P a g e | 1

Prof. Jos Antonio Pliego Garza Sabtico 2009-2010.

ELEMENTOS DE CINTICA ENZIMTICA

Un Enfoque Totalmente Prctico
Derivacin de las Ecuaciones Cinticas para
Describir el Efecto de las Concentraciones de
Sustrato e Inhibidores

Prof. Jos Antonio Pliego Garza



Antecedentes
A principios del siglo 20, varios investigadores
hbian demostrado que a concentraciones fijas
de sustrato S, la velocidad v de las reacciones
catalizadas por enzimas, era directamente
proporcional a la concentracin de enzima [E].
Esto es, duplicando la concentracin de enzima
2[E], duplicamos la velocidad de la reaccin 2v.
vo[E]
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Por el otro lado, manteniendo constante la
concentracin de enzima [E], se encontr que la
dependencia que tiene la velocidad v de la
concentracin de sustrato [S], produce una
hiprbola rectangular.
x b
ax
y
+
=

donde a=y cuando x tiende a y b=x cuando y=a/2

Basndose en las sugerencias de Fischer y
Henri de que las reacciones catalizadas por
enzimas, proceden en dos etapas diferentes, fue
que Leonor Michaelis y Maud Menten,
derivaron su famosa ecuacin de velocidad,
definiendo las constantes geomtricas a (V
max
)
y b (K
M
)de una hiprbola rectangular.



0
10
20
30
40
50
60
0 2 4 6 8
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La constante de velocidad k
-2
del regreso de productos a complejo ES, es
eliminada tomando las velocidades iniciales de la reaccin v
o
.
Para analizar ms fcilmente la reaccin podemos dividirla en 2 partes, asumiendo
la siguiente mentira piadosa, k
-1
>>>k
2
que significa que es mucho mas fcil
que el complejo
ES
se disocie en enzima libre
E
y sustrato
S,
que en
E
y
producto
P
, por lo que as tendremos una primera parte prcticamente en
equilibrio, que nos permitir describir [ES] en trminos de cosas que podamos
medir o controlar.



Primero veamos la reaccin como la disociacin del complejo ES en S y E



] [
] [
] [
] [
] ][ [
S
ES K
E
ES
S E
K
S
S
=
=

As tendremos K
S
que es la constante de sustrato, para luego resolver para la
concentracin de enzima libre [E]

Luego planteamos la ecuacin de conservacin para la enzima [E]
0


] [ ] [ ] [
0
E ES E + + =

Sustituyendo la enzima libre [E]

] [
] [
] [ ] [
0
S
ES K
ES E
S
+ =

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Tomamos a [ES] como factor comn

|
|
.
|

\
|
+ =
] [
1 ] [ ] [
0
S
K
ES E
S


y despejamos.

1
] [
] [
] [
0
+
=
S
K
E
ES
S


] [
] [ ] [
] [
0
S K
S E
ES
S
+
=

De esta manera tendremos [ES] en trminos de cosas que podemos medir.



La segunda parte, ser una reaccin de velocidad de primer grado.



] [
] [ ] [
] [
0
2 0
2 0
S K
S E
k v
ES k v
S
+
=
=



Veamos lo que sucede a muy bajas concentraciones de sustrato, en donde la
suma de [S] a la K
M
, se hace despreciable

1 0 2
0
] [
] [
S
K
E k
v
S
=


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quedando una ecuacin lineal o de primer orden para [S]
1


Por el contrario, a muy altas concentraciones de sustrato la K
S
es la que se hace
despreciable

max
0
0 2 0
] [ ] [ V S E k v = =




quedando una ecuacin de orden cero para [S]
0
, definimos entonces V
max
=k
2
[E]
o



0
2
4
6
8
10
0.0 1.0 2.0 3.0
V
o
[S]
V
o
a muy bajas [S]
V
primer orden
P a g e | 6
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la ecuacin resultante sera la de una hiprbola rectangular.

