matrizes daquele grupo. 3. Na seleo da matriz representativa, devem ser utilizados os critrios estabelecidos na Tabela A.XI.2. 4. Matrizes representativas podem ser utilizadas na validao de procedimentos analticos mono e multitoxinas. 5. A Tabela A.XI.2 deste item apresenta as classes de matrizes representativas para cada grupo de micotoxinas de interesse, que podem ser avaliadas como uma combinao de matriz x micotoxina durante a validao de procedimentos analticos. Essa tabela baseada nas informaes acumuladas pelo Lacqsa/Lanagro-MG, ao longo dos ltimos 15 anos de atividades de preparo e anlises de micotoxinas em produtos diversos. A evidncia dada pelos dados de estudos de validao e revalidao dos mesmos. 6. Todas as micotoxinas contempladas pelo escopo do procedimento analtico necessitam ser validadas. 7. Preferencialmente, cada batelada de amostras a serem analisadas deve ter uma curva de calibrao contemplando todas as micotoxinas do escopo do procedimento analtico. 8. Se o escopo do procedimento analtico for igual ou inferior a 20 micotoxinas, ento todas as micotoxinas devem ser contempladas na curva de calibrao.
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9. Sempre que uma substncia ultrapassar o nvel mximo requerido (no conformidade) a amostra deve ser reanalisada, de forma a atender aos requisitos estabelecidos na Parte IV deste Manual.
VI. 4.2 Validao (Requisitos Mnimos e Critrios de Aceitao) A validao de procedimentos analticos para determinao de micotoxinas em matrizes de origem vegetal ou animal dever ser conduzida atendendo aos critrios mnimos dos seguintes parmetros de desempenho: 1. Seletividade; 2. Efeito Matriz; 3. Linearidade (Curva de Calibrao); 4. Veracidade e Preciso; 5. Limite de Deteco (LD); Limite de Quantificao (LQ); CCa e CCb; 6. Robustez; 7. Estudo de Estabilidade; 8. Incerteza de Medio; 9. Valores de HORRAT.
VI.4.2.1 Seletividade Para se avaliar a presena de possveis interferentes, analisar no mnimo seis amostras brancas, preferencialmente de seis fontes distintas e verificar a ocorrncia de interferncias (sinais e picos no tempo de reteno em que se prev a eluio da micotoxina).
VI. 4.2.1.1 Critrios de Aceitabilidade O sinal do interferente deve ser < 30% do sinal apresentado para a menor concentrao da micotoxina na curva de calibrao. Esse critrio deve ser utilizado desde que no afete valores de Veracidade e Preciso, conforme Tabela 8.
VI.4.2.2 Efeito Matriz Aplicar os procedimentos de avaliao e critrios de aceitao da seo 4 Seletividade e Efeito Matriz, da Parte II deste Manual.
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Curvas de calibrao em soluo s podero ser utilizadas se for comprovada a ausncia de efeito matriz. Os procedimento analticos que utilizam colunas de imunoafinidade na etapa de purificao so considerados, a princpio, sem efeito matriz, tendo em vista a especificidade de separao das micotoxinas em um gel (coluna de fase slida de imunosorbente contendo anticorpos especficos para as micotoxinas pesquisadas para as matrizes pertencentes ao mesmo grupo da Tabela A.XI.2. Entretanto, preciso avaliar a capacidade de ligao da coluna de imunoafinidade empregada (ng de toxinas) e as condies analticas do mtodo para classes de matrizes e grupos de micotoxinas. Quando o procedimento analtico em validao estiver destinado anlise de diferentes matrizes para quantificao das mesmas micotoxinas pode-se, na etapa de avaliao do efeito matriz, fazer uma composio das diferentes matrizes do mesmo grupo conforme Tabela A.XI.2. Se o efeito matriz for comprovadamente positivo na matriz composta, deve-se avaliar cada matriz individualmente. Caso contrrio, a matriz composta pode ser utilizada nos testes de validao e inclusive como amostra branco nos controles de qualidade de resultados analticos. Valida-se, ento, o procedimento analtico para uma matriz composta e insere-se, nos trabalhos de rotina, amostras de controle de qualidade em trs replicatas para cada matriz do grupo contaminadas (MR, MRC) ou fortificadas no nvel requerido. Faz-se necessria a confirmao do LQ para todas as matrizes.
VI. 4.2.3 Linearidade Os procedimentos relacionados curva de calibrao devem ser realizados conforme descrito na seo 3 Curvas de Calibrao, Linearidade, Sensibilidade e Faixa de Trabalho, da Parte II, anexos III e VIII. Os laboratrios devem estabelecer internamente critrios de aceitabilidade dos parmetros da curva de calibrao: S(a), S(b), disperso dos resduos individuais da curva, coeficiente de correlao.
VI. 4.2.4 V eracidade e Preciso (Repetitividade e Preciso Intermediria) Os procedimentos relacionados Veracidade e Preciso devem ser realizados conforme as sees 5 Veracidade/Recuperao e 6 Preciso, da Parte II deste Manual.
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A veracidade poder tambm ser realizada por comparao dos resultados obtidos com outro procedimento analtico de ensaio previamente validado ou a partir dos resultados da participao em ensaios de proficincia. Os resultados devem ser considerados em termos de recuperao do valor certificado ou atribudo.
VI.4.2.4.1 Critrios de Aceitabilidade O procedimento analtico deve apresentar desempenho conforme os critrios descritos na Tabela 8. Tabela 8 Critrios de desempenho dos procedimentos analticos para determinao de micotoxinas em produtos de origem vegetal e leite (aflatoxina M1)
Micotoxina Aflatoxinas B1, B2, G1, G2* Aflatoxina M1 Citreoviridina** Desoxinivalenol Fumonisinas B1 e B2 Ocratoxina A Patulina Toxinas T-2 Toxina HT-2 Zearalenona Nvel Recuperao (mg/kg) (%) <1 50 a 120 1 10 70 a 110 >10 80 a 110 0,01 0,05 60 a 120% > 0,05 <5 >5 >100 - <500 >500 <500 >500 <1 1 10 <20 20 50 >50 50 250 > 250 100 200 > 200 <50 >50 70 a 110% 60 a 130 65 a 110 60 a 110 70 a 120 60 a 120 70 a 110 50 a 120 70 a 110 50 a 120 70 a 105 75 a 105 60 a 130 60 a 130 60 a 130 60 a 130 60 a 120 70 a 120 < 40 < 25 < 20 < 20 < 30 < 20 < 40 < 20 < 30 < 20 < 15 < 40 < 30 < 40 < 30 < 40 < 25 DPRr 0,66 x DPRR DPRR Recomendado: valor derivado da equao de Horwitz Mximo: 2 vezes o valor derivado da equao de Horwitz < 50 < 40 < 40 < 40 < 60 < 30 < 60 < 30 < 40 < 30 < 25 < 60 < 50 < 60 < 50 < 50 < 40
Fonte: Diretiva CE 401/2006. Notas: * Estes critrios aplicam-se para B1 e para a soma de B1, B2, G1 e G2. * Critrios estabelecidos com base na EU 401/2006 para zearalenona (DPR) e em procedimentos de * validao obtidos pelo Lacqsa/Lanagro-MG.
Para as micotoxinas para as quais no existam critrios de aceitabilidade estabelecidos recomenda-se que eles sejam determinados levando-se
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em considerao a similaridade do procedimento analtico e faixa de contaminao, podendo ainda esses critrios serem determinados durante os procedimentos de validao. Para anlise de micotoxinas em produtos de origem animal (exceto leite) deve-se atender aos critrios de validao conforme requisitos e critrios descritos nas sees 2 Critrios de Desempenho Aplicveis Deteco por EM e 5 Veracidade/Recuperao, da Parte II deste Manual. Excepcionalmente, quando a recuperao for menor que a estabelecida, porm consistente com os dados de preciso, e a causa para tal desempenho estiver bem estabelecida, a recuperao abaixo do requisito estabelecido poder ser aceitvel desde que devidamente justificada. Entretanto, um procedimento analtico mais exato deve ser usado, se praticvel.
VI.4.2.5 Limites de Deteco (LD), Limite de Quantificao (LQ), Limite de Deciso (CC) e Capacidade de Deteco (CC) Os procedimentos relacionados determinao de Limites de Deteco (LD), Limite de Quantificao, (LQ), Limite de Deciso (CC) e Capacidade de Deteco (CC) devem ser realizados em consonncia com o disposto na seo 7 Limites de Deteco, Limite de Quantificao, Limite de Deciso e Capacidade de Deteco, da Parte II deste Manual. Os Limites de Deciso (CC) e Capacidade de Deteco (CC) so necessrios quando se tratar de validao de matrizes de origem animal, exceto leite. Aps a estimativa matemtica do Limite de Quantificao (LQ), segundo a ISO11843, este deve ser confirmado em termos de preciso, veracidade (Tabela 8) e incerteza, conforme requisito especfico para o nvel em que o LQ se encontra, utilizando materiais de referncia ou matrizes brancas fortificadas com padro. Analisar no mnimo seis amostras da matriz branca fortificada, de preferncia de origens diferentes. A relao sinal/rudo deve ser superior a seis (S/R 6). Sugere-se que na estimativa do LQ pelo modelo proposto pela ISO 11843, o valor da menor concentrao de padro da curva de calibrao seja utilizado como zero (0).
VI.4.2.6 Estudo de Robustez, Escopo e Portabilidade Os procedimentos relacionados determinao de Robustez, Escopo e Portabilidade devem ser realizados em consonncia com o disposto na seo 9 Estudo de Robustez, Escopo e Portabilidade, da Parte II deste Manual.
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A robustez do procedimento analtico deve ser demonstrada minimamente por intermdio de: 1. Monitoramento do procedimento analtico por intermdio dos resultados das Amostras Controle e verificaes de desempenho do sistema. 2. Dados de srie histrica de controle intralaboratorial, participao em programas interlaboratoriais. Dados de preciso intermediria, obtidos ao longo de um determinado perodo de tempo, podem ser utilizados para evidenciar robustez. A portabilidade a capacidade de o procedimento analtico ser transportado/transferido para outro local de execuo ou outro equipamento sem, no entanto, perder suas caractersticas metrolgicas e seu desempenho. Os parmetros a serem avaliados para demonstrar portabilidade so: linearidade, veracidade, preciso, LQ.
VI.4.2.7 Estudos de Estabilidade (Orientao Geral) Os procedimentos relacionados a estudos de estabilidade devem ser realizados em consonncia com o disposto na Parte III Estudos de Estabilidade deste Manual. O estudo de estabilidade deve ser realizado, preferencialmente, em materiais considerados homogneos. Deve simular as condies nas quais o laboratrio submete as amostras e padres. Por exemplo, se o laboratrio armazena as amostras congeladas por 24 horas ele deve provar a estabilidade da micotoxina nas amostras nesse perodo nas mesmas condies. Se o extrato aps purificao armazenado deve-se evidenciar a estabilidade da micotoxina nele aps o armazenamento. Os estudos de estabilidade podem ser realizados ao longo dos ensaios de rotina a partir da avaliao de soluo padro, de amostras j analisadas pelo laboratrio e de material de referncia, dentre outros.
VI.4.2.8 Incerteza de Medio A incerteza para os procedimento analticos que determinam micotoxinas em alimentos de origem vegetal ou animal deve ser estimada seguindo os procedimentos citados na seo 8 Incerteza de Medicao Analtica, da Parte II deste Manual. Ambas as metodologias aqui citadas so usadas na estimao da incerteza dos procedimentos analticos: metodologias denominadas de Bottom-Up e Top-Down.
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Minimamente, deve-se levar em conta as contribuies dos componentes de incerteza, preciso intermediria e curva de calibrao.
VI.4.2.9 Valores de HORRAT Os valores de HORRAT devem ser calculados para os procedimentos analticos de anlise de micotoxinas em alimentos de origem vegetal e animal seguindo os procedimentos citados no item 3.6 - Preciso, da Parte VI deste Manual.
VI.4.2.9.1 Critrios de Aceitabilidade dos Valores HORRAT Os valores de HORRAT devem ser <1. Valores de HORRAT > 1 e < 2 podero ser aceitos se a causa do desempenho da preciso estiver claramente identificada e os valores de veracidade estiverem de acordo com o requisito na faixa validada (Tabela 8).
VI.4.3 Extenses de Escopo (Novos Analitos) Quando se desejar incluir novas micotoxinas a um procedimento analtico previamente validado, o laboratrio deve utilizar os mesmos parmetros e critrios definidos anteriormente para garantir sua adequao (validao) aps a incluso. Na introduo de uma nova micotoxina, a seletividade deve ser avaliada. Caso no ocorram mudanas nas condies analticas, repetir tambm as etapas de determinao de Limite de Deciso (CC), Capacidade de Deteco (CC), LQ, veracidade e preciso. Caso seja necessria alguma modificao analtica, repetir o procedimento de validao integralmente. Alternativamente, a validao de nova micotoxina pode ser realizada de forma concorrente, por intermdio do uso de amostras de controle de qualidade durante as anlises de rotina, isto , com cada lote de amostras da rotina um ou mais produtos da categoria so fortificados (n=3) na concentrao do LQ um nvel maior preferencialmente o nvel requerido e um limite correspondente ao ponto da curva de calibrao mais concentrado.
VI.4.4 Extenses de Escopo (Novas Matrizes) Quando a matriz a ser introduzida no pertencer a um grupo representativo de amostras (Tabela A.XI.2) uma validao completa deve ser conduzida.
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Quando a matriz pertencer a um determinado grupo representativo, a ampliao do escopo dever ser feita a partir da avaliao de estudos de seletividade, preciso e veracidade e LQ; com no mnimo um dia de experimento, conforme descrito neste Manual, e dever atender aos critrios de desempenho estabelecidos para a validao.
VI. 4.5 Alterao do Nvel de Concentrao Requerido Caso seja necessrio mudar o limite de referncia (nvel de interesse ou nvel requerido) utilizado no processo de validao, e este estiver fora da faixa de trabalho da curva de calibrao, deve-se repetir os experimentos de Limite de Deciso (CC), Capacidade de Deteco (CC) e LQ, conforme o item 4.2.5 Limites de Deteco, Limite de Quantificao,Limite de Deciso e Capacidade de Deteco, desta Parte. Caso o novo limite esteja dentro da curva de calibrao, avaliar o Limite de Deciso (CC), Capacidade de Deteco (CC), LD e LQ pelo menos uma vez.
VI. 4.6 Revalidao Revalidao o procedimento que deve ser adotado quando houver alterao nas condies originais da validao que possam afetar os resultados de medio ou para avaliar o desempenho do procedimento analtico ao longo de um perodo, conforme previsto pela Norma NBR/ ISO/IEC 17025, item 5.4.5.2. Dados de srie histrica de controle intralaboratorial, participao em ensaios de proficincia e testes de homogeneidade de materiais tambm podem ser utilizados para revalidar os procedimentos analticos, desde que atendam aos parmetros exatido e preciso. Os parmetros mnimos que devem ser avaliados na revalidao so: veracidade, preciso intermediria, HORRAT, LD, LQ e incerteza de medio do procedimento analtico.
VI.4.7 Calibrao Analtica e Recuperao (Rotina Analtica) Todos os procedimentos adotados na rotina analtica devero ser respaldados pelos estudos de validao do procedimento analtico.
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VI.4.7.1 Frequncia Mnima para Utilizao da Curva de Calibrao na Rotina Analtica Para as micotoxinas, cada batelada de amostras deve ser acompanhada de no menos que uma curva de calibrao com, no mnimo, cinco concentraes, e que pelo menos um ponto da curva de calibrao contemple o LQ.
VI.4.7.2 Determinao da Recuperao na Rotina Analtica Os nveis de fortificao das amostras para determinao das recuperaes das micotoxinas devero estar na faixa da curva de calibrao (e.g. no LR), ou dentro de um nvel de relevncia para as amostras analisadas. Esse nvel de fortificao deve ser alternado ao longo do tempo. Na rotina, amostras com contaminao fora da faixa da curva de calibrao devero ser diludas e reinjetadas. obrigatrio um monitoramento contnuo dos procedimentos analticos e dos resultados das medies obtidos na rotina laboratorial, realizado com o objetivo de decidir se os resultados analticos esto em conformidade com os requisitos estabelecidos, devendo ser empregado para todos os procedimentos analticos utilizados na rotina. Assim, sempre que possvel, em uma batelada contendo diferentes matrizes deve-se avaliar a recuperao de todas as micotoxinas analisadas em pelo menos uma matriz de cada grupo. Recomenda-se plotar as recuperaes obtidas em grficos de controle (cartas de controle) preferencialmente por micotoxinas e grupo de matriz, considerando as faixas de contaminao. Caso seja observada uma tendncia significativa ou sistemtica de desvio de recuperao, procedimentos devem ser adotados no intuito de identificar e corrigir as causas provveis do desvio.
VI.4.7.2.1 Critrios de Aceitao do Desempenho de Recuperao na Rotina Analtica Os critrios de aceitabilidade, em termos de recuperao para os resultados dos controles, devem ser de acordo com aqueles definidos na Tabela 8 e so baseados na normativa EU 401/2006 e em casos especiais nos parmetros obtidos durante a validao dos procedimentos analticos. Se uma tendncia significativa ocorrer na recuperao ou se resultados potencialmente inaceitveis (desvio-padro relativo) maiores que 20% forem obtidos, as causas devem ser investigadas.
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VI.4.8 Preparo de Amostras para Validao de Procedimento Analtico e Anlise de Rotina Para anlise de micotoxinas, o preparo das amostras considerado aspecto crtico do procedimento, pois impacta significativamente nos nveis de contaminao de micotoxinas na amostra, uma vez que a distribuio de micotoxinas nos produtos ocorre de forma heterognea. Portanto, a granulometria e a homogeneidade devem ser observadas, e a totalidade da massa da amostra recebida pelo laboratrio deve ser preparada. A granulometria deve estar entre 20 mesh (0,841mm) e 16 mesh (1,19mm). O laboratrio deve ter procedimentos validados para garantir a homogeneidade e a granulometria apropriada, assegurando dessa forma resultados representativos para a amostra analisada. Se por questes de ajuste das condies de preparo for necessrio descascar a amostra recebida, deve-se garantir que todas as fraes da amostra, incluindo podres, chochos e mofados, sejam mantidas na amostra. As matrizes podem ser classificadas conforme sugestes apresentadas na Tabela 9, sendo este agrupamento feito considerando as caractersticas das amostras, o tipo dos equipamentos que podem ser utilizados e os procedimentos de preparo. A seleo do moinho deve levar em conta a massa a ser preparada, alm das caractersticas fsicas das amostras, tais como: dureza e teor de gordura. Tabela 9 Condies de preparo de amostras considerando grupos caractersticos, sugestes quanto ao tipo de equipamento de moagem e formas de preparo
Classe Tipo de amostras Gros, cereais e leguminosas em geral (inteiros, partidos ou esmagados) Gros, cereais e leguminosas em geral (inteiros, partidos ou esmagados) Pastas, manteigas, frutas secas, desidratadas (figo, tmara, uva passa e banana, dentre outras), nozes, amndoas, amendoim, avels, pistache, castanhas em geral e similares Tipo de equipamentos sugeridos (considerar o tamanho da amostra) Moinhos de rotor e martelo fixos, moedor de caf com funcionamento helicoidal Moinho tipo faca Moinho com rotor tipo moedor de carne, moinho de faca ou lmina com agitao com hlice, mixer ou processador, liquidificador e homogeneizadores Tipos de preparo Seco
Pasta
II
Pasta ou seco Recomenda-se pasta

