ACUMULACIN DE ARSNICO Y LAS RESPUESTAS BIOLGICAS DE BERROS (NASTURTIUM OFFICINALE R. BR.

) EXPUESTO AL ARSENITO FATMA OZTURK, FATIH DUMAN *, ZELIHA LEBLEBICI, RIDVAN TEMIZGUL RESUMEN El objetivo del presente estudio fue investigar las respuestas biolgicas de berros (Nasturtiumofficinale R. Br.) bajo estrs de arsnico. Berros muestras fueron expuestas a 1, 3, 5, 10 y 50 arsenite(As(III)) de Mof durante 7 das. La acumulacin de arsnico en las hojas de berro fue investigada, y su influencia en que las tarifas de la peroxidacin lipdica, fugas de iones, pigmentacin fotosinttica, contenido de prolina, enzymaticantioxidant rendimiento y ADN daan fue examinado. Berros fue capaz de accumulatinglarge cantidades de arsnico en las hojas. La mayor acumulacin de como (1012 gg1 dw) fue encontrada en theleaves de las plantas expuestas a 50 Mof as (III). Crecimiento de las plantas fue estimulada en 1 aplicacin de MAs(III), mientras que altas concentraciones de afectaron desfavorablemente crecimiento vegetal. Se observ que la exposicin a como (III) aument significativamente la peroxidacin de ion fugas y lpidos en comparacin con el control. Se observ un aumento de inprotein y la prolina contenido, seguido por un descenso gradual en concentraciones ms altas. Stressconditions haba causado para arriba-regulacin de la actividad enzimtica antioxidante de manera dependiente de dosis. Theresults indic que los cambios que ocurren en el polimrfico amplificado al azar ADN (RAPD) profilesafter un tratamiento de as (III), incluyen la presencia de ciertas modificaciones en la intensidad de la banda y la prdida de gainor de bandas. Los resultados del presente estudio confirman que N. officinale es capaz de superar theoccurrence de estrs inducido por el III como, especialmente, debido a las condiciones de exposicin moderada. 1. INTRODUCCIN Los compuestos de arsnico inorgnicos se han empleado en el industrial y actividades agrcolas y tambin en el control de mala hierba acutica. El phytotoxicity de arsnico depende de su estado de la oxidacin. Arsenito (Como (III)) y arsenate (Como (V)) son inorgnicos, phytoavailable formas del arsnico y son muy txicos a plantas (Mkandawire et al. 2004). Estas formas inorgnicas son interconvertibles, segn el redox condicin del ecosistema acutico. El arsnico existe predominantemente como Como (V) en aguas naturales. Sin embargo, Zhao et al. (2009) han declarado esto en condiciones aerobic, Como (III) tambin puede existir en el debido rhizosphere a la actividad de microbios y raz exudates. Por consiguiente, plantas que crecen en ambiente aerobic puede encontrar un fondo variado de Como (III) y Como (V) (Wang et al. 2010). Zhao et al. (2009) decidi que el arsnico existe en la planta predominantemente como Como (III), aunque las plantas hubieran sido expuesto a Como (V). Por lo tanto, puede ser concluido eso, siguiendo recepcin, Como (V) es reducido eficientemente a Como (III) en clulas de planta. Como (V) y el fosfato es qumicamente semejante, arsenate que permite actuar como un anlogo de fosfato, con lo cual permitiendo transporte en la clula (Meharg y Macnair, 1990). Por contraste, Como (III) es transportado en su forma natural, As(OH)3. Sin embargo, Wang et Al. (2010) determin que vittata de Pteris fue ms eficiente en el tomar Como (III) que Como (V) en la presencia de fosfato. Como (III) es considerado como phytoavailable y las la mayora del especie de arsnico de phytotoxic (Mkandawire et Al., 2004). Como (III) es inhibidores poderosos de los grupos de sulfhydryl encontraron en algunas protenas de enzimas y tejido. Atacan membranas de clula de planta, causando una inhibicin de funcin y muerte celulares (Sizova et Al., 2002). La