] [
] [
max
0
S K
S V
v
S
+
=




Para corregir nuestra mentira piadosa, analizaremos empricamente el significado
de la K
S
cuando la v
o
es exactamente V
max
/2.

M S
S
S
S
K S K
S S K
V
S V
S K
S K
S V V
= =
=
= +
+
=
] [
] [ ] [ 2
] [ 2
] [
] [
] [
2
max
max
max max


de esta forma, llamaremos Constante de Michaelis K
M
a la concentracin de
sustrato [S] necesaria para alcanzar de la V
max
de la reaccin.

As tendremos la Ecuacin de Michaelis y Menten

] [
] [
max
S K
S V
v
M
o
+
=


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Sin mentiras piadosas, tenemos la derivacin de


Briggs-Haldane
Steady-State Derivation



] [ ] [ ] ][ [
] [
2 1 1
ES k ES k S E k
t
ES
=
c
c

en Steady State
0
] [
=
c
c
t
ES



luego


M
K
k
k k
ES
S E
ES k k S E k
ES k ES k S E k
=
+
=
+ =
+ =

1
2 1
2 1 1
2 1 1
] [
] ][ [
] )[ ( ] ][ [
] [ ] [ ] ][ [


Steady State = Regimen de Flujos Permanentes.



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Formas Lineales de la Ecuacin de Michaelis y Menten

Lineweaver & Burk
(Dobles Recprocas)

Primero le damos la vuelta a la Ec. de Michaelis & Menten

max max max max max
1
] [ ] [
] [
] [ ] [
] [ 1
V S V
K
S V
S
S V
K
S V
S K
v
M M M
o
+ = + =
+
=

luego buscamos
b mx y + =


max max
1
] [
1 1
V S V
K
v
M
o
+ =




Si
m
b
a

=

Entonces
M
M
K
V
K
V
a
1
1
max
max

=

=


-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
-1 0 1 2
1
/
V
o
1/[S]
Lineweaver & Burk
1/Vo
Regresin L&B
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Hanes & Wolf

Para obtener esta forma lineal, solo hay que multiplicar la Ec. de Lineweaver &
Burk por la concentracin de sustrato [S].

|
|
.
|

\
|
+ =
max max
1
] [
1 1
] [
V S V
K
v
S
M
o


max max max max
] [ ] [
] [
] [ ] [
V
S
V
K
V
S
S V
S K
v
S
M M
o
+ = + =

Acomodando para la recta
b mx y + =


max max
] [
1 ] [
V
K
S
V v
S
M
o
+ =




Aqu tendremos que
M
M
K
V
V
K
a =

=
max
max
1



-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
-5.00 0.00 5.00 10.00
[
S
]
/
V
o
[S]
Hanes & Woolf
[S]/Vo
Regresin H&W
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Eadie & Hofstee

Aqu partiremos de la Ec. de Michaelis

] [
] [
max
0
S K
S V
v
M
+
=


] [ ] [
] [ ]) [ (
max
max
S V S v K v
S V S K v
o M o
M o
= +
= +


luego dividimos todo sobre [S]

max
max
] [
] [
] [
] [
] [
] [
V v
S
K v
S
S V
S
S v
S
K v
o
M o
o M o
= +
= +


acomodando trminos para la recta
b mx y + =


max
] [
V
S
v
K v
o
M o
+ =



M M
K
V
K
V
a
max max
=

=


0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
-4 1 6 11
V
o
Vo/[S]
Eadie & Hofstee
Vo/[S]
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Mtodo Lineal directo de Eisenthal y Cornish-Bowden

Este mtodo consiste en despejar de la Ec. de Eadie & Hofstee las variables como
constantes y las constantes como variables.

max
] [
V
S
v
K v
o
M o
+ =

o M
o
v K
S
v
V + =
] [
max


donde

] [
] [
S
S
v
v
a
o
o
=

=


quedando una recta en su forma simtrica

1
] [
0
max
=
S
K
v
V
M


por lo que al graficar cada punto ([S],v
o
) como la abscisa (-K
M
) y la ordenada (V
max
)
al origen de la recta que corta los ejes
max
V y K
m
, tendremos una familia de rectas
que deberan cruzarse en la solucin comn a todas ellas,
V
max
y K
M
.
Como esto no sucede por la variacin experimental, tendremos una familia de
cruces de la rectas, por lo que se tendr que calcular la mediana de las todas
posibles V
max
y K
M
.
Se utiliza la mediana, para no sesgar los valores debido a puntos extremos.