continua
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III
IV
Farelos, farinhas, coco ralado, caf solvel, caf torrado Homogeneizador mecnico modo, rao, ingredientes ou manual de rao e similares Moinhos tipo: Amostras com casca moedor de caf com funcastanha-do-brasil, avels, cionamento helicoidal e pistache, nozes e amndoas lmina com agitao com e amendoins hlice, moinho de rotor e martelo fixos Homogeneizador mecnico Leite em p ou manual
Seco
Seco ou pasta Recomenda-se pasta Seco
Obs.: Alguns moinhos disponveis no mercado que podem ser utilizados para o preparo de amostras para anlise de micotoxinas: CAF (Modelo: B.22 inox, srie: 12587; 1 CV, 220V), Geiger (Modelo GUM 12; Srie: 3994; motor: 10019 ou Modelo: UM-25E, srie: 9927), Turrax (modelo Marconi, MA -1700/SGS), Retsch (Retsch, Modelo: SM 2000, srie: 1271007041), Marconi (Modelo: MA 090/CF, Moinho de rotor e de martelo fixos, srie: 001438; 1500W, 220V) e Arbel (Modelo: moedor de caf potncia: 1/3 HP, 110/220V, 50/60Hz; 2.75, 220V, srie: 3359).
VI.4.9 Preparo de Solues Padro de Micotoxinas As solues padro de micotoxinas devem ser preparadas e padronizadas de acordo com os procedimentos descritos na AOAC internacional (2005). As solues padro utilizadas na rotina deve ser periodicamente monitoradas por repadronizao, cabendo ao laboratrio definir o perodo para repadronizao das solues padro de micotoxinas. As solues padro devem ser preparadas por injeo de solventes apropriados nos frascos (utilizando-se seringa com agulha) para cada micotoxina, seguindo-se de retirada de fraes das solues concentradas para preparo das solues estoque, evitando dessa forma a abertura dos frascos contendo padro slido e consequente disperso das partculas. As concentraes das solues estoque devem ser calculadas aps determinao das absorbncias das solues por espectrofotometria UV. Antes disso, o espectrofotmetro deve ser avaliado quanto ao seu desempenho por meio de solues do padro primrio de dicromato de potssio, segundo AOAC Internacional, ou pelo uso de padro certificado por organismo nacional de metrologia (National Institute of Standards and Technology NIST; LGC; Instituto Nacional de Metrologia Inmetro ou outros). Para algumas micotoxinas no esto disponveis valores de absortividade. Dessa forma, devem ser preparadas por medio exata das massas seguida de transferncias quantitativas para frascos volumtricos calibrados e aferio criteriosa do volume, utilizando micropipetas ou pipetas calibradas.
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Na Tabela 10 esto apresentados os solventes apropriados para o preparo das solues, assim como os parmetros a serem utilizados na sua padronizao. Tabela 10 Parmetros para Padronizao de Solues de Micotoxinas
Micotoxina Faixa de Massa comp. Molecular de onda (g/mol) (nm) Faixa de conc. ideal (mg/mL) Solvente Indicado Benzeno: Acetonitrila (98:2, v/v) Tolueno: Acetonitrila (9:1, v/v) Metanol Acetonitrila Benzeno: Acetonitrila (98:2, v/v) Tolueno: Acetonitrila (9:1, v/v) Metanol Acetonitrila Benzeno: Acetonitrila (98:2, v/v) Tolueno: Acetonitrila (9:1, v/v) Metanol Acetonitrila Benzeno: Acetonitrila (98:2, v/v) Tolueno: Acetonitrila (9:1, v/v) Metanol Acetonitrila Benzeno: Acetonitrila (9:1, v/v) Acetonitrila Clorofrmio Benzeno:cido Actico (99:1, v/v) Tolueno: cido Actico (99:1, v/v) Benzeno Metanol Metanol Acetonitrila Metanol Etanol Absortiv. Molar () 19800 (350 nm) 19300 (350 nm) 21500 (350 nm) 20700 (350 nm) 20900 (350 nm) 21000 (350 nm) 21400 (350 nm) 22500 (350 nm) 17100 (350 nm) 16400 (350 nm) 17700 (350 nm) 17600 (350 nm) 18200 (350nm) 18300 (350 nm) 19200 (350 nm) 18900 (350 nm) 18000 (350 nm) 19000 (350 nm) 1995 (350 nm) 5550 (330nm) 5440 (333nm) 6060 (317nm) 6000 (314 nm) 13900 (274 nm) 30000 (236 nm) 7040 (219 nm) 6400 (208 nm) 44925 (383 nm) 48000 (388 nm)
Aflatoxina B1 AFLAB1
330-370 312
8-10
Aflatoxina B2 AFLAB2
330-370 314
8-10
Aflatoxina G1 AFLAG1
330-370 328
8-10
Aflatoxina G2 AFLAG2
330-370 330
8-10
Aflatoxina M1 330-370 328 AFLA M1 Ocratoxina A OCRA ou OTA Zearalenona ZON Desoxinivalenol DON Citreoviridina CTV
8-10
300-400 403
40
280-380 318
50
200-400 296,3 200-400 402
50 5
Obs.: O preparo das solues na faixa ideal desejado, mas no podendo ser atendido, dever ser observado no espectro obtido se a altura do pico est aceitvel. Solues de DON em metanol podem sofrer degradao aps 30 dias de preparo (AOAC, 2000; Shepherd e Gilbert, 1988). Soluo padro de AFLA M1 estvel em acetonitrila por aproximadamente um ms (DRAGACCI et al., 2001).
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VI.4.10 Armazenamento de Padres Armazenar os padres slidos e suas solues separadamente das amostras ou extratos de amostras, em frascos para padro mbar ou frascos protegidos da luz por papel alumnio, vedados com parafilme, sob temperatura de congelamento (< -15 C).
VI.4.11 Critrios de Aceitabilidade das Solues Padro de Micotoxinas Recomenda-se que a diferena entre as concentraes determinadas na padronizao anterior e a atual seja < 3% As solues padro de micotoxinas devem ser descartadas quando observadas alteraes indicativas de deteriorao como: turbidez, separao entre as fases e alterao de cor, entre outras. A avaliao da pureza ou possvel degradao das solues padro pode ser realizada por tcnicas de cromatografia em camada delgada e/ou cromatografia lquida.
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ANOTAES
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ANEXOS
ANEXO I
Clculos da Estimativa dos Parmetros da Regresso pelo Mtodo dos Mnimos Quadrados Ordinrios (MMQO)
Construir a curva de calibrao (de calibrao) fazendo o grfico de todas as Ny leituras versus os I nveis de concentrao. Dessa forma haver no mnimo seis valores de respostas instrumentais (pontos) para cada nvel de concentrao. Estimar os parmetros de regresso: o coeficiente angular (b) e o coeficiente linear (a), pelo Mtodo dos Mnimos Quadrados Ordinrios (MMQO), conforme mostrado a seguir. Modelo da Reta de Calibrao: Onde: Yijl =varivel dependente: a resposta instrumental da l-sima leitura da j-sima preparao do i-simo nvel de concentrao das solues de calibrao. a varivel resposta na terminologia da ISO 11843; =intercepto ou interseo; b=inclinao; Xi = varivel independente: a concentrao do analito, do i-simo nvel de concentrao. a varivel lquida de estado na terminologia da ISO 11843; eijl=resduos aleatrios da regresso da l-sima leitura da j-sima preparao do i-simo nvel de concentrao das solues de calibrao. Equao de Regresso Linear de Primeiro Grau, Reta: Onde: i = (varivel dependente) a resposta instrumental estimada (calculada) pela equao de regresso no i-simo nvel de concentrao; (A.I.2) (A.I.1)
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a = estimativa de MMQO da interseo a; b = estimativa e MMQO da inclinao b; xi = (varivel independente) so as concentraes conhecidas do analito nas solues padro de calibrao em cada nvel de concentrao.
Procede-se estimao da inclinao (b) ou coeficiente angular, da interseo (a) ou intercepto ou coeficiente linear e das somas quadrticas (S): (A.I.3) Onde: (A.I.4)
(A.I.5)
(A.I.6)
(A.I.7)
(A.I.8)
Sendo:
(A.I.9)
xi = concentrao conhecida do analito em cada i-simo nvel de concentrao da soluo padro de calibrao; yijl=resposta instrumental medida da l-sima replicata de reinjeo da j-sima preparao da i-sima concentrao; I=nmero de nveis de concentrao da curva de calibrao; J=nmero de repeties de preparo independentes de cada nvel de concentrao;
128
L = nmero de replicatas de reinjeo ou de leituras ou indicaes de respostas instrumentais de cada j-sima preparao da i-sima concentrao; Nx=nmero total de nveis independentes de concentrao da curva de calibrao dado por Nx = IJ, para um planejamento balanceado, quando todos os nveis de concentrao so preparados com igual nmero J de rplicas. Porm, se cada nvel de concentrao tiver um nmero Ji diferente de replicatas de preparao, o que no desejvel, ento . Valor mdio dos I nveis de concentrao da curva de calibrao. Valor mdio de todas as Nx L respostas instrumentais. Valor mdio das respostas instrumentais das L replicatas de leituras da j-sima preparao da i-sima concentrao da curva de calibrao.
As varincias, ou os quadrados dos desvios padro s2 do intercepto e da inclinao, assim como a covarincia, cov (a, b) entre eles so dadas por:
(A.I.10)
(A.I.11)
(A.I.12) O resduo de regresso (eijl) para cada uma das Ny respostas instrumentais : Varincia residual do ajuste : (A.I.13)
(A.I.14)
129
ANOTAES
130
ANEXO II
Qualidade do Ajuste e Verificao da Homoscedasticidade ou Heterocedasticidade da Resposta Instrumental na Regresso pelo MMQO
Calcular os Ny resduos eyijl a partir da equao de regresso, usando a eq.(A.I.13). Construir o grfico de disperso dos resduos da regresso em funo da concentrao para avaliar a qualidade do ajuste, i.e.: a linearidade e a homogeneidade das varincias (homoscedasticidade). Se a distribuio dos resduos for aleatria, segundo a Figura A. II.1(a) a seguir, apresentando envoltrio retangular (retas paralelas), considerar que h homogeneidade das varincias e o Mtodo dos Mnimos Quadrados Ordinrios (MMQO) pode ser de fato aplicado. Se a distribuio dos resduos apresentar envoltrias na forma de um cone crescente, como na FiguraA.II.1(b) (retas oblquas), ou decrescente (outras formas de envoltrias que no retangular so possveis), considerar que no h homogeneidade das varincia, i.e., heterocedasticidade das varincias e, neste caso, o Mtodo dos Mnimos Quadrados Ponderados (MMQP) deve ser aplicado. Para testar a homoscedasticidade, um simples teste F pode ser feito [33]. Trata-se de um teste F comparando a maior varincia (quadrado do desvio-padro) das respostas instrumentais ou dos resduos dos nveis de calibrao com a menor delas. Esse teste mais exigente que o teste de Cochran e o Hartley, ao qual se assemelha. Teste F para a homoscedasticidade. Calcula-se os desvios padro syi das respostas instrumentais independentes em cada i-simo nvel de calibrao pela equao:
(A.II.1)
Onde: Os valores mdios que aparecem na equao citada so calculados de acordo com as equaes eq.(A.I.8) e eq.(A.VI.7). Se o grfico dos desvios-padro syi em funo das concentraes dos padres de calibrao
131
indicar algum comportamento sistemtico (crescimento ou decrescimento), ento os dados so heterocedticos. A FiguraA.II.2 apresenta esse grfico para os dados da TabelaA.II.1. Usando a maior varincia e a menor varincia, calcular a estatstica discriminante:
(A.II.2) Ao mesmo tempo obtm-se, de uma tabela de teste F, o valor tabelado de Fh,crit,a,n1,n2 com n1 = Ji,max 1 graus de liberdade no numerador e n2 = Ji,min 1 graus de liberdade no denominador, Ji,max e Ji,min so, respectivamente, o nmero de reinjees do nvel de calibrao com a maior e menor varincias. Adotar um nvel de confiana de 95%. Se Fh,calc for menor que Fh,crit,a,n1,n2, as varincias podem ser consideradas iguais. Nesse caso, considera-se que as respostas instrumentais so homoscedsticas e que o MMQO pode ser usado para obter os parmetros de regresso da curva de calibrao. Nota: O teste F aplicado aqui no um teste mltiplo para a homoscedasticidade de varincias, por isso mais rigoroso. Ele foi preferido em detrimento aos testes mltiplos de Hartley [7,29,34], de Cochran [7,25,34] e Leven-Brown-Forsythe [34], por ser de mais fcil execuo e usar a tabela de pontos percentuais da funo densidade de probabilidade de Fisher-Snedecor, que facilmente encontrada em qualquer livro de estatstica e no Excel. O teste de Cochram recomendado pela ISO 5725-2 [26]. Exemplo: A Tabela A.II.1 mostra os dados de absorvncia para a anlise de Cd por espectroscopia de absoro atmica, encontrados no exemplo A.5 do Guia Eurachem de clculo de incerteza [16]. Estatstica discriminante Fh,calc = F do teste F:
Fh,crit,0,05,2,2 = 19,00 [7,19, 29, 30,31,32]. Como o valor da estatstica discriminante maior que seu valor crtico no nvel de significncia de 5% (nvel de confiana de 95%), conclui-se por rejeitar a hiptese nula da homoscedasticidade. Logo, os dados de calibrao so heterocedsticos. Estatstica discriminante FH,calc = r do teste de Hartley ou teste de F mximo:
132
(A.II.3)
FH,crit,0,05,2,5 = 202 [7]. Como o valor da estatstica discriminante maior que seu valor crtico no nvel de significncia de 5% (nvel de confiana de 95%), conclui-se por rejeitar a hiptese nula da homoscedasticidade. Logo, os dados de calibrao so heterocedsticos. Estatstica discriminante FC, calc = C do teste de Cochran ou teste de F mximo:
(A.II.4)
FC,crit,0,05,2,5 = 0,684 [7,26,29,31]. Como o valor da estatstica discriminante maior que seu valor crtico no nvel de significncia de 5% (nvel de confiana de 95%), conclui-se por rejeitar a hiptese nula da homoscedasticidade. Logo, os dados de calibrao so heterocedsticos. Para se calcular a estatstica discriminante FL,calc = tL,calc do teste de Levene-Brown-Forsythe ou teste de Levene modificado [34], os dados dos resduos ei,j de regresso pelo MMQO de cada resposta experimental replicada so calculados e divididos em dois grupos (Grupo 1 e Grupo2), com aproximadamente o mesmo nmero de dados cada um, nG1@nG2. As rplicas de um mesmo nvel de concentrao no podem ser separadas em grupos diferentes. Quando o nmero de nveis de concentrao mpar, exclui-se dos clculos o nvel de concentrao i-simo nvel central (i= I/2+1), so obtidas as medianas Med1 e Med2 de cada grupo de resduos. Calcula-se ento o valor absoluto dos desvios di,j,1 e di,j,2 de cada resduo ei,j em relao mediana de seu grupo. Obtm-se as mdias dm,1 e dm,2 e as somas de quadrados dos desvios SQd1 e SQd2 de cada um dos dois grupos. Finalmente, calcula-se a varincia agrupada s 2 e a estattica t p de Levene tL,calc:
Onde: e
(A.II.5)
(A.II.6)
133
e (A.II.7)
e (A.II.8)
(A.II.9)
Os clculos para o teste t de homoscedasticidade de Levene-BrownForsythe dos dados de calibrao da TabelaA.II.1 so mostrados na TabelaA.II.2. O valor de tL maior que o valor de tcrit,a,nG1+nG2-2=tcrit;0,05;10= 2,2281 para o nvel de confiana de 95% e grau de liberdade 10, indicando, surpreendentemente e ao contrrio dos trs testes anteriores, em que os desvios-padro das respostas instrumentais so homocedsticos. O teste t de Levene-Brown-Forsythe pouco exigente quanto heterocedasticidade dos dados, tendendo a indicar, como no exemplo supracitado, homoscedasticidade, mesmo quando vrias outras evidncias indicam o contrrio. Por esse motivo, preferimos o uso de um dos trs testes: Fh eq.(A.II.2) ou FH eq.(A.II.3) ou FC eq.(A.II.4), acima ao teste t de Levene-Brown-Forsythe eq.(A.II.5). Recomendamos que quando ocorrer uma divergncia de concluses, como a desse exemplo entre o teste t de Levene-Brown-Forsythe e algum dos outros trs testes, que se d preferncia concluso desses ltimos e se proceda a um ajuste pelo MMQP, visto que ele mais geral e inclui o MMQO. Tabela A.II.1 Dados da Calibrao de um EAA para anlise de Cd obtidos do Guia Eurachem de clculo de Incerteza [16]
i 1 j 1 2 3 xi = ci 0,1 0,1 0,1 yi = resp inst 0,028 0,029 0,029 s(yi) 0,00057735 s2(yi) 3,3333E-07
continua
134
i 2
j 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 j
xi = ci 0,3 0,3 0,3 0,5 0,5 0,5 0,7 0,7 0,7 0,9 0,9 0,9 xi = ci
5 i
yi = resp inst 0,084 0,083 0,081 0,135 0,131 0,133 0,18 0,181 0,183 0,215 0,23 0,216 yi = resp inst
s(yi) 0,001527525
s2(yi) 2,3333E-06
0,002
4,0000E-06
0,001527525
2,3333E-06
0,008386497
7,0333E-05
s(yi)
s2(yi)
Figura A.II.1 Grfico de disperso dos resduos de ajuste eyijl das respostas instrumentais yijl calculados pela eq.(A13) em funo da concentrao (ou em funo do valor calculado da resposta instrumental como mostrado no eixo x dos grficos anteriores)
Fonte: Adaptado da Figura 5.15 de Miller e Miller (2005) [30].
135
Notas: (a) resduos aleatoriamente dispersos ao redor de zero, indicando um ajuste satisfatrio e a homoscedasticidade das respostas instrumentais. (b) resduos crescentes (ou decrescentes) com a concentrao, forma de cone, indicando heterocedasticidade da resposta instrumental e exigindo o ajuste pelo MMQP. (c) Resduos apresentando uma tendncia decrescente (crescente) e em seguida crescente (decrescente), forma de U ou de U invertido, indicando falta de ajuste ou de linearidade (i.e. curva de calibrao no retilnea) na faixa de calibrao. Nesses casos, a curva de calibrao pode ser ajustada por um polinmio de ordem superior a um, ou alternativamente reduz-se a faixa de concentrao da calibrao. (d) Disperso aleatria satisfatria dos pontos, exceto pelo sexto ponto, que deve ser um valor aberrante, duvidoso (outlier).
Figura A.II.2 Grfico dos desvios-padro das respostas replicadas em cada nvel de concentrao em funo da concentrao das solues padro de calibrao
Desvios-padro das respostas instrumentais em cada nvel de concentrao 0,009 0,008 0,007 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Concentrao dos padres de calibrao / mg/L
O comportamento funcional, em geral crescente, dos desvios-padro indica a existncia de heterocedasticidade. Particularmente, o ltimo ponto de calibrao apresenta um desvio-padro surpreendentemente alto em relao aos demais pontos de calibrao. TabelaA.II.2 Clculos envolvidos no teste t de homoscedasticidade de Levene-Brown-Forsyte para os dados da curva de calibrao apresentada na TabelaAII.1.
xi 0,1 0,1 0,1 0,3 0,3 0,3 0,5 0,5 0,5 yi,j 0,028 0,029 0,029 0,084 0,083 0,081 0,135 0,131 0,133 yi,j,calc 0,0328 0,0328 0,0328 0,081 0,081 0,081 0,1292 0,1292 0,1292 ei,j -0,0048 -0,0038 -0,0038 0,003 0,002 0 0,0058 0,0018 0,0038 Med -0,0019 di,j 0,0029 0,0019 0,0019 0,0049 0,0039 0,0019 dm 0,0029 SQd 5,846E-05
continua
136
0,7 0,7 0,7 0,9 0,9 0,9
0,18 0,181 0,183 0,215 0,23 0,216
0,1774 0,1774 0,1774 0,2256 0,2256 0,2256
0,0026 0,0036 0,0056 -0,0106 0,0044 -0,0096
0,0031
0,0005 0,0005 0,0025 0,0137 0,0013 0,0127
0,0052
0,00035742
Os dois grupos de resduos usados para calcular a estatstica discriminante do teste-t de homoscedasticidade de Levene-Brown-Forsyte so marcados pelos sombreados superiores e inferiores. Os dados do nvel de concentrao 0,5 foram excludos dos clculos. A varincia agrupada : (sp)2=(5,846 105 + 3,5742 105) = 4,1588 104. A estatstica t de Levene-Brown-Forsythe: tL,calc = |0,0029 0,0052| / [4,1588 104 (1/6 + 1/6)] = 0,0023/1,1774 104 = 0,1953.
137
ANOTAES
138
ANEXO III
Avaliao dos Pontos Duvidosos, Aberrantes, Extremos (outliers) e Critrios de Aceitao para a Linearidade no MMQO
Avaliar os pontos duvidosos, aberrantes, extremos (outliers) da curva de calibrao (de calibrao) calculando-se a estatstica tyijl,calc:
(A.III.1) Onde: eyijl = resduoijl = yijlmedido yicalculado dado pela eq.(A.I.13); sres,yi = desvio-padro amostral dos resduos das respostas instrumentais do i-simo nvel de concentrao calculado pela eq. (A.III.2), usando os valores de i calculados pela eq.(A.I.2) do ajuste de MMQO. Seu valor diferente, mas prximo daquele calculado na eq.(A.I.14):
(A.III.2) Se o valor de tyijl,calc para um ponto duvidoso de uma curva de calibrao for menor ou igual ao valor de t crtico tabelado, tcrit, bilateral, para nvel de confiana igual a 95% e (JL 1) graus de liberdade, considera-se que o ponto pertence curva e a faixa at ele linear. Calcular o coeficiente de correlao linear (r) pelo mtodo dos mnimos quadrados ordinrios:
(A.III.3)
139
(A.III.4) Critrio de aceitao para linearidade (caso das varincias homogneas ou homoscedasticidade). Calcular a estatstica tr:
(A.III.5)
Se o valor de tr para a regresso da curva de calibrao (de calibrao) for maior ou igual ao valor de t crtico (tabelado) bilateral, para nvel de confiana igual a 95% e (Nx 2) graus de liberdade, considera-se que a faixa linear, i.e. rejeita-se a hiptese nula H0: r = 0 de que no h correlao entre x e y.
140
ANEXO IV
Avaliao da Incerteza de Previso da Concentrao do Analito na Curva de Calibrao Clculo de Incerteza de Calibrao no MMQO
A incerteza padro da concentrao do analito obtida da interpolao na curva de calibrao u (x*) dada pelas equaes eq.(A.IV.1a) ou eq.(A.IV.1b) ou eq.(A.IV.1c), que so equivalentes entre si. A incerteza u (x*) no a incerteza da concentrao do analito na amostra de ensaio, pois ela no leva em considerao as demais fontes de incerteza do procedimento analtico. A incerteza u (x*) dada pelas equaes eq.(A.IV.1a) ou eq.(A.IV.1b) ou eq.(A.IV.1c) apenas a incerteza devido curva de calibrao, e um dos componentes da incerteza padro da concentrao do analito na amostra.
(A.IV.1a)
(A.IV.1b)
Onde:
(A.IV.1c)
x* = C* = concentrao do analito na soluo injetada no instrumento de medio analtica, obtida por interpolao ou extrapolao na curva de calibrao. K = nmero de replicatas verdadeiras de reanlise de alquotas de anlise da mesma amostra de ensaio. Cada alquota de anlise passa por todas as etapas do procedimento analtico, desde a etapa inicial de abertura ou extrao ou digesto etc. at produzir a soluo que ser injetada uma ou mais vezes no instrumento de medio analtica. L = nmero de reinjees das solues de cada alquota de anlise no instrumento de medio analtica.
141
y* = RI* = resposta instrumental mdia das K reinjees no instrumento de medio analtica das solues obtidas das reanlises das K alquotas de anlise da mesma amostra de anlise. s2(y*) = s2res,y = desvio-padro da resposta instrumental para a soluo da amostra injetada no instrumento de medio analtica. No caso do MMQO, como a repetitividade das respostas instrumentais so homoscedsticas, usa-se a varincia residual s2res,y, calculada pela eq.(A.I.14) para estimar s2(y*), i.e. s2(y*) = s2res,y.
142
ANEXO V
Planilhas de Clculos no Excel validado
Para se fazer os clculos do MMQO utilizando as equaes eq.(A.I.3) a eq.(A.III.5) recomendvel a construo de uma planilha de clculo eletrnica com a estrutura mostrada na planilha Excel do arquivo MMQO e MMQPR do Manual de Validao CGAL Mapa. Para facilitar a construo da planilha de clculo vale salientar as seguintes identidades:
(A.V.1)
(A.V.2)
(A.V.3)
(A.V.4)
(A.V.5)
143
ANOTAES
144
ANEXO VI
Clculo da Estimativa dos Parmetros da Regresso pelo Mtodo dos Mnimos Quadrados Ponderados (MMQP)
O ajuste da reta de calibrao pelo Mtodo dos Mnimos Quadrados Ponderados (MMQP) deve ser feito nos casos em que a resposta instrumental heterocedstica na faixa de calibrao, i.e., repetitividades diferentes, desvios-padro estatisticamente diferentes, nos diversos nveis de concentrao das solues de calibrao. Existem duas abordagens de MMQP: a absoluta, MMQPA, e a relativa, MMQPR. Usaremos neste Manual o MMQPR para evitar problemas com a representao numrica computacional de nmeros grandes, como pode ocorrer em mtodos analticos cromatogrficos. O modelo linear dado pela eq.(A.I.1) assim como as definies associadas a essa equao continuam valendo no MMQP. Para enfatizar a diferena entre os parmetros ajustados pelo MMQO daqueles obtidos pelo MMQP, a equao regresso dada pela eq.(A.I.2) reescrita como: (A.VI.1) Onde: i=varivel dependente: a resposta instrumental estimada (calculada) pela equao de regresso do MMQP no i-simo nvel concentrao. aw=estimativa de MMQP da interseo a. bw=estimativa da inclinao b. xi=varivel independente: so as concentraes conhecidas do analito nas solues padro de calibrao em cada nvel de concentrao.
Procede-se estimao da inclinao (bw) ou coeficiente angular, da interseo (aw) ou intercepto ou coeficiente linear e das somas quadrticas (Sw) para o caso do MMQP:
145
(A.VI.2)
(A.VI.3) Onde:
(A.VI.4) de um dado nvel de Todas as respostas instrumentais mdias concentrao tm o mesmo peso wi, que usado para as J respostas instrumentais mdias de cada nvel. A constante knorm de normalizao da eq.(A.VI.4) no MMQPA knorm = 1. No MMQPR podemos usar qualquer outro valor knorm constante para normalizar os pesos. Usaremos como valor de knorm a mdia das varincias das respostas instrumentais dos I nveis de concentrao da curva de calibrao, conforme definido na eq.(A.VI.5):
(A.VI.5)
(A.VI.6)
146
(A.VI.7)
(A.VI.8)
(A.VI.9)
(A.VI.10)
O denominador na eq.(A.VI.2) e na eq.(A.VI.3) o Sxxw definido na eq. (A.VI.10).
(A.VI.11)
(A.VI.12)
As varincias ou os quadrados dos desvios-padro s2, do intercepto e da inclinao, assim como a covarincia, cov(aw,bw) entre eles so dadas por:
(A.VI.13)
147
(A.VI.14)
(A.VI.15)
O resduo de regresso (eyijl) para cada uma das Ny respostas instrumentais : (A.VI.16) A varincia residual do ajuste obtida dos resduos dados pela eq.(A.VI.16) no tem nenhum significado no MMQP. Define-se tambm o resduo ponderado eyijlw como: (A.VI.17)
A varincia residual do ajuste obtida dos resduos dados pela eq.(A. VI.17) representa a varincia do ponto de peso unitrio, que raramente faz parte dos valores experimentais.
148
ANEXO VII
Qualidade do Ajuste e Verificao da Heterocedasticidade da Resposta Instrumental na Regresso pelo MMQP
Calcular os Ny resduos normalizados (ou padronizados ou reduzidos) eyijl,norm a partir da regresso ponderada, usando a eq.(A.VII.1). Esses resduos normalizados so na verdade estatsticas t de Student.
(A.VII.1)
Construir o grfico de disperso dos resduos normalizados da regresso em funo da concentrao para comprovar a no homogeneidade das varincias (heterocedasticidade). Se a distribuio dos resduos normalizados for aleatria, segundo a FiguraA.II.1(a), apresentando envoltrio retangular retas paralelas na FiguraA.II.1(a) comprova-se que no h homogeneidade das varincias, i.e., heterocedasticidade, e o Mtodo dos Mnimos Quadrados Ponderados (MMQP) deve ser, de fato, aplicado. Se a distribuio dos resduos normalizados apresentar envoltrias na forma de um cone crescente, como na FiguraA.II.1(b) (retas oblquas) ou decrescente (outras formas de envoltrias que no a retangular so possveis), conclui-se que a heterocedasticidade (os desvios-padro si de cada nvel de concentrao) no foi adequadamente estimada a partir dos dados de calibrao disponveis. Nesse caso devemos aumentar o nmero J de replicatas de repreparo das solues de calibrao. Se o problema persistir, refazer toda a curva de calibrao. Formas em U ou em U invertido indicam falta de ajuste ou de linearidade (i.e., curva de calibrao no retilnea) na faixa de calibrao. Nesses casos, a curva de calibrao pode ser ajustada por um polinmio de ordem superior a um, usando o MMQP, ou alternativamente reduz-se a faixa de concentrao da calibrao.
149
ANOTAES
150
ANEXO VIII
Avaliao dos Pontos Duvidosos, Aberrantes, Extremos (outliers) e Critrios de Aceitao para a Linearidade no MMQP
Avaliar os pontos duvidosos, aberrantes, extremos (outliers) da curva de calibrao (de calibrao) por meio da estatstica:
Onde:
(A.VIII.1)
eijl = yijlmedido yicalculado. Notar que no o resduo ponderado definido na eq.(A.VI.17) e sim o da eq.(A.VI.16). Sres,yi = desvio-padro amostral das respostas instrumentais do i-simo nvel de concentrao calculado pela eq.(A.III.2), mas agora usando os valores de i calculados pela eq.(A.VI.1) do ajuste de MMQP. Seu valor diferente, mas prximo daquele calculado pela eq.(A.VI.6):
(A.VIII.2)
Se o valor de tyijl,calc para um ponto duvidoso de uma curva de calibrao for menor ou igual ao valor de t crtico tabelado, tcrit, bilateral, para nvel de confiana igual a 95% e (JL 1) graus de liberdade, considera-se que o ponto pertence curva e a faixa at ele linear. Calcular o coeficiente de correlao linear (rw) pelo mtodo dos mnimos quadrados ponderado:
151
(A.VIII.3) Onde:
(A.VIII.4)
Critrio de aceitao para linearidade (caso das varincias heterogneas ou heterocedasticidade). Calcular a estatstica trw:
(A.VIII.5)
Se o valor de trw para a regresso da curva de calibrao for maior ou igual ao valor de t crtico (tabelado) bilateral, para nvel de confiana igual a 95% e (Nx 2) graus de liberdade, considera-se que a faixa linear, i.e., rejeita-se a hiptese nula H0: rw = 0 de que no h correlao entre x e y.
152
ANEXO IX
Avaliao da Incerteza de Previso da Concentrao do Analito na Curva de Calibrao, Clculo de Incerteza de Calibrao no MMQP
A incerteza padro da concentrao do analito obtida da interpolao na curva de calibrao u (x*) dada pelas equaes eq.(A.IX.1a) ou eq.(A.IX.1b) ou eq.(A.IX.1c), que so equivalentes entre elas. A incerteza u (x*) no a incerteza da concentrao do analito na amostra de ensaio, pois ela no leva em considerao as demais fontes de incerteza do procedimento analtico. A incerteza u (x*) dada pelas equaes eq.(A.IX.1a) ou eq.(A.IX.1b) ou eq.(A.IX.1c) apenas a incerteza devido curva de calibrao e um dos componentes da incerteza padro da concentrao do analito na amostra.
(A.IX.1a)
(A.IX.1b)
(A.IX.1c) Onde:
(A.IX.2)
o peso da resposta instrumental obtida para a soluo da amostra de ensaio cujo desvio-padro amostral sy*=s(y*).
153
A constante de normalizao knorm definida pela eq.(A.VI.5) e que aparece nas equaes eq.(A.VI.13), eq.(A.VI.14), eq.(A.VI.15), eq.(A.IX1b) e eq.(A.IX.1c) deve ser substituda pelo valor unitrio (1) quando se usar as equaes, apresentadas anteriormente, no MMQPA. A no observncia dessa nota causa de erro em alguns softwares comerciais e em bibliografias de estatstica para a qumica. A ttulo de exemplo, a equao (2.18) em Meier e Zund (2000, p. 98); a equao (5.17) em Miller e Miller (2005, p. 151); e a equao (8.28) em Massart et al. (1997, p. 200) so diferentes entre si e no resultam em valor igual ao dado pela eq.(A.IX.1a). As equaes dessas referncias tambm so diferentes da eq.(A.IX.1b) e da eq.(A.IX.1c) citadas anteriormente, que com knorm = 1 so idnticas equao (21) em Cetama (1986, p. 361).
154
ANEXO X
Glossrio: Definies, Vocbulos, Termos, Siglas e Abreviaes
Neste documento so adotadas preferencialmente as definies dos termos e vocbulos empregadas no Vocabulrio Internacional de Metrologia (VIM) [22,28]. So tambm adotadas as definies do Codex Alimentarius [9] presentes no documento Guidelines on Analytical Terminology CAC/GL 72-2009, que por sua vez adota as definies do VIM. Finalmente, so relatadas definies do livro Analytical Chemistry, Theoretical and Metrological Fundamentals de Kaus Danzer2007 [47], do Guia Eurachem1998 The Fitness for Purpose of the Analytical Measurement [15], do Orange Book da IUPAC [45] e de algumas normas ISO. Acurcia ou exatido:Grau de concordncia entre um valor medido e um valor verdadeiro de um mensurando [21]. Grau de concordncia entre o resultado de um ensaio e o valor de referncia aceito. A acurcia determinada pela veracidade (trueness) e preciso.
Adequado ao propsito (fit for purpose), ou adequao ao propsito (fitness for purpose), ou adequado ao propsito de uso, ou adequado ao uso pretendido:Grau com o qual o resultado de um procedimento de medio permite ao usurio tomar uma deciso tecnicamente e administrativamente correta para um dado propsito (seo 18.6.1 do IUPAC Orange Book [45] e [36]. Um processo formal de avaliar que um procedimento adequado para dada aplicao [33].
Alquota de ensaio ou alquota analtica:A quantidade de material (usualmente homogeneizado) tomada da amostra de ensaio ou amostra analtica e sobre a qual a anlise realizada. Uma subamostra representativa da amostra de ensaio, ou seja, a alquota que ser analisada. Amostras de Controle de Qualidade (ACQ):So amostras de matrizes brancas adicionadas com o analito, em trs concentraes: baixa (0,5 vezes o LMR), mdia (1,0 vezes o LMR) e alta (1,5 vezes o LMR). No caso de substncia proibida com o LMDR estabelecido, ou seu equivalente, os controles de baixa devem ter concentrao igual zero, os controles de mdia devem ter concentrao igual ao limite de deteco do mtodo e os controles de alta devem ter concentrao igual ao Limite Mnimo de Desempenho Requerido. As ACQ so usadas para monitorar o desempenho de anlises qumicas e para avaliar integridade, validade e confiabilidade dos resultados.
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Amostra de laboratrio ou amostra laboratorial:Amostra enviada para e recebida pelo laboratrio. Amostra de ensaio ou amostra analtica:Amostra preparada a partir da amostra de laboratrio, da qual so retiradas as alquotas ou pores de ensaio ou as alquotas ou pores analticas. Amostra laboratorial depois da remoo de quaisquer partes que no sero analisadas, e.g. ossos, solo aderido. Pode ser ou no cominuda e misturada antes de se retirar as alquotas de ensaio, de acordo com a necessidade ou o propsito do ensaio. Analito: A espcie qumica, substncia, que ser identificada e/ou cuja concentrao (ou massa) ser determinada em uma amostra de ensaio. Analito representativo:Analito escolhido, de acordo com as sua caractersticas e propriedades fsico-qumicas, para representar um grupo de analitos susceptveis de serem semelhantes quanto ao seu comportamento analtico, sob determinado procedimento analtico multirresduos. Calibrao: Operao que estabelece, numa primeira etapa e sob condies especificadas, uma relao entre os valores e as incertezas de medio fornecidas por padres e as indicaes correspondentes com as incertezas associadas; numa segunda etapa, utiliza esta informao para estabelecer uma relao visando obteno de um resultado de medio a partir de uma indicao [22,28].
Nota1: Uma calibrao pode ser expressa por meio de uma declarao, uma funo de calibrao, um diagrama de calibrao, uma curva de calibrao ou uma tabela de calibrao. Em alguns casos, pode consistir de uma correo aditiva ou multiplicativa da indicao com uma incerteza de medio associada. Nota2: Convm no confundir a calibrao com o ajuste de um sistema de medio, frequentemente denominado de maneira imprpria de autocalibrao, nem com a verificao da calibrao. Nota3: Frequentemente, apenas a primeira etapa na definio acima entendida como sendo calibrao.
Capacidade de Deteco (CC): o teor mais baixo que pode ser detectado, identificado e/ou quantificado numa amostra com uma probabilidade de erro . Chemical Abstracts Service (CAS):Servio de Resumos Qumicos. Comparao Interlaboratorial (CI) ou Ensaios Interlaboratoriais (EI): Organizao, realizao e avaliao de ensaios ou medies de um mesmo item ou itens similares por dois ou mais laboratrios de acordo com condies predeterminadas [ISO 13528:2005].
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Condio de preciso intermediria:Condio de medio num conjunto de condies, as quais compreendem o mesmo procedimento de medio, o mesmo local e medies repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares, ao longo de um perodo extenso de tempo, mas pode incluir outras condies que envolvam mudanas. Nota 1: As condies que podem variar compreendem novas calibraes, padres, operadores e sistemas de medio.
Nota 2: conveniente que uma especificao referente s condies contenha, na medida do possvel, as condies que mudaram e as que no.
Nota 3: Em qumica, o termo condio de preciso interserial (intercorrida, interbatelada) , algumas vezes, utilizado para designar este conceito. Condio de repetitividade:Condio de medio num conjunto de condies, as quais compreendem o mesmo procedimento de medio, os mesmos operadores, o mesmo sistema de medio, as mesmas condies de operao e o mesmo local, assim como medies repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares durante um curto perodo de tempo.
Nota 1: Uma condio de medio uma condio de repetitividade apenas com respeito a um conjunto especificado de condies de repetitividade. Nota 2: Em qumica, o termo condio de preciso intrasserial (intracorrida, intrabatelada) , algumas vezes, utilizado para designar este conceito. Condio de reprodutibilidade:Condio de medio num conjunto de condies, as quais compreendem diferentes locais, diferentes operadores, diferentes sistemas de medio e medies repetidas no mesmo objeto ou em objetos similares.
Nota 1: Os diferentes sistemas de medio podem utilizar procedimentos de medio diferentes.
Nota 2: Na medida do possvel, conveniente que sejam especificadas as condies que mudaram e as que no mudaram. Controle de Qualidade (CQ):Conjunto de atividades do sistema de gesto da qualidade focado em demonstrar que os requisitos de qualidade so atendidos. constitudo do conjunto de atividades planejadas para monitorar, verificar e controlar a qualidade dos resultados analticos, tais como: a anlise de amostra branca, ou de amostra de controle, ou de material de referncia certificado, a elaborao de cartas de controle e a participao em avaliaes externas de qualidade, como os ensaios interlaboratoriais colaborativos e de proficincia. Controle de Qualidade Interno (CQI):Conjunto de aes que um laboratrio de qumica analtica pode utilizar para assegurar que os resultados produzidos esto adequados finalidade proposta. Na prtica, a adequao ao propsito determinada por uma comparao entre a exatido obtida
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no laboratrio, em tempo determinado, com o nvel de exatido requerido. O CQI, portanto, inclui procedimentos prticos de rotina que possibilitam ao analista aceitar um resultado ou grupos de resultados como adequados ao propsito ou rejeitar os resultados e repetir as anlises. Curva de calibrao:Expresso da relao entre uma indicao e o valor medido correspondente [22,28].
Nota 1: Uma curva de calibrao expressa uma relao biunvoca que no fornece um resultado de medio, pois ela no contm informao a respeito da incerteza de medio. Nota 2: O termo curva analtica muitas vezes usado como sinnimo de curva de calibrao.
Curva de Calibrao de Analito em Solvente (CCAS): Curva de calibrao, sem ajuste de matriz ou no matrizada, de um instrumento de medio obtida a partir de solues padro de calibrao, preparadas pela dissoluo do analito puro em um solvente puro. Curva de Calibrao de Extrato de Matriz Branca Fortificado com o Analito (CCEMBF): Curva de calibrao, com ajuste de matriz ou matrizada, de um instrumento de medio obtida a partir de solues padro de calibrao, preparadas por meio da fortificao do extrato/digerido/soluo de abertura de uma matriz branca da amostra a analisar com o analito puro. A obteno do extrato (no fortificado) de matriz branca deve ser feita com uma massa de matriz branca igual massa de amostra a analisar e para volume igual ao obtido na extrao de amostras a analisar. Diluies de uma soluo de calibrao obtida dessa forma devem ser feitas com o extrato no fortificado de matriz branca. Curva de Calibrao de Matriz Branca Fortificada com o Analito (CCMBF): Curva de calibrao, com ajuste de matriz ou matrizada, de um instrumento de medio obtida a partir de solues padro de calibrao preparadas por meio da fortificao da matriz branca da amostra a analisar com o analito puro, seguida da extrao/digesto/abertura, de forma a obter um volume fixo de soluo. Diluies de uma soluo de calibrao obtida dessa forma devem ser feitas com o extrato no fortificado de matriz branca. Curva de Calibrao Matrizada (CCM) ou Curva de Calibrao com Ajuste de Matriz: a curva de calibrao ou caracterstica de resposta construda a partir da matriz branca fortificada, do extrato de matriz branca fortificado, ou do material de referncia certificado, ou do extrato do material de referncia certificado. DCB: Denominao Comum Brasileira DCI: Denominao Comum Internacional
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Desvio-Padro Relativo de Repetitividade (DPRr), Repeatability Relative Standard Deviation (RSDr), ou Coeficiente de Variao de Repetitividade (CVr):Desvio-padro relativo calculado de resultados gerados sob condies de repetitividade:
Desvio-Padro Relativo de Reprodutibilidade (DPRR), Reproducibility Relative Standard Deviation (RSDR) ou Coeficiente de Variao de Reprodutibilidade (CVR):Desvio-padro relativo calculado de resultados gerados sob condies de reprodutibilidade:
Desvio-Padro de Repetitividade (sr):Desvio-padro amostral (experimental) calculado de resultados gerados sob condies de repetitividade. Desvio-Padro de Reprodutibilidade (sR):Desvio-padro amostral (experimental) calculado de resultados gerados sob condies de reprodutibilidade. Ensaio (Estudo, Comparao) interlaboratorial:Estudo em que diversos laboratrios medem uma grandeza em uma ou mais pores idnticas de um material estvel e homogneo, em condies documentadas, cujos resultados so compilados em um nico relatrio [47]. Ensaio (Estudo) Colaborativo (EC): Determinao do desempenho de um procedimento de medio ou de ensaio mediante comparaes (ensaios ou estudos) interlaboratoriais. Ensaio (Estudo) de Proficincia (EP): Determinao do desempenho de um laboratrio de medio ou de ensaio por meio de comparaes (ensaios ou estudos) interlaboratoriais [ISO 13528:2005]. Avaliao do desempenho de um participante sob critrios preestabelecidos por comparaes (ensaios ou estudos) interlaboratoriais [ISO 17043:2010].
Erro aleatrio:Componente do erro de medio que, em medies repetidas, varia de maneira imprevisvel. Erro alfa () ou erro do tipo I: a obteno de um resultado de anlise que estabelece a no conformidade de uma amostra quando ela de fato conforme. tambm chamado de falso no conforme, ou falso positivo, e de risco do vendedor ou do produtor. Erro beta () ou erro do tipo II: a obteno de um resultado de anlise que estabelece a conformidade de uma amostra quando ela de fato no conforme. tambm chamado de falso conforme, ou falso negativo, e de risco do comprador ou do cliente.
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Erro de medio:Diferena entre o valor medido de uma grandeza e um valor de referncia. Erro sistemtico:Componente do erro de medio que, em medies repetidas, permanece constante ou varia de maneira previsvel. Escopo ou aplicabilidade:Os analitos, matrizes e concentraes para os quais o procedimento analtico pode ser usado satisfatoriamente.
Nota: Alm da definio da faixa de capacidade de desempenho satisfatrio de cada fator, a definio da aplicabilidade (escopo) pode incluir advertncias como a conhecida interferncia de outros analitos e a no aplicabilidade do procedimento analtico a certas matrizes e situaes. Exatido ou Acurcia:Ver acurcia. Fator de abrangncia:Nmero maior do que um, pelo qual uma incerteza padro combinada multiplicada para se obter uma incerteza de medio expandida [22,28]. Nota: Um fator de abrangncia geralmente simbolizado por k (ver tambm o Guia ISO/IEC 98-3:2008, 2.3.6).
Faixa de Trabalho (FT) ou faixa de medio ou faixa validada: Conjunto de valores de um mensurando para os quais os erros do procedimento medio analtica esto dentro de limites especificados (adaptado de [15,45]). O intervalo entre as concentraes inferior e superior do analito na amostra de ensaio dentro da qual foi determinado que o procedimento analtico adequado ao uso pretendido (adaptado de [47])
Faixa de linearidade ou faixa linear ou faixa dinmica linear:Faixa de concentrao na qual a resposta instrumental linear com a concentrao do analito [47]. Em geral, quando se refere a uma faixa linear, considera-se o comportamento funcional da curva de calibrao. Nesse caso, a concentrao do analito a qual essa definio se refere aquela no domnio de concentrao das solues padro de calibrao. Para evitar dvidas, recomendamos usar as expresses: faixa de linearidade da calibrao, ou faixa linear da calibrao, ou faixa dinmica linear da calibrao.
No se deve confundir a faixa de linearidade da calibrao com a faixa de trabalho ou faixa validada. A primeira est no domnio de concentrao do analito nas solues de calibrao, enquanto a segunda est no domnio de concentrao do analito nas amostras de ensaio, o mensurando. A diferena entre esses domnios de concentrao depende do tipo de unidades de medio de cada um e de fatores de diluio ou pr-concentrao das solues de extrao/abertura/digesto das amostras de ensaio e determinada pela funo de medio (equao do mensurando). Quando alquotas da soluo de extrao/abertura/digesto so submetidas diretamente ao instrumento de medio analtica, sem diluies ou pr-concentraes, a
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constante de proporcionalidade entre esses dois domnios pode, mas no obrigatoriamente, ser igual unidade. Funo analtica ou funo avaliao:Funo inversa da funo de calibrao, x= f1(y), que descreve a dependncia do valor analtico (concentrao do analito no padro de calibrao) com o valor medido (resposta instrumental) [47]. Exemplo: No caso em que a funo de calibrao a equao da reta y=a+bx, ento a funo analtica ser x=(ya)/b.
