Trasformacin de clulas vegetales Obtencin de plantas transgnicas

Diana Carranza Domnguez.

NDICE:
1.- INTRODUCCIN 2.-Agrobacterium COMO TRANSFORMACIN VEGETAL: 2.1.- Agrobacterium tumefaciens
2.1.1.- TRANSFORMACIN DE LA CLULA VEGETAL CON EL PLSMIDO TI DE A. tumefaciens
- GENES op - GENES onc - ORIGEN DE REPLICACIN - GENES vir - BORDES DERECHO E IZQUIERDO

MTODO

DE

2.1.2- Ingeniera gentica de plantas usando T-DNA

- LIMITACIONES DE LOS PLSMIDOS TI - SISTEMAS DE VECTORES DERIVADOS DEL PLSMIDO TI: Sistemas de vector binario Sistemas de vector cointegrado

2.2.- Agrobacterium rhizogenes

3.- VECTORES VIRALES:

3.1- VIRUS DNA:
- Caulimovirus - Geminivirus

3.2.- VIRUS RNA

4.-VECTORES TRANSPOSONES

5.- TCNICAS DE TRANSFERENCIA GNICA DIRECTA:

5.1.- TRANSFETERENCIA DE DNA A PROTOPLASTOS 5.2.- BOMBARDEO CON MICROPROYECTILES 5.3.- MICROINYECCIN 5.4.- MACROINYECCIN 5.5.- ELECTROPORACIN 5.6.- ULTRASONIDOS 5.7.-TRANSFORMACIN GNICA MEDIANTE LSER 5.8.- TRANSFORMACIN MEDIADA POR POLEN 5.9.- TRANSFERENCIA GNICA POR IMBIBICIN

6.- GENES MARCADORES

6.1.- Marcadores que confieren viabilidad o letalidad bajo condiciones de seleccin
6.1.1.- Marcadores de resistencia a herbicidas o antibiticos 6.1.2.- Marcadores auxotrficos 6.1.3.- Marcadores letales

6.2.- MARCADORES VISIBLES:

6.2.1.- Marcadores histolgicos. 6.2.2- Marcadores morfolgicos 6.2.3.- Marcadores de pigmentacin

1.- INTRODUCCIN
Se ha realizado un esfuerzo considerable para el desarrollo de variedades de plantas con una elevada produccin o un valor nutricional realzado. Aunque las principales investigaciones se han dedicado a la mejora de los tres principales cereales maz, trigo y arroz se han establecido tambin programas de mejora para otras plantas comestibles y especies de horticultura. La tecnologa del DNA recombinante, ampliamente utilizada con sistemas microbianos, es tambin una importante herramienta para la manipulacin gentica directa de plantas, Existe un nmero de mtodos de transferencia de DNA y vectores de expresin efectivos que se ocupan de un amplio rango de clulas vegetales. Adems, las clulas vegetales son totipotentes se puede regenerar una planta entera a partir de una sola clula as que se pueden producir plantas frtiles que porten gen(es) forneo(s) en todas sus clulas (i.e., plantas transgnicas) a partir de clulas genticamente modificadas. Si la planta transgnica florece y produce semillas viables, el carcter deseado pasar a sucesivas generaciones. Existen tres principales motivaciones para el desarrollo de plantas transgnicas. En primer lugar, la adicin del gen o genes generalmente mejora el valor agricultor, horticultor u ornamental de una planta. Segundo, las plantas transgnicas pueden actuar como biorreactores para la produccin barata de protenas o metabolitos econmicamente relevantes. Y por ltimo, la transgnesis de plantas proporciona medios eficaces para el estudio de la accin de genes durante el desarrollo y otros procesos biolgicos de las plantas. Algunos de los caracteres genticamente determinados que pueden introducirse en plantas mediante un nico gen o, potencialmente, mediante un pequeo cluster de genes, incluyen actividad insecticida, proteccin frente a la infeccin viral, resistencia a herbicidas, proteccin contra bacterias y hongos patgenos, reduccin de la senescencia, tolerancia a estrs ambiental, pigmentacin alterada de las flores, mejora de la calidad nutricional de las semillas... Adems, las plantas transgnicas pueden producir una amplia variedad de compuestos tiles, incluyendo agentes teraputicos, polmeros, y herramientas diagnsticas como fragmentos de anticuerpos. De forma alternativa, pueden disearse para la sntesis de determinantes antignicos virales que, tras la ingestin, pueden usarse como vacunas comestibles. Hasta la fecha, unas 140 especies vegetales diferentes han sido genticamente transformadas, incluidas muchas especies de forestales y de cultivo a lo largo de 50 pases repartidos por el mundo entero. La transformacin de plantas se llev a cabo primero mediante el uso del plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, un fitopatgeno que en su ciclo vital normal transforma genticamente las plantas que infecta. Serias limitaciones en el mecanismo natural condujeron al desarrollo de vectores genticamente diseados basados en el plsmido Ti: el vector binario y el vector cointegrado. Pese a que estos sistemas eran eficientes en varias especies vegetales, las plantas monocotiledneas, incluidas los principales cereales de cultivo (trigo, arroz y maz), no podan ser transformadas mediante A. tumefaciens. Cuando las dificultades para la transformacin de algunas especies vegetales resultaron evidentes, se desarrollaron un cierto nmero de mecanismos alternativos a la transformacin mediada por A. tumefaciens: los mtodos fsicos de transferencia del DNA. Muchos de estos mtodos requeran la eliminacin de la pared celular de las clulas vegetales (es decir, requeran el uso de protoplastos).

Estos protoplastos pueden mantenerse en cultivo como clulas en crecimiento independientes o, mediante un medio de cultivo especfico, pueden regenerarse las paredes celulares y las plantas enteras. Adems, se han desarrollado mtodos de transformacin para introducir genes clonados en un pequeo nmero de clulas de un tejido vegetal, a partir del cual se puede desarrollar la planta entera, evitando as la regeneracin a partir de protoplastos, en ocasiones compleja. En el presente, la mayor parte de los investigadores usa los vectores derivados del plsmido Ti o el bombardeo con microproyectiles (biolstica) para la transformacin de clulas vegetales. En este trabajo pretendemos realizar un compendio de las tcnicas que a lo largo de la historia se han utilizado para la transgnesis de plantas, no todas con buenos resultados. Los avances en las tcnicas utilizadas por la Ingeniera Gentica han permitido la mejora de estos mecanismos, alguno de los cuales se han ido dejando atrs por no corroborar los resultados auspiciados. Aqu encontramos una muestra de ellos.

2.- Agrobacterium COMO MTODO DE TRANSFORMACIN VEGETAL:

2.1.- Agrobacterium tumefaciens
El mtodo mas utilizado para introducir genes forneos en una planta es la capacidad natural de A. tumefaciens. Por ello, comenzaremos revisando los diferentes estudios que permitieron descubrir como esta bacteria transformaba de forma natural clulas vegetales con el plsmido Ti.

2.1.1.- Transformacin de la clula vegetal con el plsmido Ti de A. tumefaciens

La biologa molecular y la ingeniera gentica en plantas se inician con el descubrimiento y el estudio de A tumefaciens. Esta bacteria, Gram negativa, induce la formacin de tumores, denominados agalla de la corona, generalmente en la unin del tallo con la raz, en numerosas dicotiledneas y en muy pocas monocotiledneas y gimnospermas (De Cleene y De Ley, 1976). Esta bacteria del suelo infecta a dicotiledneas como parte de su ciclo vital insertando genes forneos en las mismas y consiguiendo que se expresen en forma de protenas. En 1947, Armin C. Braun del instituto Rokefeller de Investigacin Mdica, logr cultivar tejido de la agalla libre de bacteria, pudiendo observar como los tumores crecan in vitro en un medio bsico carente de auxinas y citoquininas (hormonas necesarias para el crecimiento de clulas vegetales normales). Braun concluy que la bacteria introduca en las clulas un principio tumorgeno. En 1965, Menagu y Morel del instituto de investigaciones agronmicas de Versalles, observaron que las clulas tumorgenas podan sintetizar una serie de derivados de intermediarios metablicos de la mayora de los aminocidos, cetocidos y azcares. Denominaron a estas sustancias qumicas opinas. Fue en 1974 cuando Jeff Schell, Marc Van Montangu y sus colaboradores de la Universidad de Gante, encontraron plsmidos muy desarrollados en las cepas virulentas y observaron que eran transferidos desde estas a cepas no virulentas por conjugacin. Luego el principio tumorgeno del que hablaba Braun, responsable de la formacin de la crown gall (en ausencia de la bacteria) era la transferencia de un fragmento de DNA llamado T-DNA que a su vez se localizaba en un plsmido al que se denomin Ti (de inductor de tumores). Tras la transferencia el T-DNA se integraba en el genoma nuclear de la planta y su expresin induca el fenotipo tumoral.

Figura : Plmido Ti. El T-DNA est definido por los bordes derecho e izquierdo e incluye los genes para la biosntesis de auxina, citoquinina y opina; estos genes son transcritos y traducidos slo en las clulas de la planta. Fuera de la regin del T-DNA, hay un cluster de genes vir, un gen que codifica para un enzima(s) del catabolismo de la opina, y un origen de replicacin (ori) que permite que el plsmido sea mantenido de forma estable en A. tumefaciens

GENES op
Experimentos de conjugacin realizados en la Universidad de Leiden por Rob A Schiperoort y sus colegas evidenciaron que este plsmido Ti le permita a la bacteria degradar octopina o nopalina (opinas) y crecer sobre uno de esos compuestos, adems determinaba si el tumor sintetizara una u otra opina y era esa opina la que induca, especficamente, la transferencia del plsmido en la conjugacin. El gen op es el responsable de la sntesis de opinas. Basndose en el tipo de opinas codificadas por el plsmido Ti Dessaux et al en 1992 y Vudequin-Dransart et al en 1995 clasificaron a un amplio rango de agrobacterias en distintas variedades segn indujeran la sntesis de octopina, nopalina, agropina, succinamopina o crisopina. Las opinas formadas en los tumores pueden ser metabolizadas por el Agrobacterium que lo inicia pero no por la mayora de las bacterias del suelo (Tempe y Petit, 1982). Estas opinas sirven como fuente de carbono y de nitrgeno para el Agrobacterium que indujo el tumor y para todos aquellos que presenten los genes para el catabolismo de la opina producida, estos genes que permiten la degradacin se localizan en el plsmido Ti pero fuera del T-DNA. As, mediante la modificacin gentica de la planta, Agrobacterium crea un nicho favorable para s mismo, utilizando la maquinaria de la clula vegetal para producir sustancias que no va a utilizar esta pero que permiten el crecimiento de la bacteria, el plsmidoTi simbitico es, por tanto, el elemento central de una interrelacin ecolgica altamente evolucionada.

