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Amibes libres de l'environnement :

cologie et interactions avec des micro-


organismes pathognes mergents
Vincent Thomas
Mmoire prsent et soutenu publiquement le 11/05/2012
lUniversit Paris Sud-11, Facult de Pharmacie de Chtenay-Malabry
pour lobtention de l
Habilitation Diriger des Recherches
devant le Jury compos de
Pr Anne Collignon
Pr Gilbert Greub
Pr Yann Hchard
Pr Yves Lvi
Dr Jean-Yves Maillard
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Remerciements
Merci Anne Collignon, Gilbert Greub, Yann Hchard, Yves Lvi et Jean-Yves Maillard de
m'avoir fait l'amiti de bien vouloir faire partie du jury de ce mmoire d'HDR.
Merci tous ceux qui ont particip de prs ou de loin la construction de ma carrire
scientifique de microbiologiste, soit dans l'ordre chronologique :
Jacky Fourniat et Sylvie Bouttier la Facult de Pharmacie de Chtenay-Malabry
(Laboratoire de Microbiologie Industrielle),
Pierre Bourlioux, Anne Collignon et Hlne Bourreau la Facult de Pharmacie de
Chtenay-Malabry (Dpt Microbiologie), ainsi que Jol Dor et Violaine Rochet l'INRA de
Jouy,
Yves Lvi la Facult de Pharmacie de Chtenay-Malabry (Dpt Sant Publique), ainsi que
Jean-Franois Loret et Michel Jousset (Suez), et Thodore Bouchez (Cemagref Antony),
Gilbert Greub et David Baud lhpital de Lausanne,
Gerry McDonnell chez STERIS, ainsi qu'Emmanuel Comoy et Jean-Philippe Deslys au CEA
de Fontenay et Romain Briandet l'INRA de Massy.
Merci enfin tous ceux avec qui j'ai pu collaborer / changer au cours de ces annes, dont je
ne citerai pas les noms de peur d'en oublier...
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Table des matires
Chapitre 1 : Introduction................................................................................................................................................7
1.1- Curriculum vitae................................................................................................................................................7
1.1.1- tat civil.....................................................................................................................................................7
1.1.2- Adresse professionnelle...........................................................................................................................7
1.1.3- Titres universitaires...................................................................................................................................7
1.1.4- Parcours professionnel.............................................................................................................................8
1.1.5- Activits lies l'administration................................................................................................................8
1.1.6- Activits lies la recherche....................................................................................................................8
1.1.7- Encadrement scientifique.........................................................................................................................9
1.2- Liste des publications.....................................................................................................................................10
1.2.1- Revues comit de lecture....................................................................................................................10
1.2.2- Chapitres de livres..................................................................................................................................12
1.2.3- Confrences dans des congrs..............................................................................................................12
Chapitre 2 : Contexte de nos travaux.........................................................................................................................14
Chapitre 3 : cologie amibienne et rsistance des amibes la dsinfection............................................................18
3.1- cologie et diversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans les rseaux d'eau : de la
source au point d'usage.........................................................................................................................................18
3.1.1- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans une usine de
production d'eau potable ..................................................................................................................................20
3.1.2- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans un rseau d'eau
hospitalier..........................................................................................................................................................22
3.2- Rsistance des amibes aux traitements de dsinfection mis en uvre dans les rseaux...........................23
3.2.1- Publication : Amibes dans les rseaux domestiques : rsistance aux traitements de dsinfection et
implication dans la persistance des lgionelles................................................................................................23
3.2.2- Publication : Rsistance des kystes d'Acanthamoeba aux traitements de dsinfection utiliss dans les
tablissements de soins ...................................................................................................................................25
3.2.3- Publication : Influence des conditions de croissance in vitro des Acanthamoeba sur la rsistance des
kystes drivs....................................................................................................................................................28
Chapitre 4 : Interactions amibes libres / micro-organismes ......................................................................................34
4.1- Les amibes libres de l'environnement : melting-pot du monde microbien...............................................34
4.2- Interactions des amibes avec de nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia.................36
4.2.1- Publication : Description d'une nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Criblamydia sequanensis
...........................................................................................................................................................................38
4.2.2- Publication : Description d'une nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Rhabdochlamydia
crassificans (25)................................................................................................................................................39
4.2.3- Publication : Implication de la nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Waddlia chondrophila
dans les avortements chez la femme ..............................................................................................................39
4.2.4- Publication : Capacit de survie dans l'environnement des nouvelles espces bactriennes
apparentes aux Chlamydia.............................................................................................................................40
4.3- Interactions des amibes avec les mycobactries...........................................................................................43
4.3.1- Publication : Test de la virulence de diffrentes souches cliniques de Mycobacterium kansasii vis--vis
d'Acanthamoeba castellanii..............................................................................................................................44
4.4- Interactions des amibes avec les virus NCLDV.............................................................................................45
4.4.1- Publication : Lausannevirus, un nouveau virus d'amibes.......................................................................47
Chapitre 5 : Perspectives............................................................................................................................................51
5.1- Synthse de nos travaux................................................................................................................................51
5.2- Perspectives / dveloppements envisags....................................................................................................51
5.2.1- Protozoaires de l'environnement : interactions avec l'cosystme biofilm.............................................52
5.2.2- Protozoaires de l'environnement : rle dans la slection et la dissmination de bactries pathognes
...........................................................................................................................................................................54
5.3.3- Protozoaires de l'environnement : amlioration des stratgies de contrle...........................................55
5.3- Collaborations en cours et envisages...........................................................................................................58
Rfrences bibliographiques......................................................................................................................................59
Rfrences fournies en annexe..................................................................................................................................64
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Liste des Figures
Figure 1: Les amibes libres, chevaux de Troie du monde microbien..........................................................
Figure 2 : Mthode de co-culture amibienne utilise lors de nos diffrentes tudes environnementales....
Figure 3 : Lieux de prlvements d'chantillons pour analyse de la flore amibienne et des micro-
organismes rsistants aux amibes dans une usine de potabilisation d'eau de rivire..................................
Figure 4 : Diversit morphologique des amibes retrouves aux diffrentes tapes de potabilisation..........
Figure 5 : Effet des traitements de dsinfection sur les biofilms rvl en marquage Live/Dead................
Figure 6 : Aspect en microscopie lectronique des kystes obtenus partir des diffrentes souches
d'amibes......................................................................................................................................................
Figure 7 : Dtection des kystes permabiliss par le traitement SDS par marquage l'iodure de
propidium....................................................................................................................................................
Figure 8 : Proportion des kystes marqus par l'iodure de propidium avant et aprs traitement SDS..........
Figure 9 : Aspect en microscopie lectronique transmission des kystes produits partir de
trophozoites cultivs sur cellules HEp-2......................................................................................................
Figure 10 : Analyse des populations de kystes en cytomtrie aprs marquage au
calcofluor.....................................................................................................................................................
Figure 11 : Aspect des kystes en microscopie lectronique balayage.....................................................
Figure 12 : Comparaison de l 'efficacit des traitements de dcontamination sur les kystes de 4 souches
d'Acanthamoeba obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG ou sur cellules HEp-2..........................
Figure 13 : Exemples d'changes d'information gntique entre micro-organismes intra-amibiens...........
Figure 14 : Arbre phylogntique mettant en vidence les relations phylogntiques entre les gnes
codant pour la sterol delta-7 reductase chez l'amibe Naegleria gruberi et chez les bactries
intracellulaires affilies aux lgionelles et aux Chlamydiae.........................................................................
Figure 15 : Arbre phylogntique des Chlamydiales bas sur la squence codant pour l'ARN ribosomal
16S..............................................................................................................................................................
Figure 16 : infection d'Acanthamoeba castellanii par Criblamydia sequanensis.........................................
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Figure 17 : Survie extra-cellulaire des Chlamydia-like et de Chlamydia trachomatis..................................
Figure 18 : Dtection de Chlamydia trachomatis dans la souche d'Acanthamoeba sp2.............................
Figure 19 : volution du pourcentage d'amibes infectes et du nombre de bactries par amibe lors de
l'infection d'Acanthamoeba castellanii par diffrents sous-types de Mycobacterium kansasii......................
Figure 20 : Arbre phylogntique de virus reprsentatifs du groupe des NCLDV (nucleocytoplasmic
large DNA viruses)......................................................................................................................................
Figure 21 : Observation de Lausannevirus en coloration de Gimenez........................................................
Figure 22 : Observation de Lausannevirus en microscopie lectronique transmission............................
Figure 23 : droulement du cycle d'infection d'Acanthamoeba castellanii par Lausannevirus.....................
Figure 24 : Nuage de points construit partir de l'emplacement dans le gnome des protines
orthologues entre Lausannevirus et Marseillevirus......................................................................................
Figure 25 : Phylognie et rpartition des motifs d'histones trouvs chez Lausannevirus et Marseillevirus..
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Liste des Tables
Table 1 : Rpartition des isolats amibiens retrouvs aux diffrentes tapes de potabilisation....................