Funo de medio: Funo de grandezas cujo valor, quando calculado a partir de valores conhecidos das grandezas de entrada no modelo de medio, medido da grandeza de sada no modelo de medio [22,28]. Nota 1: Se um modelo de medio h(Y, X1, ..., Xn) = 0 pode ser escrito explicitamente como Y = f(X1,..., Xn), onde Y a grandeza de sada no modelo de medio, a funo f a funo de medio. Geralmente, f pode simbolizar um algoritmo que fornece, para os valores da grandeza de entrada x1,..., xn, um valor de sada nico correspondente a y = f (x1, ..., xn). Nota 2: A funo de medio tambm utilizada para calcular a incerteza de medio associada ao valor medido de Y.
Nota 3: Costuma-se tambm chamar a funo de medio de equao do mensurando ou equao de medio, embora esses termos no constem do VIM. Funo de calibrao:Equao para a estimao do valor de uma grandeza y a partir de um dado valor de uma grandeza analtica x: y = f(x). A funo de calibrao pode ser conhecida a priori por leis naturais ou estimada experimentalmente por meio de amostras de calibrao. A funo de calibrao representa aquele segmento da funo resposta escolhido para estimar o valor analtico de uma amostra de ensaio [47].
Exemplos: O tipo de funo de calibrao mais usado em qumica analtica a equao da reta ou funo afim: y= a+bx, onde y a resposta instrumental (e.g., absorvncia, rea de pico etc.) e x a concentrao do analito na soluo padro de calibrao. Costuma-se dizer nesses casos que a funo de calibrao linear, mas a expresso mais estritamente correta seria calibrao linear na concentrao. Funes de calibrao no lineares na concentrao so, por exemplo, y=aebx, que tem concavidade para cima e sensibilidade crescente com o aumento da concentrao; y= abecx, que tem concavidade para baixo e sensibilidade decrescente com o aumento da concentrao; ou ainda polinmios de segundo (y=a+bx+cx2) ou terceiro graus (y=a+bx+cx2+dx3). Essas duas ltimas so lineares nos parmetros ajustados a, b, c, e d, mas no na concentrao x. Funo resposta: Relao entre a resposta de um instrumento analtico e a quantidade do analito. A funo resposta completa frequentemente no retilnea [47].
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O intervalo de concentrao da funo resposta contm, em seu interior, o intervalo de concentrao da funo de calibrao. Garantia da qualidade:Conjunto das aes sistemticas planejadas e necessrias para prover a adequada confiana de que o resultado analtico satisfar um dado requisito de qualidade. Grandeza:Propriedade de um fenmeno, de um corpo ou de uma substncia, que pode ser expressa quantitativamente sob a forma de um nmero e de uma referncia [22,28]. Nota 1: O conceito genrico de grandeza pode ser dividido em vrios nveis de conceitos especficos. Nota 2: A referncia pode ser uma unidade de medida, um procedimento de medio, um material de referncia ou uma combinao desses.
Nota 3: As sries ISO 80000 e IEC 80000 Quantities and units fornecem os smbolos das grandezas. Os smbolos das grandezas so escritos em itlico. Um dado smbolo pode indicar diferentes grandezas. Nota 4: O formato preferido pela IUPAC-IFCC para designar as grandezas na rea de medicina laboratorial Sistema-Componente; tipo de grandeza.
Exemplo: Plasma (Sangue)on sdio; concentrao em quantidade de substncia igual a 143 mmol/L em determinada pessoa, em determinado instante. Nota 5: Uma grandeza, conforme aqui definida, escalar (valor numrico associado a uma unidade de medida). Entretanto, um vetor ou um tensor, cujas componentes so grandezas, tambm considerado como uma grandeza. Nota 6: O conceito de grandeza pode ser genericamente dividido em, por exemplo, grandeza fsica, grandeza qumica e grandeza biolgica, ou grandeza de base e grandeza derivada.
Grandeza de entrada:Grandeza que deve ser medida, ou grandeza cujo valor pode ser obtido de outro modo, para calcular um valor medido de um mensurando [22,28]. Exemplo: Quando o comprimento de uma haste de ao a uma temperatura especificada o mensurando, a temperatura real, o comprimento na temperatura real e o coeficiente de dilatao trmica linear da haste so grandezas de entrada.
Nota 1: Uma grandeza de entrada frequentemente uma grandeza de sada de um sistema de medio. Nota 2: As indicaes, as correes e as grandezas de influncia so grandezas de entrada. Grandeza de sada:Grandeza cujo valor medido calculado utilizando-se os valores das grandezas de entrada em um modelo de medio [22,28].
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Grandeza de influncia:Grandeza que, em uma medio direta, no afeta a grandeza efetivamente medida, mas afeta a relao entre a indicao e o resultado de medio [22,28].
Exemplo 1: Frequncia na medio direta da amplitude constante de uma corrente alternada com um ampermetro.
Exemplo 2: Concentrao em quantidade de substncia de bilirrubina, em uma medio direta da concentrao, em quantidade de substncia de hemoglobina no plasma sanguneo humano. Exemplo 3: Temperatura de um micrmetro utilizado na medio do comprimento de uma haste, mas no a temperatura da prpria haste que pode fazer parte da definio do mensurando. Exemplo 4: Presso ambiente na fonte inica de um espectrmetro de massa, durante uma medio de uma frao molar. Nota 1: Uma medio indireta compreende uma combinao de medies diretas, em que cada uma delas pode ser afetada por grandezas de influncia.
Nota 2: No Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement (GUM), o conceito grandeza de influncia definido como na 2a edio do VIM, contemplando no somente as grandezas que afetam o sistema de medio, como na definio anterior, mas tambm as que afetam as grandezas efetivamente medidas. Alm disso, no GUM este conceito no est limitado a medies diretas. Heterocedasticidade:Antnimo de homoscedasticidade. Homoscedasticidade: Igualdade dos desvios-padro de diferentes amostras estatsticas. Em uma curva de calibrao, refere-se igualdade estatstica dos desvios-padro das replicatas das respostas instrumentais em diferentes nveis de concentrao das solues padro de calibrao. HORRATR Reproducibility Horwitz Ratio, razo de Horwitz de reprodutibilidade:Desvio-Padro Relativo de Reprodutibilidade (DPRR) ou Coeficiente de Variao de Reprodutibilidade (CVR), dividido pelo Desvio-Padro Relativo de Reprodutibilidade (DPRRH) ou Coeficiente de Variao de Reprodutibilidade (CVRH) estimado por meio da equao de Horwitz, na qual w a frao de massa do analito (com ambos, numerador e denominador, nas mesmas unidades):
HORRATr Repeatability Horwitz Ratio, razo de Horwitz de repetitividade:Desvio-Padro Relativo de Repetitividade (DPRr), ou Coeficiente de Variao de Repetitividade (CVr), dividido pelo Desvio-Padro Relativo de Repetitividade (DPRrH) ou Coeficiente de Variao de Repetitividade (CVrH) estimado pela equao de Horwitz, na qual w a frao de
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massa do analito (com ambos, numerador e denominador, nas mesmas unidades), e usando a hiptese sr = 2/3 sR:
Incerteza de medio: Parmetro no negativo que caracteriza a disperso dos valores atribudos a um mensurando, com base nas informaes utilizadas [22,28]. Nota1: A incerteza de medio compreende componentes provenientes de efeitos sistemticos, tais como componentes associados a correes e valores atribudos a padres, assim como a incerteza definicional. Algumas vezes no so corrigidos efeitos sistemticos estimados; em vez disso so incorporados componentes de incerteza de medio associados.
Nota2: O parmetro pode ser, por exemplo, um desvio-padro denominado incerteza padro (ou um de seus mltiplos) ou a metade de um intervalo tendo uma probabilidade de abrangncia determinada. Nota3: A incerteza de medio geralmente engloba muitos componentes. Alguns deles podem ser estimados por uma avaliao do Tipo A da incerteza de medio, a partir da distribuio estatstica dos valores provenientes de sries de medies e podem ser caracterizados por desvios-padro. Os outros componentes, que podem ser estimados por uma avaliao do Tipo B da incerteza de medio, podem tambm ser caracterizados por desvios-padro estimados a partir de funes de densidade de probabilidade baseadas na experincia ou em outras informaes.
Nota4: Geralmente para um dado conjunto de informaes, subentende-se que a incerteza de medio est associada a determinado valor atribudo ao mensurando. Uma modificao desse valor resulta em modificao da incerteza associada. Incerteza de Medio Analtica (IMA): Incerteza de medio associada ao mensurando obtido atravs de um procedimento de anlise qumica validado. Incerteza de medio expandida ou incerteza expandida: Produto de uma incerteza padro combinada por um fator maior do que o nmero um [22,28].
Nota1: O fator depende do tipo de distribuio de probabilidade da grandeza de sada e da probabilidade de abrangncia escolhida. Nota2: O termo fator nesta definio se refere ao fator de abrangncia. Nota3: A incerteza de medio expandida chamada de incerteza global, no pargrafo 5 da Recomendao INC-1 (1980) (ver o GUM), e simplesmente incerteza, nos documentos IEC. Incerteza Mxima Aceitvel (Imax): Incerteza de medio mxima determinada em funo do risco mximo aceitvel de se tomar uma deciso
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errada quando usando um resultado de medio. Ela pode ser estabelecida por norma, legislao, contrato ou internamente no laboratrio. Resultados de medio com incertezas maiores que a incerteza mxima aceitvel no so adequados ao uso pretendido. Intervalo de abrangncia: Intervalo, baseado na informao disponvel, que contm o conjunto de valores verdadeiros de um mensurando, com probabilidade determinada [22,28].
Nota1: Um intervalo de abrangncia no est necessariamente centrado no valor medido escolhido (ver o Guia ISO/IEC 98-3:2008/Supl.1). Nota2: No recomendvel que um intervalo de abrangncia seja denominado intervalo de confiana para evitar confuso com o conceito estatstico (ver o Guia ISO/IEC 98-3:2008, 6.2.2).
Nota3: Um intervalo de abrangncia pode ser deduzido de uma incerteza de medio expandida (ver o Guia ISO/IEC 98-3:2008, 2.3.5). Instrumento de medio:Dispositivo utilizado para realizar medies, individualmente ou associado a um ou mais dispositivos suplementares [22,28]. Nota 1: Um instrumento de medio que pode ser utilizado individualmente um sistema de medio. Nota 2: Um instrumento de medio pode ser um instrumento de medio indicador ou uma medida materializada.
Nota 3: Em qumica analtica comum encontrarmos os termos instrumento de medio analtica ou instrumento analtico, e.g.: espectrmetro de absoro atmica, cromatgrafo, peagmetro, balana, bureta, pipeta, termmetro, multmetro, rgua etc. International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC):Unio de Qumica Pura e Aplicada. Limite de Deciso (CC): o limite a partir do qual se pode concluir que uma amostra no conforme com uma probabilidade de erro . Limite de Deteco (LD): Valor medido, obtido por um dado procedimento de medio, para o qual a probabilidade de declarar falsamente a ausncia de um componente em um material b, sendo a probabilidade de declarar falsamente a sua presena. Essa definio equivalente definio de capacidade de deteco (CCb) [9,22,28,47]. Nota2: s vezes, usa-se a abreviao LD (LOD, em ingls).
Nota1: A IUPAC recomenda valores convencionais para e b iguais a 0,05. Nota3: O termo sensibilidade no deve ser empregado no sentido de limite de deteco. Esta definio e suas notas so aquelas do 4.18 do VIM 2009 [22] e do JCGM200:2008 [28]. A definio de LD corresponde definio de capa-
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cidade de deteco (CCb) da Deciso 2002/657/EC e definio de valor mnimo detectvel da varivel lquida de estado da ISO11843-1. Limite de Quantificao (LQ) ou limite de determinao: Existem vrias definies desse termo na literatura:
Um valor analtico, xLQ, acima do qual a determinao analtica possvel com uma dada preciso mnima. A condio de preciso deve ser declarada em cada caso. (DANZER,2007) [47] a menor concentrao que pode ser determinada com veracidade e preciso de repetitividade aceitveis. (EURACHEM,1998) [15] o menor teor ou concentrao de um analito que pode ser estimada com confiabilidade aceitvel. (AOAC2002) [2]
Concentrao igual ou maior que a menor concentrao da curva de calibrao. (ANVISA,2007) [3]
A definio do Codex Alimentarius (CAC/GL72-2009) [9]: Uma caracterstica de desempenho geralmente expressa em termos de um sinal ou um valor medido que produzir uma estimativa que ter um desvio-padro relativo DPR especificado, em geral 10% (ou 6%).
Teor mnimo medido a partir do qual possvel medir o analito com certeza estatstica razovel (95% de confiana). Se a veracidade e a preciso so constantes numa gama de concentraes centrada no limite de deteco, o limite de quantificao numericamente igual a seis ou dez vezes o desvio-padro da mdia de ensaios em branco (n > 20). (EC/333/2007) [12]
Onde LQ o limite de quantificao, sQ o desvio-padro nesse ponto e kQ um multiplicador cujo valor igual ao recproco do desvio-padro relativo (DPR) selecionado. O DPR aproximado de uma estimativa de s, baseada em n graus de liberdade .
Nota: Se s conhecido e constante, ento sQ= s0, uma vez que o desvio-padro da quantidade estimada independente da concentrao. Substituindo kQ pelo DPR obtm-se: LQ=10s0. Nesse caso LQ exatamente igual a 3,04 vezes o limite de deteco, considerando que os dados so normais a=b=0,05. No LQ uma identificao positiva pode ser alcanada com uma razovel e/ou previamente estabelecida confiana para uma dada matriz e usando um procedimento analtico especfico. Esta definio estabelece as bases para tratar as excees ao caso simples descrito, i.e., envolvendo distribuies no-normais e heterocedasticidade, e.g. o processo de contagem (Poisson) como aquele usado em PCR em tempo real. Limite Mximo de Resduo (LMR): a concentrao mxima de um dado resduo admissvel em determinada matriz.
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Nota 1: Os valores de LMR so estabelecidos pela Coordenao de Controle de Resduos e Contaminantes (CCRC). Limite Mnimo de Desempenho Requerido (LMDR):Teor mnimo de uma substncia a analisar em uma amostra que deve ser detectvel e passvel de confirmao [10]. Nota 1: Tem o objetivo de padronizar o desempenho analtico mnimo requerido do procedimento analtico cuja substncia, sob anlise, no possui limite permitido definido. Nesses casos, CC e CC devem ser menores que o LMDR. Nota 2: Os valores do LMDR so estabelecidos pela Coordenao de Controle de Resduos e Contaminantes (CCRC).
Limite de Referncia (LR): o teor mximo admissvel de determinada substncia em determinada matriz, estabelecido por legislao nacional ou internacional, pelo cliente interno ou externo. Material de Referncia Certificado (MRC):Material de referncia, acompanhado por um certificado, com um ou mais valores de propriedades, atestado por um procedimento que estabelece sua rastreabilidade obteno exata da unidade na qual os valores da propriedade so expressos. Cada valor certificado acompanhado por uma incerteza para um nvel de confiana estabelecido [22,28]. Matriz branca ou amostra branca:Matriz isenta da substncia a analisar ou cujo nvel de concentrao seja suficientemente baixo de modo a no interferir nos resultados de medio. Matriz representativa:Matriz escolhida para representar um grupo de matrizes de composio semelhante e usada durante a validao de um procedimento analtico, para o qual se tenha demonstrado que no h diferena significativa do resultado do analito quando medido na matriz representativa e na matriz representada. Menor Nvel Calibrado (MNC): a concentrao (ou massa) mais baixa do analito com a qual o instrumento de medio analtica foi devidamente calibrado [10]. Medio: Processo de obteno experimental de um ou mais valores que podem ser, razoavelmente, atribudos a uma grandeza [22,28]. Nota 1: A medio no se aplica a propriedades qualitativas. Nota 2: A medio implica a comparao de grandezas e engloba contagem de entidades. Nota 3: A medio pressupe uma descrio da grandeza que seja compatvel com o uso pretendido de um resultado de medio, de um procedimento de medio e de um sistema de medio calibrado que opere
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de acordo com um procedimento de medio especificado, incluindo as condies de medio. Mensurando: Grandeza que se pretende medir [22,28]. Nota 1: A especificao de um mensurando requer o conhecimento do tipo de grandeza, a descrio do estado do fenmeno, do corpo ou da substncia da qual a grandeza uma propriedade, incluindo qualquer componente relevante e as entidades qumicas envolvidas.
Nota 2: Na segunda edio brasileira do VIM, o mensurando definido como a grandeza especfica submetida medio e na IEC 60050300:2001, como a grandeza submetida medio.
Nota 3: A medio, incluindo o sistema de medio e as condies sob as quais ela realizada, pode modificar o fenmeno, o corpo ou a substncia, de modo que a grandeza que est sendo medida pode diferir do mensurando como ele foi definido. Nesse caso, necessria uma correo adequada. Exemplo 1: A diferena de potencial entre os terminais de uma bateria pode diminuir quando, na realizao da medio, utilizado um voltmetro com uma condutncia interna significativa. A diferena de potencial em circuito aberto pode ser calculada a partir das resistncias internas da bateria e do voltmetro.
Exemplo 2: O comprimento de uma haste de ao em equilbrio com a temperatura ambiente de 23C ser diferente do comprimento temperatura especificada de 20C. Nesse caso, necessria uma correo.
Nota 4: Em qumica, analito, o nome de uma substncia ou de um composto so termos utilizados algumas vezes para mensurando. Tal uso incorreto porque esses termos no se referem a grandezas. Mtodo analtico:Sequncia lgica de operaes, descritas genericamente e resumidamente, usadas na execuo de uma anlise qumica de um dado analito ou um conjunto de analitos em uma matriz, usando determinada tcnica analtica [47, ISO3524-1]. Mtodo multirresduo:Mtodo analtico capaz de identificar e quantificar vrios tipos de analitos de um mesmo grupo qumico ou de grupos qumicos distintos, em determinada matriz. Mtodo ou procedimento normalizado:Procedimento analtico desenvolvido, validado e aprovado em ensaios interlaboratorias colaborativos por um organismo de normalizao. Mtodo ou procedimento oficial: Procedimento analtico desenvolvido, validado e aprovado em ensaios interlaboratorias, por organismo de normalizao ou outras organizaes, devidamente homologado pelo rgo legalmente competente.
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Nota 1: Os mtodos descritos na Farmacopeia Brasileira so considerados mtodos oficiais. Por analogia, tambm so reconhecidos os mtodos descritos nas principais farmacopeias. Nvel de interesse ou nvel requerido: A concentrao da substncia a analisar em uma amostra que significativa para determinar a sua conformidade com a legislao [10]. Padro interno (surrogate): Composto puro ou elemento adicionado amostra de ensaio, cujo comportamento qumico-fsico considerado como representativo do analito nativo. s vezes, como nas tcnicas analticas envolvendo espectrometria de massa, so usadas molculas do analito marcadas com algum istopo de seus elementos constitutivos. Padro de referncia:Padro, geralmente tendo a mais alta qualidade metrolgica disponvel em um dado local ou em uma dada organizao, a partir do qual as medies executadas so derivadas. Padro de trabalho (padro analtico, padro de calibrao):Padro utilizado rotineiramente para calibrar ou controlar medidas materializadas, instrumentos de medio ou materiais de referncia. Um padro de trabalho geralmente calibrado por comparao a um padro de referncia. Em laboratrios qumicos, o padro de trabalho , em geral, chamado de padro analtico ou de calibrao. Plano Nacional de Controle de Resduos e Contaminantes (PNCRC) Preciso de medio (preciso):Grau de concordncia entre indicaes ou valores medidos, obtidos por medies repetidas, no mesmo objeto ou em objetos similares, sob condies especificadas [22,28].
Nota 1: A preciso de medio geralmente expressa numericamente por indicadores de incerteza tais como: disperso, desvio-padro (s), varincia (s2), ou coeficiente de variao (CV), sob condies de medio especificadas. Uma menor preciso indicada por um elevado desvio-padro. Nota 2: As condies especificadas podem ser, por exemplo, condies de repetitividade, condies de preciso intermediria ou condies de reprodutibilidade (ver ISO 57253: 1994). Nota 3: A preciso de medio utilizada para definir a repetitividade, a preciso intermediria e a reprodutibilidade de medio. Nota 4: O termo preciso de medio algumas vezes utilizado, erroneamente, para designar a exatido de medio.
Preciso intermediria (z):Preciso de medio sob um conjunto de condies de preciso intermediria [22,28].
Nota 1: Os termos estatsticos pertinentes so apresentados na ISO 5725-3: 1994.
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Probabilidade de abrangncia:Probabilidade de que o conjunto de valores verdadeiros de um mensurando esteja contido em um intervalo de abrangncia especificado [22,28]. Nota 1: Esta definio se refere abordagem de incerteza, como apresentado no GUM. Nota 2: A probabilidade de abrangncia tambm chamada de nvel da confiana no GUM.
Probabilidade de erro alfa (a): a probabilidade de cometer o erro a. Isto , a probabilidade de obter um resultado no conforme quando a amostra de fato conforme. Probabilidade de erro beta (b): a probabilidade de cometer o erro b. Isto , a probabilidade de classificar uma amostra como conforme quando ela de fato no conforme. Procedimento analtico: Conjunto de operaes, descritas especificamente e detalhadamente, usadas na execuo da anlise de um analito particular ou um conjunto de analitos, de acordo com um dado mtodo analtico [47, ISO3524-1]. Rastreabilidade metrolgica ou rastreabilidade: Propriedade de um resultado de medio pela qual tal resultado pode ser relacionado a uma referncia por meio de uma cadeia ininterrupta e documentada de calibraes, cada uma contribuindo para a incerteza de medio [22,28].
Nota 1: Para esta definio, a referncia pode ser definio de uma unidade de medida por meio de sua realizao prtica, ou um procedimento de medio que engloba a unidade de medida para uma grandeza no ordinal, ou um padro. Nota 2: A rastreabilidade metrolgica requer uma hierarquia de calibrao estabelecida.
Nota 3: A especificao da referncia deve compreender a data em que ela foi utilizada no estabelecimento da hierarquia de calibrao, juntamente com qualquer outra informao metrolgica relevante sobre a referncia, tal como a data na qual foi realizada a primeira calibrao da hierarquia de calibrao. Nota 4: Para medies com mais de uma grandeza de entrada no modelo de medio, cada valor de entrada deve ter sua prpria rastreabilidade e a hierarquia de calibrao envolvida pode formar uma estrutura ramificada ou uma rede. O esforo envolvido no estabelecimento da rastreabilidade metrolgica para cada valor da grandeza de entrada deve ser proporcional sua contribuio relativa para o resultado de medio.
Nota 5: A rastreabilidade metrolgica de um resultado de medio no assegura que a incerteza de medio seja adequada para um dado objetivo ou que exista uma ausncia de erros humanos. Nota 6: Uma comparao entre dois padres pode ser considerada como uma calibrao se ela for utilizada para verificar e, se necessrio, corrigir o valor e a incerteza de medio atribudos a um dos padres.
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Nota 7: O ILAC considera que os elementos necessrios para confirmar a rastreabilidade metrolgica so uma cadeia de rastreabilidade ininterrupta a um padro internacional ou a um padro nacional, uma incerteza de medio documentada, um procedimento de medio documentado, uma competncia tcnica reconhecida, a rastreabilidade metrolgica ao SI e os intervalos entre calibraes (ver ILAC P-10:2002).
Nota 8: O termo abreviado rastreabilidade , s vezes, utilizado com o significado de rastreabilidade metrolgica, assim como de outros conceitos, tais como rastreabilidade de uma amostra, de um documento, de um instrumento ou de um material, em que o histrico de um item importante. Portanto, prefervel utilizar o termo completo rastreabilidade metrolgica para evitar quaisquer dvidas. Recuperao ou fator de recuperao:Frao da concentrao ou da quantidade de analito presente, ou adicionado, ou presente e adicionado na alquota da amostra de ensaio, que extrada e apresentada para o instrumento de medio. A recuperao mede toda a parte do analito que no extrada da amostra, ou que se perde nas etapas analticas anteriores medio instrumental. Replicatas independentes: Para fins deste documento, definimos como replicatas independentes aquelas replicatas para as quais todo o processo experimental de medio ou de anlise qumica, ou de produo de uma soluo de calibrao, ou de obteno de uma amostra de ensaio etc. repetido desde a sua etapa inicial. No so replicatas independentes os vrios valores de respostas instrumentais obtidos de releituras de uma nica injeo no instrumento de medio analtica, de uma mesma soluo padro de calibrao, ou de uma mesma soluo de amostra de ensaio. Para que essas respostas instrumentais sejam independentes suas solues devem ser repreparadas desde o incio e cada soluo repreparada lida uma nica vez no instrumento de medio analtico. Repetitividade de medio ou repetitividade (r):Preciso de medio sob um conjunto de condies de repetitividade [22,28]. As condies de repetitividade so aquelas em que todos os fatores que podem alterar o resultado da medio so mantidos constantes ou controlados, isto , mesmo procedimento de medio, mesmo analista, mesmas temperatura, presso e umidade ambientes, mesmo laboratrio, mesmos fornecedores e lotes de reagentes, e replicatas de medio realizadas em curto perodo de tempo.
Reprodutibilidade de medio ou reprodutibilidade (R):Preciso de medio sob um conjunto de condies de reprodutibilidade [22,28]. Nota: Os termos estatsticos pertinentes so apresentados na ISO 57251:1994 e na ISO 5725-2:1994. As condies de reprodutibilidade so aquelas em que todos os fatores que podem alterar o resultado da medio so variados na maior extenso possvel que se pode ter na rotina. As replicatas
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de medio so feitas em dias diferentes, em intervalo de tempo abrangente, em laboratrios, instrumentos e analistas diferentes, entre outros. Resposta Instrumental (RI): a indicao (valor indicado, leitura, resultado) do instrumento de medio quando uma amostra de ensaio ou uma soluo de calibrao inserida no instrumento de medio, e.g.: absorvncia, rea de pico, pH, diferena de potencial eltrico etc. Sada de um sistema analtico com uma reao a certo estmulo [47]. Resultado de medio: Conjunto de valores atribudos a um mensurando, completado por todas as outras informaes pertinentes disponveis [22,28]. Nota 1: Um resultado de medio geralmente contm informao pertinente sobre o conjunto de valores, alguns dos quais podem ser mais representativos do mensurando do que outros. Isso pode ser expresso na forma de uma Funo de Densidade de Probabilidade (FDP).
Nota 2: Um resultado de medio geralmente expresso por um nico valor medido e uma incerteza de medio. Caso a incerteza de medio seja considerada desprezvel para alguma finalidade, o resultado de medio pode ser expresso como um nico valor medido. Em muitas reas, essa a maneira mais comum de expressar um resultado de medio. Nota 3: Na literatura tradicional e na edio brasileira anterior do VIM, o resultado de medio era definido como um valor atribudo a um mensurando obtido por medio, que poderia ser representado por uma indicao, ou um resultado no corrigido, ou um resultado corrigido, de acordo com o contexto.
Robustez:Susceptibilidade de um procedimento analtico a alteraes das condies experimentais, as quais podem ser expressas como uma lista dos materiais da amostra, das substncias a analisar, das condies de armazenamento, das condies ambientais e/ou de preparao da amostra em que o mtodo pode ser aplicado tal como apresentado ou com pequenas alteraes especficas. Relativamente a todas as condies experimentais que possam, na prtica, estar sujeitas a variaes (por exemplo, estabilidade dos reagentes, composio da amostra, pH, temperatura), devem ser indicadas quaisquer alteraes susceptveis de afetar os resultados analticos. Propriedade de um procedimento analtico que indica sua insensibilidade a mudanas de condies operacionais conhecidas sobre o resultado do procedimento e, portanto, sua adequao a seu propsito de uso [47]. Seletividade:Propriedade de um sistema de medio, utilizado com um procedimento de medio especificado, segundo a qual o sistema fornece valores medidos para um ou vrios mensurandos, tal que os valores de cada mensurando sejam independentes uns dos outros, ou de outras grandezas associadas ao fenmeno, corpo ou substncia em estudo [22,28].
Exemplo 1: Aptido de um sistema de medio composto por um espectrmetro de massa para medir a razo entre correntes inicas geradas por
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dois compostos especificados, sem interferncia de outras fontes especificadas de corrente eltrica. Exemplo 2: Aptido de um sistema de medio para medir a potncia de uma componente de um sinal a uma determinada frequncia sem sofrer interferncias de componentes do sinal ou de outros sinais, em outras frequncias.
Exemplo 3: Aptido de um receptor para discriminar entre um sinal desejado e sinais no desejados, tendo geralmente frequncias ligeiramente diferentes da frequncia do sinal desejado.
Exemplo 4: Aptido de um sistema de medio de radiao ionizante para responder a uma radiao particular a ser medida na presena de radiao concomitante. Exemplo 5: Aptido de um sistema de medio para medir a concentrao em quantidade de substncia de creatinina no plasma sanguneo por um procedimento de Jaff sem ser influenciado pelas concentraes de glicose, urato, cetona e protena.
Exemplo 6: Aptido de um espectrmetro de massa para medir a abundncia em quantidade de substncia do istopo 28Si e do istopo 30Si no silcio proveniente de um depsito geolgico sem influncia mtua ou do istopo 29Si. Nota 1: Em fsica, existe somente um mensurando; as outras grandezas do mesmo tipo do mensurando so grandezas de entrada para o sistema de medio. Nota 2: Em qumica, as grandezas medidas envolvem frequentemente componentes diferentes do sistema submetido medio e estas grandezas no so, necessariamente, do mesmo tipo.
Nota 3: Em qumica, a seletividade de um sistema de medio obtida normalmente para grandezas associadas a componentes selecionadas em concentraes dentro de intervalos estabelecidos. Nota 4: O conceito de seletividade em fsica (ver Nota 1) prximo daquele da especificidade, como s vezes utilizado em qumica.
a extenso na qual um conjunto de n analitos podem ser medidos simultaneamente por (no mnimo) n sensores (canais detectores) sem interferncia de outros componentes e, portanto, podem ser determinados independentemente e sem distrbios [47].
a extenso na qual um procedimento analtico pode determinar analito(s) particular(es) em uma mistura(s) ou matriz(es) sem a interferncia de outros componentes de comportamento semelhante. Nota 5: Seletividade o termo recomendado em qumica analtica para expressar a extenso na qual um procedimento analtico particular pode determinar analito(s) na presena de outros componentes. A seletividade pode ser graduada. O uso do termo especificidade para o mesmo conceito desencorajada, pois em geral isso leva a confuses.
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Sensibilidade:Quociente entre a variao de uma indicao de um sistema de medio e a variao correspondente do valor da grandeza medida [22,28]. Nota 1: A sensibilidade pode depender do valor da grandeza medida. Nota 2: A variao do valor da grandeza medida deve ser grande quando comparada resoluo. Nota em [47]: Em medies analticas , de fato, a quociente diferencial do valor medido para o valor analtico.
Sistema Analtico: Conjunto de circunstncias que contribuem para a qualidade do resultado analtico, incluindo equipamentos, reagentes, procedimentos, materiais de ensaio, pessoal, condies ambientais, medidas de garantia da qualidade (seo 18.6.1 do IUPAC Orange Book [45]). Soluo padro de calibrao ou soluo de calibrao ou padro de calibrao: Uma soluo (ou outra diluio) do analito e, se usado, do padro interno usada para a calibrao do instrumento de medio analtica. Ela pode ser preparada a partir de um padro de trabalho e pode ser matrizada. Tcnica analtica ou princpio de medio:Princpio fsico ou qumico e/ ou instrumental usado na determinao de um analito. o fenmeno que serve como base para uma medio. Aplicao analtica genrica de um princpio cientfico [47]. Tendncia (Bias): Estimativa de um erro sistemtico [22,28].
a diferena entre a esperana de um resultado de ensaio e um valor de referncia aceito [47].
a diferena entre uma mdia de um nmero suficiente de resultados de medio em condies de repetitividade e o valor verdadeiro convencional estabelecido por um padro, material de referncia ou MRC. A tendncia uma medida da veracidade, quanto maior a tendncia menor a veracidade do resultado da medio. Validao: Verificao na qual os requisitos especificados so adequados para um uso pretendido [22,28].
Exemplo: Um procedimento de medio, normalmente utilizado para a medio da concentrao da massa de nitrognio em gua, pode tambm ser validado para a medio no soro humano.
Confirmao por exame e fornecimento de evidncia objetiva de que os requisitos especficos para determinado uso pretendido so atendidos (ISO17025 [23]). Processo pelo qual estabelecido, por estudo em laboratrio, que as caractersticas de desempenho de um procedimento atendem aos requisitos para um uso pretendido [47].
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Valor convencional: Valor atribudo a uma grandeza por um acordo, para um dado propsito [22,28]. Exemplo 1: Valor convencional da acelerao da gravidade, gn = 9,806 65 m.s-2.
Exemplo 2: Valor convencional da constante de Josephson, KJ-90 = 483 597,9 GHz.V-1. Exemplo 3: Valor convencional de um dado padro de massa, m = 100,00347 g.
Nota 1: O termo valor verdadeiro convencional algumas vezes utilizado para esse conceito, porm seu uso desaconselhado. Nota 2: Um valor convencional algumas vezes uma estimativa de um valor verdadeiro. Nota 3: Geralmente considera-se que um valor convencional est associado a uma incerteza de medio convenientemente baixa, que pode ser nula.
Valor analtico: Magnitude de uma grandeza analtica (x) medida em uma amostra de ensaio, em um primeiro momento, e atribuda a uma amostra de referncia usada para calibrao, em um segundo momento [47].
Portanto, podemos interpretar essa definio dizendo que o valor analtico o valor convencional definido no 2.12 do VIM [22,28] e chamado de valor verdadeiro convencional nas edies anteriores do VIM. Por exemplo, o valor analtico pode ser o valor do teor de um analito em um MRC ou o valor da concentrao de uma soluo padro de calibrao. Veracidade ou veracidade de medio:Grau de concordncia entre a mdia de um nmero infinito de valores medidos repetidos e um valor de referncia [22,28, 9]. Nota 1: A veracidade no uma grandeza e, portanto, no pode ser expressa numericamente. Porm, a norma ISO 5725 apresenta medidas para o grau de concordncia.
Nota 2: A veracidade est inversamente relacionada ao erro sistemtico, porm no est relacionada ao erro aleatrio.
Nota 3: No se deve utilizar o termo exatido de medio no lugar de veracidade e vice-versa [22,28]. A veracidade geralmente expressa como um erro sistemtico, ou uma correo, ou um vis. estimada por meio de correes, ou fatores de correes oriundos de calibraes, recuperaes, efeito de matriz, ou outros efeitos sistemticos. o grau de concordncia entre o valor mdio obtido de uma grande srie de resultados de ensaio e um valor de referncia aceito [47,45]. Verificao:Provimento de evidncia objetiva de que um dado item atende a requisitos especificados [22,28].
Exemplo 1: Confirmao de que um dado material de referncia, como declarado, homogneo para o valor e para o procedimento de medio em questo, at uma poro, do material sob medio, com massa de 10 mg.
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Exemplo 2: Confirmao de que as propriedades relativas ao desempenho ou aos requisitos legais so atendidas por um sistema de medio. Exemplo 3: Confirmao de que uma incerteza alvo pode ser obtida. Nota1: Quando aplicvel, recomenda-se que a incerteza de medio seja levada em considerao. Nota 2: O item pode ser, por exemplo, um processo, um procedimento de medio, um material, um composto ou um sistema de medio.
Nota3: Os requisitos especificados podem ser, por exemplo, as especificaes de um fabricante.
Nota4: Em metrologia legal e geralmente na avaliao da conformidade, a verificao, conforme definida no VIML, compreende o exame e a marcao e/ou a emisso de um certificado de verificao para um sistema de medio. Nota5: A verificao no deve ser confundida com calibrao. Nem toda verificao uma validao.
Verificao de Procedimento Analtico (VPA): Processo de verificao/ avaliao de desempenho, documentado, aplicvel ao procedimento (mtodo) analtico normalizado ou oficial. Objetiva comprovar se o referido procedimento analtico opera adequadamente nas condies de rotina do laboratrio, em conformidade com os critrios de aceitao estabelecidos neste Manual.
O mtodo para a verificao do procedimento analtico constitui-se no mnimo da anlise em replicatas e em condies de preciso intermediria de um MRC ou outro material de referncia, para a estimao da veracidade (correo, fator de correo, recuperao) e da preciso de repetitividade e intermediria do procedimento analtico, isto , a acurcia ou exatido do procedimento. A qualificao ou verificao de um procedimento analtico uma validao simplificada.
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ANEXO XI
Matrizes Representativas (Praguicida e Micotoxinas)
Tabela A.XI.1 Seleo de matrizes representativas para validao de procedimentos de determinao de praguicidas
Grupos de Produtos Propriedades Espcies Classe de Produtos Comuns Representativas Produtos de Origem Vegetal Hortalias frondosas do Espinafre, alface Alto teor de gua gnero Brassica, hortalbrcolis, repolho, couve e clorofila ias frondosas, legumie vagem nosas Ma, pera, pssego, Alto teor de gua Pomos; drupas, pequecereja, morango, uva, e ausncia ou nas frutas e bagas, hortomate, pimento, baixo teor de talias de frutos, razes e melo, batata, cenoura, clorofila tubrculos cogumelo, salsa Alta acidez Frutas ctricas Laranja, limo Alto teor de Passas, tmaras acares Abacate, semente de Alto teor leos/ Oleaginosas; castanhas girassol, noz, pistache gorduras Ausncia ou baixo Cereais em gros e seus Trigo, arroz, milho teor de gua produtos Produtos de alta e.g.: Alho, lpulo, ch, especificidade especiarias, oxicoco Produtos de Origem Animal Carne bovina, carne de Carnes frango Vsceras Fgado, rim Gorduras da carne Leite Leite de vaca Ovos Ovos de Galinha
II
III IV V VI
Obs.: Produtos de alta especificidade no podem ser validados por intermdio do uso de espcies representativas.
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Tabela A.XI.2 Grupo de matrizes, por categoria, a serem utilizadas na validao de procedimento analticos e no controle de qualidade para micotoxinas
Classe Categoria Amndoas e amendoim Cereais Rao e ingredientes de rao Frutas secas Leguminosas e oleaginosas Caf verde Caf torrado e solvel Leite Algodo Matrizes consideradas similares pertencentes mesma categoria Amendoim, pasta de amendoim, farelo de amendoim, avels, castanha-do-brasil, pistache, nozes, amndoas em geral e suas respectivas pastas ou manteigas e coco Arroz, milho, cevada centeio, trigo, farinha de milho, trigo, farinha de trigo Farelo de soja, farelo de trigo, farelo de milho, raes de frango, suno, equino e bovina Uva-passa, ameixa, damasco, tmara, figo, banana, dentre outras Feijo, lentilhas e leguminosas em geral Caf verde Caf torrado ou solvel Leite fludo, leite em p Caroo de algodo e farelo de algodo
II III IV V VI VII VIII
Obs.: Na caracterizao do grupo, foram levados em considerao os seguintes parmetros: dureza, composio centesimal, interferentes analticos (pigmentos e outros), processo de preparo de amostras.
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ANEXO XII
Planejamento Fatorial para o Estudo de Robustez
Uma das mais eficientes estratgias para realizar o estudo de robustez utilizar os chamados planejamentos fatoriais completos ou fracionrios. Existem outros planejamentos, tais como o planejamento fatorial com ponto central, planejamento estrela, planejamento fatorial com face centrada e ponto central, planejamento Plackett-Burman, planejamento Doehlert etc. [4,10,19,29,40,41,42,43,44]. Os planejamentos fatoriais fracionrios saturados so chamados de abordagem de Youden na Deciso 2002/657/EC [10]. O planejamento fatorial reduz o nmero de experimentos (ou ensaios ou amostras) ao mnimo necessrio para detectar os efeitos principais e/ou os efeitos de interao dos fatores (tratamentos na linguagem da ANOVA), que podem influenciar significativamente no resultado da medio do procedimento analtico, afetando, assim, na qualidade metrolgica e na confiabilidade do procedimento analtico. Devido sua eficincia, os planejamentos fatoriais permitem a reduo do tempo e dos custos para a realizao da validao de um procedimento analtico. Planejamentos fatoriais so constitudos de combinaes de condies experimentais, os fatores ou tratamentos, nas quais alguns ou todos os fatores estudados ocorrem conjuntamente com dois ou mais nveis de outro fator (definio adaptada de [14]). Os fatores ou tratamentos so as grandezas de entrada ou de influncia que podem afetar as respostas, as variveis de sada, do processo em estudo. Um processo pode apresentar mais de uma resposta (FiguraA.XII.1). Na validao de um procedimento analtico, o processo o prprio procedimento analtico. A funo resposta, ou simplesmente resposta, a tendncia (erro sistemtico ou correo) do resultado analtico experimental, a concentrao ou o teor do analito, em um MRC ou um padro, ou uma matriz branca fortificada, ou um extrato de matriz branca fortificada, ou uma Amostra de Controle de Qualidade (ACQ). Preferencialmente a resposta uma combinao da tendncia e da preciso do ensaio, por exemplo, suas somas. Os fatores so as condies experimentais que, espera-se, possam alterar o resultado analtico.
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Os fatores podem ser quantitativos ou qualitativos, contnuos ou discretos. Exemplos: temperatura 40C ou 60C; tempo de extrao 50min ou 55min; solvente acetonitrila ou etanol; coluna cromatogrfica A ou B; laboratrio A ou B; matriz fgado ou msculo etc. Os nveis dos fatores so os diferentes valores, dois ou mais, que eles podem assumir. O nmero de nveis, estudados para cada fator no precisa ser igual (planejamentos de nveis misturados). No entanto, os planejamentos mais usados experimentalmente so aqueles de mesmo nmero de nveis por cada fator. FiguraA.XII.1 Representao de um sistema ou processo que, sob a ao de diversos fatores, responde de formas diferentes
Fator 1
Resposta1
Fator 2
. . .
Fator N
Sistema ou processo
Resposta 2
. . .
Resposta N
Obs.: Os detalhes ou o mecanismo de funcionamento do sistema ou processo so desconhecidos (caixa preta). possvel apenas alterar os valores dos fatores e medir as respostas resultantes.
Planejamentos Fatoriais Completos