tasa de crecimiento relativa (RGR) es un parmetro importante a evaluar los efectos fisiolgicos de sustancias qumicas txicas en plantas (Cedergreen, 2008). La condicin del nfasis puede aumentar procesos protectores como acumulacin de soluciones y aumento compatibles en las actividades de desintoxicar enzimas. Malondialdehyde (MDA) es un producto citotxico de peroxidation de lpido y un indicador de la produccin radical libre y tejido consecuente daa (Ohkawa et Al., 1979). Mishra y Dubey (2006) determin que cuando semilleros de arroz son sujetos al nfasis del arsnico, la tasa normal de actividad de sus enzimas de proteolytic y el nivel de protenas es cambio. Otra reaccin digna de mencin indujo en las plantas que son expuestas al nfasis del arsnico es la acumulacin de ciertos metablicos especficos, como, liberta proline. Proline acumula violentamente en varias plantas bajo nfasis, consiguiendo la defensa de plantas contra dao por ROS. Proline juega papeles importantes en el osmoregulation, la proteccin de enzimas, la estabilizacin de la maquinaria de sntesis de protena, la regulacin de la acidez de cytosolic (Choudhary et Al., 2007). Algunos autores informaron anteriormente que en tasas crecientes de Como concentraciones, ciertas plantas producen la especie reactiva de oxgeno (ROS) que daa membranas de clula, ADN, la protena, pigmentos de lpido y cloroplasto (Cao et Al., 2004; Patrocinadores et Al., 2004). Para minimizarlos efectos perjudiciales de ROS, las plantas han evolucionado un sistema efectivo que barre compuesto de molculas antioxidantes y enzimas antioxidantes (Meharg, 1994). Las sendas antioxidantes,enzimticas y mayores de plantas incluyen dismutase de superoxide (CESPED), encontrado en casi todos los compartimientos celulares. El CESPED es ametalloenzyme que cataliza dismutation de anin de superoxide en el oxgeno y el agua oxigenada. Tales enzimas proporcionan un sistema de defensa para la supervivencia de organismos aerbicos (Beyer et Al., 1991). Varios estudios han utilizado el cometa, micronucleus o aquilatamientos de aberracin de cromosoma para medir efectos de genotoxic de sustancias qumicas txicas en plantas. Recientemente, el desarrollo de la tecnologa molecular de marcador ha proporcionado nuevas herramientas para el descubrimiento de modificacin gentica en respuesta a la tolerancia txica de sustancias qumicas mirando directamente en el nivel de sucesin de ADN y estructura. Sobre los ltimos aos el ADN polimrfico, amplificado y aleatorio (GOLPEO) anlisis ha sido utilizado tambin para determinacin de rearragements de genoma caus por factores de genotoxic inclusive sustancias qumicas txicas (Atienzar et Al., 1999). El aquilatamiento GOLPEADO es una tcnica de PCR-BASO que amplifica fragmentos aleatorios de ADN de genomic ADN con soltero pinturas bases cortas de sucesin arbitraria de nucletido bajo condiciones de recocer de punto ms bajo (William et Al., 1990). El aquilatamiento fue aplicado exitosamente discernir genomicDNAalterations indujo por agentes de severalDNAdamaging, como Cd, Pb y radiacin UV en plantas (Liu et Al., 2009; Cenkci et Al., 2010; Atienzar et Al., 2000). Es sugerido que modificaciones a perfiles GOLPEADOS debido a exposicin de genotoxic pueden ser consideradas como cambios en la estabilidad de plantilla de genomic (GTS, una medida cualitativa de efecto de genotoxic) (Atienzar et Al., 1999). Es sabido que Como potencial de acumulacin de macrophytes acutico es muy alto (Alvarado et Al., 2008). Como (V) recepcin y toxicidad han sido documentadas bien en plantas (Smith et Al., 2008; Mrak et Al., 2008), mientras que Como (III) recepcin y toxicidad han sido menos estudiadas (Mkandawire et Al., 2004). El berro, officinale de Capuchina R. Br., es una planta acutica comestible. Como una planta medicinal, el berro ha sido considerado tradicionalmente un diurtico, el purgante y el tnico, y consumido como una ensalada verde. Las propiedades de N. officinale que trae consigo acumulacin metlica fue estudiado extensamente en el pasado. Sin embargo, an entonces el conocimiento disponible con respecto al Como caractersticas de acumulacin de berro expusieron a Como (III) y el efecto resultante de acumulacin no es suficiente. Primero, el estudio presente se centr en las propiedades de acumulacin de Como. En segundo lugar, este estudio se propuso demostrar las respuestas