Table 2 : Effet des traitements de dcontamination base de gluataraldhyde sur les trophozoites
amibiens.....................................................................................................................................................
Table 3 : Effet de diffrents traitements de dcontamination sur les kystes amibiens................................
Table 4 : Pathologies associes aux nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia.........
Table 5 : Efficacit de l'infection de diffrentes souches d'Acanthamoeba par les Chlamydia-like.............
Table 6 : Efficacit des traitements de dsinfection sur les Chlamydia-like................................................
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Abrviations
ADN : Acide dsoxyribonuclique
ARNr : Acide ribonuclique ribosomique
ATCC : American Type Culture Collection
EPA : US Environmental Protection Agency
GFP : Green Fluorescent Protein
IP : iodure de propidium
MALDI-TOF MS : Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation time-of-flight mass spectrometry
NCLDV : nucleocytoplasmic large DNA viruses
NNA : Non-Nutrient Agar (agar non-nutritif utilis pour la culture des amibes sur Escherichia coli)
NTM : non-tuberculous mycobacteria
PCR : Polymerase Chain Reaction
PYG : Proteose peptone, Yeast extract, Glucose (milieu utilis pour la culture axnique des amibes du
genre Acanthamoeba)
SDS : sodium dodecyl sulfate
VIH : virus de l'immunodeficience humaine
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Chapitre 1 : Introduction
1.1- Curriculum vitae
1.1.1- tat civil
Nom et prnom : THOMAS, Vincent
Date et lieu de naissance : 23 mai 1973 Paris, 14me arrondissement
Nationalit : Franais
1.1.2- Adresse professionnelle
Laboratoire de Recherche de la socit STERIS SA
Commissariat lnergie Atomique (CEA)
18, route du Panorama - 92265 Fontenay-aux-Roses FRANCE
E-mails : vincent_thomas@steris.com (professionnel) ; vincethom2009@yahoo.fr (personnel)
Tlphone : +33 1 46 54 85 57 (fixe), +33 6 75 74 00 16 (portable)
1.1.3- Titres universitaires
2000-2004 : Thse de doctorat en cologie Microbienne, Facult de Pharmacie, Universit Paris
11
Sujet : cologie de Legionella pneumophila dans les rseaux de distribution deau potable
Interactions biofilms/amibes valuation de lefficacit des traitements biocides.
Travail sous forme de convention CIFRE entre le Laboratoire de Sant Publique Environnement
de la Facult de Pharmacie (P
r
Yves Levi) et le Centre International de Recherche sur lEau et
lEnvironnement du Groupe SUEZ (CIRSEE, Le Pecq).
Diplm avec mention du Jury.
Manuscrit tlchargeable l'adresse suivante : http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00116971
1997-1998 : Diplme dtudes Approfondies en cologie Microbienne, Pathogense et
Antibiothrapie, Facult de Pharmacie, Universit Paris 11
Sujet : tude dune flore de barrire Clostridium difficile.
Travail collaboratif entre le Dpartement de Microbiologie de la Facult (P
r
Pierre Bourlioux) et
lINRA de Jouy-en-Josas (D
r
Jol Dor).
1991-1997 : Docteur en Pharmacie, Facult de Pharmacie, Universit Paris 11. Filire Industrie,
certificats de spcialisation en Bactriologie et Virologie.
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1.1.4- Parcours professionnel
Depuis Mai 2006 : Responsable R&D, employ par la socit STERIS pour dvelopper et diriger un
laboratoire de recherche en microbiologie hberg dans les locaux du CEA de Fontenay-aux-Roses.
Responsable de cinq employs : un chercheur, deux techniciens et deux tudiants en thse.
En charge de la coordination de plusieurs projets de recherche pour ltude de pathognes
mergents et ltude de lefficacit des traitements biocides des vis--vis de nombreuses
espces/souches de bactries, de protozoaires, de virus et de prions.
Collaborations avec des laboratoires de R&D publics et privs en Europe et aux tats-Unis.
Reprsentant scientifique de la socit STERIS dans divers congrs internationaux de
microbiologie.
Mai 2004 - Avril 2006 : Post-doctorat dans le laboratoire de Recherche sur les Bactries
Intracellulaires, Institut de Microbiologie, Centre Hospitalier Universitaire de Lausanne, Suisse (D
r
Gilbert Greub). tude de lcologie des amibes et de leurs htes intracellulaires : lgionelles,
mycobactries, chlamydia, nouveaux virus Installation du laboratoire, prise en charge de plusieurs
projets de recherche en vue dune publication rapide de rsultats. Formation de plusieurs tudiants et
techniciens. Rdaction de demandes de financement et de rapports dactivit.
Novembre 1998 - Dcembre 1999 : Assistant de Recherche, Facult de Pharmacie, Universit Paris
11. Dveloppement doutils molculaires (PCR, sondes spcifiques de dtection) pour ltude du
devenir in vivo de ferments lactiques. Projet men au sein du Dpartement de Microbiologie (P
r
Pierre
Bourlioux), en collaboration avec la compagnie Danone.
1.1.5- Activits lies l'administration
Reprsentant de la socit STERIS au Conseil dAdministration de la Fondation de Recherche
Alliance Biosecure (www.fondation-alliance-biosecure.org). Fondation reconnue dutilit publique qui lance
une deux fois par an des appels projets dans le domaine de la comprhension et de la matrise du risque
infectieux dans les produits biologiques. Participation la vie de la Fondation : dfinition des objectifs,
budgets, appels doffre, suivi des projets financs
1.1.6- Activits lies la recherche
Coordinateur du projet Plateforme Globale de Dcontamination labellis par le ple de
comptitivit Medicen Rgion Ile-de-France : rdaction et prsentation du projet devant les membres
du ple, coordination et suivi du projet (2007-2010). Ce projet dot dune subvention de 3,5 millions
dEuros a fait intervenir plusieurs quipes de R&D publiques (INRA, CEA, AP-HP, INSERM) et
prives (STERIS, LFB, Texcell, Genethon, Hutchinson Sant) .
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Participation des Comits de Pilotage de Thse :
Thse de M
elle
Emilie Fouque lUniversit de Poitiers (quipe P
r
Yann Hchard, dmarrage en
novembre 2010) : Mise au point dune stratgie innovante de matrise des amibes dans les
biofilms
Thse de M
r
Arnaud Bridier ralise lINRA de Massy (quipe D
r
Romain Briandet, 2008 - 2011) :
tude de la formation de biofilms et de laction de traitements biocides sur ces biofilms
Plus de 25 articles de recherche reviews pour des revues internationales avec comit de lecture
depuis 2008. Reviewing de projets de R&D en rponse diffrents appels doffre.
Organisation avec la Fondation Alliance Biosecure dun colloque Risques infectieux mergents lis
aux biotechnologies : Principe de prcaution et Innovation qui sest tenu en juin 2010 au Ministre
de la Sant.
Participation des conseils scientifiques : CS du Colloque Rseau National Biofilm 2011.
Nombreuses collaborations internationales en cours.
1.1.7- Encadrement scientifique
Encadrement ( 75%) de la Thse de M
elle
Cline Coulon ralise doctobre 2007 mars 2011 sous
forme de convention CIFRE entre STERIS et la Facult de Pharmacie (P
r
Anne Collignon). Titre :
Amibes libres de lenvironnement : Rsistance aux traitements de dsinfection et interactions avec
les Chlamydiales . Thse soutenue en avril 2011 avec la mention Trs Honorable et proposition un
prix de Thse. Trois articles publis dans Journal of Clinical Microbiology , Journal of Eukaryotic
Microbiology et FEMS Immunology and Medical Microbiology . Ces travaux ont aussi donn lieu
la prsentation de cinq posters et une communication orale dans des congrs internationaux. Le
manuscrit de la thse est tlchargeable l'adresse suivante : http://www.theses.fr/2011PA114806#
Co-encadrement ( 25%) de la Thse de M
me
Anglique Egalon dbute en mars 2010 sous forme de
convention CIFRE entre STERIS et le CEA de Fontenay-aux-Roses (D
r
Jean-Philippe Deslys), en
partenariat avec l'INRA de Jouy-en-Josas (D
r
Human Rezaei). Titre de la Thse : tude des
mcanismes sous-tendant linactivation des prions et application aux autres protines impliques dans
les pathologies amylodes . Pas de publications ni de posters pour le moment.
Encadrement ( 100%) du stage de Matrise de M
elle
Hedia Arfaoui (2006-2007, Universit Paris 7
Denis Diderot). Titre du mmoire : Dcontamination du matriel mdical: efficacit du traitement au
peroxyde dhydrogne gazeux VHP STERIS . Ce travail a donn lieu la prsentation dun poster au
congrs de la Socit Amricaine de Microbiologie (ASM) Boston en 2008.
