Departamento Acadmico de Qumica Curso Tcnico Integrado: Disciplina: Microbiologia Industrial Relatrio de Aulas Prticas Grupo: Lara Machado

Rodrigues Letcia Thas de Oliveira Alves Mariana Loures Morais Ndia Mayra Duarte Dias Subturma: T2 Professora: Leila Saddi Ortega

1. Ttulo: Ao de Agentes Fsicos e Qumicos Sobre o Crescimento Bacteriano 2. Introduo: O controle de crescimento bacteriano algo indispensvel para o bem estar e a sobrevivncia humana, pois evita transmisso de doenas, decomposio de alimentos, contaminao de gua, ambiente, cosmticos, preparaes farmacuticas e outros.1 Esse controle pode ser feito de vrias maneiras diferentes, mas tem a sempre a finalidade de inibir a reproduo do microrganismo, determinando um bloqueio a uma funo microbiolgica, ou destrulo, havendo perda irreversvel da capacidade de reproduo. interessante saber a diferena entre os conceitos de esterilizao, desinfeco e antissepsia, pois so muito utilizados nesta rea. A esterilizao consiste na inativao total da capacidade reprodutiva de um organismo, a desinfeco a inativao ou reduo de microrganismos numa superfcie de material inanimado e a antissepsia a destruio de patgenos vegetativos em tecido vivo. Os mtodos de controle de crescimento microbiolgico so divididos em dois grandes grupos: agentes qumicos e agentes fsicos. O mtodo a ser utilizado deve ser escolhido de acordo com a natureza do agente e do material que contm o microrganismo para que um resultado de qualidade seja assegurado. Alguns fatores que influenciam o tempo de ao dos agentes fsicos e qumicos so nmero e natureza do microrganismo, pois quanto maior a populao maior ser o tempo gasto para mat-la e a temperatura, j que quanto maior a temperatura mais rpida ser a morte da populao.

3. Objetivos: Verificar a ao de mtodos fsicos sobre diferentes micro-organismos. Avaliar a eficcia dos agentes qumicos atravs da reduo ou eliminao de microorganismos em superfcies sanitizadas/desinfetadas.

Atividade 1- Controle da Populao Microbiana por Agentes Fsicos 4. Materiais Necessrios: 4.1. Reagentes: - Caldo lactosado simples (CLS); - Caldo tioglicolato (TGE);

4.2. Materiais: - Cultura em caldo de E.coli e Bacillus sp. - Tubos de ensaio secos e estreis. - Tiras de papel de filtro esterilizadas. - Tubos com caldo lactosado simples (CLS) e caldo tioglicolato (TGE). - Pina. - Tesoura. - Ala de platina. - Placas de gar nutriente. - Swabs.

4.3. Equipamentos: - Capela com fluxo laminar com lmpada UV. - Forno de Pasteur (ou forno comum). - Autoclave. - Bico de Bunsen. Atividade 2- Controle da Populao Microbiana por Agentes Qumicos 5. Materiais Necessrios: 5.1. Reagentes: - lcool 70% - gua destilada esterilizada

5.2. Materiais: - Swabs - Papel toalha - Tesoura - Moldes de papel de 10x10cm - Tubos de ensaio com gua esterilizada - Tubos com gar padro para contagem - Placas esterilizadas 5.3. Equipamentos: - Capela com fluxo laminar com lmpada UV. - Forno de Pasteur (ou forno comum). - Autoclave. - Bico de Bunsen. 6. 1 etapa Preparao da atividade prtica principal: 6.1. Preenchimento da Ficha Informativa de Reagentes (Tabela 1) Tabela 1 - Ficha Informativa de Reagentes
Nomes do Meio de Cultura Caldo Lactosado (CLS) Constituintes Composio Qumica Protenas, carboidratos, polissacardeos Descrio FsicoQumica pH = 6,9 0,2 higroscpico P amarelo, homogneo e sem p circulante. pH = 7,1 0,1 higroscpico Riscos Sade/ Impacto Ambiental Manuseio Estocagem

Lactose, extrato de carne, peptdeo digesto de tecido animal Peptona de casena, extrato de levedura, dextrose, Lcistena, tioglicolato de sdio, NaCl, resazurina, gar bacteriolgico Agar, extrato de levedura, casena enzimatica hidrolisada, dextrose