biolgicas de berro contra el Como, basado en las concentraciones varias de Como (III) aplicacin. Los resultados de las investigaciones pueden ayudar a explicar los efectos de arsenite en plantas acuticas, y en las respuestas biolgicas consecuentes de estas plantas. Adems, la planta de usefulwhenthis de findingsmaybe es utilizada como un phytoremediator en contamin agua. 2. MATERIALES Y MTODOS 2.1. Coleccin y cultivacin N. De la muestra. las plantas de semillero del officinale fueron recogidas en abril de 2008 de la corriente en Kayseri, Turqua de Karasu. Antes del experimento, los envases fueron desinfectados por la inmersin en el 1% (v/v) NaClO por 3-5 Min. Los envases entonces fueron aclarados tres veces con el agua destilada (Hou y otros., 2007). Las muestras recogidas fueron lavadas en agua del grifo y aclimatadas por 3 das en un compartimiento de clima con una temperatura del agua del C 15, una humedad relativa de el 70% y el photoperiod ligero/oscuro 16 de la obsc uridad de h light/8 h. Los envases fueron aireados suavemente. 2.2. El diseo experimental los experimentos conducidos en el actual estudio set-up en triplicado, en donde cada repliegue aproximadamente 4 constituidos de las plantas evaluadas. Como (III) soluciones utilizadas en el actual estudio fueron preparados de NaAsO2. Cada muestra de la planta del berro fue expuesta a cuatro concentraciones variadas de la prueba (1, 3, 5, 10, y 50 el M) de segn lo (III) mantenido en la solucin del 10% Hoagland en los frascos cnicos separados 400mL (Srivastava y otros., 2006). Las plantas a las cuales no fueron expuestos segn lo (III) servido como los grupos de control de este experimento. Los frascos que abarcan la planta y como concentrados fueron colocados en un compartimiento de clima bajo condiciones ya mencionadas por 7 das. Los frascos no fueron aireados durante el experimento. El cambio que ocurri en el volumen de la solucin dentro de los frascos debido al evapotranspiration fue compensado por la adicin del agua destilada doble. En el final del experimento de la exposicin, las muestras resultantes de la planta fueron recogidas y tamizadas con una plancha plstica. Cada planta fue aclarada con agua desionizada, dren, y despus borr en las toallas de papel para 2min. 2.3. Cuantificacin del arsnico y determinacin de RGRs el ndice de crecimiento relativo (RGR) del N. el officinale era calculado en cada tratamiento usando la ecuacin: RGR (%/day) = ln del [del ln (W2) (W1)] el 100% (1) W1 y W2 de t es el inicial y el (G) final de los pesos frescos, respectivamente, y t es la longitud del perodo experimental. Las hojas de la muestra de las plantas fueron secadas en 70 C. Cada muestra entonces fue digerida con 10mL del HNO3 puro usando un sistema de la digestin de la microonda de CEM Marte 5 (CEM Corporation Mathews, NC, los E.E.U.U.). Las condiciones de la digestin eran como sigue: la energa mxima era W 1200, la energa era en 100%, la rampa fue fijada por 20 minutos, la presin e ra 180 PSI, la temperatura era el C 210

y el tiempo de asimiento era 10 Min. Despus de la digestin, la solucin fue evaporada a la sequedad cercana en un cubilete. El volumen de cada muestra fue ajustado a 10mL usando el HNO3 de los 0.1M. La concentracin total del arsnico fue determinada usando un espectrmetro total inductivo juntado del plasma (Agilent, 7500a). La estabilidad del dispositivo fue evaluada cada diez muestras examinando un estndar interno. Los espacios en blanco el reactivo tambin fueron preparados para detectar cualquier contaminacin potencial durante la digestin y el procedimiento analtico. Las hojas del melocotn (NIST, SRM- 1547) fueron utilizadas como el material de referencia para todos los procedimientos analticos realizados. Las muestras eran analizadas en triplicado. All chemicals used in this study were analytical reagent grade (Merck, Darmstadt, Germany). 2.4. La determinacin de la salida del ion y del peroxidation del lpido la salida del ion inducida por como (III) era estimada midiendo la conductividad elctrica (EC) (Devi y Prasad, 1998). Las hojas de plantas arsnico-expuestas fueron lavadas con agua dobledesionizada. Entonces, 500mg del material de planta fue transferido a 100mL del agua desionizada para que 24 h faciliten salida mxima del ion. La EC del agua entonces fue registrada con el metro modelo de la conductividad de WTW. Para la determinacin del peroxidation del lpido, el material de la hoja (magnesio 500) fue homogeneizado con 3mL de 0.5% TBA en el TCA del 20% (peso/volumen). El homogenate fue incubado en el C 95 por 30 minutos, y el hielo fue utilizado para parar la reaccin. Las muestras fueron centrifugadas en 10,000g por 10 minutos, y la absorbencia del supernatant que resultaba fue registrada en 532 y 600 nanmetro. La cantidad del malondialdehyde (MDA) (coeficiente de la extincin de 155mM1 cm1) era calculada restando la absorbencia no especfica en 600nm de la absorbencia en 532nm (Heath y Packer, 1968) 2.5. Determinacin del pigmento fotosinttico contenido Photosynthetic pigmentos de las hojas de las plantas tratadas y no tratadas (100 mg) se extrajeron 10 ml de solucin de acetona enfriada en la oscuridad. Despus de la centrifugacin a 4000 g durante 10 min, la absorbancia del sobrenadante fue tomada en 480, 510, 645 y 663 nm. El contenido de clorofila se estim mediante el mtodo de Arnon (1949), y se determin el contenido de carotenoides mediante la frmula de en Duxbury y Yentsch (1956). 2.6. Determinacin de protenas totales, prolina y la actividad SOD hojas de la planta de muestras (500 mg) se homogeneizaron en 1mL de tampn de fosfato de potasio 100mM (pH 7.0) que contiene 0,1 mM EDTA y 1% polivinil pirrolidona (PVP, (w/v)) en 4 C. El homogeneizado se centrifug a 15, 000 g durante 15 min a 4 C. El sobrenadante de se extrajo y se utiliza para medir las actividades de SOD. El contenido de protena se determin por el mtodo de Lowry et al., (1951) utilizando albmina srica bovina como la protena estndar. La cantidad de prolina se determin segn un mtodo modificado de Bates (1973). Contenido de prolina libre fue extrado de 0.25 g de muestras en 3% (w/v) sulfosaliclicos acuoso cido y estimado por reactivo de ninhidrina. Absorbencia de la fase superior fue grabado en 520nm contra tolueno en blanco. SOD fue probada por el mtodo fotoqumico descrito por Giannopolitis y Ries (1977) con algunas modificaciones. La reaccin mezcla contena 20mM fosfato de sodio (pH 7,5), 10mM extraccin de metionina, 0.1mM EDTA, 0,1 mM nitro-azul-tetrazolio (NBT), riboflavina 5 M y 50 gmL1 enzima