Encadrement ( 75%) du stage BN Forschung de M
me
Katia Herrera-Rimann (2005, Institut de
Microbiologie de lhpital de Lausanne, Suisse). Thme de recherche : Interactions amibes-espces
bactriennes rsistantes aux amibes. Ce travail a donn lieu la publication dun article dans
Applied and Environmental Microbiology en 2006.
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1.2- Liste des publications
1.2.1- Revues comit de lecture
Liens internet sur le document lectronique: cliquer sur les caractres bleus pour avoir accs au
rsum de la publication correspondante, sur les caractres rouges pour avoir accs l'article au format pdf
(articles en libre accs). Les publications pour lesquelles les copies figurent en annexe de ce mmoire sont
indiques par la mention Publication en annexe.
Publications lies aux travaux de DEA
1. Thomas, V., V. Rochet, H. Boureau, C. Ekstrand, S. Bulteau, J. Dore, A. Collignon, and P. Bourlioux. 2002.
Molecular characterization and spatial analysis of a simplified gut microbiota displaying colonization resistance
against Clostridium difficile. Microb Ecol Health Dis 14:203-210
Publications lies aux travaux de thse
2. Thomas, V., T. Bouchez, V. Nicolas, S. Robert, J. F. Loret, and Y. Lvi. 2004. Amoebae in domestic water
systems: resistance to disinfection treatments and implication in Legionella persistence. J Appl Microbiol 97:950-
963. Publication en annexe
3. Loret, J., S. Robert, V. Thomas, A. J. Cooper, W. F. McCoy, and Y. Lvi. 2005. Comparison of disinfectants for
biofilm, protozoa and legionella control. Journal of Water and Health:423-433
Publications lies aux travaux de post-doctorat
4. Thomas, V., N. Casson, and G. Greub. 2006. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated
from Seine river water using amoebal co-culture. Environmental Microbiology 8:2125-2135. Publication en
annexe
5. Thomas, V., K. Herrera-Rimann, D. S. Blanc, and G. Greub. 2006. Biodiversity of amoebae and amoebae-
resisting bacteria in a hospital water network. Applied and Environmental Microbiology 72:24282438.
Publication en annexe
6. Goy, G., V. Thomas, K. Rimann, K. Jaton, G. Prod'hom, and G. Greub. 2007. The Neff-strain of Acanthamoeba
castellanii, a tool to test the virulence of Mycobacterium kansasii. Research in Microbiology 158:393-397.
Publication en annexe
7. Corsaro, D., V. Thomas, G. Goy, D. Venditti, R. Radek, and G. Greub. 2007. ' Candidatus Rhabdochlamydia
crassificans', an intracellular bacterial pathogen of the cockroach Blatta orientalis (Insecta: Blattodea). Syst Appl
Microbiol 30:221-228
8. Baud, D., V. Thomas, A. Arafa, L. Regan, and G. Greub. 2007. Waddlia chondrophila, a potential agent of human
fetal death. Emerg Infect Dis 13:1239-43. Publication en annexe
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9. Thomas, V., N. Casson, and G. Greub. 2007. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources
by amoebal co-culture. Syst Appl Microbiol 30:572-9
10. Loret, J. F., M. Jousset, S. Robert, G. Saucedo, F. Ribas, V. Thomas, and G. Greub. 2008. Amoebae-resisting
bacteria in drinking water: risk assessment and management. Water Sci Technol 58:571-577
11. Thomas, V., J. F. Loret, M. Jousset, and G. Greub. 2008. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting
bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology 10:2728-2745. Publication en annexe
Publications lies aux travaux mens depuis 2006
12. Thomas, V., and G. McDonnell. 2007. Relationship between mycobacteria and amoebae: ecological and
epidemiological concerns. Lett Appl Microbiol 45:349-57. Publication en annexe
13. Eterpi, M., G. McDonnell, and V. Thomas. 2009. Disinfection efficacy against parvoviruses in comparison to
reference viruses. Journal of Hospital Infection 73:64-70
14. Eterpi, M., G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Decontamination efficacy against Mycoplasma. Letters in
Applied Microbiology 52:150155
15. Eterpi, M., G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Virucidal activity of disinfectants against parvoviruses and
reference viruses. Applied Biosafety: Journal of the American Biological Safety Association 15:165-171
16. Coulon, C., A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Resistance of Acanthamoeba cysts to disinfection
treatments used in health care settings. Journal of Clinical Microbiology 48:2689-97. Publication en annexe
17. Thomas, V., G. McDonnell, S. P. Denyer, and J.-Y. Maillard. 2010. Free-living amoebae and their intracellular
pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiology Reviews 34:231-259. Publication en
annexe
18. Thomas, V., and G. Greub. 2010. Amoebae/amoebal symbionts genetic transfers: lessons from giant viruses
neighbours. Intervirology 53:254-267. Publication en annexe
19. Bridier, A., F. Dubois-Brissonnet, A. Boubetra, V. Thomas, and R. Briandet. 2010. The biofilm architecture of sixty
opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. Journal of Microbiological Methods
82:64-70
20. Bridier, A., D. Le Coq, F. Dubois-Brissonnet, V. Thomas, S. Aymerich, and R. Briandet. 2011. The spatial
architecture of Bacillus subtilis biofilms deciphered using a surface-associated model and in situ imaging. PLoS
ONE 6:e16177
21. Bridier, A., E. Tischenko, F. Dubois-Brissonnet, J. M. Herry, V. Thomas, F. Daddi-Oubekka, F. Waharte, K.
Steenkeste, M. P. Fontaine-Aupart, and R. Briandet. 2011. Deciphering biofilms structure and reactivity by
multiscale time-resolved fluorescence analysis. Advances in Experimental Medicine and Biology 715:333-49
22. Bridier, A., F. Dubois-Brissonnet, G. Greub, V. Thomas, and R. Briandet. 2011. Dynamics of the action of
biocides in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 55:2648-54
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23. Bridier, A., R. Briandet, V. Thomas, and F. Dubois-Brissonnet. 2011. Comparative biocidal activity of peracetic
acid, benzalkonium chloride and ortho- phthalaldehyde on 77 bacterial strains. Journal of Hospital Infection
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24. Bridier, A., R. Briandet, V. Thomas, and F. Dubois-Brissonnet. 2011. Resistance of bacterial biofilms to
disinfectants: a review Biofouling 27:1017-32
25. Thomas, V., C. Bertelli, F. Collyn, N. Casson, A. Telenti, A. Goesmann, A. Croxatto, and G. Greub. 2011.
Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environmental Microbiology 13:1454-56.
Publication en annexe
26. Coulon, C., M. Eterpi, G. Greub, A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2012. Amoebal host-range, host-
free survival and disinfection susceptibility of environmental Chlamydiae as compared to Chlamydia trachomatis.
FEMS Immunology and Medical Microbiology - Accepted article - doi: 10.1111/j.1574-695X.2011.00919.x.
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27. Coulon, C., N. Deschamps, T. Meylheuc, A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2012. The effect of in vitro
growth conditions on the resistance of Acanthamoeba cysts. Journal of Eukaryotic Microbiology In Press.
Publication en annexe
28. Fouque, E., M.-C. Trouilh, V. Thomas, P. Hartemann, M.-H. Rodier, and Y. Hchard. 2012. Cellular and
molecular changes during encystment of free-living amoebae. Eukaryotic Cell - In Press.
1.2.2- Chapitres de livres
1. Thomas, V. 2012. Sensitivity and resistance of protozoa to biocides. In A. Fraise, Lambert, PA and Maillard, J-Y
(ed.), Principles and Practice of Disinfection, Preservation and Sterilization - 5th edition - In Press
2. Thomas, V. 2012. Ecology and diversity of amoebal symbionts and amoebal pathogens. In G. Greub (ed.),
Free-living amoebae: an evolutionary crib for emerging pathogens In Press
1.2.3- Confrences dans des congrs
1. Thomas, V. 2006. La mesure et la prdiction de la virulence. Presented at the Colloque Ecomicth : "Lgionelles
et lgionellose : Avances effectives et questions sensibles", Paris, France, 27 Octobre.
2. Thomas, V., and J. Mills. 2008. Amsco V-ProTM 1 A new low temperature sterilization system by STERIS.
Presented at the 30rd CEFH meeting, Nantes, France, 8 April.
3. Thomas, V. 2011. La strilisation la vapeur sche H2O2. Presented at the 6me Forum du Dpartement
Gnie Biomdical de lEcole Suprieure dIngnieurs de Luminy Marseille, France, 30 November.
4. Thomas, V. 2011. A review of new sterilization technologies. Presented at the XIXth CEDEST Meeting Albacete,
Spain, 11-13 May.
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5. Thomas, V. 2011. Dveloppement et valuation de traitements biocides actifs contre les biofilms. Presented at
the Colloque Adebiotech / Rseau National Biofilms: Gestion des biofilms, enjeux industriels, Romainville,
France, 13 October.
6. Thomas, V. 2011. Amibes libres et pathognes intra-amibiens : le risque ne se limite pas aux lgionelles.
Presented at the Colloque de l'Association Scientifique Europenne pour l'Eau et la Sant, Paris, France, 18
November.