GENES onc
Algunos de los genes del plsmido T-DNA (genes onc) eran los responsables de la sntesis anormal de hormonas de crecimiento por parte de la planta, los altos niveles de

estas auxinas y citoquininas eran los que permitan una diferenciacin anormal de las clulas de la planta y provocaban un crecimiento neoplsico. Existen principalmente tres oncogenes de los cuales dos iamM (codifica la triptofano monooxigenasa) y iaaH (codifica la iodoaceamida hidrolasa) codifican enzimas que inician la sntesis de una nueva auxina biosinttica. Actan secuencialmente para convertir el trp en indol-3acetamida y luego en indol-3-acetico (IAA). El gen ipt (codifica la isopenteniltransferasa) es el responsable de la sntesis de citokininas. Mientras que estos genes estn implicados en la sntesis de auxinas y citoquininas dos genes T-DNA modulan las actividades de las mismas. Se trata de 5 y 6b, el gen 5 influye en las respuestas de la planta a las auxinas mediante la sntesis autorregulada de antagonistas (Krber et al, 1991) y la funcin concreta del gen 6b es desconocida, algunos estudios sugieren que reduce la actividad de las citoquininas (Spanier et al, 1989; Gaudin et al, 1994) mientras que otros parecen demostrar que tiene un efecto similar al de las auxinas (Tinland et al, 1989,1990). Los genes que regulan los niveles hormonales en la clula infectada son muy importantes puesto que niveles demasiado altos, pueden provocar la muerte de la misma, en lugar de la formacin del tumor.

Origen de replicacin
El ori permite que el plsmido Ti sea mantenido de forma estable en A tumefaciens. Existen tres elementos genticos necesarios para la transferencia del T-DNA a la planta, estas regiones crticas estn presentes en todos los plsmidos de Agrobacterium, aunque su estructura y organizacin son muy distintas segn la especie y la variedad: Bordes flanqueantes del T-DNA: A la izquierda y derecha del T-DNA existen dos direct repeats de unos 24-25pb que flanquean y definen el T-DNA (van Haaren et al, 1998). Estos bordes son secuencias en cis necesarias para la transferencia (Zambryski et al, 1983) y normalmente todo el DNA contenido entre los mismos es transferido a la planta. Parece que el borde derecho es crtico en la transferencia del DNA y en el proceso tumorgeno mientras que el izquierdo no afecta a la formacin del tumor. Genes vir. Genes de virulencia o regin vir codificada por el plsmido Ti en una regin de 35 kb localizada fuera del T-DNA, existen 25 genes vir reunidos en 7 operones. Recientes investigaciones indican que la interaccin entre los genes vir y las secuencias de los bordes inician el proceso de transferencia. Genes codificados por el cromosoma bacteriano. Estos genes son necesarios para la unin de la bacteria a la clula vegetal daada.

GENES vir
Para que este proceso de transferencia tenga lugar es necesario que adems de practicarle una herida a la planta esta sintetice una serie de compuestos que induzcan la expresin de los genes vir (Bolton et al, 1986; Janssens et al, 1986; Stachel et al1986). Se trata de derivados de aminocidos, azcares y una serie de compuestos derivados del metabolismo del fenlpropanoico (principal va para la produccin de metabolitos secundarios) y una serie de metabolitos secundarios que producen las clulas daadas. Stachel et al en 1986, trabajando con Nicotiana tabacum identificaron un grupo de compuestos que inducan la expresin de los genes vir al aadir Agrobacteriuum a exudados de heridas practicadas a esta planta. Una de las sustancias ms activas identificadas fue la acetosiringona, pero adems es necesario que se den una serie condiciones para que la transferencia tenga lugar: deben utilizarse medios pobres en azcares, de bajo pH y con niveles bajos de fosfato (Winans et al, 1988; Ankenbauer y Nester, 1990; Canguelosi et al, 1990). Vir A y vir G son dos genes reguladores necesarios para la activacin transcripcional de los operones vir ( Stachel y Zambrynski, 1986a), mientras que estos dos genes son expresados constitutivamente, los dems genes vir permanecen silenciados en ausencia de ciertos factores, producidos por la planta, que activan su sntesis. - Vir G, en base a la homologa de su secuencia de aminocidos, fue incluido en una clase de genes reguladores positivos inducidos por factores externos (Nixon et al, 1986; Winans et al, 1986). - Vir A , pertenece a un segundo grupo de genes que dirige la activacin de protenas reguladoras positivas de la expresin gnica (Ronson et al, 1987; Winans et al, 1986). Presenta una alta homologa con quimiorreceptores proten kinasa transmenbrana (Leroux et al, 1987) y se localizan en la membrana de Agrobacterium (Winans et al, 1989). La induccin de los genes vir de Agrobacterium implica que el sistema de reconocimiento de la bacteria detecte los compuestos fenlicos producidos por la planta y transmita la informacin al interior de la clula bacteiana. Este proceso es mediado por el producto de los genes vir A y vir G. El dominio periplsmico de la protena Vir A detecta el pH externo y la presencia de inductores aunque no tiene que unirse necesariamente a los mismos (Lee et al, 1992). Los inductores como la glucosa o la acetosiringona son reconocidos por Vir A. En el caso de la induccin por azcares, es necesario el producto del gen chv E, localizado en el cromosoma bacteriano, y que codifica por una protena de unin periplsmica. La seal percibida por Vir A provoca su autofosforilacin en un residuo de histidina especfico y esta es transmitida posteriormente a Vir G por la fosforilacin del cido asprtico 52 del dominio receptor de este (Jin et al, 1990). La unin de la protena citoplasmtica Vir G a las llamadas cajas vir en las regiones promotoras de los operones vir provoca la activacin de la trascripcin de forma eventual (Steck et al, 1988; Jin et al 1990; Powel y Kado, 1990; Heido et al, 1994; Scheeren-Groot et al, 1994).

Figura : Activacin de los genes vir.

Han sido identificados muchos de los loci cromosmicos que afectan a la expresin de los genes vir. Mutaciones en ChvD, ros, miaA, ivr, chvG y chvI son algunos ejemplos y su influencia en dicha expresin no est todava bien caracterizada, de cualquier forma, la influencia cromosmica en la expresin y regulacin de los genes vir y por tanto en la virulencia est mas que demostrada. Una vez se ha producido el reconocimiento y la unin a la clula vegetal susceptible, el siguiente paso en la tranformacin es la produccin de un T-DNA intermediario denominado T-strand. La bacteria produce una copia lineal de cadena sencilla a partir del T-DNA (Stachel et al, 1986). Juntos VirD1 y VirD2 reconocen las repeticiones directas de los bordes del T-DNA y producen dos cortes entre el tercer y cuarto nucletido final de cada secuencia repetitiva de los bordes (Yanofsky et al, 1986; Wang et al, 1987; Pansegrau et al, 1993; Jasper et al, 1994; Scheiffele et al, 1995). Estos dos cortes marcan los sitios de inicio y terminacin de la formacin de la Tstrand. VirD1 acta como una topoisomerasa relajando la doble hlice (Ghai y Das, 1989) aunque esto no pudo ser confirmado utilizando VirD1 purificado (Scheiffele et al, 1995). Tras el corte VirD2 permanece covalentemente unida al extremo 5 final de la Tstrand (Herrera-Estrella et al 1988; Young y Nester, 1988; Ward y Barnes, 1988) mediante el residuo de tirosina nmero 29, de esta forma protege a la T-strand de la accin de exonucleasas (Drremberg et al, 1989), a esta proteccin se suma la proporcionada por VierE2 que tambin se une, pero a lo largo de toda la T-strand. VirD2 acta como protena piloto impidiendo la deleccin de este extremo que es imprescindible para la transferencia ya que su deleccin abole la transferencia mientras que si se delecciona el borde izquierdo solo disminuye la eficacia del proceso (Joos et al, 1983; Herman et al, 1990). Esta polaridad observada est en total concordancia con el modo en el que se genera la T-strand, ya que su sntesis no puede iniciarse sin el

borde derecho mientras que la terminacin puede tener lugar sin el izquierdo aunque la frecuencia sea baja. Las protenas VirC estn implicadas en la formacin del complejo de borde, al menos en el caso de los plsmidos Ti para la octopina (Toro et al, 1989). VirC1 se une a la secuencia OD presente en el borde derecho, y dirige el corte realizado por VirD2 en dicho borde (Toro et al, 1988), sin embargo, el modo en que VirC1 media la interaccin entre VirD2 y OD es desconocido. Aunque todo el DNA localizado entre los bordes derecho e izquierdo es transferido la planta, en ocasiones, tambin se transfieren secuencias que no estn entre los mismos (Joos et al, 1983; Herman et al, 1990; Martineau et al, 1994; Denis et al, 1995; Cluster et al, 1995) seguramente debido a que el borde izquierdo no es procesado (Ramanathan y Veluthamby, 1995). En el 20-25% de las lneas transgnicas se detectan secuencias que no pertenecen al T-DNA y que se localizan corriente abajo del borde izquierdo (Martineau et al, 1994). Incluso se ha demostrado que secuencias cromosmicas pueden ser transferidas a la planta, aunque, con una frecuencia de 10-4 (Herman et al, 1994). Una vez producida la T-strand, es necesario que esta sea transportada a travs de la membrana bacteriana, diversos estudios demuestran que los productos del opern vir B estn implicados en este proceso (Tompson et al, 1988; Ward et al, 1988; Shirasu et al, 1990). De hecho la mayora de los 11 ORFs codificados por este opern codifican protenas que renen las caractersticas esenciales de un sistema de transporte a travs de membrana. Recientemente se ha observado que tras la induccin de los genes vir Agrobacterim forma un pili, en ausencia del mismo no se produce la transferencia del T-DNA (Fullner et al, 1996). Por tanto dicha transferencia se produce por un proceso de conjugacin en el que estn implicados estos polipptidos cuya funcin concreta se trata de dilucidar en estos momentos.

Bordes derecho e izquierdo

Una vez trasladado el T-DNA a la planta este debe insertarse en el genoma y para ello son necesarias las unidades de repeticin de 25pb presentes en el borde derecho: Derecho: 5-TGNCAGGATATATNNNNNNGTNANN 3 Izquierdo: 5-TGGAGGATATATNNNNNTGTAAANN 3 Durante la insercin del T-DNA en el DNA cromosmico de la planta, ste a menudo experimente cortas delecciones debido al proceso de empalme entre ambos DNAs. La insercin del T-DNA es aleatoria mientras que los bordes presentan cierta homologa con aquellos lugares del DNA de la planta en los que se insertan. Tras la insercin se produce la activacin de numerosos genes como los onc y op que ya hemos descrito.