crudo en un volumen total de de 3 mL. Una unidad de la actividad SOD se define como la cantidad de la enzima necesaria para dar lugar a una inhibicin del 50% de la tasa de NBT (azul-nitro-tetrazolio cloruro) reduccin medido en 560nm (Liang et al., 2003). 2.7. Extraccin de ADN y RAPD-PCR y estimacin de la estabilidad genmica de plantilla el proceso de extraccin de ADN se realiz segn el mtodo CTAB (Rogers y Bendich, 1985) y la concentracin de DNA se estim mediante un espectrofotmetro a 260 nm. Adems, los experimentos de RAPD-PCR se realizaron de acuerdo al mtodo de Williams et al (1990) y el oligonucletido 12 pimers (alfa DNA, Canad) fueron utilizados con el propsito de llevar al anlisis RAPD-PCR. Adems, una mezcla de reaccin de 25 L estndar que constituye una 100 ng de ADN genmico, 1.5U de polimerasa Tag, 0,4 Mof cartilla 0,2 mM de cada dNTP, 2,0 mM de MgCl2 y 2,5 L de 10 reaccin buffer. El proceso de amplificacin de DNA fue realizado en un termociclador Thermo . La desnaturalizacin inicial 2min en 94 C fue seguida por 44 ciclos de 1min a 94 C, 1min 36 C, 2min 72 C y 1 ciclo de 5min a 72 C. Despus de la terminacin del proceso de amplificacin , los productos obtenidos fueron separados en a base de agarosa al 2% mediante electroforesis realizado en el buffer TrisBorateEDTA (TBE) y teidas con etidio bromuro. Los geles resultantes luego fueron fotografiados en un UVtransilluminator. El proceso de amplificacin de eachDNAsamplewasrepeated en por lo menos tres veces con el fin de garantizar resultados reproducibles. Cada modificacin obvia de observada en los patrones RAPD (desaparicin de bandas ) y la aparicin de nuevas bandas fue dada la arbitrariedad el puntaje de 1 y para cada grupo de experimento de las plntulas de arroz se calcul el promedio teniendo en cuenta 12 cartillas, que mostraba claras variaciones en sus perfiles RAPD. Sin embargo, los iniciadores que no revelar las alteraciones especficas en sus perfiles RAPD o fueron muy difcil ser puntuados no eran considerados en el clculo final de la estabilidad genmica plantilla (GTS), una medida cualitativa que refleja los cambios que se producen en los perfiles RAPD. Estabilidad genmica plantilla (GTS; %) fue calculada como sigue: GTS = (1 un/n) 100 (2) donde a es el nmero promedio de las bandas polimrficas detectadas en cada muestra tratada y n el nmero total de bandas en el control de . El polimorfismo que se presentan en los perfiles RAPD incluyeron banda la desaparicin de un normal y las apariencias de una nueva banda de en comparacin con el control. El polimorfismo promedio que se presentan en cada grupo experimental expuesto a diferentes as (III) tratamientos se calcul. Para comparar el grado de sensibilidad de cada parmetro, los cambios que ocurren en este valor fue calculado como un porcentaje de su control (ajustado a 100%).