7. De Broglie, V., and V. Thomas. 2011. Enhancing precompetitive research to increase safety of biological
products in the field of emerging pathogens. Presented at the Ensuring Adventitious Agents Safety In Biologics,
Munich, Germany, 18-19 October.
8. Coulon, C., A. Collignon, G. McDonnell, and V. Thomas. 2010. Resistance of amoebal cysts and trophozoites to
disinfection treatments commonly used in healthcare settings. Presented at the ICAR 2010 meeting, Valladolid,
Spain, 3-5 November.
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Chapitre 2 : Contexte de nos travaux
La matrise du risque infectieux au sein de diffrents environnements (hpitaux, industrie
agroalimentaire) passe par une meilleure comprhension des diffrents cosystmes microbiologiques en
place dans ces environnements. Ces deux dernires dcennies ont ainsi vu merg le concept de biofilm,
communaut microbienne complexe constitue de multiples espces bactriennes interagissant entre elles
(interactions mtaboliques, changes gntiques) et avec leur environnement. Ltude de ces biofilms a
clairement mis en vidence leur importance dans un grand nombre de problmatiques ayant trait au risque
infectieux : protection de micro-organismes pathognes vis--vis de traitements biocides, barrire biologique
empchant limplantation de flores pathognes Les biofilms rencontrs dans lenvironnement sont
complexes, composs de multiples espces bactriennes mais aussi de virus (phages) et de micro-
organismes eucaryotes. Une meilleure matrise de la composition de ces biofilms, et notamment de leur
colonisation par des micro-organismes pathognes, passe obligatoirement par une meilleure comprhension
de lcologie de ces biofilms et de limpact des activits humaines (traitements biocides, pollutions) sur leur
composition. Des travaux de plus en plus nombreux montrent que les amibes libres de lenvironnement
jouent un rle central dans l'cologie de l'cosystme biofilm. Ce sont des micro-organismes eucaryotes
unicellulaires dont les anctres sont apparus avant les organismes pluricellulaires. Elles sont ubiquitaires, se
nourrissant de bactries quelles broutent la surface des biofilms (Fig. 1), et rgulent ainsi de manire
importante les populations bactriennes de ces biofilms (47). Cependant de nombreuses espces
bactriennes (mais aussi eucaryotes et virales) ont dvelopp la capacit de rsister ces phagocytes
professionnels et peuvent tirer bnfice de l'interaction avec les amibes en rsistant la digestion
intracellulaire et/ou en prolifrant de manire importante dans le trophozoite amibien (cellule en tat de
croissance active). Or les mcanismes permettant la rsistance la digestion par les amibes sont
frquemment similaires ceux permettant aux micro-organismes infectieux de rsister la digestion par les
macrophages ; la consquence en est que les espces bactriennes qui ont dvelopp des mcanismes de
rsistance la digestion par les amibes au cours de leur volution sont aussi potentiellement pathognes
pour les organismes suprieurs, dont l'homme et les animaux. Ces similarits entre les mcanismes de
virulence vis--vis des amibes et des eucaryotes suprieurs ont t largement dmontres pour l'espce
bactrienne Legionella pneumophila (22) mais aussi pour Mycobacterium avium (23) et plus rcemment
pour Salmonella enterica Typhimurium (72). Par ailleurs, parmi plus de 500 espces bactriennes
pathognes pour l'homme et les animaux recenses par lagence amricaine de protection de
lenvironnement (EPA), une revue exhaustive de la littrature nous a permis de dmontrer quau moins 20%
sont capables de rsister aux amibes ((96), publication en annexe). Une fois lintrieur des amibes les
bactries sont protges vis--vis de laction de traitements biocides utiliss dans les rseaux d'eau potable
(chlore) qui sont peu efficaces vis--vis des trophozoites amibiens, et peuvent ventuellement se multiplier
en grand nombre dans la cellule infecte (90). A titre d'exemple une amibe infecte par une lgionelle peut
librer plus de 10
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nouvelles bactries en quelques heures (18). Les amibes constituent donc une niche
cologique dans laquelle des bactries potentiellement pathognes peuvent survivre, se multiplier, mais
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aussi changer des informations gntiques : l'analyse des gnomes de micro-organismes capables de
survivre dans les amibes dmontre clairement l'existence de ces changes gntiques entre bactries
intracellulaires ainsi qu'avec l'hte amibien et avec certains types de virus capables d'infecter les amibes (59,
75, 92). Un degr supplmentaire de protection des micro-organismes intra-amibiens vis--vis des
traitements biocides est apport par la capacit de certaines de ces espces bactriennes survivre dans
les kystes amibiens. Ces kystes sont les formes de dormance dans lesquelles se diffrencient les amibes en
raction diffrents stress, leur paroi contient notamment de la cellulose et ils sont extrmement rsistants
aux tempratures leves, la dessiccation et diffrents types de traitements biocides (26, 96). En plus de
nombreuses espces responsables dinfections nosocomiales (Legionella, mycobactries, Pseudomonas
aeruginosa, Staphylococcus aureus), de nombreuses espces bactriennes pathognes de premire
importance dans le domaine des industries agro-alimentaires sont concernes par ces interactions avec les
amibes (87, 96) :
Survie dans les trophozoites pour diffrentes espces de Listeria (contest), diffrentes espces
dAeromonas, Coxiella burnetii et Helicobacter pylori ;
Survie et croissance dans les trophozoites pour Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Escherichia
coli O157H7, Francisella philomiragia, Rhodococcus equi, Salmonella typhimurium ;
Survie et croissance dans les trophozoites ainsi que survie dans les kystes pour Mycobacterium
avium subspecies paratuberculosis (ainsi que la plupart des autres espces de mycobactries),
Francisella tularensis, Shigella sonnei et Shigella dysenteriae.
De nouvelles espces bactriennes considres comme pathognes mergents sont aussi capables
de se multiplier en grand nombre dans les amibes : cest le cas notamment de nouvelles espces
environnementales de Chlamydiales regroupes sous le terme Chlamydia-like qui sont aujourdhui
considres comme responsables probables de pneumonies dtiologie inconnue et davortements
spontans chez lhomme ainsi que d'avortements chez les bovins (9, 12, 55).
Les amibes rsistent aux traitements mis en uvre pour la potabilisation de leau (94) et sont donc
retrouves dans la plupart des rseaux deau domestique ou industrielle. Elles ont t isoles de plus de
90% des rseaux d'eau d'habitations (82), ainsi que des rseaux d'eau hospitaliers (93), de tours aro-
rfrigrantes (67) Elles ont aussi t dtectes dans des levages de volaille (8), dans des rfrigrateurs
(100), sur des surfaces de travail d'abattoirs (98), dans des sols potentiellement utiliss pour le pturage
(amibes infectes par Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis) (102) Il est donc de plus en plus
vident que les amibes constituent les Chevaux de Troie du monde microbien, permettant la slection, la
dissmination et la prolifration d'espces bactriennes pathognes via les rseaux d'eau (Fig.1).
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Figure 1: Les amibes libres, chevaux de Troie du monde microbien.
0 Les kystes (c) et les trophozoites (T) amibiens sont naturellement prsents dans les eaux de surfaces utilises pour la
production d'eau potable, O les kystes rsistent aux traitements mis en uvre pour la potabilisation de l'eau, O une fois
dans le rseau les amibes se dsenkystent et se nourrissent en ingrant les bactries des biofilms, O les bactries
rsistant la digestion par les amibes peuvent ventuellement se multiplier dans les trophozoites et changer des
informations gntiques entre elles et avec l'hte, O des quantits importantes de bactries ainsi que des vsicules
remplies de bactries sont libres partir des amibes infectes, O en cas de stress environnemental les trophozoites
peuvent former des kystes dans lesquels certaines espces bactriennes peuvent survivre (dmontr pour les
lgionelles, les mycobactries, Vibrio cholerae et Francisella), 6 l'eau contamine peut servir de vecteur d'infection pour
l'homme et l'animal par O inhalation ou ingestion de bactries libres, d'amibes infectes ou de vsicules charges de
bactries, ou O par contamination de surfaces ou de sols qui contamineront par la suite l'homme et les animaux G.
Illustration du biofilm adapte de Center for Biofilm Engineering, MSU-Bozeman 1996.
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Plan de prsentation de nos travaux de recherche
Afin de permettre une comprhension plus aise par le lecteur ces travaux ne sont pas repris dans
leur ordre chronologique de publication. Dans un premier temps nous reprenons dans le chapitre 3 le
cheminement dcrit dans la Figure 1 : tude environnementale de la diversit des amibes et des bactries
rsistantes aux amibes depuis la source servant la production d'eau potable jusqu'au point d'usage dans
les rseaux, et rsistance des kystes amibiens aux traitements de dsinfection mis en uvre dans ces
systmes. Dans le chapitre 4, nous dcrivons plus prcisment les interactions des amibes avec de
nouveaux microorganismes pathognes potentiels isols lors de nos tudes environnementales : nouvelles
espces de Chlamydiae, mycobactries et nouveau virus.