2.1.2- Ingeniera gentica de plantas usando T-DNA El uso de T-DNA en la ingeniera gentica de plantas se basa en cuatro grandes descubrimientos y en el desarrollo de nuevas tcnicas. El primero fue la localizacin y deleccin de los genes que gobernaban la formacin del tumor (ipt, iaaM e iaaH). El segundo el desarrollo de marcadores tiles para detectar aquellas clulas vegetales que haban sido transformadas por Agrobacterium. El tercero el desarrollo de vectores y procedimientos genticos que permitan introducir genes forneos en el T- DNA y el cuarto el desarrollo de varios sistemas de cultivo de tejidos que permitieron la infeccin eficiente y la regeneracin de plantas transgnicas completas a partir de clulas vegetales transformadas con el inserto de inters. El proceso bsico de transformacin vegetal utilizando A. tumefaciens aparece recogido en la figura adjunta:

Figura : Transformacin mediante Agrobacterium tumefaciens.

Limitaciones de los plsmidos Ti

Los genes T-DNA aunque se localizan en un plsmido bacteriano, y tienen un origen claramente procaritico, estn flanqueados por seales 5 y 3 que permiten su expresin y funcionamiento en clulas vegetales (Gheisen et al, 1985). El desarrollo de los vectores de transformacin vegetal se basa en la idea de que, excepto las secuencias de los bordes, ningn otro gen del T-DNA es necesario para la transformacin y la integracin en la clula vegetal. Por lo que pueden ser sustituidos por un DNA exgeno, ya que cualquier DNA comprendido entre dichos bordes ser transferido al genoma de la planta. Pero estos los plsmidos Ti presentan ciertos inconvenientes, que como ya mencionamos, tuvieron que ir siendo solventados poco a poco. - Los genes onc tienen que ser eliminados, as las clulas vegetales transformadas no proliferan en un tejido tumoral y pueden regenerar plantas normales. Pero esto acarrea un inconveniente y es que al no formarse los tumores, las clulas transformadas son fenotpicamente indistinguibles de las clulas normales, por ello deben usarse marcadores que permitan seleccionar las clulas transformadas. - Tambin deben eliminarse los genes que codifican las opinas, ya que la planta desva parte de sus recursos para sintetizar estos compuestos y la produccin final obtenida es menor. - Los plsmidos Ti son largos para lo experimentos de de recombinacin de DNA (200,800kb), luego los segmentos de DNA que no son necesarios para el clonage se eliminan. La eliminacin de estos segmentos de DNA es lo que se conoce con el nombre de desarme del plsmido Ti.

SISTEMAS DE VECTORES DERIVADOS DEL PLSMIDO TI

Una vez superados los contratiempos sealados en el punto anterior, a tecnologa del DNA recombinante se dedic a disear vectores basados en plsmido Ti natural. Estos vectores, tienen una organizacin similar y constan de los siguientes componentes: - Un gen marcador seleccionable, como la neomicina fosfotransferasa que confiere resistencia a la kanamicina a las clulas vegetales transformadas. La mayora de los genes marcadores utilizados son de origen procaritico, por lo que deben ponerse bajo el control de la planta, por ello se hace necesario aadir un promotor y una secuencia de terminacin de poliadenilacin, que regulen y permitan la transcripcin de estos genes en la planta bajo las seales adecuadas. (Normalmente, adems de un gen marcador
para seleccionar las clulas vegetales transformadas, se emplea un segundo marcador que puede

consistir en un gen seleccionable o mas comnmente en un gen para la sntesis de opinas como la nopalina. Este segundo marcador va a permitir que sean detectadas aquellas clulas transformadas que escaparon del rgimen de seleccin inicial)

- Un origen de replicacin que le permita al plsmido replicarse en E.coli. En algunos vectores tambin se ha aadido un origen de replicacin que funcione en A.tumefaciens. - La secuencia del borde derecho del T-DNA como mnimo, aunque algunos vectores tambin incluyen la izquierda. - Un polylinker que facilite la insercin del gen clonado en la regin del T-DNA entre los dos bordes. - Lugares nicos de reconocimento para endonucleasas de restriccin, necesarios para clonar el gen o fragmento de DNA de inters en el T-DNA. - Un gen marcador bacteriano para seleccionar las clulas de E.coli y Agrobacterium que han incorporado el vector. - El gen/genes que queremos introducir en la planta deben ser tambin aadidos, al igual que los promotores necesarios para su expresin en la planta. La adicin de estos elementos es lo que se conoce con el nombre de armado del nuevo plsmido. Puesto que sin los genes vir estos vectores no pueden insertar por s mismos el TDNA en la clula vegetal, se han diseado dos tipos de sistemas de vectores derivados del plsmido Ti, estos sistemas son los que se utilizan en la actualidad: - Sistema de vector cointegrado ( sistema cis): se introducen nuevos genes en un plsmido Ti no oncognico mediante recombinacin homloga (Zambriyski et al, 1983; Deblaere et al, 1985). - Sistema de vector binario (sistema trans): los nuevos genes son clonados en un plsmido que contiene T-DNA no oncognico, este plsmido es posteriormente introducido en una variedad de Agrobacterium que posee un plsmido Ti con una regin vir intacta pero que carece de T-DNA. En cualquiera de los dos casos, el DNA de inters primero se clona en Echerichia coli y posteriormente se transfiere a Agrobacterium por conjugacin (Van Haute et al, 1983) o electroporacin (Mersereau et al, 1990). Sistemas de vector binario: El vector binario lleva: - Orgenes de replicacin tanto para E. coli como para A. tumefaciens, o en su defecto un origen de replicacin de amplio rango.

- Un gen marcador seleccionable tanto para E.coli como para A. tumefaciens. Tanto el gen marcador como los genes que se desea sean expresados por la planta van insertados entre los bordes derecho e izquierdo. El vector binario no lleva: - Los genes vir Todos los pasos de clonaje se realizan en E. coli antes de que el vector sea introducido en A. tumefaciens. A. tumefaciens presenta un plsmido Ti con el set completo de genes vir pero no consta de T-DNA. As el plsmido Ti defectivo sintetiza lo genes vir que permiten la transferencia del T-DNA del vector binario. Se tratara de un vector binario que contiene el gen de inters y el gen marcador seleccionable entre los bordes del T-DNA y un plsmido Ti llamado ayudante que contiene los genes vir necesarios para que la transferencia al genoma vegetal tenga lugar (de Framond et al, 1983; Hoeckema et al, 1983). Este es el sistema que mas se utiliza actualmente.

Figura: Vector binario.

Sistemas de vector cointegrado: El vector cointegrado lleva: - EL origen de replicacin de E.coli y no puede existir autnomamente en el interior de A.tumefaciens. - Marcador seleccionable que puede ser utilizado tanto en E. coli como en A. tumefaciens. - Marcador seleccionable para las clulas vegetales transformadas. - Los genes diana (a insertar en l genoma de la planta). - El borde derecho del T-DNA.

- Una secuencia de DNA que presenta homologa respecto a un segmento del plsmido Ti desarmado.

El plsmido desarmado Ti lleva: - El borde izquierdo del T-DNA - El cluster de genes vir - Un origen de replicacin para A. tumefaciens.

Figura : Vector cointegrado

Pero este plsmido Ti desarmado carece de: borde derecho del T-DNA y de los genes onc. El vector cointegrado tiene que integrarse en este plsmido Ti desarmado para formar un plsmido Ti recombinante.

Tanto el plsmido Ti desarmado como el vector cointegrado llevan secuencias de DNA homlogas que proporcionan un lugar para la recombinacin homloga in vivo, normalmente esta secuencias se localizan dentro del T-DNA. Tras la recombinacin homloga el vector cointegrado se integra en el plsmido Ti y este proporciona los genes vir, necesarios para la trasferencia del T-DNA a un amplio rango de clulas vegetales. La nica forma de que estos vectores sean mantenidos en A. tumefaciens es como parte de una estructura cointegrada. El problema a la hora de utilizar estos vectores es que su gran tamao (normalmente mayor de 10 kb) dificulta su manipulacin in vitro. Adems los plsmidos tan grandes tienden a tener menos sitios de restriccin nicos para el proceso de clonaje. Por ello se suelen utilizar vectores binarios de pequeo tamao basados en la secuencia del vector binario pBIN19. Este vector presenta la ventaja de que sigue siendo funcional aunque la mayor parte de su DNA sea deleccionada. As se puede construir un vector que, en lugar de las 11,8 kb que presenta el original, solamente tenga 3-5 kb. Este vector mini binario se denomina pCB301 y se muestra en la figura adyacente.

Figura : Vector Pcb301. Abreviaturas: oriV , parte del origen de replicacin; npt, gen de la neomicina fosfotransferasa; trfA, parte del origen de replicacin; RB, borde derecho del T-DNA; MCS, sitio de clonaje mltiple; LB, Borde izquierdo del T-DNA; P35s, promotor constitutivo del virus del mosaico de la coliflor; TP, secuencia de la protena diana; T35s, secuencia de terminacin de la transcripcin del gen 35s del virus del mosaico de la coliflor; bar, gen de la fosfinotricina acetiltransferasa. (Xiang et al., 1999)

Dado que ciertas regiones necesarias para la conjugacin han sido deleccionadas, este vector no puede ser transferido a A. tumefaciens por conjugacin por lo que tienen que usarse mecanismos alternativos como la electroporacin, de la que hablaremos mas tarde. Ventajas que ofrecen los vectores derivados de pCB301: - El gen bar, se localiza adyacente a una regin promotora y a una regin de terminacin de la transcripin, codifica por el enzima fosfinotricn acetltransferasa que es insertada en el sitio de clonacin mltiple. Las plantas transformadas lo expresan y son fcilmente detectadas. - Adyacente al gen bar pero en orientacin opuesta se localiza un casete que incluye: un promotor 35S; una secuencia de DNA que codifica protenas que se expresa tanto en mitocondrias como en cloroplastos; un elemento de unin transnacional que incrementa el nivel de expresin de la protena codificada por el gen anterior; una porcin del sitio de clonacin mltiple y una secuencia de terminacin de la transcripcin.

- Estos vectores derivados son flexibles, fciles de usar y contienen una amplia gama de sitios de restriccin nicos.