Se todas as combinaes possveis dos nveis de todos os fatores aparecem no planejamento ento ele chamado de planejamento fatorial completo. Um planejamento fatorial completo de f (fatores) e p (nveis de cada fator) designado planejamento pf. O nmero total de experimentos (ou ensaios ou amostras) Nexp em um tal planejamento : Nexp= pf. Exemplos: Um fatorial completo com dois fatores (f=2) e dois nveis por fator (p=2) exigir quatro experimentos (ou ensaios ou amostras): Nexp=22=4. Um fatorial completo com dois fatores (f=2) e trs nveis por fator (p=3) exigir nove experimentos (ou ensaios ou amostras): Nexpf=32=9. Um fatorial completo com sete fatores (f=7) e dois nveis por fator (p=2) exigir 128 experimentos (ou ensaios ou amostras): Nexpf=27=128. Neste Anexo sero discutidos apenas os planejamentos fatoriais de dois nveis, que so os mais aplicados em estudos de robustez. Nesses pla-
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nejamentos atribuem-se, ao nvel mais alto de cada fator, os smbolos + ou +1, ou uma letra maiscula que representa o fator. Ao nvel mais baixo de cada fator, so designados os smbolos ou 1, ou uma letra minscula que representa o fator. Os fatores, por sua vez, so simbolizados por nmeros ou letras em negritos. Os planejamentos fatoriais completos podem ser representados por quadrados, cubos ou hipercubos no espao dimensional dos fatores. A FiguraA.XII.2 apresenta os planejamentos fatoriais completos 22 e 23, e um planejamento fatorial fracionrio 23-1. A matriz quadrada NexpfNexpf, contendo as diversas combinaes de nveis dos fatores para cada experimento (ou ensaio ou amostra) a realizar e as combinaes dos sinais para o clculo da resposta mdia global M e dos efeitos principais dos fatores e de suas interaes, chamada de tabela de coeficientes de contraste. A TabelaA.XII.1 e a TabelaA.XII.2 mostram os coeficientes de contraste para os planejamentos fatoriais completos 22 e 23, respectivamente, dentro de retngulos tracejados. A matriz Nexpff apresentada nas reas sombreadas das tabelas deste Anexo chamada de matriz planejamento [44]. Ela contm todas as combinaes dos nveis dos fatores que sero utilizados em cada experimento planejado. Para construir a tabela de coeficientes de contraste de um planejamento fatorial completo, deve-se proceder da seguinte forma: 1. Constri-se primeiro uma coluna de coeficientes de contrastes da mdia global M contendo somente sinais positivos e com Nexpf elementos ou linhas. 2. Do lado direito da coluna de M, coloca-se a coluna com os coeficientes de contrastes do fator 1, constituda de uma alternncia de sinal negativo e positivo, comeando com o sinal negativo. 3. Do lado direito da coluna do fator 1, coloca-se a coluna com os coeficientes de contrastes do fator 2, constituda de uma alternncia de dois sinais negativos e dois sinais positivos, comeando com os sinais negativos. 4. Do lado direito da coluna do fator 2, coloca-se a coluna com os coeficientes de contrastes do fator 3, constituda de uma alternncia de quatro sinais negativos e quatro sinais positivos, comeando com os sinais negativos. 5. Adicionam-se as colunas dos coeficientes de contrastes dos fatores at o ltimo fator a estudar, sempre dobrando em relao coluna anterior o nmero de sinais negativos e positivos em sequncia da alternncia. Nesse ponto est terminada a cons-
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truo de todas as combinaes de experimentos (ou ensaios ou amostras) a se realizar no estudo de robustez (reas sombreadas nas tabelas de coeficientes de contrastes mostradas neste Anexo). 6. Para obter as colunas dos contrastes dos efeitos de interao basta multiplicar os coeficientes de contraste dos fatores que interagem entre si em cada linha de cada experimento (ou ensaio ou amostra). Assim, para calcular os coeficientes de contraste da coluna da interao 12, multiplicam-se os elementos da coluna do fator 1 pelos elementos da coluna do fator 2, linha aps linha; para obter os coeficientes de contraste da coluna da interao 13, multiplicam-se os elementos da coluna do fator 1 pelos elementos da coluna do fator 3; para determinar os coeficientes de contraste da coluna da interao 123, multiplicam-se os elementos da coluna do fator 1 pelos elementos da coluna do fator 2 e pelos elementos da coluna do fator 3, linha aps linha, e assim por diante at obter a ltima interao de todos os fatores que se deseja estudar. Figura A.XII.2 Representao grfica em um sistema de coordenadas dos planejamentos fatoriais completos
(+) Solvente 3 4
980,508 1327,845 1 1427,147
5
5
8
8
1083,617 151,37 1065,525 1433,305