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Chapitre 3 : cologie amibienne et rsistance des
amibes la dsinfection
3.1- cologie et diversit des amibes et des bactries rsistantes aux
amibes dans les rseaux d'eau : de la source au point d'usage
Durant notre post-doctorat ralis au sein de l'Institut de Microbiologie de l'Hpital de Lausanne, en
Suisse, nous avons tudi l'cologie et la diversit des amibes dans diffrents types d'environnements, ainsi
que leurs interactions avec diffrents types de micro-organismes. Nous avons adapt (34) une mthode de
co-culture amibienne consistant ensemencer des chantillons environnementaux (eau filtre sur
membrane, biofilms) sur des amibes provenant de l'American Type Culture Collection (souche
Acanthamoeba castellanii ATCC 30010), et surveiller la prolifration ventuelle de micro-organismes dans
les amibes inocules l'aide de diffrents outils (colorations non spcifiques, coloration de Ziehl pour les
mycobactries, PCR spcifiques de lgionelles ou de Chlamydiae...) (Fig. 2). En cas de dtection de micro-
organismes dans les co-cultures amibiennes, diffrentes stratgies taient mises en uvre pour isoler et
purifier les micro-organismes : culture sur milieux spcifiques des mycobactries, culture sur milieux
spcifiques des lgionelles, r-ensemencement en dilution limite sur A. castellanii ATCC 30010 L'objectif
tait d'isoler de nouvelles espces bactriennes non dtectes par culture sur les milieux classiques :
intracellulaires stricts non cultivables ou intracellulaires facultatifs qui, mmes s'ils sont cultivables, sont
normalement masqus par la flore majoritaire. L'intrt de la mthode est donc double : limination de la
flore majoritaire non pathogne qui est phagocyte et digre par les amibes, et slection de micro-
organismes dont la capacit rsister la digestion et survivre dans les amibes pourrait ventuellement
indiquer une pathognicit pour l'homme et/ou l'animal. La mthode a t applique deux types
d'environnements particulirement critiques : usine de production d'eau potable partir de l'eau de Seine et
eau du rseau de lhpital de Lausanne. Dans les deux cas les chantillons d'eau et de biofilms taient
ensemencs sur la souche d'amibe A. castellanii ATCC 30010 et une recherche d'amibes indignes
naturellement prsentes dans les chantillons tait ralise sur ces mmes chantillons afin de mieux
prciser l'tendue de la colonisation et de la diversit amibienne dans ces environnements. Les bactries et
les amibes taient identifies par PCR et squenage avec des amorces ciblant l'ARNr 16S et l'ARNr 18S,
respectivement.
Figure 2 (page suivante) : Mthode de co-culture amibienne utilise lors de nos diffrentes tudes environnementales.
Les chantillons taient traits afin :
(1) d'isoler les amibes indignes naturellement prsentes dans les chantillons par ensemencement des
chantillons concentrs sur gloses non-nutritives + Es coli et repiquages successifs des amibes dtectes,
(2) d'isoler les micro-organismes rsistants aux amibes par ensemencement des chantillons concentrs et
dcontamins (pH acide, pH basique, traitement la chaleur) sur la souche d'Acanthamoeba castellanii ATCC
30010.
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3.1.1- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans une usine
de production d'eau potable
Rfrence (94), publication en annexe
Les tudes ralises sur l'usine de production d'eau potable ont consist appliquer les mthodes de
co-culture amibienne et d'isolement des amibes indignes sur des chantillons d'eau et de biofilms prlevs
diffrentes tapes du procd de potabilisation (Fig. 3).
Figure 3 : Lieux de prlvements d'chantillons pour analyse de la flore amibienne et des micro-organismes rsistants
aux amibes dans une usine de potabilisation d'eau de rivire.
0 eau de rivire, O biofilm dpos sur le sable utilis pour la premire tape de filtration, O eau filtre sur sable, O eau
traite par ozonation, O biofilm dpos sur les granules de charbon actif, O eau filtre sur charbon actif, 6 eau chlore,
O eau en sortie d'usine et O eau potable prleve en diffrents points du rseau.
Ces travaux, raliss en partenariat avec SUEZ et l'Institut de Microbiologie de Lausanne, avaient
pour objectif de dterminer si les usines qui produisent l'eau potable partir d'eau de rivire sont colonises
par les amibes, si oui quel niveau prfrentiel du processus de potabilisation et si les amibes sont
finalement relargues dans l'eau potable. La recherche de pathognes par co-culture avait pour objectif
d'tudier la distribution de nouvelles espces microbiennes ventuellement pathognes dans l'usine afin de
permettre une meilleure connaissance de leur cologie, et donc une meilleure gestion du risque ventuel.
Cinquante isolats amibiens indignes ont t cultivs, principalement partir de l'eau de rivire (19 isolats)
mais aussi partir des biofilms dvelopps sur le lit de sable (tape 2, 15 isolats) (Fig. 4). Quatorze isolats
ont t retrouvs aprs l'tape de filtration sur sable : 3 dans l'eau filtre sur sable (tape 3), 3 aprs l'tape
d'ozonation (tape 4), 6 sur le biofilm dpos sur les granules de charbon actif (tape 5) et 2 dans l'eau
filtre sur charbon (tape 6). De manire intressante la diversit amibienne changeait dans l'usine : alors
que des amibes appartenant principalement aux genres Acanthamoeba, Naegleria et Vannella taient
principalement retrouves dans la rivire et dans le biofilm sur sable (Table 1), on retrouvait ensuite
principalement des Hartmannella et des Echinamoeba dans l'usine. Ces deux genres taient aussi prsents
dans l'eau de rivire mais de faon minoritaire ; leur prvalence dans l'usine suggre que le processus de
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potabilisation slectionne prfrentiellement les amibes appartenant ces genres (amibes de petite taille,
souvent thermo-rsistantes). Aucune amibe n'a t retrouve en sortie d'usine mais cela est sans doute d
aux faibles volumes d'eau et de biofilms prlevs plutt qu' une efficacit relle de la chloration sur les
amibes car plusieurs tudes rapportent une efficacit limite du chlore sur les kystes amibiens (96).
Concernant les bactries, quatre souches de bactries ont t retrouves partir des amibes indignes, dont
une mycobactrie (M. mucogenicum) cultive partir d'une souche d'amibe (Echinamoeba) retrouve dans
l'eau traite l'ozone. La co-culture des chantillons d'eau et de biofilm avec l'amibe A. castellanii ATCC
30010 a permis d'identifier 27 mycobactries (dont 8 dans l'usine aprs filtration sur sable) et 65 isolats
bactriens appartenant diffrentes classes (dont 21 dans l'usine aprs filtration sur sable). Parmi ces 65
isolats figuraient notamment des lgionelles ainsi que deux espces de Chlamydiae environnementales (cf
Chlamydiae plus loin): l'espce dj dcrite Parachlamydia acanthamoebae (retrouve partir de l'eau
de rivire et du biofilm sur charbon actif) et le premier reprsentant d'un nouveau genre de Chlamydiales :
Criblamydia sequanensis (isole partir de l'eau de rivire). Nous avons aussi dtect la prsence de petites
particules colores en coloration de Gimenez dans une des co-cultures ralises partir de l'eau de rivire.
Aucun ADN bactrien ne pouvait tre amplifi l'aide d'amorces universelles 16S ; ces particules se sont
rvles tre un nouveau virus d'amibe que nous avons dcrit par la suite (cf Lausannevirus plus loin).
Ces travaux ont donc clairement dmontr la prsence d'amibes et de bactries capables de crotre dans les
amibes dans l'usine de potabilisation, surtout dans les chantillons de biofilms prlevs sur le filtre sable et
sur le filtre charbon actif. Ces travaux, publis en 2008 (94) ont permis SUEZ de proposer une
optimisation des procdures de rtro-lavage de ces filtres, ceci afin de rduire la colonisation par les biofilms,
les amibes et les bactries potentiellement pathognes associes ces amibes. Par ailleurs ces travaux
s'inscrivent dans des tudes visant promouvoir l'utilisation de membranes d'ultrafiltration en sortie d'usine
afin d'viter le relargage de micro-organismes dans les rseaux de distribution.
Figure 4 : Diversit morphologique
des amibes retrouves aux
diffrentes tapes de
potabilisation.
Amibes affilies aux genres
Playtamoeba (A), Acanthamoeba
(B, D et K), Vanella (C), Glaeseria
(E), Hartmannella (F et I),
Naegleria (G et H) et
Echinamoeba (J) sur la base du
squenage partiel du gne
codant pour l'ARNr 18S.
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Table 1 : Rpartition des isolats amibiens retrouvs aux
diffrentes tapes de potabilisation.