2.2.- Agrobacterium rhizogenes

Existe otra familia de plsmidos de Agrobacterium que podra servir de vectores de genes para la obtencin de plantas sanas, genticamente modificadas. Provocan una proliferacin de las races denominada raz en cabellera, en la plantas infectadas por A. rhizogenes y se llaman plsmidos Ri (de root inducing). Las races, como el tejido de la agalla, crecen rpidamente en un cultivo libre de bacterias. Jacques Temp y sus colegas del Instituto nacional Francs de Investigaciones Agronmicas, demostraron que las clulas de las races contienen opinas y T-DNA. Al igual que los plsmidos Ti del mutante races de la nopalina, los plsmidos Ri dan origen a clulas vegetales transformadas que pueden regenerar plantas frtiles intactas y sanas. Estos plsmidos Ri parecen ser vectores desarmados sin violencia exterior y los procedimientos para transformar plantas utilizndolos son bastante similares a los de A. tumefaciens por lo que no nos extenderemos mas y daremos paso a otro tipo de tcnicas que permiten la transferencia directa de DNA

3.- VECTORES VIRALES:

Los vectores virales no han satisfecho las expectativas sobre su uso en Ingeniera Gentica de plantas, pero s tienen el potencial de complementar las tecnologas existentes de transferencia directa de genes y transformacin mediante Agrobacterium de manera efectiva. Se pueden infectar de forma sistmica plantas completas e investigar as la expresin gnica en los diferentes tejidos. La infeccin sistmica tiene lugar de forma tpica en das o semanas, no en meses, y las partculas virales se acumulan en altos niveles conduciendo a la amplificacin gnica y a la posibilidad de expresin a gran escala. Sin embargo, los virus descubiertos hasta ahora no se integran en el genoma husped, y la transmisin a travs de la lnea germinal no ha sido posible. Tambin existen problemas con respecto a la existencia de un rango de hospedadores limitado y problemas de empaquetamiento segn el tamao del inserto en vectores virales. Existen dos grupos diferenciados de virus vegetales, los virus DNA y los virus RNA. En general, los virus de RNA tienen su ciclo en el citoplasma mientras que los virus de DNA pueden tener su replicacin asociada al ncleo. De esta manera, los virus de DNA presentan mecanismos de regulacin similares a los de la planta husped, mientras que los virus de RNA tienen mecanismos de regulacin generalmente diferentes. Los virus DNA constituyen slo el 1-2% de los virus vegetales que se conocen (Lebeurier, 1986). Pueden subdividirse en dos grupos: los caulimovirus de doble cadena y los geminivirus de cadena sencilla. Debido a que es ms fcil trabajar con virus DNA, la mayor parte del trabajo en desarrollo de vectores virales se lleva a cabo en estos virus.

1.- VIRUS DNA

Caulimovirus:

Figura : Visin al microscopio de partculas virales de caulimovirus infectando un tejido vegetal.

Existen al menos doce miembros de la Familia Caulimoviridae (Hull y Davies, 1983), y de ellos el mejor caracterizado es el virus del mosaico de la coliflor (CaMV).

El CaMV posee un genoma con DNA de doble cadena de aproximadamente 8 kilobases, y con un rango limitado de hospedadores, en su mayora crucferas como la coliflor y el nabo. Los fidos son los vectores de transmisin naturales; sin embargo, tambin se puede producir infeccin mediante inoculacin mecnica y agroinfeccin (uso de Agrobacterium como vector para facilitar la infeccin viral de plantas). El DNA viral se transcribe en el ncleo de las clulas infectadas mediante la RNA polimerasa II codificada por el genoma vegetal. Se producen dos transcritos principalmente, un RNA 35s correspondiente al DNA viral completo con una repeticin terminal de 180 pb, y un RNA mensajero subgenmico 19s que termina en el mismo punto que el RNA 35s. Hay ocho pautas de lectura abierta potenciales (ORFs). El transcrito 19s probablemente codifica el ORF IV, responsable del desarrollo de los sntomas (Baughman et al., 1988). Se ha propuesto que los otros ORFs son traducidos desde el transcrito 35s mediante un mecanismo (relay race) en el que los ribosomas paran despus de pasar el codn de terminacin de un transcrito, y se reinician en el siguiente codn de iniciacin del transcrito. Tambin se ha sugerido que los ORFs IV y V podran expresarse como una larga protena precursora que sera posteriormente modificada para producir dos protenas funcionales. El virus se replica mediante el priming del transcrito 35s con un tRNA-met codificado por el hospedador, seguida de la sntesis de la cadena menos (-) de DNA catalizada por una reversotranscriptasa codificada por el virus. El ORF II es un factor de transmisin por fidos (Daubert et al., 1983) y no es esencial para la infectividad viral como un hecho natural. Gronenborn et al. (1981) clonaron con xito DNA extrao en el ORF II y encontraron que mayor tamao de DNA que se poda introducir de esta manera era de aproximadamente 250 pb. Brisson et al. (1984) remplazaron ORF II con un pequeo (234 pb) de bacteriano que codifica para la dihidrofolato reductasa (dhfr), el cual fue expresado y propagado de forma estable en plantas de nabo. Este gen confiere resistencia al metotrexato, y las plantas de nabo que fueron infectadas con CaMV que contena este gen dhfr resultaron resistentes a dicho compuesto. Se encontr que cuando alguna de las construcciones tena una extensa regin no codificante entre el final de ORF I y el principio de dhfr, entonces la construccin era inestable para el trnsito a la planta y expresaba el gen en menor medida. Esta sensibilidad al tamao de las secuencias intergnicas hallada en CaMV muestra lo cuidados que hay que ser en el diseo de este tipo de vectores. En el vector CaMV simple el tamao lmite de los insertos clonados es probablemente de unas 800 pb (mediante deleccin y adicin). Se sugiri otra aproximacin diferente, que es la construccin de mutantes complementarios, tales que el vector mutante transporte el DNA extrao y slo unas pocas de las funciones de CaMV, y el otro mutante porte todos los ORFs de CaMV (pero es deficiente en los ORFs que portan el vector. Esta aproximacin ha sido testada (Choe et al., 1985); se contruyeron pares de complementarios, mutantes no infectivos CaMV que se usaron en una infeccin mixta. Se consigui una infeccin con xito, pero sucesos de recombinacin eliminaron el DNA exgeno. La alta frecuencia de recombinacin de CaMV se haba observado ya con anterioridad (Walden y Howell, 1982). Quizs, si los mutantes defectivos complementarios pudiesen construirse sin homologa, o con muy poca, esta aproximacin del diseo del vector resultara fructfera. Pazkowski et al. (1986) intentaron tambin usar la complementacin como una ruta para la utilizacin de

CaMV como vector; remplazaron el ORF IV (traducido del transcrito 19s) con la regin codificadora de NPTII. Desafortunadamente, este mutante no fue infectivo tanto por s mismo como cuando era complementado por la cepa salvaje del virus. El gen NPTII se expres a partir del promotor viral cuando el virus mutante fue transferido a los protoplastos de nabo mediante transferencia directa de genes, pero no hubo escape del virus, y las secuencias virales se asociaron slo con DNA genmico de alto peso molecular. Otra aproximacin a la complementacin en los vectores CaMV sera introducir un genoma de un virus defectivo complementario dentro del genoma de la planta mediante agroinfeccin (transformacin mediada por Agrobacterium). ste podra constituir un sistema equivalente al sistema de clulas COS para la propagacin de vectores basados en el virus SV40 defectivo de mamferos (Gluzman, 1981). La validez de este mtodo en vectores basados en CaMV an empieza a investigarse. El trabajo de Pazkowski et al. (1986) dio lugar a la demostracin de que los productos gnicos de los genomas de CaMV mutantes clonados en plantas pueden ser expresados. Shewmaker et al. (1985) clonaron una copia entera de CaMV en una gran variedad de especies vegetales, y mostraron que tanto el transcrito 19s como el 35s son expresados (a distintos niveles segn la especie). Adems, Walden ha conseguido plantas de tabaco (fuera del rango de hospedadores normal de CaMV) que contienen dmeros de CaMV y muestra que el homogenizado de la hoja de estas plantas es infeccioso cuando se inocula en nabo; pero an no est claro si el virus se replica en el tabaco, o s la infeccin del nabo est mediada por los transcritos 19s y 35s. Quizs el tabaco, que es ms susceptible a transformacin gentica, pueda usarse como modelo para este sistema. Recientemente nuevos estudios proponen el uso de estos virus como vectores. El ms prometedor, desarrollado por Hull et al. (2005) propone un sistema de activacin de transgn mediada por el virus CaMV. A pesar de ello, el sistema de transformacin vegetal mediada por caulimovirus sigue, hoy en da, sin constituir un sistema eficaz y con aplicabilidad en este terreno

Geminivirus:

Figura : Visin al microscopio de partculas virales de geminivirus infectando un tejido vegetal.

Los geminivirus (revisado por Davies et al., 1987; Harrison, 1985; Stanley, 1985) son virus DNA de cadena sencilla que se replican en el ncleo de las clulas mediante un DNA intermediario de doble cadena. Copias clonadas de varios miembros de los gemini virus son transmisibles a un amplio rango de hospedadores, que incluyen tanto a monocotiledneas como a dicotiledneas (Harrison, 1985). En la literatura se presentan evidencias de algunas enfermedades causadas por geminivirus desde hace varios siglos. Estas enfermedades se caracterizan por presentar sntomas como enrollamiento de la hoja, rugosidad, mosaicos amarillos, enanismo de la planta, clorosis y generalmente una disminucin en el rendimiento. Sin embargo, fue en la dcada de los aos 1970 cuando se determin que el agente causal de una enfermedad que produca un mosaico dorado en yuca era un virus con caractersticas nicas que incluan una morfologa geminada (dos icosahedros unidos por un lado) y un genoma circular de DNA de cadena sencilla. A partir de entonces, el nmero de geminivirus registrados ha ido creciendo aceleradamente hasta llegar a ser una de las familias ms numerosas. Los geminivirus son una familia de virus patgenos de plantas que son transmitidos por insectos vectores a una gran variedad de plantas monocotiledneas y dicotiledneas. La distribucin geogrfica del insecto vector es la responsable de la distribucin paralela del geminivirus que transmite. La familia Geminiviridae se divide en tres gneros segn su espectro de huspedes (si infectan mono o dicotiledneas), a su insecto vector (mosca blanca o chicharrita), y a su estructura genmica (mono o bipartita). Aquellos virus transmitidos por la chicharrita tienen, por lo general, genomas monopartitos, mientras que los transmitidos por la mosca blanca tienen genomas bipartitos. Los miembros de esta clase han sido recientemente propuestos como vectores vegetales. Adems del inters que los geminivirus despertaron como agentes causales de muchas enfermedades de importancia econmica, el hecho de tener un genoma de DNA atrajo la atencin de muchos grupos que se dedicaron a explorar la posibilidad de usar los geminivirus como vectores para la introduccin de material gentico en plantas. Una segunda razn poderosa era la perspectiva de usar los geminivirus como modelos de estudio de manera similar a los trabajos realizados con bacterifagos a mediados del siglo pasado o un poco ms tarde con algunos virus de DNA (SV40, adenovirus) en sistemas animales. La posibilidad de usar los geminivirus como vectores para introducir DNA forneo en plantas ha ido perdiendo inters al verificarse que estos virus presentan restriccin al aumento de tamao de su genoma, es decir, cuando se les introducen genes forneos que aumentan el tamao del genoma los virus quimricos tienden a eliminar ese DNA en un intento de recuperar su tamao original. Por otro lado, los geminivirus s estn respondiendo a las expectativas de ser usados como modelos para estudiar algunos procesos moleculares en plantas. El genoma del virus latente de la yuca (Cassava Latent Virus CLV) consiste en dos componentes denominados DNA 1 y DNA 2. El DNA 1 codifica funciones esenciales para la replicacin, pero no para la infeccin sistmica o la transmisin clula a clula (Townsend et al. 1986); tambin se ha descubierto que este DNA 1 codifica una protena de la cubierta que no es esencial para la infectividad (Stanley y Townsand, 1986). Ward et al. (1988) mostraron que, aunque la deleccin del gen que codifica para la protena de la cubierta suprime la infectividad mediante inoculacin manual con molculas lineales de DNA 1 y DNA 2, los mutantes en los que se remplaza por secuencias de tamao similar son totalmente infecciosos. Cuando el gen de esta protena