2.8. Estadsticas datos se expresaron como medios con errores estndar (SE). El KolmogorovSmirnov y prueba de Levene se utilizaron para asegurar la suposicin de normalidad y la homogeneidad de varianzas, respectivamente. Donde la heterogeneidad de varianza fueron reconocidos, datos de sesin transformada ln (x 1) y reevaluacin. El anlisis de varianza (ANOVA) fue realizado para confirmar la de diferencias significativas entre tratamientos. Todo pairwise decir las comparaciones fueron hechas usando anlisis post-hoc. Prueba de Duncan se utiliz para determinar la diferencia significativa entre tratamientos. Correlaciones acumularon entre como y tambin se realizaron los parmetros estudiados. Usamos 0.05 como el umbral de significancia estadstica. Todos anlisis estadsticos se realizaron con el software SPSS 15.0 paquete. 3. RESULTADOS 3.1. Efectos de as (III) sobre el crecimiento de berros que los resultados del presente estudio revelaron que una exposicin inicial a hasta 1 M de as (III) induce un aumento en los valores RGR (Fig. 1a) y en la produccin de hojas de un color ms oscuro. Las plantas que fueron expuesto a 3 y 5 M de as (III) revel un un efecto significativo sobre los parmetros de crecimiento como es evidente por el visual cambia, tan como, clorosis de las hojas y el debilitamiento del tallo. Fue determinado que en 3, 5 y 10 aplicaciones de Mof as (III), se midieron los valores RGR para ser ms bajas que las del control (p0. 05). Adems, 50 Mof arsenito exposicin revelaron un efecto negativo sobre la planta de crecimiento. 3.2. Como acumulacin de hojas de berro tratado con as (III) la tasa de acumulacin de arsnico en las hojas del officinale del N. se encontr que dependen de las diversas concentraciones de exposicin (Fig. 1b). La mayor acumulacin de como (1012 gg1 dw) fue encontrado en las hojas de las plantas expuestas a 50 M de as (III). Correlacin negativa significativa fue determinada entre valores RGR y acumulada como (R = 0.946, p0. 01). 3.3. Efectos de as (III) en el nivel de la CE y MDA se observ que cuando las plantas fueron sometidas a 5 M de como la exposicin, sus valores de CE no mostr alteraciones (Fig. 2a). Sin embargo, una exposicin sobre esta concentracin result en el aumento de la CE valores significativamente (p0. 05). En comparacin con el control de , se observ el mayor incremento en el valor de 307% aplicacin de 50 M. Como la acumulacin y CE fueron significativamente correlacion positivamente con el otro (R = 0.950, p0. 01).

Adems, en una aplicacin de as (III) de 1 M, el contenido de MDA no se encontr a ser significativamente alta, en comparacin con el control. Sin embargo, en una aplicacin de as (III) de 3-10 M, el MDA contenido aumentado con un aumento en la concentracin de as (III) hasta 10 M, ms all de que el contenido MDA revela una tendencia a la disminucin de de valor (Fig. 2b),

aunque nunca alcanz un nivel que fue significativamente menor que la del control (p0. 05). Adems, el mayor incremento en el valor del contenido MDA en comparacin con el control se observ a contentarse 86% en una aplicacin de as (III) de una correlacin significativa entre MDA 10 M. y como observ acumulacin (R = 0.606, p0. 01). 3.4. Efectos de as (III) en fotosntesis pigmentos ambos clorofila a y clorofila b negativamente correlacionada con acumulado como (R = 0.724, p0. 01; R = 0.769, p0. 01, respectivamente).Contenido de el pigmento fotosinttico de las plantas que estaban tratados con as (III) aumentado ligeramente hasta 3 M, en comparacin a con el control. Sin embargo, cuando las concentraciones de as (III) fueron aumentado, el contenido de clorofila a y b fueron encontrados para ser menor que los del testigo (Figura 3a y b). Se observ la disminucin mxima en el contenido de clorofila a y b contenidos d 58% y 52%, respectivamente, en una aplicacin de as (III) de 50 M. No significativa se observ correlacin entre acumulado como y contenido de carotenoides (R = 0.140, p0, 05). Bajo todas las condiciones de exposicin, el carotenoide contenido de las plantas que estaban expuestos to As(III) revel valores mayores que la muestra de control (Fig. 3C). Adems, en comparacin con el control, se observ el aumento mximo en el contenido de carotenoides como 46% en una aplicacin de as (III) de 3 M. 3.5. Efectos de as (III) en la protena y contenido de prolina y SOD actividad Los niveles de protena mostraron correlacin negativa significativa con como acumulacin de (R = 0.933, p0. 01). En aplicaciones de as (III) de 1 y 3 M , el contenido de protena fue encontrado para ser significativamente alta, en comparacin de con el control (Fig. 4a). Adems, el efecto de una aplicacin de as (III) de 1 M sobre el contenido de protena fue observado para ser significativamente mayor que el efecto de 3 Mof as (III). Adems, las aplicaciones de the As(III) de 5 y 10 M no produjo ninguna estadsticamente importantes diferencias con la muestra de control. Sin embargo, en an As(III) aplicacin de 50 M, una disminucin (383%) se observ a aparece en el contenido de protena en comparacin con el control de. No significativa se observ correlacin entre el contenido de prolina y acumulada como (R = 0.119, p0, 05). Por lo tanto, puede ser comprob que bajo todas las concentraciones de exposicin, los niveles de prolina fueron encontrados para ser significativamente mayor en comparacin con el control (Fig. 4b). Adems, tambin se observ que el contenido de prolina aumentado con un aumento en la concentracin de as (III) hasta 5 M, ms all del cual el contenido de prolina revel una tendencia a la disminucin de de valor, aunque nunca alcanz un nivel significativamente inferior que el control de. En aplicaciones de as (III) de 1 a 10 M, la tasa de actividad SOD fue grabada para ser significativamente mayor que la del control (Fig. 4C). Adems, se observ que en comparacin con el control, se observ el aumento mximo de en la tasa de actividad SOD ser 37% para una aplicacin de as (III) de 5 M.However, una vez que el valor de la actividad de la SOD alcanz su mximo nivel lo revel una tendencia a disminuir conforme a concentraciones crecientes. Al igual que el efecto sobre el contenido de protena, una aplicacin de as (III) de 50 M caus una disminucin (142% en comparacin con el control) en la actividad SOD .