1
x3
Tempo
( )
3
1
-1
(+) ( ) Temperatura (a) (b)
Te
-1
3
-1
pe
ra
tu
ra
737,731
-1 -1
R1
x1
0 1
0 -1
(c)
x2
Notas: (a) 22, fatores: temperatura e solvente, nas circunferncias os nmero dos experimentos. (b) 23, fatores: temperatura, razo de impregnao e tempo (Figura7 em [41]). (c) Planejamento fatorial fracionrio 23-1 para trs fatores genricos x1, x2 e x3, somente os experimentos 2, 3, 5 e 8 do fatorial completo so realizados (Figura1 em [40]).
Tabela A.XII.1 Planilha para um planejamento fatorial completo 22 com duplicata dos experimentos
Exp./ Amostra 1 2 3 4 Efeitos: M + + + + Fatores 1 2 + + + + Int. 12 + + Respostas Ri,2 Ri,1 57(5) 92(7) 55(2) 66(4) 61(3) 88(8) 53(6) 70(1) Rm,i 59 90 54 68 sp: sefeito Varr,i 8 8 2 8 2,55 1,803
67,75 22,5 13,5 8,5
Fonte: Adaptao da Tabela 3.1 em [4].
182
Notas: Ri,j a resposta da j-sima replicata do i-simo experimento. Rm,i a resposta mdia em cada experimento i replicado. Varr,i a varincia das respostas replicadas em cada experimento i do planejamento fatorial. Obs.: A tabela dos coeficientes de contraste mostrada na matriz 44 circundada pela linha tracejada. A matriz planejamento dos nveis alto e baixo para cada fator em cada experimento mostrada na rea sombreada.
Na Tabela A.XII.1, os fatores so a temperatura (1) nos nveis 40C () e 60C (+) e o solvente de extrao (2) nos nveis acetonitrila () e etanol (+). As respostas R i,1 e R i,2 so as recuperaes percentuais do analito em cada experimento de extrao. A resposta mdia global M=67,75. O efeito principal da temperatura 22,5 maior que o efeito principal do solvente 13,5. O efeito de interao da temperatura e do solvente 8,5 o menor dos efeitos. Teste F: a diferena entre as varincias 8 e 2 no significativa (Fcalc=4, Fcrit;a;n1;n2=Fcrit;0,05;1;1=161,5, p-valor= 29,5%) O desvio-padro agrupado 2,55 e o desvio-padro do efeito 1,80. A ordem sorteada de execuo dos experimentos replicados est indicada pelos nmeros entre parnteses e sobrescritos ao lado das respostas do experimento. Tabela A.XII.2 Planilha para um planejamento fatorial completo 23 com duplicata dos experimentos
Exp./ Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 Efeitos: Fatores
M + + + + + + + + 1 + + + + 2 + + + + + + + 8,88 3 12 + + + +
Interaes
13 + + + + 23 + + + + 0,88 123 + + + + 0,13 Ri,1 56(7) 85(9) 49(11) 64
(2)
Ri,2 52(12) 88(10) 47(15) 62