se sustituye por el gen CAT bacteriano y el DNA 1 diseado se inocula en Nicotiana benthamiana junto con el tipo salvaje de DNA 2, las plantas desarrollan sntomas normales de infeccin, y CAT se expresa sistemticamente en altos niveles (80 unidades/mg de protena soluble) 10 das despus de la inoculacin. Los mutantes defectivos de complementacin de CLV sufren frecuentemente recombinacin para originar el virus de tipo salvaje (Ward et al., 1988). Sin embargo, no se observ inestabilidad en la expresin vrica del den CAT, presumiblemente porque no exista una presin selectiva para la deleccin del gen. Hayes et al. (1988) realizaron un trabajo similar con el virus del mosaico dorado del tomate (TGMV). El TGMV tiene un genoma bipartito de dos molculas circulares de DNA de cadena sencilla, aproximadamente de 2,5 kb (DNA A y DNA B). La nica homologa entre las dos cadenas es la llamada regin comn de unas 200 pb. Hayes et al. (1988) encontraron que, cuando las plantas de tabaco de tipo salvaje son agroinfectadas con bacterias que contienen (dentro del mismo T-DNA) o dmeros de DNA A y DNA B, o un dmero parcial de A y un dmero de B, o un dmero de B y un dmero parcial de A con ausencia de una parte del gen que codifica la protena de la cubierta, la infeccin sistmica se consigue fcilmente. La infeccin sistmica se consigue tambin cuando las plantas son agroinfectadas con una mezcla con una cepa que contiene un dmero de A y otra cepa que contiene un dmero de B. Se ha sugerido que la partcula A puede codifica las funciones necesarias para la replicacin, y que la partcula B codifica las funciones relacionados con la transmisin clula a clula y el desarrollo de los sntomas. Hayes et al. (1988) construyeron vectores en los cuales la regin que codifica NPTII sustituye a la regin que codifica la protena de la cubierta, y realizaron a partir de aqu sistemas de agroinfeccin en plantas de tabaco. Estos vectores contenan o 1,6 copias repetidas en tndem de la regin que codifica NPTII del DNA A del TGMV (pBIN19A1.6 neo), o lo mismo ms dos copias de del DNA B de TGMV (pBIN19A1.6 neoB2) entre los bordes del T-DNA de Agrobacterium. Las plantas de tabaco de tipo salvaje fueron agroinfectadas con pBIN19A1.6 neoB2, y las plantas transgnicas B2 (que contenan el DNA B de TGMV integrado en el genoma) fueron agroinfectadas con pBIN19A1.6 neo. Cuatro de las 20 plantas del primer tipo, y 18 de las 20 del segundo fueron infectadas sistemticamente tal y como se determin mediante un anlisis dot blot de DNA usando sondas especficas para DNA A y DNA B de TGMV. Ningunas de las plantas neo-infectadas mostraron sntomas. Las infecciones fueron confirmadas mediante Southern Blot; se encontraron formas del DNA viral superenrrolladas y en crculo abierto del tamao esperado. Cuando se usaron plantas del tipo salvaje sin neo pBIN19A1.6B2 para infectar plantas de tabaco, la infeccin fue ms eficiente. Tambin se construyeron plantas que contenan A1.6neo integrado en su cromosoma. Mediante Southern blot reencontr en el DNA de la planta las formas mononmricas del DNA A neo de TGMV (con la regin codificante de NPTII en lugar del gen de la protena de la cubierta. El tamao del NTPII expresado en el DNA A de TGMV es de 2708 pb, en comparacin con el DNA A de la cepa salvaje, que es de 2588 pb. El tamao lmite de este vector ha sido ampliado mediante la introduccin de la regin codificante para la glucuronidasa (GUS) en el sitio de NPTII; es un aumento de 600 pb.

Existen varias diferencias interesantes entre el trabajo con CMV y con TGMV. La prdida de infectividad observado en los mutantes CLV por deleccin de gen para la protena de cubierta no se ha observado en los mutantes TGMV por deleccin del gen para la protena de cubierta, lo cual sugiere que quizs el tamao obligado en CMV es ms reducido en CMV que en TGMV. Adems, la construccin de TGMV produjo plantas asintomticas, a diferencia de CMV. Debido a que el gen marcador, el hospedador y el mtodo de infeccin difieren en los dos experimentos, no est claro si las diferencias observadas fueron debidas a los virus o a la forma en que los experimentos fueron llevados a cabo. Los vectores basados en geminivirus parecen constituir una enorme promesa en cuanto a aplicabilidad. Pueden proporcionar mecanismos eficientes de amplificacin gnica en plantas, tanto por infeccin sistmica de plantas con el vector proporcionando un rpido ensayo de expresin gnica, o por producir plantas transgnicas para un dmero parcial del vector proporcionando amplificacin gnica heredable. An no se ha determinado el lmite en cuanto al tamao del DNA forneo que se puede replicar por un vector de este tipo, pero no est limitado por restricciones en cuanto a encapsulamiento, como en el caso de los caulimovirus. Adems, el rango de hospedadores de los geminivirus es muy elevado.

2.- VIRUS RNA

La utilidad potencial de los virus RNA es an incierta. No existen ensayos de infecciones directas de las formas cDNA de los virus RNA. As, la infeccin mediante transcritos RNA sintetizados in vitro es la nica ruta obvia de disear virus de RNA (Fraley et al., 1986). Tambin se ha sugerido que la elevada tasa de error durante la sntesis viral de RNA causara inestabilidad en genes forneos (van Vloten-Doting et al., 1985). No existe presin selectiva a la hora de corregir errores producidos en estos genes forneos, en contraste con las mutaciones producidas en los genes virales endgenos, aunque es una cuestin bastante discutida. Existen un par de investigaciones sobre genes forneos expresados en vectores virales de RNA. French et al., 1986 inform de la expresin del gen bacteriano CAT mediado por transcritos de RNA de una protena de fusin de la cubierta del virus del mosaico de bromo en protoplastos de cebada. Como se usaron protoplastos, es difcil comparar los resultados con otros obtenidos con diferentes vectores de origen viral. Takamatsu et al. (1987) tambin realizaron experimentos similares con el virus del mosaico del tabaco, pero los resultados fueron poco consistentes Todos estos resultados sugieren que la utilizacin de virus RNA como vectores para la transformacin de plantas es poco factible en este momento.

4.- VECTORES TRANSPOSONES:

Los transposones son fragmentos de DNA que pueden realizar saltos de una zona del DNA a otra in vivo. Un buen ejemplo lo constituye el elemento Ac (McClintock, 1951), que crea una duplicacin de 8 pb en el sitio de integracin y puede escindirse a s mismo de forma precisa de una parte del genoma e integrarse en otra, en una posicin distal. Este descubrimiento condujo a la posibilidad del uso de los transposones como vectores de transferencia gnica. El elemento Ac del maz se transfiri a plantas de tabaco por medio de una transformacin mediada por Agrobacterium. En dichas plantas se observ su escisin y reintegracin en cualquier sitio tal y como ocurre en el hospedador natural (maz), (Baker et al., 1986). Se han clonado varios genes de plantas usando transposones. Un gen mutado portando un inserto transposn se aisla primero usando un transposn previamente clonado como sonda para encontrar el elemento y el DNA flanqueante; el DNA flanqueante se usa posteriormente como sonda para aislar el gen desde la lnea salvaje. A pesar de ello, su aplicabilidad como vectores no est del todo definida.

5.- TCNICAS DE TRANSFERENCIA GNICA DIRECTA

Adems de las tcnicas de transferencia gnica basadas en el uso de Agrobacterium, existen otro tipo de tcnicas basadas en la utilizacin de tratamientos qumicos, fsicos y elctricos para introducir DNA en las clulas. Estas tcnicas son denominadas comnmente como tcnicas de transferencia gnica directa (DGT). Aunque la transferencia gnica mediada por Agrobacterium resulta efectiva en varias especies, las plantas monocotiledneas, incluidos los principales cereales (arroz, maz y trigo) no son transformadas fcilmente por Agrobacterium tumefaciens. Estas dificultades en la transformacin de determinadas especies vegetales crean la necesidad de desarrollar otros procedimientos alternativos para la transferencia gnica. Comienza as el desarrollo de las tcnicas de transferencia gnica directa.