3.6. Efectos de as (III) en el RAPD perfiles entre las 12 decamer evaluadas las cartillas del oligonucletido, nica 9 equip resultados especficos y estables (tabla 1). Las huellas RAPD consecuentes revelaron la ocurrencia de differencesamongthe substancial no expuestos y las plantas expuestas, demostrando cambios aparentes en el nmero, el tamao y la intensidad de los fragmentos del ADN amplificado. Adems, se observ que el RAPD patrones generados por las plantas como III-expuestas en todos los casos fueron claramente diferentes de los obtenidos mediante la evaluacin de la DNA de los controles. Los principales acontecimientos que fueron observados a ocurrir posterior a una exposicin de as (III) eran una variacin en la intensidad de la banda, prdida de bandas normales y la aparicin de nuevas bandas en comparacin con las plantas de el control normal. La disminucin de la intensidad de la banda fue particularmente obvio para berros expuestos a 5, 10 y 50 Mof As(III) para imprimaciones, numerados 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9 (Fig. 5). Considerando que, el aumento de la intensidad de la banda fue particularmente evidente con un aumento de de 50 M en la concentracin de as (III) para cartillas 3 y 8. El nmero mximo de bandas RAPD desaparecidas fue encontrado en dos mayores (10 y 50 M) concentracin de as (III) para cartillas 3, 4, 8, 9 y las bandas de tamao molecular se observaron aproximadamente 2001200 bp han desaparecido (Fig. 5). Finalmente, observ que aparecieron bandas adicionales con la cartilla 1 (PCR ocho nuevos productos de amplificacin), cartilla 4 (una o dos nuevas bandas), cartilla 6 (siete nuevas bandas), cartilla 5 (una nueva banda), cartilla 8 (una nueva banda de ), cartilla 9 (nueva banda de uno a cinco) y cartilla 2 (uno a siete bandas de ) (tabla 2). Las bandas adicionales que aparecieron fueron observadas para ser de tamao molecular aproximadamente 100 a 2000 BP. figura 6. Estabilidad genmica plantilla en berros expuestos a diferentes concentraciones de as (III). Nueve cartillas revelaron la presencia de 63 bandas que van desde 200 a 2100 bp en tamao molecular, mientras que en el grupo control diferentes bandas polimrficas fueron detectadas en cada concentracin de as (III) para diferentes cartillas. El valor de la was P(%) polimrfica = 4%, 17%, 25%, 33% y 74% para 1, 3, 5, 10 y 50 Mof as (III) concentracin, respectivamente. En todos los casos, la ocurrencia del polimorfismoera debido a la prdida o ganancia de los fragmentos PCR en la tratados planta en comparacin con el control. La tabla 2 indica tambin que el nmero de bandas de cambiadas observado en perfiles RAPD en el como (III)-planta berros contaminados aument dramticamente posterior a una exposicin de as (III). En este experimento, la estabilidad de la plantilla de genmica fue utilizada para comparar los cambios de perfiles RAPD con grupo de control (Fig. 6). Segn el grupo de control, reduce gradualmente planta GTS de expuesta con as (III). 4. Discusin 4.1. Como caractersticas de acumulacin y crecimiento Similar a los resultados obtenidas por los estudios anteriores (Cao et al., 2004; Abbas y Meharg, 2008), el presente estudio tambin encontr que la captacin de as (III) dependiente de la concentracin. Estudios anteriores confirman la ocurrencia de una alta acumulacin de arsnico en las plantas acuticas. En el