Les isolats indiqus par les flches verte (Echinamoeba
exundans) et rouge (Hartmannella vermiformis) prsentaient des
squences d'ARNr18S identiques, suggrant qu'il pourrait s'agir
de la mme souche retrouve tout le long du procd de
potabilisation.
3.1.2- Publication : Biodiversit des amibes et des bactries rsistantes aux amibes dans un rseau
d'eau hospitalier
Rfrence (93), publication en annexe
Une tude semblable (et antrieure) celle dcrite ci-dessus a t entreprise l'hpital universitaire
de Lausanne. Il s'agissait l aussi de prlever de l'eau et des biofilms dans diffrents services (ranimation,
chirurgie...) et d'tudier la prvalence des amibes et la prsence de nouvelles espces bactriennes
rsistantes aux amibes. L'tiologie des infections acquises l'hpital n'tant pas toujours connue, nous
suspections que de nouveaux agents infectieux difficiles cultiver pourraient tre responsables d'une part de
ces infections, notamment des pneumonies. La co-culture amibienne pourrait tre un bon moyen de dtecter
ces nouveaux agents infectieux et c'est donc avec cet objectif que ces travaux ont t initis. Sur 200
chantillons analyss au cours de cette tude 13 ont t retrouvs coloniss par deux souches diffrentes de
l'amibe Hartmannella vermiformis (dont une thermorsistante capable de croitre 44C, et l'autre prsentant
un intron dans la squence codant pour l'ARNr18S), 1 par une souche d'Acanthamoeba polyphaga et 1 par
une nouvelle espce amibienne non clairement identifie. Une souche indigne d' H. vermiformis tait
colonise par L. pneumophila. Par ailleurs la co-culture des 200 chantillons avec la souche d'amibe A.
castellanii ATCC 30010 a permis l'amplification sur glose de 125 isolats bactriens (42,3% des chantillons
d'eau, 52,4% des biofilms prlevs sur les pommeaux de douches, 45,1% des biofilms prlevs sur les
robinets d'eau). En particulier, 43 isolats de mycobactries ont t identifis (espce peu pathogne
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Mycobacterium gordonae majoritairement, mais aussi espces pathognes Mycobacterium kansasii et
Mycobacterium xenopi), ainsi que 11 isolats de lgionelles (espce pathogne Legionella anisa
majoritairement, ainsi que L. pneumophila). Les chantillons positifs pour des amibes indignes taient
statistiquement plus frquemment coloniss par des lgionelles, ce qui avait dj t rapport dans la
littrature, mais aussi par des mycobactries, dmontrant pour la premire fois une association cologique
mycobactries-amibes. Ce dernier point tait important souligner lheure o les infections
mycobactries atypiques (ou mycobactries croissance rapide) sont de plus en plus frquemment
rapportes, avec une rsistance gnralement leve de ces mycobactries aux traitements antibiotiques
ainsi qu certains types de biocides. Par ailleurs nous avons aussi isol de nouvelles espces bactriennes.
Parmi elles une espce d'Alphaprotobactrie appartenant au genre Rhodoplanes a t retrouve dans 23
chantillons, suggrant une colonisation importante du rseau d'eau de l'hpital. Il est noter qu'une souche
de Rhodoplanes phylogntiquement proche de celle isole dans notre tude a t rcemment implique
pour la premire fois dans une infection fatale chez l'homme (105). Les autres souches isoles par co-culture
amibienne comprenaient deux souches de Pseudomonas aeruginosa ainsi que de nombreuses
Alphaprotobactries. Ces travaux publis en 2006 (93) sont frquemment cits dans les publications ayant
trait la thmatique de la contamination amibienne des rseaux et aux relations mycobactries-amibes, ils
ont contribu une meilleure connaissance de cette problmatique.
3.2- Rsistance des amibes aux traitements de dsinfection mis en
uvre dans les rseaux
Sachant que les amibes sont prsentes dans les rseaux de distribution d'eau, la question se pose de
savoir comment contrler le risque infectieux potentiel caus par les amibes et les bactries associes. Dans
cette partie nous exposons plusieurs tudes entreprises afin de contribuer rpondre cette question. La
premire tude porte sur l'efficacit des dsinfectants utiliss en faible concentration rsiduelle ou en
traitement de choc pour traiter l'eau potable dans les rseaux. La deuxime tude porte sur l' efficacit des
biocides utiliss pour traiter des matriels et des surfaces ventuellement en contact avec l'eau du rseau :
surfaces de travail, matriels lavs dans des machines laver alimentes en eau de rseau par exemple.
Enfin la troisime tude confirme l'importance cruciale des mthodes mises en uvre pour cultiver les
trophozoites et produire des kystes amibiens, avec des sensibilits des kystes la dsinfection qui varient
normment en fonction de ces mthodes.
3.2.1- Publication : Amibes dans les rseaux domestiques : rsistance aux traitements de dsinfection
et implication dans la persistance des lgionelles
Rfrence (90), publication en annexe
Nos travaux de thse ont port sur ltude de lactivit de traitements biocides couramment utiliss
pour la matrise du risque infectieux dans leau potable. Ces traitements sont utiliss de faon relativement
empirique et leur impact rel sur les diffrentes populations bactriennes et les amibes prsentes dans les
biofilms sont peu ou mal connus. Ces travaux ont t mens en collaboration avec le centre de recherche
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sur l'eau et l'environnement (CIRSEE) de la socit SUEZ, toute particulirement concerne par la
problmatique de la colonisation des rseaux par les amibes et les lgionelles (L. pneumophila) qui
constituaient l'poque et constituent aujourd'hui encore un problme majeur de sant publique (pidmies
rptition dans plusieurs grandes villes franaises dont Paris pendant la coupe du monde de football de
1998, pidmie dans le tout nouvel hpital europen Georges Pompidou en 2000...). L'enjeu principal de
l'tude tait de dterminer si certains traitements sont plus mme de contrler la prolifration des amibes
et des lgionelles dans les rseaux, voire mme de les radiquer. Afin d'valuer l'efficacit de 6 traitements
biocides diffrents nous avons d'abord mis en place un pilote reproduisant un rseau d'eau intrieur. Ce
pilote comprenait 7 boucles parallles, avec pour chacune un bras principal en acier galvanis (circulation
d'eau en continu) et un bras mort en cuivre (eau stagnante). Le pilote a d'abord t aliment avec de l'eau de
rivire filtre sur sable, progressivement remplace par de l'eau du rseau pour permettre la colonisation par
une flore microbienne reprsentative. Des systmes de coupons amovibles et de cartouches de billes de
verre taient installs sur le pilote afin de permettre des prlvements de biofilms pour analyse qualitative et
quantitative, respectivement. Lors de l'tape de colonisation nous avons dop la flore en lgionelles isoles
partir du pilote. Une fois la flore stabilise nous avons valu l'action de 6 traitements diffrents (+1 boucle
tmoin) sur la flore. Nous avons utilis des mthodes de quantification des diffrentes populations
bactriennes (hybridation fluorescente in situ avec des sondes spcifiques de groupe, dtection en
microscopie confocale et quantification par analyse d'images) et amibiennes (dnombrement) afin de mettre
en vidence les changements de composition des populations induits par les traitements. Des mthodes
dvaluation de la viabilit des populations bactriennes (marquage fluorescent Live/Dead coupl une
dtection en microscopie confocale) ont aussi t utilises pour mesurer lefficacit biocide des traitements.
Les rsultats obtenus ont clairement dmontr que si parmi les 6 traitements tests (chlore, dioxyde de
chlore, monochloramine, ozone, ionisation cuivre-argent et lectro-chloration) le dioxyde de chlore paraissait
tre le plus efficace pour contrler les prolifrations dans le bras mort, aucun traitement ntait en revanche
capable dradiquer compltement les biofilms bactriens ainsi que les bactries du genre Legionella et les
amibes associes aux biofilms. La plupart des traitements permettaient de diminuer de faon plus ou moins
importante la flore totale ainsi que les lgionelles et les amibes dnombres sur glose mais leur interruption
menait invariablement une r-apparition rapide de la flore, y compris les amibes et les lgionelles. Par
ailleurs les amibes semblaient prolifrer sur les biofilms traits par certains biocides, se nourrissant de
bactries mortes (Fig. 5). Ces travaux dmontrent donc que des traitements mal maitriss peuvent conduire
une prolifration de ces micro-organismes eucaryotes et des pathognes associs dans les rseaux. Ces
travaux ont t publis en 2004 (90). Ils ont contribu une meilleure comprhension de l'efficacit relative
des biocides sur la flore des rseaux en conditions proches des conditions relles.
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Figure 5 : Effet des traitements de dsinfection sur les biofilms rvl en marquage Live/Dead.
Le biofilm trait au dioxyde de chlore est majoritairement constitu d'une flore bactrienne morte (marquage IP) mais de
nombreuses amibes sont prsentes (nombreuses tches jaunes, agrandies en B), suggrant un effet limit du traitement
sur les amibes.