(1)
Rm,i 54,0 86,5 48,0 63,0 63,0 93,5 58,5 72,0 sp: sefeito
Varr,i 8 4,5 2 2 8 4,5 4,5 8 2,28 1,14
65(13) 92(6) 57(14) 70

(8)
61(5) 95(16) 60(3) 74(4)
67,31 22,88 13,88
8,63 0,88
Fonte: Adaptao das tabelas 3.3 e 3.4 em [4]. Notas: Ri,j a resposta da j-sima replicata do i-simo experimento. Rm,i a resposta mdia em cada experimento i replicado. Varr,i a varincia das respostas replicadas em cada experimento i do planejamento fatorial. Obs.: A tabela dos coeficientes de contraste mostrada na matriz 88 circundada pela linha tracejada. A matriz planejamento dos nveis alto e baixo para cada fator em cada experimento mostrada na rea sombreada.
183
Na Tabela A.XII.2, os fatores so a temperatura (1) nos nveis 40C () e 60C (+); o solvente de extrao (2) nos nveis acetonitrila () e etanol (+); e o tempo de extrao (3) nos nveis 100min () e 120min (+). As respostas Ri,1 e R i,2 so as recuperaes percentuais do analito em cada experimento de extrao. A resposta mdia global M=67,31. O efeito principal da temperatura 22,8 maior que o efeito principal do solvente 13,88, o qual, por sua vez, maior que o efeito principal do tempo 8,88. O efeito de interao da temperatura e do solvente 8,63 o maior dos efeitos de interao, sendo todos os demais efeitos de interao insignificantes (desprezveis). O desvio-padro agrupado 2,28 e o desvio-padro do efeito 1,14. A ordem sorteada de execuo dos experimentos replicados est indicada pelos nmeros entre parnteses e sobrescritos ao lado das respostas do experimento. Fazendo-se um teste F de homogeneidade de varincias [ver a eq.(1) e pargrafos seguintes ou eq.(A.II.2) e pargrafos seguintes], com graus de liberdade do numerador e do denominador iguais a 1 (duplicata menos 1), entre todos os pares de varincias dos experimentos, conclumos que todos os pares tm varincias iguais. Exemplo: Fcalc=8/2=4<161,4=Fcrit,0,05;1;1=Fcrit,a,n1,n2, isto , mesmo as duas varincias mais diferentes no so estatisticamente diferentes entre si (logo, so iguais), no nvel de confiana de 95%. Embora esse no seja um teste de hiptese mltiplo para testar a simultnea igualdade entre todas essas varincias, ele d uma forte evidncia dessa igualdade mltipla. Assim, pode-se assumir que o desvio-padro do efeito sefeito = 1,61 uma medida da incerteza de todos os efeitos. Dessa forma, um Intervalo de Confiana (IC) ao redor do valor dos efeitos pode ser calculado usando o tcrit,a,n = tcrit;0,05;2 = 2,776 para 4 graus de liberdade (n = Nexp Nexpf = 16 8 = 4) e 95% de nvel da confiana. Logo, o IC ao redor de cada efeito ser de (2,776 1,14 = 3,16). Somente os IC dos efeitos de interao 13, 23 e 123 contm o zero e so insignificantes, enquanto os trs efeitos principais e o da interao 12 so significativamente diferentes de zero. As tabelas dos coeficientes de contrastes para os planejamentos fatoriais completos 24 e 25, que levam a 16 e 32 experimentos (ou ensaios ou amostras), respectivamente, so mostradas na Tabela A.XII.3 e na TabelaA.XII.4, respectivamente. Os experimentos (ou ensaios ou amostras) para o estudo de robustez so realizados nas combinaes de nveis dos fatores apresentadas nas
184
colunas dos fatores principais e indicadas nas reas sombreadas nas tabelas de coeficientes de contrastes presentes neste Anexo. Recomenda-se que cada um dos Nexpf experimentos (ou ensaios ou amostras) de um planejamento fatorial sejam replicados J vezes, na medida em que isso no aumente exageradamente o nmero total de experimentos replicados: Nexp=JNexpf (notar a diferena entre os ndices dessa equao). A replicao dos experimentos (ou ensaios ou amostras) reduz a chance de que respostas de experimentos (ou ensaios ou amostras) esprios ou duvidosos (outliers) conduzam super ou subestimao dos efeitos e interaes. A realizao de todos os Nexp experimentos (ou ensaios ou amostras), incluindo as J replicaes, deve ser feita em ordem aleatria e no segundo o seu nmero no planejamento. Na TabelaA.XII.1 e na TabelaA. XII.2, a ordem de realizao dos experimentos (ou ensaios ou amostras) indicada pelos nmeros entre parnteses sobrescritos direita de cada resposta. Para se calcular a mdia global ou grande mdia M usa-se a seguinte equao:
(A.XII.1) Exemplos: A mdia global do fatorial da TabelaA.XII.1 : M=67,75=(59+90+54+68)/4. A mdia global do fatorial da TabelaA.XII.2 : M=67,31=(54,0+86,5+48,0+63,0+63,0+93,5+58,5+72,0)/8 Os efeitos principais dos fatores, tambm chamados de efeitos de primeira ordem, so designados pelos seus nmeros ou smbolos em negrito: 1, 2, 3 etc., ou p, V, T etc. Os efeitos de interao de dois, trs ou mais fatores, tambm chamados de efeitos de segunda, terceira ordem etc., so designados pelas justaposies de seus nmeros ou smbolos em negrito dos fatores que interagem: 12, 13, 123 etc., ou pV, pT, pTV etc. Em geral, um efeito de interao dos fatores torna-se menor quanto maior a ordem desse efeito de interao. O clculo de qualquer efeito principal ou de interao se faz somando as respostas mdias Rm,i dos Nexpf experimentos (ou ensaios ou amos-
185
tras), cada uma multiplicada pelo i-simo sinal + ou que aparece na coluna do efeito na tabela dos coeficientes de contraste do planejamento fatorial (i), dividido por metade dos experimentos (ou ensaios ou amostras) do fatorial:
(A.XII.2)
Exemplos: O efeito principal do fator 1 (temperatura T), na Tabela.A.XII.1, : Efeito1=T=22,5=(59+9054+68)/2. O efeito principal do fator 2 (solvente S), na Tabela.A.XII.1, : Efeito2=S=13,5=(5990+54+68)/2. O efeito de interao dos fatores 1 e 2 (temperatura T e solvente S), na Tabela.A.XII.1, : Efeito 12=TS=8,5=(599054+68)/2. O efeito de interao dos fatores 1, 2 e 3 (temperatura T, solvente S e o tempo t), na Tabela.A.XII.2, : Efeito 123=TSt=0,125=(54+86,5+4863+6393,558,5+72)/4 @0,13. Uma consequncia da eq.(A.XII.2) que todos os efeitos so obtidos da diferena entre duas metades das respostas do planejamento fatorial. Por isso, esses efeitos so tambm chamados de contrastes, na linguagem estatstica. Quando um ou mais experimentos (ou ensaios ou amostras) so replicados, pode-se calcular a varincia de repetitividade varr,i associada da cada i-simo experimento (ou ensaio ou amostra) do planejamento fatorial replicado pela expresso:
(A.XII.3)
Para o caso particular de duplicatas, J=2, a eq. (A.XII.3) se torna:
(A.XII.4)
186
Se considerarmos como vlida a hiptese de que todas as varincias varr,i de cada experimento (ou ensaio ou amostra) replicado so iguais entre si, a chamada hiptese de homoscedasticidade, que pode no ser verdadeira e pode ser testada estatisticamente com um teste F, ento uma varincia agrupada varp pode ser obtida pela equao:
(A.XII.5)
O desvio-padro agrupado, igual raiz quadrada da varincia agrupada, sp=(varp), mede o desvio-padro de uma nica medio da resposta do experimento no caso de validade da hiptese de homoscedasticidade. Portanto, sp uma estimativa da incerteza de repetitividade de cada um dos experimentos (ou ensaio ou amostra) do planejamento fatorial. No caso da validade da hiptese de homoscedasticidade citada anteriormente, e para o planejamento balanceado (mesmo nmero J de rplicas para todos os Nexpf experimentos do planejamento fatorial), o desvio-padro associado a todos os efeitos, isto , a incerteza padro dos efeitos :
(A.XII.6)
Exemplo: Aplicando a eq.(A.XI.5) nos dados da ltima coluna da Tabela.A.XII.1 obtm-se a varincia agrupada: varp=(8+8+8+2)/(84)=26/4=6,5 Logo, o desvio-padro agrupado sp = 6,5 = 2,5495 e os experimentos foram duplicados, J = 2. Ento, aplicando a eq.(A.XII.6): sefeito=2,5495/2 =1,803. Se a incerteza combinada do ensaio j estiver sido calculada, conforme as metodologias apresentadas na seo 8 Incerteza de Medio Analtica, da Parte II, ela (ou seu quadrado) deve ser preferencialmente usada no lugar de sp ou de sp2 na eq.(A.XII.6). Na falta da incerteza combinada, prefere-se tambm usar o desvio-padro da preciso intermediria sR no lugar de sp na eq.(A.XII.6). Um teste t bilateral pode ser feito para um dado nvel de confiana 1a/2 e grau de liberdade n igual ao nmero total de experimentos replicados menos o nmero de experimentos do fatorial n=NexpNexpf, encontrando-se na tabela de pontos percentuais de t de Student, o t crtico, tn,1a/2.
187
O efeito somente considerado significativo, isto , diferente de zero, se seu mdulo for maior que tn,1a/2 sefeito. Em geral se usa a=0,05, ou seja 95% de nvel de confiana. Existem outras formas de testar a significncia de um dado efeito como usando ANOVA ou um grfico de probabilidades normais [4,19,29,43,44]. TabelaA.XII.3 Tabela dos coeficientes de contraste para um planejamento fatorial completo 24
Exp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M + + + + + + + + + + + + + + + + 1 + + + + + + + + 2 + + + + + + + + 3 + + + + + + + + 4 + + + + + + + + 12 + + + + + + + + 13 + + + + + + + + 14 + + + + + + + + 23 + + + + + + + + 24 + + + + + + + + 34 123 124 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 134 + + + + + + + + 234 1.234 + + + + + + + + + + + + + + + +
Obs.: A matriz planejamento dos nveis alto e baixo para cada fator em cada experimento mostrada na rea sombreada.
Exemplo: Usando o fatorial 24 da TabelaA.XII.3, estuda-se a resoluo de separao entre dois picos cromatogrficos em funo da variao em dois nveis dos fatores: 1= temperatura; 2 = percentagem do solvente A, na mistura de solventes; 3 = velocidade do fluxo do solvente; e 4 = tipo do solvente A, etanol () ou acetonitrila (+). As respostas para os 16 experimentos 1 a 16, no replicados nessa ordem, so: 52, 61, 124, 113, 85, 66, 185, 192, 98, 86, 201, 194, 122, 139, 289, 286 (valores da Tabela 4.2 em [4]). Calculam-se os contrastes dos efeitos principais dos fatores 2 e 4, do efeito de interao desses dois fatores e do efeito de interao dos quatro fatores, usando a eq.(A.XII.2) e os sinais das colunas 2, 4, 24 e 1.234 da TabelaA.XII.3, respectivamente, a saber:
188
Clculos semelhantes levam a todos os valores dos demais contrastes: 1 =-2,38; 2 =109,38; 3 =54,38; 12 =-1,13; 13 =2,88; 14 =1,13; 23 =25,63; 24 = 21,88; 34 = 9,88; 123 = 2,63; 124 = -2,63; 134 = 5,38; 234 = 0,13; 1.234 = -8,88. Como no h replicao, no se pode calcular as varincias varr,i e nem o sp. TabelaA.XII.4 Tabela dos coeficientes de contraste para um planejamento fatorial completo 25
Exp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Exp. M + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + M 1 + + + + + + + + + + + + + + + + 1 2 + + + + + + + + + + + + + + + + 2 3 + + + + + + + + + + + + + + + + 3 4 + + + + + + + + + + + + + + + + 4 5 12 25 124 135 235 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 5 12 25 124 135 235 345 1.235 1.345 2.345 12.345 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 345 1.235 1.345 2.345 12.345
Obs.: Para economizar espao, so mostrados apenas os coeficientes de contrastes da media global, dos cinco fatores principais e de dez interaes dos fatores. A matriz planejamento dos nveis alto e baixo para cada fator em cada experimento mostrada na rea sombreada. Fica como exerccio a obteno dos coeficientes de contraste das outras 16 interaes: 13, 14, 15, 23, 24, 34, 35, 45, 123, 125, 134, 145, 234, 245, 1.234, 1.245, que esto faltando para completar a matriz 3232 da tabela de coeficientes de contrastes desse planejamento.
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Planejamentos Fatoriais Fracionrios

Quando o nmero de parmetros superior a cinco, o total de experimentos de um planejamento fatorial completo se torna muito grande. Nesses casos pode-se reduzir o tempo e o custo de realizao do estudo de robustez, diminuindo o nmero de experimentos a realizar, por meio do uso dos chamados planejamentos fatoriais fracionrios. Nos planejamentos fracionrios, no possvel estimar todos os efeitos e as interaes possveis de maneiras completamente independentes. Efeitos principais se confundem com os de interao e estes se confundem com efeitos de interao de ordem superior. Devido a esses confundimentos, os contrastes calculados por meio da tabela de coeficientes de contrastes no so os efeitos principais puros ou os efeitos de interao puros de uma dada ordem. Os contrastes so, na verdade, a soma de dois ou mais efeitos de ordens diferentes. Lembrando que, em geral, os efeitos de ordem superior so menores que os efeitos de ordem inferior. Esses contrastes estimam aproximadamente bem o efeito de ordem inferior. A literatura especializada usa novos smbolos para esses contrastes e no os smbolos dos nmeros em negrito. Por motivo de simplificao, continuaremos a us-los neste Manual. Assim, em trabalhos com planejamentos fatoriais fracionrios, procura-se, em geral, construir planejamentos fatoriais que, de preferncia, s confundam os efeitos principais com os efeitos de interao de ordem trs ou superiores do planejamento, isto , no h confundimento entre efeito principal e efeito de interao de ordem dois. Por causa desses inconvenientes, s utilizamos planejamentos fatoriais fracionrios para fazer uma triagem entre os muitos fatores a estudar, de modo a evidenciar os fatores que apresentam maiores efeitos. Aps a triagem dos fatores que mais afetam o procedimento analtico com um planejamento fatorial fracionrio, pode ser conveniente ou necessrio fazer-se um estudo mais detalhado dos efeitos principais e de interaes desses fatores mais importantes, agora em menor nmero, com um planejamento fatorial completo. Um planejamento fatorial fracionrio de frao meia para planejamentos com dois nveis e f fatores reduz o nmero de experimentos pela metade, relativamente ao planejamento completo. Tal planejamento de frao meia denotado 2f1. Assim, um planejamento de frao meia para trs fatores denotado 231 e tem quatro (Nexpf=231=22=4) experimentos em vez dos oito experimentos do fatorial completo 23. Analogamente, o fatorial de frao meia 251 tem 16 (Nexpf=251=24=16) experimentos, em vez dos 32 do fatorial completo 25.
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Um fatorial fracionrio de frao um quarto () para planejamentos com dois nveis e f fatores reduz o nmero de experimentos para a quarta parte, relativamente ao planejamento completo. Tal planejamento de frao denotado 2f2. Assim, um planejamento de frao para cinco fatores denotado 252 e tem oito (Nexpf=252=23=8) experimentos em vez dos 32 do fatorial completo 25. Um fatorial de frao para trs fatores no pode existir, pois resultaria em um nmero de experimentos (232=2) menor que o nmero de fatores a estudar. Em planejamentos fatoriais fracionrios 2fk, h uma resoluo mxima que se pode alcanar igual a f, no mximo. O planejamento de resoluo mxima tem a menor quantidade de confundimentos entre efeitos e tambm a maior eficincia para detectar efeitos principais dos f fatores estudados. Exemplo: Para o planejamento fatorial fracionrio 241 podem-se construir planejamentos de resoluo quatro ou trs; no caso do planejamento fatorial fracionrio 283 podem-se construir planejamentos de resoluo cinco, quatro ou trs. A notao para indicar a resoluo de um planejamento fatorial fracionrio um ndice em algarismos romanos. Exemplos: O planejamento tem resoluo quatro, enquanto o planejamento de resoluo trs estuda o mesmo nmero de fatores com o mesmo nmero de experimentos (ensaios), mas menos eficiente que o planejamento . O planejamento tem resoluo trs, a menor possvel para um fatorial 274 (esse o planejamento que aparece na Tabela11 da Deciso 2002/657/EC [10] (ver TabelaA.XII.7). No mostraremos aqui como se obtm o valor da resoluo de um planejamento fatorial fracionrio (ver a bibliografia especializada [4, 29,43]). Planejamentos fatoriais fracionrios de resoluo trs confundem ou efeitos principais com os efeitos de interao de segunda ordem (e.g., ). Os planejamentos fatoriais fracionrios de resoluo quatro no confundem mais seus efeitos principais com os efeitos de interao de segunda ordem, mas os confundem com os de terceira ordem (e.g., ou ou ). Os planejamentos fatoriais fracionrios de resoluo cinco somente confundem efeitos principais com os efeitos de interao de quarta ordem (e.g., ou ou ). Quanto mais alta a resoluo mais pura fica a estimativa dos efeitos principais a partir dos contrastes de primeira ordem. Em alguns casos, possvel construir diferentes planejamentos fatoriais fracionrios com a mesma resoluo, quando ela menor que a resoluo mxima. Esses diferentes planejamentos tm diferentes eficincias diferentes podem ser construentre si. Exemplo: Trs planejamentos dos com a mesma resoluo trs. O planejamento fatorial fracionrio com o menor nmero de experimentos ainda maior que o de fatores chamado de planejamento fatorial fracionrio saturado. Exemplo: Para sete fatores o planejamento fatorial
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fracionrio saturado 274, que um planejamento de frao 1/16, e resulta em oito (23) experimentos em vez dos 128 experimentos do planejamento completo 27. Para cinco fatores o planejamento fatorial fracionrio saturado 252, que tambm tem oito experimentos. Para cinco fatores no existe o planejamento fracionrio de frao 1/8, que resultaria em menos experimentos (253=4) que fatores. A Tabela A.XII.5, a Tabela A.XII.6 e a Tabela A.XII.7 mostram os , coeficientes de contraste para os planejamentos fatoriais fracionrios e , respectivamente, todos de apenas oito experimentos (ensaios). Para construir a tabela de coeficientes de contraste de um planejamento fatorial fracionrio de frao meia para estudar f fatores, procede-se da seguinte forma: 1. Constri-se primeiramente uma tabela de coeficientes de contrastes da mdia e dos efeitos principais de um planejamento fatorial completo, para um fator a menos do que se deseja. Assim, para obter o planejamento 241 para quatro fatores, necessrio construir a tabela do planejamento completo 23. Dessa forma, tm-se os coeficientes de contrastes para a mdia global e para os f1 fatores que se deseja estudar. 2. Justape-se direita da tabela construda, no passo anterior, a coluna dos contrastes do f-simo fator obtido, multiplicando-se os elementos das colunas anteriores linha a linha. 3. Constri-se cada uma das colunas das interaes da mesma forma que para um planejamento fatorial completo, multiplicando os elementos das colunas dos fatores que interagem. Tabela A.XII.5 Planilha para um planejamento fatorial fracionrio sem replicao
Exp./ Fatores Interaes Amostra M 1 2 3 4 12 13 14 23 24 1 + + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + 5 + + + + 6 + + + + + 7 + + + + + 8 + + + + + + + + + + Contr.: 138,87 2,25 114,75 51,75 69,75 8,75 24,75 26,75 26,75 24,75
Fonte: Adaptao das tabelas 4.4 e 4.5 em [4]. Notas: Contr. = contrastes. Relao geradora do fator 4: 4=123. Obs.: A matriz planejamento dos nveis alto e baixo para cada fator em cada experimento mostrada na rea sombreada.
34 + + + +
8,75
R
52 86 201 113 122 66 185 286
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Na Tabela A.XII.5, os fatores so a temperatura (1) nos nveis 40C () e 60C (+); o solvente de extrao (2) nos nveis acetonitrila () e etanol (+); o tempo de extrao (3) nos nveis 100min () e 120min (+); e a granulometria da amostra sob extrao (4) nos nveis 150 Mesh () e 200Mesh (+). As respostas R so as recuperaes percentuais do analito em cada experimento (ou ensaio ou amostra) de extrao. Os padres de confundimento so: 1=234, 2=134, 3=124, 4=123, 12=34, 13=24, 14=23 e I=1234. Tabela A.XII.6 Planilha para um planejamento fatorial completo em replicao
Exp./ Fatores Amostra M 1 2 3 4 1 + 2 + + + 3 + + + 4 + + + 5 + + + 6 + + + 7 + + + 8 + + + + + Contr.: 141,0 1,5 111,0 54,5 67,0
Fonte: Adaptao das tabelas 3.3 e 3.4 em [4]. Notas: Contr. = contrastes. Relaes geradoras: 4=123, 5=23. Obs.: A matriz planejamento dos nveis alto e baixo para cada fator em cada experimento (ou ensaio) mostrada na rea sombreada.
5 + + + + 4,5
12 + + + +
13 + + + +
Interaes 14 15 + + + + + + + +
23 + + + +
R 52 92 198 113 122 76 189 286
Os fatores so a temperatura (1) nos nveis 40C () e 60C (+); o solvente de extrao (2) nos nveis acetonitrila () e etanol (+); e o tempo de extrao (3) nos nveis 100min () e 120min (+); a granulometria da amostra sob extrao (4) nos nveis 150 Mesh () e 200Mesh (+); e o volume de solvente de extrao (5) nos nveis 150ml () e 200ml (+). As respostas R so as recuperaes percentuais do analito em cada experimento (ou ensaio ou amostra) de extrao. Os padres de confundimento so: 2=35, 3=25, 5=23, 1=234, 2=134, 3=124, 4=123 e I=1234. Para evitar erros, sempre aconselhvel usar uma planilha eletrnica para obter as tabelas dos coeficientes de contrastes dos planejamentos fatoriais desejados e para os clculos de seus efeitos. As tabelasA.XII.8, A.XII.9, A.XII.10,A.XII.11 eA.XII.12 apresentam os coeficientes de contrastes para os planejamentos fatoriais fracionrios
193
no saturados , , , ,e . Todos esses planejamentos apresentam resoluo mxima e no misturam os efeitos principais com os de interao de segunda e nem de terceira ordens. Assim, eles tm eficincias, suficientemente altas para os estudos de robustez e levam a 32 (Nexpf=32) experimentos no replicados. Essas tabelas foram construdas sob a hiptese de que os efeitos principais dos fatores diminuem do primeiro fator para o ltimo. Se essa ordem de importncia for verificada aps o estudo de robustez, ento esses planejamentos so os de maior eficincia para detectar os efeitos principais dos fatores, apesar dos confundimentos inerentes dos fatoriais fracionrios. Por isso, no uso dessas tabelas, sempre conveniente ordenar, com base nas expectativas e experincias anteriores, os fatores em ordem decrescente de importncia esperada para atribuir-lhes os seu smbolos numricos 1, 2, 3 etc., procurando fazer com que o fator1 seja o mais importante e assim sucessivamente, aps o estudo de robustez. As planilhas eletrnicas para planejamentos fatoriais fracionrios das tabelasA.XII.7, A.XII.8, A.XII.9, A.XII.10, A.XII.11 e A.XII.12, assim como outros fatoriais fracionrios, envolvendo no mximo 32 (Nexpf32) experimentos no replicados, podem ser encontradas, juntamente com este Manual de Garantia da Qualidade Analtica, no stio do Mapa: <www.agricultura. gov.br>. Dessa forma o usurio deste Manual poder sempre encontrar um planejamento fatorial mais conveniente aos seus interesses e objetivos. As planilhas eletrnicas para planejamentos fatoriais completos at sete fatores e planejamentos fatoriais fracionrios at seis fatores (231, 241, 251, 252, 261, 262, 263) so apresentadas na referncia [40] e esto disponveis no stio: <http://lqta.iqm.unicamp.br/>. O conjunto das 12 tabelas de coeficientes de contrates apresentadas no AnexoXII disponibiliza ao usurio deste Manual de Garantia da Qualidade Analtica uma gama de possveis escolhas de planejamentos para realizar seu estudo de robustez particular. Os vrios exemplos numricos includos permitem um autotreinamento do pessoal tcnico, refazendo os clculos apresentados. Aconselhamos que, para um nmero mais baixo de fatores, o usurio faa mais replicaes de modo a, se possvel, realizar 32 ou no mximo 48 experimentos no total. Por exemplo, para os planejamentos fatoriais 23 ou 241 ou 252 ou 274 poder-se-ia realizar quatro, cinco ou seis replicaes por experimento; para os planejamentos fatoriais 24 ou 251 ou 262, a realizao de duas replicaes por experimento j levaria aos 32 experimentos e de triplicatas a 64 experimentos. Os nmeros de replicaes para cada experimento de um planejamento fatorial no precisam ser todos iguais (planejamento no balance-
194
ado). Pode-se, inclusive, no replicar alguns experimentos. Sempre que possvel procure replicar no mnimo dois experimentos, replicando um experimento entre aqueles que contiverem o maior nmero de sinais negativos (nveis baixo) e outro entre aqueles de maior nmero de sinais positivos (nveis altos) na matriz de planejamento. Para facilitar a realizao dos experimentos na bancada, aconselhvel construir um formulrio de registro dos experimentos, contendo a matriz de planejamento com os valores dos nveis de cada fator no lugar dos sinais + ou . possvel tambm substituir os nmeros em negrito, smbolos dos fatores, por sua identificao textual. Esse formulrio conter tambm os campos para anotar os valores das respostas replicadas, avaliadas em cada experimento. Um exemplo de formulrio de registros apresentado na TabelaA.XII.13, para o planejamento 23 apresentado na TabelaA.XII.2, com a adio de mais replicaes de alguns dos experimentos de forma no balanceada.
Critrios de Aceitao, Anlise dos Resultados dos Planejamentos Fatoriais

De posse dos valores dos efeitos e ou contrastes do planejamento fatorial realizado, necessrio verificar se o valor de algum efeito/contraste principal ou de interao de segunda ordem, demonstrado como significativo, maior que trs vezes o desvio-padro da preciso intermediria (reprodutibilidade interna) sR do procedimento analtico (Ateno: essa comparao com sR e no com CVR). Se todos os efeitos/contrastes principais ou de segunda ordem so menores que 3sR, ento o procedimento analtico poder ser classificado como procedimento analtico robusto e adequado para as anlises de rotina, na faixa de variao estudada dos fatores de influncia. Especificar essas faixas por fator. Se um ou mais desses efeitos/contrastes de segunda ordem maior que 3 sR, o procedimento analtico dever ser classificado como procedimento analtico de uso restrito, na faixa de variao estudada dos fatores de influncia. Especificar essas faixas por fator. Nesse caso pode-se tambm refazer o estudo de robustez para aqueles fatores que foram significativos e uma faixa de variao (nvel alto menos nvel baixo) mais curta, verificando a adequao nessa nova faixa. Se um ou mais desses efeitos/contrastes principais maior que 3 sR, o procedimento analtico dever ser classificado como procedimento analtico no robusto e inadequado para as anlises de rotina, na faixa de variao estudada dos fatores de influncia.
195
TabelaA.XII.7 Tabela dos coeficientes de contraste para um planejamento fatorial fracionrio saturado com triplicata dos ensaios
Exp./
Amostr.
Fatores M + + + + + + + + 1 + + + + 2 + + + + 3 + + + + 4 + + + + 5 + + + + 6 + + + + 7 + + + +
Respostas Ri,1 Ri,2 Ri,3 54 65(9) 51(17) 50(2) 50(13) 67(6) 42(22) 60(8)
(7)
Rm,i Varr,i 56 4 66 1 51 36 52 4 54 16 70 9 42 9 64 16 sp: 3,45 sefeito 1,41
1 2 3 4 5 6 7 8
58 66(21) 45(11) 52(23) 58(5) 70(20) 39(14) 64(18)

(12)
56 67(10) 57(15) 54(1) 54(24) 73(16) 45(3) 68(4)

(19)
Contr.: 56,88 12,25 -9,25 1,25 -0,75 6,75 0,25 3,75

Fonte: Adaptao das tabelas 4.10 e 4.11 em [4]. Nota: Contr. = contrastes. Relaes geradoras: 4=123, 5=23, 6=13, 7=12.
Obs.: Esse o planejamento fatorial que aparece na Tabela11 da Deciso 2002/657/EC [10], usando letras maisculas e minsculas no lugar dos sinais e em ordem transposta dessa tabela. As correspondncias dos smbolos dos fatores entre essas duas tabelas so: 1=C, 2=B, 3=A, 4=G, 5=D, 6=E, 7=F.
Como a TabelaA.XII.7 apresenta um planejamento saturado, os contrastes dos efeitos principais j se confundem com os contrastes de efeitos de interao de segunda ordem e com os contrastes de interaes de ordem superiores: 1=27=36=45=234, 2=17=35=46=134, 3=15=25=47=124, 4=12=34=56=123, 5=13=24=57, 6=14=23=67, 7=15=26=37, Se considerarmos as varincias dos oito experimentos iguais entre si (hiptese de homoscedasticidade), ento o intervalo de confiana para 95% de nvel de confiana e grau de liberdade n=NexpNexpf=248=16 e t crtico tcrit,a,n=tcrit;0,025;16=2,120 ser: IC=tcrit,a,nsefeito=2,121,41=2,99. Assim, conclumos que somente os contrastes relacionados aos efeitos principais 1, 2, 5 e 7 so significativamente diferentes de zero. No entanto, essa concluso deve ser encarada com cautela, pois um teste F [vide eq.(1) e pargrafos seguintes ou a eq.(A.II.2) e pargrafos seguintes] entre os pares das varincias dos experimentos, com graus de liberdade dois (triplicata menos 1) para o numerador e denominador, tem um F crtico igual a Fcrit,a,n1,n2=Fcrit;0,05;2;2=19,00, porm, o Fcalc para os experimentos trs e dois, Fcalc,a,n1,n2=36/1=36, maior que 19, implicando em diferena significativa dessas duas varincias, logo na heterocedasticidade dessas duas varincias. No calculamos aqui os contrastes associados aos efeitos de interao de segunda ordem. Em um estudo de robustez pode valer a pena, tambm, calcul-los e estudar suas significncias. Lembramos que os contrastes em um planejamento fatorial fracionrio no medem os efeitos puros devido aos confundimentos. Nesse exemplo, seria conveniente fazer um estudo com um planejamento completo 24 dos fatores 1, 2, 5 e 7.
196
TabelaA.XII.8 Tabela dos coeficientes de contraste para um planejamento fatorial fracionrio