presente estudio, no obstante, las condiciones experimentales de fueron diseadas para representar una condicin "peor escenario"; Adems, este estudio llama la atencin sobre la tendencia de N. officinale a acumular importantes concentraciones de as (III) bajo condiciones favorables de crecimiento . Srivastava et al (2007), quienes evaluaron las propiedades de la acumulacin de las especies como de una planta acutica, Hydrilla verticillata y confirm que la planta de Hydrilla tolerada normalmente altas concentraciones de as (III) de la cantidad presente en las zonas contaminadas. Los resultados del presente estudio son de acuerdo con estas evaluaciones. Por lo tanto, puede indic que esta planta puede usarse como un phytoaccumulator como para aguas contaminados con arsnico de Los productos qumicos txicos estimulan el crecimiento de las plantas en dosis ms bajas y tienen un efecto txico en dosis ms altas (Cedergreen, 2008). Asimismo, el presente estudio comprobado que una dosis menor de arsenito (1 M) estimula el crecimiento, sin embargo, las dosis ms altas afectan negativamente la planta crecimiento. Southam y Erlich (1943) llamado el efecto de sustancias txicas a estimulan el crecimiento en dosis ms bajas como "efecto hormesis". Adems, fue grabado que los valores RGR, tienden a disminuir cuando se aplica una dosis alta de de sustancias txicas basndose en el hecho de que la pared celular y el cellmembranemaybe destruyen por el oxgeno reactivo especies formado como resultado de la tensin dependiendo de una concentracin creciente de exposicin (Srivastava et al., 2009). 4.2. Peroxidacin de fuga y de los lpidos de ion un aumento en el nivel MDA segn el creciente sustancias txicos concentracin y exposicin el perodo indica la existencia de un estrs oxidativo. En este contexto, el presente estudio observ que un as (III) la aplicacin de 1 Mdid dao no significativamente el plasma membrana de hojas de N. officinale. Sin embargo, conforme a la literatura (Shri et al., 2009), aumentan en el aumento de concentracin causado la exposicin en theMDAcontent. Por lo tanto, puede ser indicado que la aplicacin de una alta concentracin de as (III) a plantsmaycause dao a su integridad de la membrana. As (III) puede modificar las actividades de la enzima lipoxigenasa (Chakrabarty et al., 2009), que puede resultar en la permeabilidad de la membrana alterado y, en consecuencia, creciente fuga de iones. Sin embargo, el contenido MDA se registr disminucin de en una aplicacin de as (III) de 50 M. Similar a los Resultados obtenido en el presente estudio, Wang y Zhou (2006) tambin determinada que el nivel MDA de trigo disminuye cuando un herbicida aplicado en dosis altas. 4.3. Fotosinttica pigmentacin Adems, tambin se revel que una cantidad excesiva de as (III) afect el contenido de los pigmentos fotosintticos presentes en N. officinale. Adems, la cantidad de pigmentos fotosintticos fue grabado para aumentar mientras que la concentracin de metal fue encontrada a se convierten en baja. Posteriormente, como la concentracin de metal aumentada, all era una disminucin en la cantidad de pigmentos fotosintticos producida. Los resultados del presente estudio son tambin de acuerdo con el informe generado por Seth et al., (2007). Esta situacin puede ser interpretado como una respuesta adaptativa que se produjo contra un xenobitico

presente en los medios de comunicacin. La disminucin en la cantidad de contenido de pigmentos fotosinttico puede deberse a varios factores: el per desglose oxidativo de los pigmentos y los lpidos de la membrana del cloroplasto por las especies reactivas del oxgeno (Li et al., 2006; Singh et al., 2006), un deteriorada la absorcin de nutrientes (por ejemplo, Mn, Cu, Fe y P) (Srivastava et al., 2007), o la degradacin de la clorofila a travs de un aumento en la tasa de actividad chlorophyllase (Sharma y Dubey, 2005). 4.4. Protena y prolina contenido sin embargo, tambin es conocido que las plantas que son expuesta a estrs arsnico intentan sobrevivir mediante la produccin de protenas de estrs como respuesta a las cambiantes condiciones ambientales en las primeras etapas de la de aplicacin (Seth et al., 2007). En este estudio, un aumento de el contenido de protena total fue encontrado para ocurrir en concentraciones ms bajas de as (III); Sin embargo, en altas concentraciones (50 M) de as (III) una disminucin significativa de ocurri en el contenido de protena. Este eventual disminucin en el contenido de protena puede ser dependiente de un aumento de ROS. Prolina es conocido como un importante soluto orgnico acumula en muchas especies bajo condiciones de estrs abiticos (Ozden et al., 2009). En los experimentos realizados en el presente estudio, el nivel de prolina aument significativamente con un aumento en el as (III) concentracin hasta 5 M. Un efecto similar fue anterior observados en Oryza sativa, bajo una condicin de estrs As2O3 (Mishra y Dubey, 2006). Junto con los resultados obtenidos por Mishra y Dubey (2006), el presente estudio revela que ms all de una valor of As(III) concentracin de 5 M, el contenido de prolina disminuy de manera que dependen de las concentraciones de exposicin variadas. Sin embargo, nunca alcanz un nivel que fue significativamente menor que el que observ en el control. El aumento de la prolina puede regular la toxicidad de as (III) en la reduccin de su absorcin (Wu et al., 1998). 4.5. Rendimiento enzimtica antioxidante SOD se considera que la enzima clave de la celular sistema que se ha formado contra ROS de defensa. La actividad de SOD reduce la formacin de de hidrxido. El presente estudio revel que la tasa de de la actividad de SOD aument en una concentracin de as (III) hasta 5 M. Similar a los resultados obtenidos en el presente estudio, Srivastava et otros (2007) estudi el estrs oxidativo inducido por arsenito causado por Hydrilla verticillata, que depende de la concentracin de la sustancia txica de y la duracin de la aplicacin; sus investigaciones lleg a la conclusin de que la tasa ms alta de la actividad SOD se produce en 5 M por 4 das. El aumento en la tasa de actividad SOD en concentraciones ms bajas indic que N. officinale es capaz de tolerar la exposicin moderada a arsenito y combatir eficazmente el estrs oxidativo. Sin embargo, la tasa de actividad de la SOD disminuy significativamente a la concentracin mxima de arsnico de 50 metros. Esta situacin puede ser causado por el potencial de daos que se producen en el antioxidante sistema de defensa. Este resultado sugiere que la planta no puede lidiar con concentraciones muy altas arsenito .