5.1.- TRANSFETERENCIA DE DNA A PROTOPLASTOS

La incorporacin y expresin de DNA mediante protoplastos fue el primer mtodo de transferencia gnica que se demostr que funcionaba en plantas. La tcnica se basa en el principio de que la pared celular es la principal barrera para la captacin de DNA, as que esta puede ser temporalmente extrada; posteriormente distintos mtodos simples pueden ser utilizados para la transferencia gnica. Los protoplastos tiene un gran inters en lo que se refiere al proceso de extraccin de la pared celular (mediante enzimas de restriccin), pues este va a aislar las clulas de una en una a partir del tejido utilizado, por lo que las clulas diana para la transferencia es una gran poblacin de unidades individuales. Para la transformacin, las clulas son obtenidos a partir de distintos tejidos, que van a depender de la planta utilizada y del objetivo del estudio. Para los anlisis de expresin transitoria, no se necesitan clulas en divisin, solo se necesitan clulas capaces de sobrevivir 24-72 horas tras el tratamiento, por lo que los protoplastos pueden ser aislados a partir de casi cualquier tipo de tejido. Para la transformacin estable se necesitan clulas en divisin, por lo que el nmero de tejidos que van a servir como fuente de protoplastos es ms restringido. La subsiguiente captacin de DNA a los protoplastos aislados puede ser efectiva mediante distintos mtodos fsicos y qumicos que van a crear poros en la membrana o bien mediante mecanismos de endocitosis que van a permitir el paso de molculas externas a travs de la membrana. El mtodo qumico ms efectivo es el mtodo que usa polietilen glicol (PEG) en combinacin con cationes divalentes (Ca++ o Mg++). El mecanismo de la captacin de DNA inducido por el PEG no est completamente entendido, pero implica la contraccin del volumen del protoplasto debido a la alta presin osmtica originada por el PEG, seguido de la creacin de vesculas endocticas que incorporan el complejo catin/DNA. Muchos factores van a influir en la eficacia del proceso de transformacin, principalmente la concentracin de PEG, el pH del tampn de transformacin y la cantidad de cationes divalentes. Los protoplastos de distintas

especies muestran distinta sensibilidad al estrs producido por el tratamiento de transformacin con PEG y en todos los casos un porcentaje de la poblacin de protoplastos es daada. Con la optimizacin del procedimiento se pueden llegar a alcanzar frecuencias de transformacin estable del 1-5% (Spangenberg & Potrykus, 1995). La mayor alternativa al tratamiento con PEG para la transformacin de protoplastos es la electroporacin. En este mtodo los protoplastos son suspendidos en un tampn con gran conductividad que contiene el DNA. Se aplican pulsos cortos de alto voltaje que pasa a travs de la solucin, causando la aparicin de poros de forma reversible en la membrana, que van a permitir la entrada de molculas externas. Se han hecho una gran cantidad de trabajos con el fin de optimizar esta tcnica. Se utilizan pulsos de bajo voltaje (300-500 V/cm) durante largos periodos de tiempo (30-100 ms) o voltajes altos (1000-10000 V/cm) con pulsos cortos. Los efectos de los parmetros elctricos son obviamente modificados por la conductividad del tampn de electroporacin, y a cualquier conductividad dada, la composicin inica va a influir tambin en la captacin del DNA o en la supervivencia celular. Como es de esperar, las condiciones optimas de transformacin varan segn la planta de la que es obtenido el protoplasto. Uno de los principales factores es el tamao del protoplasto, pues a mayor tamao es ms elevado es el campo elctrico necesario para la electroporacin. Las principales ventajas del mtodo de transformacin de protoplastos son que en los ensayos de expresin transitoria permiten la transformacin de un nmero muy elevado de clulas individuales, facilitando los ensayos cuantitativos con buenos niveles de replicacin. Este mtodo tambin permite la produccin de muchas lneas independientes, la seleccin de microcayos derivados de protoplastos es eficiente y mediante la inmovilizacin de los protoplastos en sustratos como agarosa o alginato se pueden manipular con facilidad un gran nmero de cayos. Estos tributos permiten la seleccin de eventos que ocurren a muy baja frecuencia como la recombinacin homloga entre transgnes (Baur et al., 1990). La principal limitacin del uso de estas tcnicas es que en muchas de las especies vegetales en las que se aplican estas tcnicas de forma usual (i.e. aquellas especies recalcitrantes a la transformacin mediante Agrobacterium) la generacin de las plantas a partir de cultivos de protoplastos no es eficiente. Por esta razn, muchos laboratorios han elegido el uso de bombardeo de partculas como mtodo alterativo para la transferencia gnica, pues esta tcnica permite el uso de explantos multicelulares a partir de los cuales es ms fcil de regenerar plantas.

5.2.- BOMBARDEO CON MICROPROYECTILES

El bombardeo con microproyectiles o biolstica, es el mtodo alternativo al plsmido Ti ms importante para transferir DNA a plantas. La tcnica consiste en baar partculas esfricas de oro o tungsteno (aproximadamente de 0,4-1,2 micrmetros de dimetro, o del tamao de algunas clulas bacterianas) con DNA, el cual ha sido precipitado con CaCl2, espermidina o polietilen glicol. Las partculas baadas con DNA son aceleradas a altas velocidades (300-600 metros / segundo) con un equipo especial llamado pistola de partculas (o pistola de genes). La versin original de esta pistola de

partculas utilizaba una pequea cantidad de plvora para acelerar las micropartculas. Actualmente se usa helio a altas presiones como fuente para la propulsin. Los proyectiles acelerados van a penetrar la pared celular y la membrana de la clula, aunque la densidad de partculas utilizadas no va a resultar significativamente daina para la misma. El alcance de la penetracin de las partculas en las clulas vegetales puede ser controlada variando la intensidad del estallido, alterando la distancia que las partculas han de atravesar para alcanzar la clula o utilizando partculas de diferentes tamaos. Una vez dentro de la clula, el DNA se separa de las partculas y, en algunos casos, es integrado dentro del genoma de las plantas. El bombardeo con microproyectiles es utilizado para transferir DNA exgeno a suspensiones celulares de plantas, a cultivos de callos, a tejidos meristemticos, a embriones inmaduros y a polen, todos ellos obtenidos a partir de un amplio rango de plantas diferentes, incluidas monocotiledneas y confieras, plantas menos susceptibles de la infeccin por Agrobacterium. Adems, este mtodo a sido utilizado para transferir DNA a cloroplastos y mitocondrias. De forma convencional, los plsmidos de DNA disueltos en tampn son precipitados sobre la superficie de los microporoyectiles. Este procedimiento tiene como objetivo aumentar la frecuencia de clulas transformadas al aumentar la cantidad de plsmido de DNA; no obstante, una elevada cantidad de plsmido puede resultar inhibitoria. Se estima que aproximadamente 10,000 clulas son transformadas con cada bombardeo. Con esta tcnica, las clulas transformada, que son detectadas por la expresin de unge marcador, a veces solo expresan el DNA transferido de forma transitoria. La configuracin de los vectores que son utilizados en biolstica para introducir genes forneos a plantas influye tanto en la integracin como en la expresin de dichos genes. De este modo, la transformacin resulta ms eficaz cuando se usa DNA linear en vez de circular. Adems, los plsmidos de tamaos superiores a 10 Kb, a diferencia de los pequeos, pueden ser fragmentados durante el bombardeo con microproyectiles, produciendo una tasa menor de clulas transformadas. Aun as, si el fragmento de DNA que se va a incorporar en el genoma de la planta es de gran tamao, este va a ser introducido utilizando cromosomas artificiales de levadura (YACs), queque estn diseados para contener marcadors de seleccin de la planta, as como marcadores de seleccin de levaduras. Como un sistema para verificar si la transformacin de las clulas vegetales a tenido lugar, distintas cantidades de DNA obtenidas de Cochliobolus heterostrophus son clonadas en el vector, de modo que la talla del YAC ser de 80 a 550 kb. Posteriormente, el vector con el DNA del hongo ser transferido a las clulas vegetales. Aquellas clulas transformadas resistentes al antibitico kinamicina sern aisladas. Se confirmar posteriormente la presencia en estas clulas del segundo gen marcador, el cual va a conferir resistencia al antibitico higromicina, y que se encuentra localizado en el otro brazo del vector YAC. La presencia de ambos genes marcadores en las clulas transformadas indican que el vector completo, as como el DNA forneo presente en el mismo, ha sido transferido de forma eficaz. El mtodo de bombardeo de micropartculas es una de las tcnicas de transferencia gnica ms importante, ya que por su naturaleza totalmente fsica, es independiente del tipo de clula blanco y ha sido utilizado no slo para introducir ADN exgeno a clulas

vegetales, sino a clulas de una gran variedad de organismos tales como bacterias, algas, hongos, clulas animales, y an animales y plantas intactas. La biobalstica ha sido utilizada con xito para producir plantas transgnicas a partir de una gran variedad de tejidos vegetales, entre los que se incluyen hojas, meristemos, embriones en desarrollo, embriones maduros, callos embriognicos, suspensiones celulares, etc. Los principales logros en la obtencin de plantas transgnicas por medio de este mtodo, incluyen especies de gran inters econmico como son la soja, el maz, el arroz, el sorgo, la papaya, la caa de azcar, el trigo y el esprrago. Tambin se ha utilizado para transformar microorganismos como levaduras, el moho Aspergillus y el alga Chlamydomonas. Esta metodologa de transformacin tiene ciertas limitaciones. Algunos tejidos oponen una resistencia natural a la penetracin de las partculas, dada por cutculas endurecidas, paredes celulares lignificadas o superficies vellosas. Sin embargo, los principales limitantes del mtodo continan siendo la baja relacin entre el total de clulas sometidas al bombardeo y el nmero de clulas que logran incorporar de manera permanente la informacin gentica transferida.

5.3.- MICROINYECCIN
La transformacin estable va inyeccin de DNA en el ncleo celular (Jaenisch & Mintz, 1974) es una tcnica que ha sido aplicada en clulas animales desde hace ya veinte aos, convirtindose en el mtodo de transferencia gnica ms utilizado, sobre todo en mamferos. La microinyeccin ofrece la ventaja de que es uno de los dos mtodos, junto con la transformacin mediada por lser, que permite la transferencia gnica a una clula concreta. La clula continuars su desarrollo y es transgn expresado lo har tambin en su progenie. Esto constituye una poderosa herramienta para analizar la expresin gnica diferencial en distintos tipos celulares y para el marcaje de clulas en el estudio de morfognesis vegetal. En plantas la aplicacin de la microinyeccin resulta ms dificultosa que en animales y , aunque se han hecho importantes avances en la aplicacin de esta tcnica en clulas vegetales, su uso continua resultando muy complicado. La principal dificultad que se encuentran en plantas es la presencia de pared celular, la cual no es solo una barrera fsica que hace necesario el uso de capilares mucho ms gruesos para llevar a cabo la microinyeccin, sino que tambin dificulta mucho la visualizacin del ncleo, lo que hace que la microinyeccin tenga lugar muchas veces en el citoplasma. Otro problema es la presencia de grandes vacuolas en las algunas clulas vegetales, pues si el DNA es transportado a su interior, este ser degradado antes de alcanzar el ncleo. En los primeros estudios, la dificultad de atravesar la pared celular para llevar a los investigadores a utilizar sistemas de protoplastos. A mediados de los aos ochenta, se consigui llevar a cabo la transformacin de tabaco y alfalfa va microinyeccin de protoplasto con el plsmido de DNA de Agrobacterium (Cossway et al., 1986; Reich et al., 1996). Un ao despus, consigui llevarse acabo de forma exitosa la microinyeccin de cromosomas aislados (Griesbach et al., 1987; de Laat and Plaas, 1987).

Aunque en principio la transformacin de clulas mediante microinyeccin ocurre solo de manera transitoria, al menos en clula tisulares, se a observado que las clulas de la lnea germinal transformadas son capaces de generar plantas (Simmond et al., 1992) y la inyeccin en polen funciona en la fertilicin in vitro (Kranz & Loerz, 1990). A pesar de que la microinyeccin es una de las tcnicas de transferencia gnica ms precisa, pues permite introducir el DNA en compartimentos intracelulares especficos, las dificultades de su aplicacin hacen que hoy en da, no se plantea la aplicacin de la microinyeccin como una tcnica de transformacin rutinaria, aunque si puede utilizarse para la introduccin de DNA en determinadas clulas.