Manter bem fechado longe de luz

Tioglicolato (TGE)

Protenas, carboidratos, polissacardeos, NaCl, gar

Manter bem fechado, longe de luz, conservar em 15-30C

Plate Count Agar (PCA)

gar, protenas, carboidratos, polissacardeos

pH: 7.0 0.2 higroscpico P amarelo claro, homogneo e livre circulante

Conservar em temperatura ambiente, longe de luz

7. 2 etapa Execuo da atividade principal: 7.1. Procedimento/ metodologia: I. Atividade 1 Controle da Populao Microbiana por Agentes Fsicos: 1. Numerar os tubos de ensaio da seguinte forma: Grupos A,B,C Tubo 1- E.coli autoclave Tubo 2 - E.coli forno de Pasteur Tubo 3 - E.coli Controle Grupos A,B,C Tubo 1- Bacillus sp autoclave Tubo 2 - Bacillus sp forno de Pasteur Tubo 3 - Bacillus sp Controle

2. Retirar as rolhas de algodo segundo a tcnica de assepsia. 3. Flambar a abertura dos tubos antes da inoculao. 4. Inocular, com auxlio da pina, nos tubos 1 e 2, secos e estreis, identificados como tendo E.coli, tiras de papel embebidas nas culturas de Ecoli. 5. Inocular, com auxlio da pina, nos tubos 1 e 2, secos e estreis, identificados como tendo Bacillus sp., tiras de papel embebidas nas culturas de Bacillus sp. 6. Flambar a abertura dos tubos aps a inoculao. 7. Tampar os tubos com suas respectivas rolhas. 8. Inocular os tubos 3, um com E.coli e adicionar o caldo lactosado, o outro com Bacillus sp e adicionar com caldo tioglicolato. 9. Submeter os tubos 1 ao tratamento em autoclave por 20 minutos a 121C e os tubos 2 ao forno nas mesmas condies. 10. O tubo 3 no ser submetido a nenhum tratamento. 11. Aps o tratamento, colocar assepticamente os meios caldo lactosado para E.coli e caldo tioglicolato para Bacillus sp. 12. Incubar os tubos na estufa a 35C por 48 horas. II. Radiciao ultra-violeta; 1. Identificar as placas da seguinte forma: Grupos A,B,C Placas com E.coli UV Placa com E.coli - controle positivo Grupos A,B, C Placas com Bacillus sp UV Placa com Bacillus sp - controle positivo

2. Semear as culturas microbianas, com auxlio dos swabs, em placas contendo gar nutriente. 3. Remover as tampas das placas e coloc-las debaixo da lmpada ultra-violeta. 4. Retirar as placas aps 20 minutos.

5. Recolocar as tampas e incubar por 48 horas a 35C. III. Atividade 2 Controle da Populao Microbiana por Agentes Qumicos 1. Escolher uma superfcie a ser analisada e delimitar uma rea dessa superfcie com o molde. 2. Coletar o material da rea com o swab. 3. Na zona estril do bico de bunsen, colocar o swab imerso no tubo de gua esterilizada. 4. Identificar o tubo (rea contaminada) e mant-lo na rea estril do bico de bunsen. 5. Fazer a desinfeco da rea, com o papel toalha embebido em lcool 70%. 6. Aps a secagem da rea (aproximadamente 15 minutos) coletar material na regio desinfetada com auxlio do swab. 7. Na zona estril do bico de bunsen, colocar o swab imerso no tubo de gua esterilizada. 8. Identificar o tubo (rea desinfetada) e mant-lo na rea estril do bico de bunsen. 9. Inocular o contedo do tubo tratado e do tubo contaminado em placas. 10. Adicionar o meio PCA fundido de acordo com a tcnica Pour Plate. 11. Incubar as placas a temperatura 37C por 24 a 48 horas. Obs.: Todos os tubos e placas devem ser identificados com: n do tubo/tipo de placa (UV ou controle), grupo, turma, data e micro-organismo. 7.2. Leitura e interpretao dos resultados:

Tabela 1 Crescimento aps os tratamentos Cultura Autoclave Forno de Pasteur Controle UV/ controle

E.coli Bacillus sp.