Exp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Exp. M + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + M 1 + + + + + + + + + + + + + + + + 1 2 + + + + + + + + + + + + + + + + 2 3 + + + + + + + + + + + + + + + + 3 4 + + + + + + + + + + + + + + + + 4 5 + + + + + + + + + + + + + + + + 5 6 + + + + + + + + + + + + + + + + 6 12 13 14 15 16 23 24 25 26 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 12 13 14 15 16 23 24 25 26
Nota: Relaes geradoras: 6=12345. Obs.: Para economizar espao, apenas os coeficientes de contrastes da mdia global, dos seis fatores principais e de nove interaes de fatores so mostrados. A matriz planejamento dos nveis alto e baixo para cada fator em cada experimento (ou ensaio ou amostra) mostrada na rea sombreada.
197

Exp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Exp. M + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + M 1 + + + + + + + + + + + + + + + + 1 2 + + + + + + + + + + + + + + + + 2 3 + + + + + + + + + + + + + + + + 3 4 + + + + + + + + + + + + + + + + 4 5 + + + + + + + + + + + + + + + + 5 6 + + + + + + + + + + + + + + + + 6 7 + + + + + + + + + + + + + + + + 7 12 13 14 15 16 17 23 24 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 12 13 14 15 16 17 23 24
Nota: Relaes geradoras: 6=12345, 7=2345. Obs.: Para economizar espao, apenas os coeficientes de contrastes da mdia global, dos sete fatores principais e de oito interaes de fatores so mostrados. A matriz planejamento dos nveis alto e baixo para cada fator em cada experimento (ou ensaio ou amostra) mostrada na rea sombreada.
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Exp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Exp. M + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + M 1 + + + + + + + + + + + + + + + + 1 2 + + + + + + + + + + + + + + + + 2 3 + + + + + + + + + + + + + + + + 3 4 + + + + + + + + + + + + + + + + 4 5 + + + + + + + + + + + + + + + + 5 6 + + + + + + + + + + + + + + + + 6 7 + + + + + + + + + + + + + + + + 7 8 + + + + + + + + + + + + + + + + 8 12 13 14 15 16 17 18 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 12 13 14 15 16 17 18
Nota: Relaes geradoras: 6=12345, 7=2345, 8=1345. Obs.: Para economizar espao, apenas os coeficientes de contrastes da mdia global, dos oito fatores principais e de sete interaes de fatores so mostrados. A matriz planejamento dos nveis alto e baixo para cada fator em cada experimento (ou ensaio ou amostra) mostrada na rea sombreada.
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Exp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Exp. M + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + M 1 + + + + + + + + + + + + + + + + 1 2 + + + + + + + + + + + + + + + + 2 3 + + + + + + + + + + + + + + + + 3 4 + + + + + + + + + + + + + + + + 4 5 + + + + + + + + + + + + + + + + 5 6 + + + + + + + + + + + + + + + + 6 7 + + + + + + + + + + + + + + + + 7 8 + + + + + + + + + + + + + + + + 8 9 + + + + + + + + + + + + + + + + 9 12 13 14 15 16 17 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 12 13 14 15 16 17
Nota: Relaes geradoras: 6=12345, 7=2345, 8=1345, 9=1245. Obs.: Para economizar espao, apenas os coeficientes de contrastes da mdia global, dos nove fatores principais e de seis interaes de fatores so mostrados. A matriz planejamento dos nveis alto e baixo para cada fator em cada experimento (ou ensaio ou amostra) mostrada na rea sombreada.
200
TabelaA.XII.12: Tabela dos coeficientes de contraste para um planejamento fatorial fracionrio

Exp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Exp. M + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + M 1 + + + + + + + + + + + + + + + + 1 2 + + + + + + + + + + + + + + + + 2 3 + + + + + + + + + + + + + + + + 3 4 + + + + + + + + + + + + + + + + 4 5 + + + + + + + + + + + + + + + + 5 6 + + + + + + + + + + + + + + + + 6 7 + + + + + + + + + + + + + + + + 7 8 + + + + + + + + + + + + + + + + 8 9 + + + + + + + + + + + + + + + + 9 10 12 13 14 15 16 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 10 12 13 14 15 16
Nota: Relaes geradoras: 6=12345, 7=2345, 8=1345, 9=1245, 10=1235. Obs.: Para economizar espao, apenas os coeficientes de contrastes da mdia global, dos dez fatores principais e de cinco interaes de fatores so mostrados. A matriz planejamento dos nveis alto e baixo para cada fator em cada experimento (ou ensaio ou amostra) mostrada na rea sombreada.
201
Tabela A.XII.13
Lanagro-MG/CGAL/SDE/Mapa Formulrio de Registro de Estudo de Robustez com Planejamento Fatorial Laboratrio WelMAG Procedimento em Validao: POP-LWM-019 - Anlise de Resduos de Medicamentos em Carne Bovina por HPLC
Resp. da Validao: _________________________________ Tcnico da Validao: __________________________________
Data Incio: 19ago10 Data Fim: 11set10
Fatores 1Temperatura Exp./ Ensaio/ Amostra 1 2 3 4 5 6 7 8 3 Tempo Extr 2 Solv Extr
Respostas replicadas
Ri,1
Ri,2
Ri,3
Ri,4
Ri,5
Ri,6
40 60 40 60 40 60 40 60
MeCN MeCN EtOH EtOH MeCN MeCN EtOH EtOH
100 100 100 100 120 120 120 120
56(7) 85(9) 49(11) 64(2) 65(13) 92(6) 57(14) 70(8)
54(26) 88(10) 47(15) 63(18) 63(22) 95(16) 60(3) 71(17)
55(23) 48(27) 63(25) 61(5)
53(19)
54(21)
52(12)
62(1)
72(28)
73(20)
72(24)
74(4)
Obs.: Os fatores so a temperatura de extrao (1) nos nveis 40C () e 60C (+); o solvente de extrao (2) nos nveis MeCN=acetonitrila () e EtOH=etanol (+); e o tempo de extrao (3) nos nveis 100min () e 120min (+). As respostas Ri,1 e R i,6 so as recuperaes percentuais do analito em cada experimento de extrao. Planejamento no balanceado dos Nexp=8 ensaios do planejamento fatorial com Nexp=28 ensaios no total. Verifica-se que com esses novos resultados as mdias Rm,i dos experimentos 1 a 8 so as mesmas que aparecem na TabelaAXII.2. Logo os valores dos efeitos principais e de interao tambm so os mesmos. As varincias varr,i, para os experimentos 1 a 8, so agora: 2; 4,5; 1; 0,67; 4; 4,5; 4,5 e 2. Um novo teste F entre as duas varincias mais diferentes entre si (4,5 e 0,67) resulta em: Fcalc=4,5/0,67=6,7<10,1=Fcrit,0,05;1;3=Fcrit,a,n1,n2, isto , essas duas varincias ainda so estatisticamente iguais no nvel de confiana de 95%.
202
O novo valor do desvio-padro agrupado sp=[(52 + 14,5 + 21 + 30,67 + 24 + 14,5 + 14,5 + 52)/(5+1+2+3+2+1+1+5)] = [45,51 / 20] = 1,51. E o novo desvio-padro dos efeitos sefeito=0,57. O tcrit,a,n crtico para 20 graus de liberdade (n=NexpNexpf=288=20) : tcrit,a,n=tcrit;0,05;20=2,09. O IC ao redor de cada efeito ser de (2,090,57=1,19). Logo, como antes, os efeitos de interao 13, 23 e 123 so insignificantes, enquanto os trs efeitos principais e o da interao 12 so significativamente diferentes de zero.
203
ANOTAES
204
ANEXO XIII
Referncias Normativas e Bibliogrficas
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205
10. EUROPEAN COMMISSION (EC). Commission Decision 2002/657/CE of 12 august 2002. Implemementing Council Directive 96/23/EC concerning performance of analytical methods and the interpretation of results. Oficial Journal of the European Communities, 2002, L 221/8. 11. EUROPEAN COMMISSION (EC). Directorate general for health and consumer affair DG SANCO. SANCO 10684 (01/01/2010). Method Validation and Quality Control Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food And Feed. Substitui a SANCO 3131/2007. 12. EUROPEAN COMMISSION (EC). Commission Regulation. EC n. 333/2007 of 28 March 2007 laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels of lead, cadmium, mercury, inorganic tin, 3-MCPD and benzo(a) pyrene in foodstuffs. 13. EUROPEAN COMMISSION (EC). Regulamento CE n. 882/2004 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 29 de abril de 2004. Relativo aos controles oficiais realizados para assegurar a verificao do cumprimento da legislao relativa aos alimentos para animais e aos gneros alimentcios e das normas relativas sade e ao bem-estar dos animais. Jornal Oficial da Unio Europeia, p.1-141, 30 abr. 2004. L 165. 14. ELLISON, S. L. R.; BARWICK, V. J.; FARRANT, T. J. D. Practical statistics for the analytical scientist a bench guide. Cambridge: RSC Publishing, 2009. ISBN 978-0-85404-131-2. 15. EURACHEM. EURACHEM Guide: the fitness for purpose of analytical methods a laboratory guide to method validation and related topics. First Internet Version Dec. 1998. Disponvel em: <www. eurachem.org>. ISBN: 0-948926-12-0. 16. EURACHEM/CITAC. Guide: quantifying uncertainty in analytical measurement. 2 ed. 2000. Disponvel em: <www.eurachem.org>; <www.measurementuncertainty.org/>. ISBN 0 948926 15 5. 17. EURACHEM/CITAC. Guide: measurement uncertainty arising from sampling a guide to methods and approaches. Produced jointly with EUROLAB, Nordtest and the UK RSC Analytical Methods Committee. 2007. 18. EURACHEM/CITAC. Guide: use of uncertainty information in compliance assessment. ELLISON, S. L. R. (LGC, UK); WILLIAMS, A. (UK) (Ed.). 2007. 19. HINES, W. W. et al. Probabilidade e estatstica na engenharia. 4. ed. Livros Tcnicos e Cientficos (LTC). Rio de Janeiro, 2006. Traduo de: John Willey & Sons. Probability and Statistics in Engineering. 4th ed. 2003. ISBN 85-216-14748.
206
20. HUBER, L. Validation and qualification in analytical laboraories. Boca Raton, USA: Interpharm/CRC Press, 1998. ISBN 1-57491-080-9. 21. INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, NORMALIZAO E QUALIDADE INDUSTRIAL (INMETRO). Orientao sobre validao de mtodos de ensaios qumicos. Rio de Janeiro, fev. 2010. 20p. DOQ-CGCRE-008 Ver 03. 22. INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, NORMALIZAO E QUALIDADE INDUSTRIAL (INMETRO). Vocabulrio internacional de metrologia: conceitos fundamentais e gerais e termos associados (VIM 2008). Rio de Janeiro, 2009. [VIM2009]. Portaria Inmetro no 319, de 23 de outubro de 2009. Traduo autorizada pelo BIPM da 3. ed. internacional do VIM International Vocabulary of Metrology. Basic and general concepts and associated terms. JCGM 200:2008. 23. INTERNACIONAL STANDARDS ORGANIZATION (ISO). General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. Geneva, 2005. 28 p. ABNT NBR ISO/IEC 17025:2005 Verso Corrigida 2:2006. Requisitos gerais para a competncia de laboratrios de ensaio e calibrao. Disponvel em: <www. abnt.org.br>. ISO/IEC 17025. 24. INTERNACIONAL STANDARDS ORGANIZATION (ISO). Capability of detection part 1: terms and definitions. Geneva, 1997. 10 p. ISO 11843-1. 25. INTERNACIONAL STANDARDS ORGANIZATION (ISO). Capability of detection part 2: methodology in the linear calibration Case. Geneva, 2000. 24 p. ISO 11843-2. 26. INTERNACIONAL STANDARDS ORGANIZATION (ISO). Accuracy (trueness and precision) of method measurements and results part 2: basic method for the determination of the repeatability and reproducibility of a standard measurement method. Geneva, 1994. 42 p. ISO 5725-2. 27. INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY (IUPAC) (IUPAC). International Organization for Standardization (ISO). Association of Official Analytical Chemists (AOAC International). Eurachem. Technical Report Harmonised Guidelines for the Use of Recovery Information in Analytical Measurement. Prepared by THOMPSON, Michael et al. 1998. 28. JOINT COMMITTEE FOR GUIDES IN METROLOGY (JCGM). Working Group 2. International Vocabulary of Metrology Basic and General Concepts and Associated Terms (VIM). Vocabulaire International de Mtrologie Concepts Fondamentaux et Gnraux et Termes Associs (VIM). BIPM, 2008.
207
29. MASSART, D. L. et al. Handbook of Chemometrics and Qualimetrics Part A. Amsterdam: Elsevier, 1997. ISBN 0-444-89724-0 Set ISBN 0-444-82854-0. 30. MILLER, J. N.; MILLER, J. C. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry. 5th ed. Harlow, England: Pearson Prentice Hall, 2005. 268 p. ISBN-10: 0-13-129192-0, ISBN-13: 978-0131291928. 31. MONTGOMERY, D. C.; PECK, E. A.; GEOFFREY, V. C. Introduction to Linear Regression Analysis. 4th ed. John Willey & Sons, 2006. ISBN 0-471-75495-1. 32. PETER C. M.; RICHARD, E. Z. Statistical Methods in Analytical Chemistry. 2nd ed. New York: Wiley Intersciences Publications, John Willey & Sons, 2000, p. 424. ISBN 0-471-29363-6. 33. PRICHARD, E.; BARWICK, V. Quality Assurance in Analytical Chemistry. Analytical Techniques in the sciences. John Wiley & Sons, 2007. ISBN 978-0-470-01204-8. 34. SOUZA, S. V. C. de. Procedimento para Validao Intralaboratorial de Mtodos de Ensaio: delineamento e aplicabilidade em anlise de alimentos. 2007. Tese (Doutorado) Faculdade de Farmcia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, 2007. E-mail: <scheillavitorino@terra.com.br>. 35. THOMPSON, M.; ELLISON, S. L. R.; WOOD, R. Harmonized Guidelines for Single Laboratory Validation of Methods of Analysis. Pure & Appl. Chem., 2002. 36. THOMPSON, M; WOOD, R. Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in Analytical Chemistry Laboratories. Pure & Appl. Chem., v. 67, n. 4, p. 649-666, 1995. 37. AlgoritmoSimplex. Disponvel em: <www.chem.uoa.gr/applets/ AppletSimplex/Appl_Simplex2.html>. Esse stio tem um simulador grfico do algoritmo Simplex. Disponvel em: <www.grabitech. se/algorithm.html>. Acesso em: 16 dez. 2010. 38. BUREAU INTERNATIONAL DES POIDS ET MESURES (BIPM). International Eletrotechnical Commission (IEC). International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC). International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC). Internacional Standards Organization International Union of Pure and Applied Physics (IUPAP) Organizao Internacional de Metrologia Legal (OIML), Iso, , Iupap, Oiml. Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement (GUM). Corrected and Reprinted, 1995. ISBN 92-67-10188-9. 39. INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, NORMALIZAO E QUALIDADE INDUSTRIAL (INMETRO). Guia para a Expresso da Incerteza de Medio. 3. ed. brasileira do Guide to the
208
Expression of Uncertainty in Measurement. rev. Rio de Janeiro: ABNT/Inmetro, ago. 2003. ISBN 85-07-00251-X. 40. TEFILO, R. F.; FERREIRA, M. M. C. Quimiometria II: planilhas eletrnicas para clculos de planejamentos experimentais, um tutorial. Qum. Nova, So Paulo, v. 29, n. 2, p. 338-350, mar./ abr. 2006. As planilhas eletrnicas para planejamentos fatoriais desse artigo esto disponveis em: <http://lqta.iqm.unicamp. br>. Acesso em: 28 dez. 2010. 41. CAPOBIANCO, G.; COUTINHO, A. dos R.; LUENGO, C. A. Preparao de carves ativados com poros de dimenses nanomtricas a partir de precursores de biomassa. In: PROCEDINGS OF THE 5TH ENCONTRO DE ENERGIA NO MEIO RURAL, 5., 2004, Campinas (SP) [online]. Disponvel em: <http://www. proceedings.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=MSC 0000000022004000200034&lng=en&nrm=iso>. 42. GIMENEZ, I. de F.; COSTA JR., N. B. da. Quimiometria, So Cristvo. Universidade Federal de Sergipe (UFSE). Centro Superior de Educao a Distncia (CESAD), 2007. Aulas de 10 a 15 sobre planejamento fatorial. Disponvel em: <http://ava. cesad.ufs.br/cat/PDF/Quimiometria/Quimiometria%20 Aula%201.pdf>. Acesso em: 31 dez. 2010. 43. CALADO, V. Planejamento de experimentos usando o Statistica. Editora E-papers, 2005. ISBN: 8587922831, ISBN-13: 9788587922830. 44. MULLINS, E. Statistics for the quality control chemistry laboratry. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2003. ISBN 0-85404-671-2. 45. INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY (IUPAC). Compendium of Analytical Momenclature. IUPAC Orange Book. Disponvel em: <http://old.iupac.org/ publications/analytical_compendium/>. Acesso em: 27 jan. 2011. 46. CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION. Appendix V: draft guidelines for the design and implementation of national regulatory food safety assurance programmes associated with the use of veterinary drug residues in foods. (at Step 8 of the Elaboration Procedure). CODEX ALINORM 09/32/31 May 2009, Joint Fao/Who Food Standards Programme Codex Alimentarius Commission, Thirty second Session Rome, Italy, 29 Jun./4 July 2009, Report Of The Eighteenth Session Of The Codex Committee On Residues Of Veterinary Drugs In Foods, Natal, Brazil 11-15 May 2009. 47. DANZER, K. Analytical chemistry, theoretical and metrological fundamentals. Spinger, Berlin, Heidelberg, 2007. ISBN 978-3540-35988-3, DOI 10.1007/b103950. 48. DRAPER, N. R.; SMITH, H. Applied Regression Analysis. 3. ed. New York: John Wiley & Sons, 1998. ISBN: 0-471-17082-8.
209
49. HELENE, O. Mtodo dos mnimos quadrados com formalismo matricial. So Paulo: Editora Livraria da Fsica, 2006. Disponvel em: <www.livifusp.com.br>, <www.livrariadafisica.com.br>. ISBN 8588325543, EAN 9788588325548. 50. BEVINGTON, P. R.; ROBINSON, K. D. Data reduction and error analysis for physical science. New York: McGrawo Hill, 2003. ISBN 978-0-07-247227-1. 51. HAMILTON, W. C. Statistics in Physical Science: estimation, hypothesis testing and least squares. New York: The Ronald Press Company, 1964. Library Congress Catalog Card Number 64-22168. 52. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS (AOAC INTERNATIONAL). Natural Toxins. Official methods of analysis of AOAC International. 17th ed. p. 1-64, 2000. Chapter 49. (Gaithersburg, MD: AOAC International). 53. DRAGACCI, S.; GROSSO, F. Immunoaffinity column clean-up with liquid chromatography for determination of aflatoxin M1 in liquid milk: collaborative study. Journal of AOAC International, v. 84, n. 2, 2001. 54. SHEPHERD, M.; GILBERT, J. Long-Term Storage stability of Deoxynivalenol Standard Reference Solutions. Journal Agriculture of Food Chemistry, v. 36, p. 305-308, 1988. 55. EUROPEAN COMMISSION (EC). Commission Regulation 2006/401/CE of 23 frebuary 2006. Laying down the methods of sampling and analysis for the official control of the levels of mycotoxins in foodstuffs. Oficial Journal of the European Communities, 9 Mar. 2006. L 70/12. 56. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS (AOAC INTERNATIONAL) 2005. Official methods of analysis of AOAC International. 18th ed. Edited by William Horwitz and George W. Latimer. Current through Revision 3. Natural Toxins. 2010. chapter 49. 57. Scheilla V. C. de Souza, Roberto G. Junqueira, A procedure to assess linearity by ordinary least squares method. Analtica Chimica Acta, v. 552 p. 25-35, 2005, doi:10.1016/j.aca.2005.07.043. 58. Bruce, B.; Minkkinen, P.; Riekola, M. L. Pratical method validation: validation sufficient for an analysis method. Mikrochim Acta, v. 128 p. 93-106, 1998. 59. Taverniers, I; de Loose, M.; van Bockstaele, E. Trends in quality in the analytical laboratory II: Analytical method validation and quality assurance. Trends Anal. Chem. v. 23 p. 535-552, 2004.
210
ANEXO XIV
Quadros Comparativos: Manual de Garantia da Qualidade Analtica versus outras Referncias Normativas
Os quadros que se seguem fazem uma comparao simplificada dos contedos dos sete documentos ou normas internacionais com este Manual de Garantia da Qualidade Analtica. Na primeira srie de quadros, o Manual comparado com quatro documentos, nesta ordem: a Deciso EC/657/2002 [10]; SANCO 10684/2009 [11]; EC/333/2007 [12] e CODEX ALINORM 09/32/31-2009 [46]. Na segunda srie de quadros, o Manual comparado com os outros trs documentos, nesta ordem: INMETRO DOQ-CGECRE-008 Rev 03 Fev/2010 [21]; Guia EURACHEM 1998 Fit for Purpose [15] e IUPAC-AOAC Thompson 2002 [35].
211
Quadros Comparativos
212
Documentos EC/657/2002 SANCO 10684/2009(1)
Abrangncia do Manual de Garantia da Qualidade Analtica em Relao aos Parmetros de Validao Preconizados pelas Principais Normas e Referncias Utilizadas
EC/333/ CODEX ALINORM 2007 09/32/31 2009
Parmetros de Validao
Manual de Gar. Qual. Analtica
II.3 Curvas de calibrao matrizadas ou no 3.1.1.5 Pelo menos com Calibrao Bracketing. Extratos com nveis altos 172 - Ajuste ND
matrizadas.
Pelo menos com cinco nveis de
Linearidade
Sensibilidade
Faixa de trabalho

cinco nveis de concentrao, incluindo o zero. Intervalo de trabalho. Equao da Reta. Grau de ajuste dos dados na curva. Aceitabilidade dos parmetros ajustados da curva.
de regresso de reta. Curva de calibrao matrizada.
Calibrao polinomial
concentrao. Seis rplicas para cada nvel de concentrao. Intervalo de trabalho. MMQO/ MMQP(2). Homoscedasticidade/Heterocedasticidade Equao da Reta ou polinmio. Grau de ajuste da calibrao com testes estatsticos. Aceitabilidade dos parmetros. ajustados da curva de calibrao. Faixa de trabalho do LQ at a maior concentrao com incerteza = Imax Sensibilidade determinada pela derivada da curva de calibrao.
de resduos devem ser diludos at a faixa de calibrao. Prev a calibrao por interpolao entre dois pontos. Prev a calibrao com um ponto. Prev calibrao exclusiva dos analitos representativos.
Parmetros de Validao EC/657/ 2002 EC/333/ 2007
Documentos SANCO 10684/ 2009(1)
CODEX ALINORM 09/32/31 2009
162-163 - Para procedimentos
3.1.1.1 - Estimar ND
Avaliao visual
Seletividade / Especificidade
Efeito de Matriz
Manual de Gar. Qual. Analtica II.4.1 a II.4.2 - Anlise de trs nveis, seis rplicas de analito em soluo e de matriz branca fortificada usando curva de calibrao no matrizada (CCAS). Teste F e Teste t. II.4.3 - Testes estatsticos sobre o intercepto e a inclinao das curvas de calibrao matrizada (CCMBF ou CCEMBF) e no matrizada (CCAS). Teste F e Teste t. os efeitos dos possveis interferentes por fortificao de matriz branca (n 20). da resposta instrumental em branco de reagente e em amostra de controle.
analticos de triagem (screening). Anlise de 30 matrizes brancas de diferentes fontes. Testar substncias potencialmente interferentes. 164 - Para procedimentos analticos quantitativos. Definio e importncia. 175-180 - Para procedimentos analticos de confirmao. Definio. FTIR e MS acoplada a Gc e LC. Relao de possveis mtodos analticos de confirmao.
Parmetros de Validao EC/657/ 2002
EC/333/ 2007
3.1.1.2 - Ensaios
com MRC; ou
Veracidade
II.5 - Ensaios com MRC 3.1.2.1 - com
Recuperao
Se possvel
213
Tendncia
165-168 - Definio e limites.