5.4.- MACROINYECCIN
La trasformacin mediante la inyeccin de DNA en el interior de cavidades que contienen meristemos u rganos sexuales de la planta parece ser un paso obvio para la introduccin de DNA en la planta. Esta tcnica ofrece la oportunidad de un mayor y ms ntimo contacto entre el DNA y la lnea germinal. La metodologa de esta tcnica es sencilla: la solucin que contiene el plsmido de DNA ser inyectado en la cavidad que rodea la inflorescencia en desarrollo. El inconveniente es que ser necesario utilizar una gran cantidad de plsmido. La potencial ventaja de esta tcnica es por tanto su simplicidad, ya que puede ser utilizada en todas las plantas sin necesidad de la preparacin de cultivos tisulares. En los primeros estudios llevados a cabo, se utiliz DNA genmico de plantas que contena genes cuyo efecto poda ser valorado morfolgicamente. Algunos estudios afirmaron la transformacin, mientras otros dieron resultados negativos, como consecuencia de la difcil interpretacin de los resultados a causa de las contaminaciones que pueden ocurrir cuando se utilizan genes marcadores naturales de la planta. El inters en esta tcnica aument en 1987 cuando se consigui la transformacin del centeno mediante la inyeccin de DNA en el floral tiller (de la Pena et al., 1987). En este trabajo, se utiliz el gen de la neomicina fosfotransferasa como marcador y la evidencia de la transformacin se basaba en la seleccin con kinamicina y el anlisis por Southern, aunque la transmisin a la progenie no pudo ser confirmada. Se realizaron tambin experimentos con cebada, en la que se consigui llevar a cabo la transferencia del gen GUS (Rogers & Rogers, 1992), aunque no se encontraron evidencias moleculares claras de la transformacin. Aunque los distintos experimentos llevados a cabo sugieren que no se puede descartar esta tcnica como un mtodo de transformacin funcional, lo cierto es que actualmente no existen evidencias de que la macroinyeccin sea una tcnica reproducible para la transformacin de plantas.

5.5.- ELECTROPORACIN
El principio de esta tcnica de transformacin se basa en el conocimiento de que la aplicacin en la membrana celular de pulsos elctricos cortos y de alto voltaje hace que en esta aparezcan, de forma temporal, poros que van a permitir la entrada en el interior de la clula de macromolculas presentes en la solucin extracelular (Neumann & Rosenheck, 1972). Los poros van a crearse en el componente lipdico de la membrana, por lo que tras el tratamiento, la membrana volver a su estado normal. Este proceso permite a las clulas suspendidas en un tampn con plsmidos de DNA incorporar al interior celular el ADN tras la electroporacin, resultando en una trasformacin transitoria o estable. Inicialmente, la aplicacin de la electroporacin como mtodo de transformacin fue desarrollado en bacterias, levaduras y sistemas animales. Posteriormente se aplic a protoplastos de plantas como una alternativa a los procesos de captacin de DNA exgeno inducidos qumicamente. La electroporacin es un mtodo relativamente sencillo, aunque su aplicacin a protoplastos es relativamente difcil, como consecuencia de las limitaciones tcnicas que supone el cultivo y la regeneracin de protoplastos. No obstante, est tcnica comenz a utilizarse ya a principios de los ochenta, asumiendo de forma general que la pared celular no es permeable a macromolculas del tamao de los cidos nucleicos, por lo que se requera un tratamiento con pectinasas.

Electroporacin de polen y microsporas: El polen y las microsporas son clulas que en principio resultan adecuadas para la electoporacin, pues son clulas sencillas, totipotentes por definicin. Tras la electroporacin, existen dos mtodos para la obtencin de las plantas transgnicas: la induccin de la andrognesis in vitro y la utilizacin del polen transgnico para la fertilizacin normal de las plantas. En el caso de la induccin de la andrognesis in vitro, se a conseguido llevar a cabo la integracin transitoria del transgn, pero de momento no la integracin permanente del mismo. En el caso de la fertilizacin normal, aunque se han conseguido la integracin del transgn, no se ha conseguido evidencias de la transmisin de este a la progenie y la reproducibilidad del mtodo resulta complicada.

Electroporacin de tejidos: Estudios de expresin transitoria: Tras los estudios iniciales que demostraron la viabilidad de la transferencia gnica mediante electroporacin, Dereck et al (1990) aplicaron esta tcnica a tejidos obtenidos a partir de las hojas de arroz, maz, trigo y cebada. El estudio demostr que era posible la transferencia gnica a clulas intactas organizadas en tejidos. Estos estudios suscitaron el inters en el potencial de la electroporacin para la transformacin de especies de cultivo no susceptibles a la transformacin con Agrobacterium. Los siguientes estudios demostraron la transformacin transitoria de distintos tejidos

obtenidos de diversas especies de cultivo (Xu et al., 1990; Akella et al., 1993; Dillen et al., 1995). Estos estudios demostraron tambin la permeabilidad de muchas paredes celulares al DNA y otras macromolculas, en contra de lo asumido inicialmente, estableciendo la electroporacin como una tcnica adecuada para la transferencia gnica.

Estudios de transformacin estable: La obtencin de plantas transformadas de forma estable a partir de tejidos sometidos a electroporacin se consigui por primera vez en arroz (Li et al., 1992), a partir de semillas maduras pre-cultivadas. Poco despus se consigui en maz, aunque esta vez a partir de embriones inmaduros. En cada caso, se aplicaron cultivos estndar y procedimientos de seleccin mediante Kinamicina tras la trasferencia gnica. La integracin fue adems confirmada por anlisis moleculares. Posteriormente, se consiguieron plantas transgnicas de caa de azcar mediante la electroporacin de meristemos basales (Arencibia et al., 1992) as como plantas de maz transformadas a partir de suspensiones celulares (Laursen et al., 1994). Queda as demostrado que la electroporacin es una tcnica vlida para la transformacin estable de especies vegetales.

5.6.- ULTRASONIDOS
El tratamiento con ultrasonidos o sonicacin es un mtodo fsico para la transferencia de plsmidos de DNA a protoplastos y clulas intactas. Esta tcnica se basa en la aplicacin se ondas de ultrasonido que van a crear, en primer lugar, la formacin de burbujas, con la consecuente generacin de elevada presin y temperatura. En segundo lugar, los ultrasonidos van a provocar la generacin de corrientes alrededor de las burbujas. La velocidad de estas corrientes estarn relacionadas con el efecto que va a producir el tratamiento con ultrasonidos; de forma general, el tratamiento fuerte con ultrasonidos se asocia con la inhibicin de la sntesis de polisacridos y protenas, as como con la destruccin de algunas macromolculas. De hecho, antes de disponer de los enzimas de restriccin, esta tcnica era utilizada para el fraccionamiento de DNA (Hagen et al., 1970). Los primeros experimentos realizados en plantas y animales mostraron los importantes efectos fsicos que la sonicacin tiene en las clulas; el Vicia faba produce la rotura de la pared celular de las clulas de la raz (Miller et al., 1974) mientras que en clulas animales produce alteraciones en la permeabilidad de la membrana plasmtica (Chapman, 1974). En base a estas observaciones, la sonicacin comenz a emplearse para la transferencia gnica a protoplastos, clulas en suspensin y pedazos intactos de tejidos. El proceso utilizado para transferir DNA es el mismo independientemente del tipo de clulas de la planta con el que se vaya a trabajar. El plsmido de DNA es transferido al medio de sonicacin , en el cual se encuentran ya resuspendidas previamente las de inters. La mezcla es tratada con pulsos de ultrasonidos de una intensidad que

previamente ha sido seleccionada y de una duracin que va a depender fundamentalmente del tipo de clula. El factor ms importante que afecta a la entrada de DNA en la clula mediante sonicacin es la composicin del medio de sonicacin as como la cantidad de plsmido. Joersbo y Brunstedt (1990) encontraron que los experimentos llevados a cabo con elevadas cantidades de DNA (80-110 g/ml) y el medio de sonicacin suplementado con sacarosa producen una mayor expresin transitoria de los genes. Una de las principales ventajas que ofrece la sonicacin es la simplicidad y velocidad de la tcnica, as como su bajo coste. Adems, la sonicacin es un mtodo de transferencia gnica muy verstil, que permite introducir DNA exgeno desde protoplastos a clulas en suspensin y tejidos. No obstante, esta tcnica tiene tambin alguna limitacin, como es el hecho de que las ondas de ultasonidos pueden causar dao en las clulas a causa de la elevada temperatura que produce, lo que limitan el uso de esta tcnica.

5.7.- TRANSFORMACIN GNICA MEDIANTE LSER

La transformacin de las clulas vegetales mediante la irradiacin con lser se basa en llevar a travs del objetivo pulsos de luz de alta energa a las regiones del tejido diana de menos de 1 m de dimetro. Esta tcnica resulta muy til para manipular componentes celulares y orgnulos, porque el rayo puede ser dirigido directamente a esta rea seleccionada. El hecho de que con el lser, agujeros de dimensiones definidas pueden ser creados en la pared y membrana celular, permitiendo la entrada pasiva de DNA a travs de los al interior de la clula, hace de esta herramienta una posible forma de vencer la barrera para introducir DNA en la clula. Este proceso puede ser ayudado por la creacin de un gradiente osmtico entre la clula y el tampn hipotnico que favorezca la entrada de DNA a favor de gradiente. El experimento tpico comienza introduciendo agregados de cultivos en suspensin o explantos de tejidos en un medio hipertnico durante 1-3 horas. Este medio va a inducir que las clulas situadas en la zona exterior de los agregados se plasmolicen hasta el 80-90% de su volumen total. Despus, los cultivos son filtrados y trasladados a una cmara de cultivo. El DNA, disuelto en medio lquido es aadido a las clulas, las cuales son inmediatamente irradiadas con el lser. Las clulas pre-plasmolizadas, cuando son introducidas en el medio hipotnico que contiene el DNA, introducen rpidamente el DNA a travs de las perforaciones hechos por el lser. Este hecho s ve maximizado porque las clulas plasmolizadas captan mayores cantidades de lquido que las clulas no tratadas previamente. El dao causado a las clulas por el tratamiento con lser es mnimo debido al hecho de que las perforaciones hechas con el lser son muy pequeas y pueden ser rpidamente cerradas tras el tratamiento. La forma en la que el tratamiento con lser es llevado a cabo es enfocando el rayo en la superficie de las clulas elegidas y posteriormente desplazndolo en una lnea fina para perforar clulas sucesivas.