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Por lo general cuando tenemos ms de 6 puntos experimentales el mtodo grafico directo,
se convierte en una pesadilla, por lo que ser mejor calcular matemticamente las
soluciones para cada par de rectas.
Propongo lo siguiente:
Calcular el nmero de combinaciones (soluciones) posibles, segn el nmero de puntos.
Luego obtener las soluciones (Vmax y KM) para todos los puntos de cruce entre las rectas.
Para por ltimo, obtener la mediana de las mismas.




] [
] [
] [
&
] [
&
max
max
S
S
v
v
a
v K
S
v
V
Bowden Cornish Eisenthal
V
S
v
K v
Hofstee Eadie
o
o
o M
o
o
M o
=

=
+ =

+ =
( )
n
n
n n
n
n n n
n
n
n
n
n n
M
v
S
v S
v
v v v
V
S
v
S
v
v v
K
N N
nes Combinacio
Bowden Cornish Eisenthal Pliego
+

+
+
+
+
+
+
1
1
2
1
max
1
1
1
2
] [
] [
] [ ] [
2
& @
E Ei is se en nt th ha al l& &C Co or rn ni is sh h- -B Bo ow wd de en n
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I
IN NH HI IB BI IC CI I N N R
RE EV VE ER RS SI IB BL LE E





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Para derivar la ecuacin general de ste modelo, consideraremos primero los
casos ms sencillos, que son los de los inhibidores Competitivos y
A(In)competitivos ya que en estos, solamente se unen a una de las formas
de la Enzima. Esto es a la Enzima libre o al complejo Enzima-Sustrato,
pero no a las dos.








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|
|
.
|

\
|
+
+
|
|
.
|

\
|
+
|
|
.
|

\
|
+
=
|
|
.
|

\
|
+ +
|
|
.
|

\
|
+
=
I
o
I
i
M o
I i
M
o
K
I
V
S
v
K
I
K
I
K v
Hofstee Eadie
K
I
S
K
I
K
S V
v
Menten Michaelis
] [
1
1
] [
] [
1
] [
1
&
] [
1 ] [
] [
1
] [
&
max
max


Si juntamos ahora ambos casos, tendremos la Ecuacion General









Forma lineal de la Ecuacion General








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Resumiendo

Inhibicin Competitiva, se observa cuando I solo se une a la enzima libre E.

] [
] [
1
] [
max
S
K
I
K
S V
v
i
M
o
+
|
|
.
|

\
|
+
=

En este tipo de inhibicin la K
M
aumenta, mientras que la
max
V no sufre cambio
alguno.

Inhibicin Acompetitiva o Incompetitiva, se observa cuando I solo se une al
complejo enzima-sustrato ES.

|
|
.
|

\
|
+ +
=
I
M
o
K
I
S K
S V
v
] [
1 ] [
] [
max


En este tipo de inhibicin la K
M
y la V
max
disminuyen en la misma proporcin.

Inhibicin No Competitiva, se observa cuando I se une exactamente de la
misma manera a ambas formas de la enzima.

( )
|
|
.
|

\
|
+ +
=
iI
M
o
K
I
S K
S V
v
] [
1 ] [
] [
max


En este tipo de inhibicin la V
max
disminuye, mientras que la K
M
no sufre cambio
alguno.