Usar MRC ou fortificaes ao redor do MRL(3). a veracidade deve ser verificada com MRC.
Recuperao
ou com matriz branca fortificada em trs nveis de concentrao, seis rplicas por nvel.
matriz branca fortificada em trs nveis de concentrao, seis rplicas por nvel.
mdia de fortificaes no nvel de interesse e no nvel de reportagem.
Parmetros de Validao EC/657/ 2002 EC/333/ 2007
214
3.1.2.1 - Repetitividade: ensaios com amostras em trs nveis de concentrao, seis Mnimo de cinrplicas por nvel. co replicatas de 3.1.2.3 - Refortificaes no produtibilidade nvel de interesintralaboratorial: se e no nvel de repetio dos reportagem. ensaios de repe DPR de retitividade em trs produtibilidade. dias. 3.1.2.4 - Reprodutibilidade: participao em ensaios colaborativos.
II .6.3 - Repetitividade:
Preciso de Repetitividade
165-166 -Definio e limites. 169 - Preciso de repetitividade HorRatr < 2. HorRatR < 2.
e reprodutibilidade. Estudo em diferentes dias, com pools de diferentes tecidos (matrizes), diferentes lotes de reagentes, diferentes equipamentos etc. (reprodutibilidade intralaboratorial).
ensaios com amostras de controle em trs nveis de concentrao, seis rplicas por nvel. Preciso II.6.4 - Reprodutibilidade Intermediria intralaboratorial: repetio (Reprodutibilidade dos ensaios de repetitividaintralaboratorial) de em trs dias. Preciso de II.6 - Reprodutibilidade: Reprodutibilidade participao em ensaios colaborativos.
Parmetros de Validao EC/ 657/ 2002 SANCO 10684/ 2009(1) EC/ 333/ 2007
Documentos CODEX ALINORM 09/32/31 2009
Limite de deciso (CC)
II.7.4 a II.7.6 CC. II.7.7 a II.7.9 CC. Utilizando a curva de previso 3.1.1.5 - CC Mtodo descrito na norma ISO 11843 ou analisando 20 ou mais matrizes brancas. 3.1.1.6 - CC Mtodo descrito na norma ISO 11843 ou analisando 20 ou mais matrizes brancas fortificadas em CCa.
Capacidade de deteco (CC)
da calibrao (ISO 11843) e principais fontes de incerteza. Pela anlise de 20 matrizes brancas fortificadas no LMDR ou no LMR.
ND
ND
ND
Parmetros de Validao EC/ 657/ 2002 SANCO 10684/ 2009(1)
Documentos EC/ 333/ 2007 CODEX ALINORM 09/32/31 2009
ISO GUM (ISBN 92-67 ND

10188-9); EURACHEM/CITAC QUAM:2000. DPR de reprodutibilidade.
Define a incerteza
Incerteza de Medio Analtica (IMA)
Manual de Gar. Qual. Analtica II.8.1 - Metodologia Bottom-Up (ISO GUM). II.8.2 - Metodologia Top-Down, considerando as incertezas de amostragem, reprodutibilidade interna, tendncia e de calibrao. (Guia EURACHEM/ CITAC QUAM:2000)
padro de medio u e a incerteza expandida de medio U, mas no descreve seus procedimentos de estimao.
190 - Determina a
obrigatoriedade e se reporta ao Guia EURACHEM/CITAC QUAM:2000.
215
Parmetros de Validao EC/657/2002 SANCO 10684/2009(1) EC/333/2007
Documentos
216
LD = CC (ver Quadro 9 dessa norma).
Limite de Deteco (LD)
ND
-padro do branco (n>20).
Trs vezes o desvio-
CODEX ALINORM 09/32/31 2009 173 - Intercepto mais trs vezes o desvio-padro residual do ajuste.
Menor nvel fortifi ND

cado validado com veracidade e preciso aceitveis.
Limite de Quantificao (LQ)
Manual de Gar. Qual. Analtica II.7.1 - Corresponde ao valor do CC calculado como para substncias banidas. II.7.2 - Estimado a partir da Incerteza Mxima Aceitvel (Imax), definida por norma, legislao especfica, contrato com o cliente ou pelo laboratrio. Abordagem por critrios ou baseada nos riscos. Adequao ao uso pretendido.
Seis ou dez vezes o

desvio-padro do branco (n>20).
174 - Intercepto
mais dez vezes o desvio-padro do residual do ajuste.
Parmetros de Validao EC/657/2002
Documentos SANCO 10684/2009(1) EC/333/2007 CODEX ALINORM 09/32/31 2009
Escopo/ Aplicabilidade com planejamento fatorial saturado (youden).
3.1.1.3 - Estudo feito
Recuperao mdia
183 - Determina o ND
Robustez
Manual de Gar. Qual. Analtica II.9 - Estudo feito com planejamento fatorial completo ou fracionrio de mxima resoluo ou fracionrio saturado (youden) ou variando fator a fator. II.11 - Relatrio de validao.
e reprodutibilidade interna em validao concorrente (on-going validation).
uso de planejamento fatorial para o estudo de robustez(4) e relaciona alguns fatores que podem ser estudados.
Parmetros de Validao EC/ 657/ 2002 SANCO 10684/ 2009(1) EC/ 333/ 2007
Documentos CODEX ALINORM 09/32/31 2009
185 - Estabelece 3.1.1.4. Estabilidade do analito em soluo.
Estabilidade
Manual de Gar. Qual. Analtica IV.1 - Estabilidade do analito na matriz no processada. IV.1 - Estabilidade ps- processamento. IV.3 - Estabilidade do analito em soluo. IV.4 - Estabilidade das solues padro.
Estabilidade do analito na matriz.
ND
ND
a necessidade de estudo de estabilidade do analito nas solues padro e na matriz. Estudo por um perodo mnimo de 90 dias.
Notas: ND - No Descrito.
(1)
Substitui a SANCO/3131/2007.
(2)
MMQ = Mtodo dos Mnimos Quadrados Ordinrios (MMQO) ou Ponderados (MMQP).
(3)
Usa erradamente o termo accuracy onde deveria usar truenesss.
(4)
Usa o termo ruggedness e no o termo robustness.
217
Documentos INMETRO DOQCGCRE-008 Rev 03 Fev/2010(5) Guia EURACHEM 1998 Fit for Purpose IUPAC-AOAC Thompson 2002
218
6.26 6.30 O limite inferior da
8.2.2 Ajuste de reta pelo MMQ. Pelo menos com cinco nveis de concentrao. Nmero de replicatas igual ao da rotina. Faixa de linearidade por inspeo visual da curva de calibrao. Indica testes para valores discrepantes (outliers), para homoscedasticidade e ANOVA para linearidade. Indica outras funes no caso da curva de calibrao no ser reta. faixa de trabalho o LD/LQ. Faixa de linearidade por inspeo visual da curva de calibrao ou do grfico de resduos com dez ou mais nveis de concentrao. Inspeo visual do grfico da resposta instrumental vs concentrao de matriz branca fortificadas ou com diversos MRCs. MMQP no caso de heterocedasticidade. Outras funes que no a reta. No recomenda polinmio de grau > 2. 6.44 - Sensibilidade: o gradiente da curva de calibrao.
A3 - Linearidade: Prope o uso de curvas de calibrao na

rotina mais simples que na validao.
Teste informal da linearidade pelo exame
do grfico dos resduos do ajuste da reta.
II.3 Curvas de calibrao matrizadas ou no matrizadas. Pelo menos com cinco nveis de concentrao. Seis rplicas para cada
O uso do coeficiente de correlao
Linearidade
Sensibilidade
Faixa de trabalho
Calibrao polinomial
nvel de concentrao. Intervalo de trabalho. MMQO/ MMQP(2). Homoscedasticidade / heterocedasticidade. Equao da Reta ou polinmio. Grau de ajuste da calibrao com testes estatsticos. Aceitabilidade dos parmetros ajustados da curva. Faixa de trabalho do LQ at a maior concentrao com incerteza = Imax. Sensibilidade determinada pela derivada da curva de calibrao.
enganoso e inadequado para testar linearidade e deve ser evitado. Seis nveis ou mais de calibrao equidistantes. Faixa de 0-150% ou 50-150% da conc. do analito. Duplicata ou triplicata em ordem aleatria das solues de calibrao. A7 - Faixa validada no necessariamente igual faixa de linearidade e depende da incerteza de medio. O nvel de interesse deve estar dentro da faixa validada. A10 - Sensibilidade: o gradiente da funo de calibrao. No o considera til para a validao, mas o para os procedimentos de garantida da qualidade para a verificao dos instrumentos de medio.
Documentos Guia EURACHEM 1998 Fit INMETRO DOQ-CGCRE-008 for Purpose Rev 03 Fev/2010(5)
IUPAC-AOAC Thompson 2002
8.2.1 Comparao dos resul-
6.13 6.19 Comparao dos resul-
A2 Deve ser avaliada para
Seletividade/ Especificidade
Efeito de Matriz
Manual de Gar. Qual. Analtica II.4.1 a II.4.2 - Anlise de trs nveis, seis rplicas de analito em soluo e de matriz branca fortificada usando curva de calibrao no matrizada (CCAS). Teste F e Teste t. II.4.3 - Testes estatsticos sobre o intercepto e a inclinao das curvas de calibrao matrizada (CCMBF ou CCEMBF) e no matrizada (CCAS). Teste F e Teste t. tados da anlise com a amostra e materiais de referncia pelo mtodo em estudo e outros mtodos validados. Analisar amostras contendo vrios interferentes suspeitos na presena do analito de interesse. tados da anlise com a amostra e materiais de referncia pelo mtodo em estudo e outros mtodos independentes validados. Analisar amostras contendo vrios interferentes suspeitos na presena do analito de interesse.
qualquer interferente importante provvel de estar presente. Define o ndice de seletividade como a razo da sensibilidade da curva de calibrao matrizada sem o interferente e a inclinao da resposta instrumental vs a concentrao do interferente na mesma matriz branca.
219
Parmetros de Validao IUPAC-AOAC Thompson 2002
220
com MRC.
A4 - Veracidade: Medir a tendncia Uso de procedimento de referncia.
Veracidade
II.5 - Ensaios com
Tendncia
Uso de fortificao
Recuperao
MRC ou com matriz branca fortificada em trs nveis de concentrao, seis rplicas por nvel.
Documentos INMETRO DOQ-CGCRE-008 Rev 03 Guia EURACHEM 1998 Fit for Purpose Fev/2010(5) 6.30 6.36 A veracidade expressa em termos da 8.2.6 tendncia. Estimada atravs de MRC ou Comparao com um MRC ou com ensaio colaborativo ou pela outro procedimento analtico bem recuperao. caracterizado (validado) de pre Recomenda corrigir o resultado se ferncia baseado em um mtodo a recuperao for significativa(6). analtico primrio. Recomenda comparar o resulta Determinao da mdia e do do da anlise do MRC com seu desvio-padro de ensaios replicados certificado usando o erro relativo com MRC. ou o ndice z-escore ou o erro Dez replicaes. normalizado. 6.46 6.47 - Recuperao: Considere como recuperao ape Obtidas de MRCs. nas o ensaio com amostra (matriz Obtidas de fortificaes em diferentes branca) fortificada. concentraes de matriz branca ou amostra de ensaio.
para medir a recuperao. A6 - Recovery: por estudo de fortificao no A.4.
II.6.3 - Repetiti-
A5 Especificada como desvio-padro ou desvio-padro relativo = CV.
vidade: ensaios com amostras de controle em trs Preciso de nveis de concenRepetitividade trao, seis rplicas por nvel. Preciso II.6.4 - ReprodutiIntermediria bilidade intralabo(Reprodutibilidade ratorial: repetio intralaboratorial) dos ensaios de repetitividade em Preciso de trs dias. Reprodutibilidade II.6 - Reprodutibilidade: participao em ensaios colaborativos.
Documentos Guia EURACHEM INMETRO DOQ-CGCRE-008 Rev 1998 Fit for 03 Fev/2010(5) Purpose 8.2.6.3 - Usa o CV. 8.2.6.3.1 - Repetitividade: desvio-padro sr em condies 6.37 6.40 de repetitividade. Limite de Ensaios com repetitividade (r): MRC, MR, r = tv,a 2 sr. matriz branca 8.2.6.3.2 - Preciso intermedifortificada, dez ria: desvio-padro spi em condireplicatas para es de preciso intermediria. cada nvel na 8.2.6.3.3 - Desvio-padro sR em faixa de trabacondies de reprodutibilidade: lho. indica a equao de Horwitz Calcular sr, r, sR -Thomson para estimar sR. Limite e R em funo de reprodutibilidade (R): da concentra R = tv,a 2 sR. o. Nmero de replicaes 7. Avaliao da preciso pelo HORRAT.
Prec. intermediria spi ou total stot, prec. de
repet. sr ou intrabateladas sib e prec. entre ou interbateladas seb: spi = stot = [sib2/nr+ seb2], onde nr = num. replicatas do resultado das amostras de ensaio na rotina, em geral 1. Prec. em geral i) const. ou ii) proporcional canal : CV = const. Avaliar em no mnimo um nvel alto e outro baixo da faixa canal validada. Um teste F adequado para avaliar a homoscedasticidade. Experimentos podem ser planejados para estimar a preciso em diferentes combinaes de condies intermedirias, estimando-se os efeitos entre-dias, entre-equipamentos, entre-tcnicos etc. (ANOVA)
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Documentos Guia EURACHEM 1998 Fit for INMETRO DOQ-CGCRE-008 Purpose Rev 03 Fev/2010(5)
222
6.20 - menciona nesta ND ND
seo que a ISO 11843 usa o termo valor mnimo detectvel da varivel lquida de estado, logo CC no lugar de LD.
Limite de deciso (CC)
II.7.4 a II.7.6 CC. II.7.7 a II.7.9 CC. Utilizando a curva de previso da
Capacidade de deteco (CC)
calibrao (ISO 11843) e principais fontes de incerteza. Pela anlise de 20 matrizes brancas fortificadas no LMDR ou no LMR.
Documentos INMETRO DOQCGCRE-008 Rev 03 Fev/2010(5) Guia EURACHEM 1998 Fit for Purpose IUPAC-AOAC Thompson 2002
6.41 6.43 Deve combinar as
A13 - Prope que um componente de incerteza
Incerteza de Medio Analtica (IMA)
devido variao possvel da matriz dentro da classe definida seja avaliada. incertezas das fontes de A14 - Lei de propagao das incertezas (mtodo II.8.1 - Metodologia preciso de longo termo Bottom-Up) incluindo as fontes de variabilidade ND Bottom-Up (ISO (prec. inter.), tendncia detectadas na validao: sr e seb, ou seja preciGUM). (correo), calibrao Cita o uso do erro so intermediria ou reprod. interna. Incluir as dos instrumentos de normalizado para II.8.2 - Metodologia fontes de no homogeneidade e variabilidade medio (em geral avaliar participaTop-Down, consideda matriz. Considerar a dependncia da incertepequena em relao s o em ensaio de rando as incertezas za com a conc. Calcular a incerteza expandida. duas primeiras) e algum proficincia se o lade amostragem, Recomenda fator de abrangncia k 3 para efeito significante boratrio calcular a reprodutibilidade procedimentos apenas validados internamente detectado no estudo de incerteza expandida interna, tendncia e no laboratrio. robustez. do resultado analtide calibrao. (Guia B1 - Detalhes sobre a determinao experimental co (8.2.6.1.3). EURACHEM/CITAC Pode-se ampliar a incerdos coeficientes de sensibilidade usando dados QUAM:2000) teza se uma correo do estudo de robustez. significativa estimada, B1 - Recomenda a avaliao de incerteza por mas o resultado no julgamento na impossibilidade de estimaes corrigido por ela. mais estatsticas.
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Parmetros de Validao INMETRO DOQ-CGCRE-008 Rev 03 Fev/2010(5) IUPAC-AOAC Thompson 2002
Documentos Guia EURACHEM 1998 Fit for Purpose
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8.2.4 Recomenda seu clculo 6.20 6.23 Recomenda seu clculo para
para anlises de concentraes baixas (traos). Calcula o LD como zero ou a mdia dos brancos somada a um mltiplo t do desvio-padro do branco. Recomenda a verificao experimental do LD com fortificao no valor calculado em, no mnimo, sete rplicas. Um LD para cada combinao matriz/analito.
A8 Para procedimentos em que a faixa
II.7.1 - Cor-
Limite de Deteco (LD)
responde ao valor do CC calculado como para substncias banidas.
validada no inclui o zero e nem anlises de concentraes baixas est prxima dele, no necessrio (traos). determinar LD. a) LD como zero dos brancos O conceito tem muitos problemas: somado a trs vezes o desvio-pavrias e diferentes abordagens envoldro do branco s0. 10 replicatas vem a incerteza no zero sem especib) LD de branco fortificado suficar as condies, as estimativas so cessivas vezes em concentrao tendenciosas para baixo e assumem baixa em, no mnimo, dez rplium questionvel comportamento norcas por concentrao. Clculo mal em baixas concentraes. como em a). LD apresentados em literatura e broc) LD = 0 + 4,65 s0. churas de instrumentos analticos so O LD para procedimento qualimenores que LD prticos e no so tativo obtido por fortificaes adequados como LD de validao. cada vez mais baixas (dez repli s0 do branco determinado com, no catas cada) at a concentrao mnimo, seis replicatas. LD calculado que no d 100% de positivos. na base de 3s0.
partir da Incerteza Mxima Aceitvel (Imax), definida por norma, legislao especfica, Limite de contrato com o cliente Quantificao (LQ) ou pelo laboratrio. Abordagem por critrios ou baseada nos riscos. Adequao ao uso pretendido.
II.7.2 - Estimado a
Documentos Guia EURACHEM 1998 Fit INMETRO DOQ-CGECRE-008 Rev for Purpose 03 Fev/2010(5) 8.2.5 Indica que LQ = MNC (especial- 6.24 6.25 mente para anlise de traos) Calcula o LQ como zero excluindo o branco. ou a mdia dos brancos Calcula o LQ como zero ou a somada a um mltiplo 5, mdia dos brancos somada 6 ou 10 do desvio-padro a um mltiplo 5, 6 ou 10 do do branco. Dez replicatas. desvio-padro do branco. LQ obtido por inspeo Recomenda que a maneira visual da curva de s vs. c mais realista determinar o LQ de fortificaes sucessivas experimentalmente por fortifiacima de LD. caes sucessivas, com base em Menor nvel fortificado critrios aceitao de desvio-pavalidado. dro pr-definidos (abordagem pr-critrios).
A9 Apresenta as definies mate-
mticas arbitrrias de LQ como 10% DPR ou 2LD questionando a garantia do uso do procedimento acima desses limites. No recomenda o uso de LQ. Recomenda expressar a incerteza de medio como funo da concentrao, e comparar essa funo com os critrios de adequao ao uso pretendido acordado entre o laboratrio e o cliente ou usurio final do resultado analtico.
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Documentos INMETRO DOQCGECRE-008 Rev 03 Fev/2010(5) Guia EURACHEM 1998 Fit for Purpose IUPAC-AOAC Thompson 2002
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6.45 Fazer variaes deliberadas no 8.2.6.4 - Estudo
feito com planejamento fatorial saturado (youden)
A1 - Escopo/aplicabilidade: O relatrio da validao: identidade/
II.9 - Estudo feito
Escopo/ Aplicabilidade
Robustez
com planejamento fatorial completo ou fracionrio de mxima resoluo ou fracionrio saturado (youden) ou variando fator a fator. II.11 - Relatrio de validao.
especiao; faixas de conc. matrizes procedimento e investigar os validadas; procedimento definitivo; subsequentes efeitos sobre seu recomendaes de controle e de segudesempenho. rana etc. Planejar experimentos para moni- A11 - robustez: Define rugedness torar os efeitos sobre a veracidade como a resistncia a pequenas variae a preciso, variando sistematies nas condies experimentais do camente as variveis que podem procedimento. Variar fator a fator ou afetar o desempenho do procediusar o planejamento fatorial fraciomento analtico significativamente. nrio (youden). Exemplos de fatores a alterar: alteraes no instrumento, Indica o uso do mtodo de operador, marca de reagente, conc. de planejamento fatorial saturado reagente, pH, temperatura e/ou tempo (youden). de um processo.
Documentos Guia EURACHEM 1998 Fit INMETRO DOQ-CGECRE-008 for Purpose Rev 03 Fev/2010(5)
IV.1 - Estabilidade do analito
na matriz no processada.
IV.1 - Estabilidade ps- pro ND ND ND
Estabilidade
cessamento.
IV.3 - Estabilidade do analito
em soluo.
IV.4 - Estabilidade das solu-
es padro.
Notas: ND - No Descrito.
canal = concentrao do analito.
(2)
MMQ = Mtodo dos Mnimos Quadrados Ordinrios (MMQO) ou Ponderados (MMQP)
(5)
numerao das sees desse documento coloca, inadequadamente, a seo 8.2.6.3 preciso e a seo 8.2.6.3 robustez como subsees da seo 8.6 Tendncia/Recuperao, dando a falsa A impresso de que esse causa daqueles.
(6)
Usa na nota da seo 8.2.6 o termo exatido quando deveria usar veracidade.
227
ISBN 978-85-7991-055-5
9 788579
91055 5

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Misso Promover o desenvolvimento sustentvel e a competitividade do agronegcio em benefcio da sociedade brasileira.

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Introduo e Requisitos Gerais

I.3 Evitando Contaminao

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I.4 Padres de Trabalho (Analticos), de Referncia e MRC

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I.5 Cadeia de Custdia de Padres de Trabalho (Analticos)

I.6 Preparao, Uso e Armazenamento de Solues Padro

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I.7 Reagentes e suas Solues

I.8 Recepo, Armazenamento e Preparao de Amostras

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I.9 Desenvolvimento e Otimizao do Procedimento Analtico

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I.10 Validao de Procedimentos Analticos

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Desenvolver o procedimento analtico Otimizar o procedimento analtico

Reotimizar o procedimento analtico.

Validao do procedimento analtico otimizado. Ver Figura 3

Parar o uso do procedimento na rotina. Procedimento validado no

*Rever critrios de validao

O procedimento analtico no pode ser usado na rotina

Procurar a causa da falta de controle estatstico do procedimento

Procedimento sobre controle estatstico

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I.11 Condues do Processo de Validao

Resultado analtico convel, rastrevel e comparvel

Fonte: Adaptado das refs. [34, 59].

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CCAS: Estudo da Linearidade, Sensibilidade:

Testar a Homocedasticidade Ver Figura 4 e Anexo II

SELETIVIDADE Testar efeito de matriz ou a incluso de nova matriz

Continuar usando as CCAS na validao e na rotina

Efeito de matriz signicativo

sim Usar as CCMBF ou as CCEMBF na validao e na rotina 3

Fonte: Adaptado das refs. [34, 57]

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Estudo da Exatido: Determinao da recuperao com MRC ou com forticao de matriz

Estudo da Preciso de Repetitividade e/ou Reprodutibilidade Replicaes do estudo de exatido

Estimar a incerteza de medio Usar o mtodo Bottom-Up ou o mtodo Top-Down

Calcular CC Calcular CCe e CC ou LD ou CC LD

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Parmetros e Critrios de Aceitao de Desempenho de um Procedimento Analtico

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II.2 Critrios de Desempenho Aplicveis Deteco por EM

CG-EM (IE) 10% 15% 20% 50%

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Tabela2 Pontos de identificao de acordo com a tcnica de espectrometria de massas utilizada

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