+ -

+/+ +/+

Legenda: + crescimento positivo - crescimento negativo

Tabela 2 Resultados com o uso do lcool 70% na bancada Piso contaminado Numero de colnias Diversidade de colnias 2 grandes e 2 pequenas = 4 2 Aps desinfeco 2 maiores e 6 menores = 8 2

7.3. Discusso dos resultados e Concluso: Discusso A autoclave e o forno de Pasteur tiveram a capacidade de esterilizar a cultura de E.coli. No foi detectado nenhum crescimento (turvao ou formao de precipitado) nos tubos comparandoos com o tubo controle, que, por ter sido incubado, teve um crescimento bacteriolgico. A tubos contendo Bacillus sp. que foram esterilizados pela autoclave e o forno de Pasteur tambm no apresentaram crescimento. Porm, nem mesmo no controle pode-se notar turvao ou formao de precipitado, indicando que no houve crescimento. Supe-se que o erro desse crescimento pode ter vindo da pouca quantidade de microorganismos que foram colocados no tubo controle (apenas uma alada). Houve crescimento das placas controle, assim como esperado. Mas houve tambm crescimento das placas que foram expostas radiao, ainda que reduzido, tanto para E. coli como para Bacillus, indicando que a radiao UV no teve eficcia para esterilizar, causando apenas uma diminuio pequena no crescimento de microorganismos. O mtodo qumico que foi escolheu para desinfetar a bancada que serve de apoio para as aulas prticas, regio onde a professora Leila se situa, foi o lcool 70% utilizando-se o mtodo de contato de superfcies com swab. Esse mesmo produto utilizado para se fazer desinfeco das mos dos alunos antes de se iniciar as prticas no laboratrio. De acordo com a tabela 2, observa-se que o lcool 70% no est eliminando os micro-organismos da bancada. Essa soluo deveria eliminar uma grande parte desses seres, pois a atividade antimicrobiana dos alcois deve-se principalmente a sua capacidade de desnaturar protenas. Eles so tambm solventes de lipdeos, lesando assim as estruturas lipdicas da membrana das clulas microbianas. Alm disso, parte de sua eficincia como desinfetante de superfcie pode ser atribuda a ao de detergente e de limpeza, que auxilia na remoo mecnica dos micro-organismos. Dessa forma, ao se passar ele na bancada, o mesmo deveria eliminar esses seres, mas isso no ocorreu, como podese comprovar observando a tabela 2: foram encontrados um numero maior de colnias na bancada aps a desinfeco do que antes, quando ela estava contaminada. Alm disso, mesmo aps a desinfeco, a diversidade de colnias continuava a mesma. Essa situao pode ter ocorrido pelo motivo do lcool 70% no est tendo sua eficcia como um agente qumico, pois o resultado aps a desinfeco era para ser outro, com um menor nmero de colnias. Apesar de ele matar esses seres, ele no mata os esporos dos mesmos. Isso leva a concluir que na rea aps a desinfeco havia esporos. Alm disso, sua concentrao pode no estar apropriada. Outro motivo poderia ser a infeco do swab aps ele ter sido passado na bancada j desinfetada com o lcool 70%, mas esse fato muito pouco provvel, pois o procedimento de toda a atividade foi realizado com bastante ateno e calma. Concluso Podemos concluir que a esterilizao por calor seco e calor mido foi eficiente para esterilizar a cultura de E. coli, mas no podemos concluir o mesmo para a cultura de Bacillus sp. j que no houve crescimento nem mesmo no controle. Podemos concluir tambm que a radiao no pode ser considerada, nesse caso, como processo de esterilizao, e talvez a eficcia da lmpada germicida j esteja comprometida, sendo necessrio ser substituda. Tambm no possvel concluir, por meio desse experimento, se a esterilizao pela autoclave mais eficiente ou no do que a esterilizao pelo forno de Pasteur.