Inhibicin Mixta tipo Competitiva, se observa cuando I se une a ambas formas
de la enzima, pero preferentemente a la enzima libre E.

|
|
.
|

\
|
+ +
|
|
.
|

\
|
+
=
I i
M
o
K
I
S
K
I
K
S V
v
] [
1 ] [
] [
1
] [
max


K
i
< K
I


En este tipo de inhibicin la K
M
aumenta mientras que la V
max
disminuye.


P a g e | 18
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Inhibicin Mixta tipo Acompetitiva, se observa cuando I se une a ambas formas
de la enzima, pero preferentemente al complejo enzima-sustrato ES.

|
|
.
|

\
|
+ +
|
|
.
|

\
|
+
=
I i
M
o
K
I
S
K
I
K
S V
v
] [
1 ] [
] [
1
] [
max


K
i
> K
I


En este tipo de inhibicin la K
M
y la Vmax disminuyen pero no lo hacen en la
misma proporcin.

I
I
n
n
h
h
i
i
b
b
i
i
d
d
o
o
r
r
e
e
s
s
R
R
e
e
v
v
e
e
r
r
s
s
i
i
b
b
l
l
e
e
s
s

Inhibicin V
max
K
M
V
max
/K
M
K
i
K
I

Competitiva
= aumenta disminuye

-
A(In)competitiva
disminuye disminuye = -

No competitiva
disminuye = disminuye
=
Mixta Competitiva
disminuye aumenta disminuye
<
Mixta Acompetitiva
disminuye disminuye disminuye
>


0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
100.00
0 50 100 150 200 250
V
o
[S]
Inhibicin Reversible
Vo
Vcomp
Vacomp
Vnocomp
Vmxcomp
Vmxacomp
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La mejor manera de distinguir el tipo de Inhibicin, es utilizando la Ec. de
Eadie & Hofstee.

Inhibicin Competitiva



max
] [
] [
1 V
S
v
K
I
K v
o
i
M o
+
|
|
.
|

\
|
+ =






y = -37.5x + 100
y = -15x + 100
0
20
40
60
80
100
120
140
-1 0 1 2 3 4 5 6 7
V
o
Vo/[S]
Inhibicin Competitiva
Vcomp
Control
Competitiva
Control
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Inhibicin A(In)competitiva



|
|
.
|

\
|
+
+
|
|
.
|

\
|
+

=
I
o
I
M
o
K
I
V
S
v
K
I
K
v
] [
1
] [
] [
1
max






y = -6x + 40
y = -15x + 100
0
20
40
60
80
100
120
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
V
o
Vo/[S]
Inhibicin A(In)competitiva
Vacomp
Control
Acompetitiva
Control
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Inhibicin No Competitiva



|
|
.
|

\
|
+
+ =
i
o
M o
K
I
V
S
v
K v
] [
1
] [
max






y = -15x + 40
y = -15x + 100
0
20
40
60
80
100
120
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
V
o
Vo/[S]
Inhibicin No Competitiva
Vnocomp/[S]
Control
No
Competitiva
Control
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Inhibicin Mixta



|
|
.
|

\
|
+
+
|
|
.
|

\
|
+
|
|
.
|

\
|
+
=
I
o
I
i
M o
K
I
V
S
v
K
I
K
I
K v
] [
1
] [
] [
1
] [
1
max




Mixta Competitiva

K
i
<K
I



y = -24x + 40
y = -15x + 100
0
20
40
60
80
100
120
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
V
o
Vo/[S]
Inhibicin Mixta Competitiva
Vmxcomp/[S]
Control
Mixta Competitiva
Control
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Mixta Acompetitiva


K
i
>K
I






y = -9.375x + 25
y = -15x + 100
0
20
40
60
80
100
120
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
V
o
Vo/[S]
Inhibicin Mixta Acompetitiva
Vmxacomp/[S]
Control
Mixta Acompetitiva
Mixta Acompetitiva
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Cinetica Sigmoide o Sigmoidea

En este tipo de cinetica, tenemos que el orden inicial de la reaccin no es 1, si no
que es 1. Lo anterior implica que a muy bajas concentraciones de Sustrato [S], la
cinetica no es lineal

1 2
] [
] [
S
K
E k
v
s
o
o
=


si no potencial (de potencia)

h
s
o
o
S
K
E k
v ] [
] [
2
=

Para simplificar el modelo, podemos considerar que el orden es la molecularidad
del sustrato h.