3.2.2- Publication : Rsistance des kystes d'Acanthamoeba aux traitements de dsinfection utiliss
dans les tablissements de soins
Rfrence (26), publication en annexe
Suite deux revues exhaustives de la littrature portant sur l'efficacit des traitements biocides sur
les protozoaires (88) et plus particulirement sur les amibes libres de l'environnement (96), nous avons
constat qu'il existait des tudes valuant les traitements utiliss pour la potabilisation de l'eau ou pour la
sanitisation des lentilles de contact (problme des kratite amibiennes) mais qu'il n'existait que trs peu de
donnes sur les biocides couramment utiliss pour traiter les surfaces et les matriels l'hpital mais aussi
dans l'industrie agro-alimentaire et l'industrie pharmaceutique. Or les amibes sont bien prsentes lhpital
(cf tude ci-dessus l'hpital de Lausanne), et il semblerait que dans certains cas elles puissent coloniser
des matriels mdicaux (74). Elles sont aussi prsentes dans les industries agroalimentaires o elles sont
notamment suspectes de servir de vecteur d'infection des levages de volailles par les campylobactries (6,
7, 78). Nous avons donc initi des travaux visant dterminer quels biocides utiliss pour traiter les surfaces
sont susceptibles d'tre efficaces contre les amibes sous forme de trophozoite (forme active) ou de kyste
(forme dormante). Alors que la plupart du temps seule une deux souches sont testes dans les tudes
d'efficacit des biocides sur les amibes nous avons utilis 9 souches diffrentes d'Acanthamoeba, dont 3
souches de collection et six souches isoles lors des tudes l'hpital et dans l'usine de potabilisation.
L'efficacit des traitements a t value contre les trophozoites (forme active) et contre les kystes (forme
dormante) en utilisant une simple mthode de mise en contact avec les produits tester suivie d'une
neutralisation de l'activit du biocide et d'un ensemencement des amibes traites sur gloses non nutritives +
Escherichia coli (les amibes se dveloppent en ingrant les bactrie, formant de vritables plages de lyse
sur la couche d'E. coli). Concernant les trophozoites (Table 2), tous les biocides se sont rvls pleinement
efficaces l'exception notable de la glutaraldhyde 2% (seule ou en formulation) qui mme aprs un temps
de contact de 30 minutes ne permettait pas d'radiquer les amibes, certaines souches prsentant moins de 1
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log de rduction. Concernant les kystes (Table 3) nous avons mis en vidence leur rsistance une
exposition la chaleur (55C) ainsi qu' de nombreux traitements (glutaraldhyde, eau de Javel 250 ppm,
peroxyde d'hydrogne 7,5%) tandis que d'autres traitements taient nettement plus efficaces (peroxyde
d'hydrogne en formulation, acide peractique...). Par ailleurs nous avons constat que la paroi des kystes
des souches environnementales tait plus paisse que celle des souches de collection, et que ces souches
environnementales taient plus rsistantes la dsinfection (Fig. 6). Parmi elles, les souches isoles de
l'hpital de Lausanne taient les plus rsistantes. Ceci peut s'expliquer par la mise en uvre rgulire de
traitements chocs de dsinfection la chaleur ou au chlore dans ces rseaux, et donc la slection de
souches plus rsistantes. Ces travaux ont t publis en 2010 (26), ils ont permis de prciser l'efficacit
relative des traitements biocides vis--vis des amibes, et de montrer que les souches de collection
gnralement utilises dans ces essais sont peu reprsentatives des souches de terrain.
Figure 6 : Aspect en microscopie lectronique des kystes obtenus partir des diffrentes souches d'amibes.
Kystes obtenus partir de souches de terrain isoles partir d'eau de rivire (A) ou d'eaux de rseaux hospitaliers (B et
C), et kystes obtenus partir de la souche de collection Acanthamoeba polyphaga CCAP 1501/18.
Barre : 2 m.
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3.2.3- Publication : Influence des conditions de croissance in vitro des Acanthamoeba sur la
rsistance des kystes drivs
Rfrence (27), publication en annexe
Lors des travaux raliss en 2010 nous avons utilis des mthodes classiques de culture des amibes
en milieu synthtique Peptone-Yeast-Glucose (PYG) suivies d'un enkystement en tampon Neff afin de
produire les kystes soumettre aux traitements de dcontamination (65). Nous savions cependant que
plusieurs auteurs ont rapport la formation de kystes relativement peu matures lorsque ces mthodes sont
utilises, ceci d'autant plus si les souches d'amibes utilises ont t cultives pendant de nombreuses
gnrations en PYG (14, 17, 46, 54, 68). Par ailleurs des travaux publis en 2009 indiquent que si les
trophozoites amibiens sont cultivs sur couches de cellules HEp-2 plutt qu'en milieu PYG strile la virulence
et la capacit d'enkystement sont ractives (53). A l'heure o les mthodes utiliser pour valuer l'efficacit
des traitements de dsinfection sur les kystes amibiens sont en discussion (4), il nous a sembl intressant
d'explorer la rsistance des kystes amibiens issus de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2, ceci afin de
pouvoir ventuellement proposer cette mthode de culture dans les futures normes d'essais de cysticidie .
Brivement, les amibes ont t :
cultives en milieu PYG puis enkystes par incubation en tampon Neff pendant 7 jours 33C,
ou cultives sur cellules HEp-2 puis enkystes par incubation en tampon Neff pendant 7 jours 33C.
La fragilit relative des kystes produits suivant les deux mthodes a t value grce un double
marquage calcofluor (marquage de la cellulose contenue dans la paroi des kystes) et iodure de propidium
(IP, intercalant ADN ne pntrant que dans les kystes permabiliss) avant et aprs traitement SDS 0,5%
pendant 10 min (Fig. 7 & 8). Cette premire caractrisation a permis de dmontrer que les kystes produits
partir de trophozoites cultivs en milieu PYG sont gnralement plus fragiles, donc plus permabiliss par le
traitement SDS et marqus en plus grande proportion par l'IP.
Figure 7 : Dtection des kystes permabiliss
par le traitement SDS par marquage l'iodure
de propidium.
Le marquage au calcofluor (bleu) et l'iodure
de propidium (rouge) permet de distinguer les
kystes permabiliss par le traitement SDS.
La proportion de kystes marqus IP est
gnralement plus importante chez les kystes
produits partir de trophozoites cultivs en
PYG, ceci aussi bien avant (A) qu'aprs (B) le
traitement SDS. Chez les kystes produits
partir de trophozoites cultivs sur cellules
HEp-2 la proportion moins importante de
kystes marqus IP avant (C) et aprs (D)
traitement SDS traduit une moindre
permabilit et une plus grande rsistance au
SDS.
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Figure 8 : Proportion des kystes
marqus IP avant (colonnes
blanches) et aprs (colonnes
grises) traitement SDS pour les
kystes des 4 souches
d'Acanthamoeba obtenus partir
de trophozoites cultivs en PYG
ou sur cellules HEp-2.
Des observations en microscopie lectronique transmission ont de plus permis de mettre en
vidence un nombre important de vacuoles lipidiques dans les kystes issus de trophozoites cultivs sur
cellules HEp-2 (Fig. 9) tandis qu'elles n'taient pas ou que peu prsentes chez les kystes issus de
trophozoites cultivs en PYG. Ces vacuoles lipidiques sont gnralement associes aux kystes matures (15).
L'analyse en cytomtrie en flux des kystes marqus au calcofluor (reflet du contenu en cellulose) a confirm
ces observations, avec une population htrogne constitue de kystes matures (contenu en cellulose lev)
et immatures (contenu en cellulose moins lev) chez les kystes issus de trophozoites cultivs en PYG,
tandis que les kystes produits partir de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 taient essentiellement
matures (Fig. 10). Les observations ralises en microscopie lectronique balayage sur une souche
d'Acanthamoeba ont confirm ces diffrences, avec des kystes matures (aspect pliss) et immatures (aspect
arrondi) chez les kystes issus de trophozoites cultivs en PYG, et essentiellement des kystes matures chez
les kystes produits partir de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 (Fig. 11).
Figure 9 : Aspect en microscopie lectronique
transmission des kystes produits partir de trophozoites
cultivs sur cellules HEp-2. De nombreuses gouttelettes
lipidiques sont visibles dans le corps cellulaire. Barre : 2 m.
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Figure 10 : Analyse des populations de kystes en cytomtrie aprs marquage au calcofluor.
Les kystes issus de trophozoites cultivs en PYG sont constitus de deux populations : rgion A correspondant aux
kystes immatures et B correspondant aux kystes matures. Les kystes issus de trophozoites cultivs sur cellules HEp-2
sont majoritairement constitus d'une population homogne de kystes matures (rgion C, la rgion D correspondant
essentiellement des dbris cellulaires).
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Figure 11 : Aspect des kystes en microscopie lectronique balayage.