J em relao ao controle de populao microbiana por agentes qumicos, conclui-se que, atravs do procedimento realizado, que o lcool 70%, no est tendo sua ao germicida no laboratrio. Para se confirmar isso, necessrio realizar todo o procedimento novamente, para ver se realmente ele no est tendo sua devida eficcia. Dessa forma, de acordo com todos os resultados obtidos, conclui-se que o mtodo mais eficaz para eliminar os micro-organismos em relao ao mtodos fsicos e qumico utilizados na aula, o mtodo fsico no qual utilizou-se a autoclave e o forno de Pauster. 8. Questes 1- Diferencie os mecanismos de ao relacionados aos mtodos de controle microbiano empregados no experimento. Calor mido (autoclave) atua desnaturado as protenas das clulas microbianas, enquanto a gua influencia na destruio das membranas e enzimas, por destruir as ligaes de hidrognio. Calor seco (forno de Pasteur) o calor seco oxida os constituintes celulares orgnicos e desnatura as protenas da clula, matando o microorganismo. Radiao ultravioleta um tipo de radiao no-ionizante. Altera o DNA atravs da formao de dmeros de pirimidina, impedindo o processo de duplicao do DNA, causando a morte celular.

2- Como voc explica os resultados diferentes para os diferentes microorganismos? A colnia de E. coli foi esterilizada tanto pela autoclavagem como pelo forno de Pasteur. J a colnia de Bacillus sp. no foi esterilizada pelo forno, devido ao fato de que esse microorganismo forma esporos, mais resistentes. Segundo a tabela: Tabela 3. Tempos de destruio de alguns esporos bacterianos pelo calor mido e calor seco[1] Calor mido Temperatura Tempo de (C) morte (min) 100 2-15 Calor seco Temperatura Tempo de (C) morte (min) 140 acima de 180

Espcie Bacillus sp.

Como o tempo de exposio dos tubos foi de 15min para os dois processos, podemos ver que o calor mido foi capaz de matar os esporos e o forno no foi, resultando no crescimento de microorganismos. Obs: essa resposta no se refere aos resultados obtidos, mas explicam os resultados esperados. 3- Quais as principais aplicaes do calor seco e mido nos processos de esterilizao na indstria?

A pasteurizao e a fervura (calor mido) so amplamente utilizadas em processos na indstria alimentcia. Embora no sejam mtodos de esterilizao, reduzem a quantidade de microorganismos nos alimentos (principalmente os patognicos) sem causar alteraes significativas no sabor e teor nutricional dos mesmos. J a incinerao (calor seco) utilizada na eliminao de lixo hospitalar e materiais biolgicos contaminados, j que destri o produto. A flambagem uma prtica rotineira em laboratrios.

4- Justifique por que a ao antimicrobiana em utenslios e maquinas pode ser dificultada na presena de altas concentraes de substncias orgnicas. dificultada porque as bactrias e os fungos degradam a matria orgnica, e, como nesses locais h altas concentraes desses micro-organismos, a ao antimicrobiana vai ser dificultada. Dessa forma, ser preciso de um agente germicida com uma alta eficcia para eliminar todos esses seres. 5 - O uso de agentes qumicos na sanitizao de superfcies pode no ser eficaz na reduo da contagem microbiana. Explique a no reduo da contagem de micro-organismos em relao a: A) resistncia dos micro-organismos ao agente qumico Se os micro-organismos forem resistentes ao agente qumico, no ir ocorrer a reduo da contagem desse seres, pois o agente qumico no ser capaz de ter sua ao germicida. Esse fato observado quando as bactrias podem produzir os seus esporos que uma forma de resistncia das mesmas. Assim, no ir ocorrer a reduo da contagem desses seres. B) Diluio ou concentrao do agente qumico utilizado Se o agente qumico estiver diludo, preciso que ele contenha um amplo espectro de atividade antimicrobiana, o que significa que ele deve inibir ou matar muitos tipos diferentes de microorganismos. Se ele no tiver esse amplo espectro, conseqentemente no ir ter a reduo da contagem de micro-organismos. J a concentrao do agente qumico utilizado ?

9. Referncias Bibliogrficas PELCZAR, M.J.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. MICROBIOLOGIA CONCEITOS E APLICAES. Volume 1. So Paulo, 1996 BORELLI, B.M.; WANDERLEY, E.C; DOS SANTOS, E.J.; GOMES, F.C.O.; BADOTTI, F.; DE SOUZA, M.C.M. MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL I. Belo Horizonte, CEFET-MG. Reviso 2012. Referncias da Tabela 1 Rtulo dos reagentes