Utilizando nuevamente la mentira piadosa k
-1
>>>k
2,
tendremos que


] [
] ][ [
EhS
S E
K
h
s
=


Se utiliza h para indicar el orden de la reaccin debido a que la ecuacin
logartmica resultante, se conoce como la ecuacin de Hill.

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Si v
o
[ES] y V
max
[E]
o
, entonces V
max
- v
o
[E]
o
-[ES]=[E], por lo
que tendremos

h
o
o
o
h
o
s
S
v
v V
v
S v V
K ] [
] [
max max

=

=

h
s
h
s
o
o
h
s
S K
S
K
v
v V
S
K

= =

= ] [
] [
1
] [
max


aplicando logaritmos tendremos una recta

s
o
o
K S h
v
v V
log ] log[ log
max
+ =
|
|
.
|

\
|


que es la Ecuacin de Hill.

P a g e | 26
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British physiologist and biophysicistin full Archibald Vivian Hill
born Sept. 26, 1886, Bristol, Gloucestershire, Eng. died June 3, 1977, Cambridge

British physiologist and biophysicist who received (with Otto Meyerhof) the 1922 Nobel
Prize for Physiology or Medicine for discoveries concerning the production of heat in
muscles. His research helped establish the origin of muscular force in the breakdown of
carbohydrates with formation of lactic acid in the absence of oxygen.
At the University of Cambridge (191114) Hill began his investigations of the
physiological thermodynamics of muscle and nerve tissue. Working with a straplike thigh
muscle in the frog, he was able to demonstrate that oxygen is needed only for the recovery,
Grfica de Hill
y = -2.3x + 1.699
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
-0.40 -0.20 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40
log((Vm-v)/v)
log[S]
log((Vm-v)/v)
Regresin de Hill
P a g e | 27
Prof. Jos Antonio Pliego Garza Sabtico 2009-2010.
not the contractile, phase of muscular activity, laying the foundation for the discovery of
the series of biochemical reactions carried out in muscle cells that results in contraction.
A professor of physiology at Manchester University (192023) and at University
College, London (192325), he served as Foulerton research professor of the Royal
Society from 1926 until his retirement in 1951. His written works include Muscular
Activity (1926), Muscular Movement in Man (1927), and Living Machinery (1927). Hill
also derived a mathematical expressionknown as the Hill equationfor the uptake of
oxygen by hemoglobin. In the 1930s he began to speak out on social issues and became
active in the rescue of refugees from Nazi Germany. Between 1940 and 1945 Hill served as
a representative to the British Parliament for Cambridge University and later helped the
government of India in its initial pursuit of scientific endeavours. He returned to
scientific research following World War II and continued to publish valuable papers on
muscle physiology that are still cited by researchers today.

La ecuacin de Hill, tiene el gran inconveniente de que el valor de
V
max
, es estimado segn el feeling (inspiracin) del que la utiliza
para obtener la K
M
y el coeficiente de Hill h (orden de la
reaccin). Esto implica un gran error en los valores obtenidos, por
lo que sugiero el siguiente anlisis:
Graficando como variable independiente la concentracin de
sustrato elevada al orden de la reaccin correcto [S]
h
y como
variable dependiente la velocidad inicial v
o
, tendremos como
resultado una hiprbola rectangular, por lo que podremos utilizar
la forma lineal de la ecuacin de Eadie y Hofstee para obtener la
V
max
y la K
m
.

max
] [
V
S
v
K v
h
o
M o
+ =



Para obtener el coeficiente de Hill h correcto podremos utilizar
iterativamente el anlisis estadstico de Mnimos Cuadrados y la