4.6.

El

cambio

de

perfiles

RAPD

los

cambios

inDNAcaused

por

genotxicos

chemicalsmaybemonitored utilizando diferentes biomarcadores ensayos tanto en bioqumica y nivel molecular (Savva, 1998). Perfiles RAPD detectan alteraciones en el ADN genmico con el uso de las reacciones de polimerizacin en cadena arbitrariamente preparadas y claramente muestran prometedores para la deteccin del ADN del agente contaminador-inducida efectos (Conte et al., 1998; Atienzar et al., 2001). Sin embargo, es slo un mtodo cualitativo a travs de qu naturaleza e importe de lata de ADN ser especulado solamente. El presente estudio muestra el primer informe sobre as (III) inducida por RAPD perfiles en las plantas acuticas. Cambios observados en los perfiles de ADN , como pueden ser modificaciones en la intensidad de la banda y la prdida de bandas debido a los cambios en los sitios de cebado del oligonucletido debido principalmente a reordenamientos genmicos y menos probable a mutaciones puntuales o ADN daan en los sitios de unin de la cartilla o la presencia de DNA foto productos que pueden bloquear o reducir la polimerizacin del ADN en la reaccin de PCR (Nelson et al.1996). Aparicin de nuevos productos de la polimerizacin en cadena o aparicin de bandas podra atribuirse a la presencia de sitios de oligonucletidos cebado que devienen accesibles a oligonucletidos cartillas despus cambio estructural o porque se han producido algunos cambios en la secuencia de ADN debido a mutaciones o delecciones grandes o recombinacin homloga (Atienzar et al., 1999). En estudios anteriores, los perfiles RAPD generan a partir de la cebada y cadmio de tratamiento de las plntulas de arroz revel diferentes patrones de la aparicin y desaparicin de bandas para el control patrn de RAPD (Liu et al., 2007; Liu et al., 2009). Asimismo, en el presente estudio diferentes bandas polimrficas estaban decididas a ser presentes en cada concentracin de as (III) en los nueve cebadores (Fig. 5). Segn los resultados, se consideraron los polimorfismos ser causada por la prdida o ganancia de las bandas amplificadas en el grupo tratado en comparacin con el grupo control. La tabla 2 describe los cambios observados en los perfiles de RAPD, por ejemplo, la desaparicin de aspecto/ de las bandas y la tasa de disminucin/aumento en las intensidades de la banda. Se encontr que las nuevas bandas fueron en un mayor nmero en una mayor concentracin as (III) (Schaltabstand M), con tamaos moleculares de 2002000. El aspecto de nuevas bandas demostr que el efecto puede estar involucrado en el ADN mecanismo de replicacin y reparacin o tambin puede ser el resultado de la inestabilidad genmica plantilla conectado con el nivel ofDNAdamage y la efectividad de la reparacin del ADN y la replicacin (Atienzar et al., 1999). Finalmente, una comparacin entre los no tratados y los tratados genomas revel que el anlisis RAPD puede ser empleado para evaluar la manera en que los contaminantes ambientales modifican la estructura del ADN presente en N. officinale. Los efectos de cada categora de de dao de la DNA (filamento por ej., rotura, bases modificadas, un sitios, bases oxidadas y abultado aducto) sobre el RAPD perfiles pueden ser especulados solamente cuando se analizan los amplicones (por ejemplo, la secuencia ) y mtodos ms especficos, tales como, el ensayo cometa y ensayo 32P-postlabelling son necesarios para obtener una informacin cuantitativa (De Wolf et al., 2004).

5. CONCLUSIONES las conclusiones de las investigaciones realizadas en el presente estudio son: (1) gran cantidad de arsnico puede ser acumulada por hojas de N. officinale (2) el pigmento fotosinttico ms sensible al as (III) exposicin es clorofila a; (3) aumento de la concentracin de la exposicin the As(III) afecta a la genmica plantilla estabilidad y mayo inducen modificaciones en la intensidad de la banda y una ganancia o prdida en el nmero de bandas; (4) N. officinale tiene la capacidad de superar el estrs inducido por el arsenito, especialmente en un grado moderado de la exposicin.