Una de las principales ventajas de la transformacin por lser es la elevada precisin del mtodo. Como el lser es dirigido con un microscopio se pueden ver y elegir exactamente las clulas que van a ser tratadas. As, esta tcnica resulta aplicable para la transformacin de clulas de los meristemos, que son competentes para la regeneracin. La microinyeccin que tiene en estos aspectos caractersticas similares, aunque esta ha de ser llevada a cabo en las clulas de forma individual. La transformacin con lser es una tcnica que puede ser llevada a cabo en un nmero de clulas mucho mayor, aunque la subsiguiente trasferencia de ADN est mucho menos controlada. No obstante, esta tcnica tiene tambin una importante limitacin, el gran coste del equipo necesario para llevarla a cabo y la gran habilidad necesaria para manejar el lser.

5.8.- TRANSFORMACIN MEDIADA POR POLEN

Dado que la funcin del polen es transmitir DNA, por lo que siempre ha existido un gran inters en la transformacin mediada por gametos. No obstante, hasta la llegada de los marcadores heterogneos y de las tcnicas moleculares de anlisis, la obtencin de evidencias de la transformacin resultaban difciles de interpretar, dado que los marcadores clsicos como un resultado de la contaminacin del polen en vez de cmo resultado de la transformacin. En 1986, se consigui obtener la transformacin de maz por polinizacin con una mezcla de polen y de DNA (Otha, 1986). Esto increment notablemente el inters en este tipo de tcnicas. En este experimento, el plsmido de DNA con el gen nptII fue aplicado a las flores tras la polinizacin. La transformacin fue confirmada por existencia a antibiticos o Southen blot. El objetivo del mtodo es que el DNA sea transportado durante la fecundacin al interior de los vulos, pues en este estado el DNA tiene ms posibilidades de ser integrado. Esta publicacin gener un gran inters, aunque los experimentos que despus se llevaron a cabo en arroz y otras plantas obtuvieron resultados generalmente negativos.

5.9.- TRANSFERENCIA GNICA POR INBIBICIN

La introduccin de DNA durante la imbibicin de tejidos de plantas deshidratados es un mtodo que ha sido estudiado desde los aos sesenta. Durante la deshidratacin ocurren cambios fsicos y qumicos como la expansin rpida de la clula, la rotura de la pared, los cambios estructurales en la membrana, etc., que sugieren que en estas condiciones el DNA puede ser captado. En 1989, Toepfer et al. consiguieron la incorporacin y expresin transitoria del plsmido de DNA con el gen nptII, mediante la imbibicin de cereales en una solucin con DNA. Seis aos ms tarde, en 1995, se consigui la transformacin estable de arroz expresando el gen GUS mediante la imbibicin de embriones.

La gran ventaja de esta tcnica es su simplicidad y que no requiera un equipamiento especializado. Sin embargo, esta tcnica solo puede ser aplicada a determinados rganos.

6.- GENES MARCADORES:

Los genes marcadores desempean un papel crucial en los procedimientos de transformacin, pues estos pueden ser utilizados para determinar si el DNA introducido en las clulas de la planta mediante distintos tratamientos se ha integrado en el genoma de la misma de manera efectiva. Los genes marcadores van a ser utilizados generalmente para la transformacin estable. Estos genes van a permitir a clulas vivas, tejidos o plantas completas crecer bajo condiciones que no previenen el crecimiento de los tejidos no transformados o confieren un fenotipo que permite diferenciar inequvocamente los tejidos transformados de los que no lo estn.

Visualizacin de la expresin del gen: Los genes marcadores que pueden ser detectados en los tejidos de la planta directamente constituyen una herramienta muy importante. En los estudios de expresin transitoria, algunos marcadores pueden indicar el nmero y la localizacin de las clulas transfectadas, ambos parmetros resultan importantes para llevar a cabo la transformacin estable. En los transformantes estables, es posible determinar si un gen introducido se expresa en todas las clulas de un tejido determinado o en elevados niveles en algunas clulas o tipos celulares concretos. Esta informacin frecuentemente proporciona una mayor percepcin del papel funcional de un gen durante el desarrollo vegetal. El sistema de gen marcador de la -D-glucuronidasa (GUS) se ha probado que resulta muy verstil en numerosas investigaciones (Jefferson, 1989). Una limitacin tpica de este sistema, sin embargo, es que el procedimiento histoqumico para la deteccin de la expresin de GUS requiere generalmente sacrificar el tejido. Por ello tambin se han desarrollado marcadores usados para visualizar la expresin gnica en tejidos vegetales vivas. Alguno de estos ya se han constituido como marcadores muy tiles para la transformacin de la planta entera (Meyer et al., 1987; Herman & Marks, 1989) o para determinar el destino de las clulas transformadas en tejidos quimricos.

Criterios para la eleccin de marcadores de seleccin: Los marcadores de seleccin confieren un fenotipo dominante en las clulas transformadas porque invariablemente causan la adicin de un nuevo carcter no asociado normalmente con las clulas sin transformar. Los caracteres que pueden ser usados para seleccionar clulas transformadas de clulas no transformadas se dividen en dos clases: aquellos que confieren o viabilidad o letalidad celular en presencia de un agente selectivo; y aquellos que confieren a las clulas transformadas algunas caracterstica fsica distinguible. Las frecuencias de transformacin de clulas vegetales son generalmente bajas, as que muchos sistemas de transformacin usan marcadores que aseguren la supervivencia de las clulas transformadas en presencia de un agente selectivo. Cuando se desarrolla un procedimiento de seleccin con un gen marcador deben considerarse tambin la naturaleza del tejido diana y el sistema de introduccin del DNA. Por ejemplo, los tejidos verdes pueden ser ms sensibles a agentes que afecten a procesos localizados en plastos que las clulas de callo. Adems, la exposicin de las

clulas del callo a elevados niveles de estos agentes durante el proceso de seleccin pueden afectar a la regeneracin de las plantas verdes o al desarrollo plastdico. Con otros agentes selectivos, la supervivencia de clulas transformadas bajo condiciones selectivas puede verse afectada por la liberacin de compuestos txicos (por ejemplo compuestos fenlicos) por las clulas no transformadas circundantes. Los marcadores de seleccin que requieren un agente selectivo pueden no se muy tiles en los procedimientos de seleccin como el desarrollo de quimeras a elevada frecuencia. Esto es debido a que los sectores transformados de las plantas quimricas frecuentemente dependen delas clulas no transformadas para el aporte de nutrientes. Por ello se han usado marcadores visibles para seleccionas plantas quimeras generadas por biolstica en meristemos apicales.

6.1.- MARCADORES QUE CONFIEREN VIABILIDAD O LETALIDAD BAJO CONDICIONES DE SELECCIN:

6.1.1- Marcadores de resistencia a herbicidas o antibiticos. El repertorio de marcadores de seleccin que resultan en la resistencia a antibiticos, herbicidas u otras fitotoxinas es actualmente muy extenso. La resistencia a estos agentes es conferida por uno d estos tres mecanismos: detoxificacin por modificacin enzimtica o secuestro; reduccin de la afinidad por el agente de seleccin y sobreexpresin de una molcula diana de tipo salvaje. En general, los marcadores que operan por los dos primeros mecanismos, son ms efectivos y, en consecuencia, su uso est ms extendido. 6.1.2.- Marcadores auxotrficos. Las mutaciones auxotrficas que requieren suplementos nutricionales son raras en plantas. En consecuencia, son escasas las investigaciones en la que se documenta la complementacin del mutante auxotrfico mediante la transformacin vegetal. Por ejemplo, la enzima treonina dehidratasa es deficiente en mutantes de Nicotiana plumbaginifolia la cual requiere isoleucina. El gen de levadura que codifica esta enzima ILV1, fue introducido en secuencias reguladoras de la planta e introducido en las clulas mutantes mediante Agrobacterium (Colau et al., 1987). Otro ejemplo es el caso en el que el gen de la nitrato reductasa de tabaco es utilizado para complementar mutantes de nicotina tabacum deficientes para esta enzima (Vaucheret et al., 1990). Las plantas transformadas van a poder crecer en presencia de nitrato mientras que los mutantes originales no. 6.1.3.- Marcadores letales. Los marcadores letales para las clulas pueden ser tener diferentes aplicaciones. Por ejemplo, estos marcadores pueden ser usados para seleccionar mutaciones que suprimen la expresin de un gen. Adems, los agentes que seleccionan para la prdida del marcador pueden tambin ser tiles para eventos de seleccin positiva / negativa (Capecchi, 1989)

Algunos marcadores codifican protenas extremadamente txicas para la planta, las cuales bajo el control de un promotor determinado slo se expresarn en ciertos tejidos o en respuesta a estmulos externos.

6.2.- MARCADORES VISIBLES:

6.2.1.- Marcadores histolgicos. Los marcadores histolgicos confieren fenotipos distinguibles en presencia de un sustrato que es suplementado de manera exgena. Los agentes histolgicos clsicos incluyen sustratos cromognicos que reaccionan con constituyentes celulares (Gahan, 1984; Vaughn, 1987). Los anticuerpos tambin pueden ser usados para detectar protenas en un procedimiento conocido como inmunohistoqumica (Harlow y Lane, 1988; Harris y Outlaw, 1990). De forma similar, la expresin gnica en cuanto a niveles de mRNA puede ser visualizada por hibridacin in situ (Raikhel et al., 1989).

6.2.2.- Marcadores morfolgicos. El uso de marcadores morfolgicos en la transferencia gnica a plantas se ve incrementado a medida que el control de los genes relacionados con caracteres morfolgicos se va haciendo posible. Las plantas transgnicas que sobreexpresan peroxidasa extracelular son susceptibles de marchitarse, y la sobreexpresin de fitocromos tiene numerosos efectos pleiotrpicos. La morfologa de las plantas que selectivamente expresan un producto txico de un gen en un tejido especfico tambin puede ser detectada. 6.2.3.- Marcadores de pigmentacin. Las plantas son organismos vistosamente coloreados. Las mutaciones que afectan a la sntesis de pigmentos son raramente perjudiciales y se han usado de manera destacable como marcadores en plantas durante decenas de aos. Muchos de los pigmentos ms universales (y coloridos) nicos en plantas son las antocianinas o los compuestos similares relacionados con flavonoides. Hace unos aos se clonaron un cierto nmero de genes asociados a la produccin de antocianinas (Mol et al., 1988; Ludwig y Wessler, 1990). Algunos de ellos son genes estructurales que codifican enzimas involucrados en la biosntesis de las antocianinas, mientras que otras codifican factores en trans que regulan la expresin de los genes estructurales a nivel trasncripcional. Se han llevado a cabo tres aproximaciones generales para la utilizacin de los genes clonados de antocianinas como marcadores dominantes en los tejidos de plantas transformadas. - Supresin de los alelos salvajes endgenos mediante el uso RNA antisentido, la adicin de copias extra del gen o protenas dominantes inhibidoras negativas. - Complementacin de alelos mutantes. - Transactivacin de alelos silentes,