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estimacin de la correlacin a travs del Coeficiente de
Determinacin r
2
para cada recta generada en el intervalo de
valores de h utilizado. De dicha manera, con el valor de h que de la
mejor correlacin, obtendremos los mejores valores de Km y Vmax.
Lo anterior, se puede llevar a cabo programando una computadora
o calculadora programable como en Excel o cualquier hoja de
clculo.




y = -50x + 100
R = 1
0
20
40
60
80
100
120
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
v
o
v
o
/[S]
h
v
Lineal (v)
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Efecto del pH

El efecto del pH en la cintica de las enzimas es sumamente complejo debido a
que el pH afecta el estado de ionizacin de:
a. la enzima, afectando:
1) la concentracin de las formas inicas activas de la enzima [E
0
]
2) la formacin del complejo ES (K
M
)
3) la velocidad de descomposicin del complejo ES hacia productos (k
2
)
b. los sustratos S y cofactores (grupos prostticos y coenzimas), de los cuales
solo algunas formas inicas son reconocidas por la enzima
De cualquier manera si podemos calcular la concentracin de las especies
inicas de una molcula poliprotonada a cualquier pH, podremos predecir con
cierta exactitud la actividad enzimtica en funcin del pH.


El nmero de especies inicas que puede tener una
molcula poliprotonada, ser igual al nmero de pKas
diferentes + 1.

Por ejemplo, si una molcula poliprotonada tiene 3 pKas
diferentes, tendr 4 especies inicas diferentes.

En base a la ecuacin de Henderson y Hasselbalch, se han
desarrollado las siguientes frmulas:

1.- Para calcular la concentracin de la especie inica totalmente protonada
[I]
1
tenemos la primera frmula.

) log( 1
] [
] [
1
0
1
pKa pH anti
ada Poliproton
I
+
=

o lo que es lo mismo

1
10 1
] [
] [
0
1
pKa pH
ada Poliproton
I

+
=


donde [Poliprot]
o
, es la concentracin total de la molcula poliprotonada.


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2.- Para calcular la concentracin de la segunda especie inica [I]
2
y de todas
las que sigan, hasta llegar a la penltima [I]
m-1
, necesitamos definir lo
siguiente:
m = nmero total de especies inicas = nmero de pKas diferentes + 1
n = nmero ordinal para los pKas, ordenados desde el mas cido (menos
bsico) pKa
1
, hasta el menos cido (mas bsico) pKa
m-1
.

As que para calcular [I]
n
, para n desde n=2 hasta n=m-1.
tendremos

|
|
.
|

\
|
+

+
=

) log( 1
1
) log( 1
1
] [ ] [
1
0
n n
n
pKa pH anti pKa pH anti
ada Poliproton I

o lo que es lo mismo

|
.
|

\
|
+

+
=


1
10 1
1
10 1
1
] [ ] [
0
n n
pKa pH pKa pH
n
ada Poliproton I


3.- Por ltimo, para calcular la ltima de las especies inicas [I]
m,
usaremos
cualquiera de las siguientes frmulas.

|
|
.
|

\
|
+
=

) log( 1
1
1 ] [ ] [
1
0
m
m
pKa pH anti
ada Poliproton I

o lo que es lo mismo

|
.
|

\
|
+
=

1
10 1
1
1 ] [ ] [
0
m
pKa pH
m
ada Poliproton I

o lo que es lo mismo

) log( 1
] [
] [
1
0
pH pKa anti
ada Poliproton
I
m
m
+
=

o lo que es lo mismo

pH pKa
m
m
ada Poliproton
I

+
=
1
10 1
] [
] [
0


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-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
[Ion] %
pH
Especies Inicas
[Ion]1 %
[Ion]2 %
[Ion]3 %
[Ion]4 %
[Ion]5 %
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
[Ion] %
pH
Especies Inicas