Les kystes matures (photos du haut) ont un aspect pliss (A) et une surface d'apparence granuleuse (B). Les kystes
immatures (photos du milieu) sont arrondis (C) et prsentent une surface d'apparence fibreuse (D). Des kystes
prsentant un aspect intermdiaire ont t observs dans les populations issues des trophozoites cultivs sur cellules
HEp-2 (photos du bas): apparence crnele (E) avec une surface fibreuse (F).
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Les kystes produits partir de trophozoites cultivs suivant les deux mthodes ont par la suite t
soumis des traitements de dcontamination. Les rsultats montrent clairement que les kystes issus de
trophozoites cultivs sur cellules HEp-2 sont souvent plus, voire beaucoup plus rsistants certains
traitements (Fig.12 page suivante): chaleur (65C), eau de javel dilue 0,25%, produit base de
glutaraldhyde 2%, peroxyde d'hydrogne 7,5% et produit base d'orthophtalaldhyde 0,55% voient leur
efficacit diminue de manire plus ou moins importante suivant les souches d'amibes considres. Le
produit base d'acide peractique 0,2% conserve son efficacit. Ces rsultats sont mettre en perspective
avec l'utilisation faite de certains de ces traitements sur le terrain. La glutaraldhyde est encore frquemment
utilise comme dsinfectant de haut niveau dans certains pays europens et aux US ; d'autres auteurs
avaient dj rapport une efficacit limite de cette molcule sur les kystes amibiens (43). Les donnes
concernant l'efficacit de la chaleur varient d'une tude l'autre. Turner et al rapportent qu'une exposition
46C pendant 30 min est efficace contre les trophozoites, tandis qu'une exposition pendant 30 min 56C
est ncessaire pour inactiver les kystes obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG et enkysts en
tampon Neff (97). Aksozek et al rapportent qu'une exposition une temprature de 65C pendant plus de 5
min est efficace pour inactiver des kystes obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG et enkysts sur
gloses non nutritives (3), tandis que Ludwig et al rapportent que des kystes de A. castellanii et A. polyphaga
produits par enkystement en milieu PYG ne sont inactivs qu'aprs exposition 80C pendant 10 min (57).
Inversement, des kystes d'une souche thermotolrante d'Acanthamoeba infects par L. pneumophila n'ont
pas t inactivs aprs une exposition 80C pendant 10 min (83). La rsistance accrue des kystes la
chaleur observe dans notre tude est un point important car des chocs thermiques 65C sont
frquemment utiliss pour contrler la prolifration de L. pneumophila dans les rseaux d'eau (63). Une
efficacit limite de ces chocs sur les kystes d'Acanthamoeba pourrait donc entrainer un risque accru de
contamination des rseaux.
Globalement, ces travaux confirment l'intrt de la mthode de culture des trophozoites amibiens sur
cellules HEp-2 plutt qu'en milieu synthtique PYG, permettant d'obtenir des kystes plus matures contre
lesquels les traitements de dcontamination peuvent tre tests de faon pertinente. Ils appellent d'autres
tudes de validation afin de mettre en place des mthodes standardises d'valuation de l'efficacit des
traitements sur les kystes.
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Figure 12 : Comparaison de l 'efficacit des traitements de dcontamination sur les kystes de 4 souches
d'Acanthamoeba obtenus partir de trophozoites cultivs en PYG (colonnes noires) ou sur cellules HEp-2 (colonnes
grises). > rduction maximale observable ; * diffrence significative avec P < 0,05 ; ** diffrence significative avec P <
0,001.
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Chapitre 4 : Interactions amibes libres / micro-
organismes
Lors des tudes environnementales menes sur l'usine de potabilisation nous avons isol par co-
culture amibienne deux micro-organismes d'intrt qui ont t tudis de manire plus approfondie par la
suite, donnant lieu deux publications scientifiques. Par ailleurs nous avons particip plusieurs descriptions
de nouvelles espces et des tudes visant dterminer la pathognicit de ces nouvelles espces. Nous
nous sommes aussi intresss aux interactions amibes-mycobactries ainsi qu'aux changes de gnes entre
micro-organismes intracellulaires (bactries et virus) et entre micro-organismes intracellulaires et htes
amibiens. Ces travaux sont brivement rsums dans ce chapitre.
4.1- Les amibes libres de l'environnement : melting-pot du monde
microbien
Le concept d'amibes faisant office de melting-pot permettant l'change de gnes entre micro-
organismes intracellulaires (bactries et virus) ainsi qu'entre micro-organismes intracellulaires et hte
amibien a merg ces dernires annes (pour une revue, voir (59)). Dans une revue publie en 2010 nous
avons cherch illustrer l'importance qu'ont eu et continuent avoir les changes dinformation gntique
entre bactries, virus et protozoaires dans l'volution des micro-organismes ((92), publication en annexe).
Nous avons expos de nombreux exemples tirs d'une littrature scientifique de plus en plus abondante
concernant ce sujet : importance des Chlamydiae dans lapparition des cellules vgtales, transferts de
gnes entre protozoaires et lgionelles, entre protozoaires et rickettsies, entre protozoaires et la bactrie
symbionte d'amibes Ca Amoebophilus asiaticus, entre protozoaires et virus gants d'amibes (Fig. 13).
Par ailleurs nous avons soulign la proximit phylogntique et/ou volutive de certaines espces
bactriennes ou de certains virus trouvs chez les amibes avec d'autres espces bactriennes ou virus
trouvs chez les insectes : par exemple les plus proches voisins phylogntiques de l'espce symbiotique
d'amibes Ca Amoebophilus asiaticus sont les bactries symbiotiques d'insecte appartenant au genre
Cardinium. Ces observations, encore trs prliminaires tant donn le faible nombre de gnomes de
protozoaires disponibles pour le moment, permettent de construire des scenario volutifs sur la base de
l'observation de transferts de gnes entre micro-organismes. Un exemple intriguant de transfert a t donn
par Moliner et al (60) concernant l'change du gne codant pour la sterol delta-7 reductase. Les tudes
initiales rapportaient la prsence de copies phylogntiquement proches de ce gne chez Legionella
drancourtii, Coxiella burnetii et Protochlamydia amoebophila, suggrant que le gne avait t acquis partir
de cellules de plantes par l'anctre des Chlamydiae, puis transmis aux intra-cellulaires d'amibes lors de co-
infections Chlamydiae-lgionelles (60). En prenant en compte le gnome rcemment publi de l'amibe
Naegleria gruberi ainsi que ceux d'autres espces de Chlamydiae et de lgionelles nous avons pu prciser
qu'il s'agissait plus probablement d'un transfert d'un gne provenant d'une Naegleria vers une bactrie
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intracellulaire d'amibes, suivi ensuite de transferts entre bactries intracellulaires d'amibes (Fig. 14). De
manire intrigante, un gne codant pour une sterol delta-24 reductase a aussi t dtect chez Coxiella
burnetii ; ce gne n'est pas dtect chez les lgionelles et les Chlamydiae mais son homologue le plus
proche est l aussi prsent chez Naegleria gruberi (38).
Figure 13 : Exemples d'changes d'information
gntique entre micro-organismes intra-amibiens
(adapt de (92)).
0 Entre les anctres des rickettsies et ceux des
Chlamydiae, O entre le symbionte d'amibes
Amoebophilus asiaticus et les Chlamydiae, les
rickettsies, les lgionelles, Francisella et les
mycobactries, O entre le symbionte d'amibes
Amoebophilus asiaticus et le virus d'amibes
Mimivirus, O entre les lgionelles et leur hte
amibien, O entre les lgionelles et le virus d'amibes
Mimivirus, O entre les virus NCLDVs et leurs htes
eucaryotes, 6 entre le virus d'amibes Mimivirus et
son hte amibien, O ente le virophage Sputnik et le
virus d'amibes Mamavirus
* NCLDV : nucleocytoplasmic large DNA viruses
Figure 14 : Arbre phylogntique mettant en vidence les relations phylogntiques entre les gnes codant pour la sterol
delta-7 reductase chez l'amibe Naegleria gruberi et chez les bactries intracellulaires affilies aux lgionelles et aux
Chlamydiae (alignement squences acides amins avec le logiciel Muscle, arbre construit avec PhyML).
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4.2- Interactions des amibes avec de nouvelles espces bactriennes
apparentes aux Chlamydia
En plus des espces classiques de Chlamydiae pathognes pour l'homme et l'animal (Chlamydia
pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia psitacci, Chlamydia felis, Chlamydia abortus, Chlamydia
caviae, Chlamydia pecorum et Chlamydia muridarum), de nombreuses espces de Chlamydiae
environnementales ont t dcrites ces dernires annes (Fig. 15). Ces espces appartiennent plusieurs
familles : Parachlamydiaceae, Simkaniaceae, Rhabdochlamydiaceae et Waddliaceae. La plupart sont
capables de croitre dans les amibes libres de l'environnement, certaines dans les cellules eucaryotes
mammifres (dont les macrophages). Certaines espces peuvent aussi survivre dans les kystes amibiens.
Du point de vue de la comprhension des mcanismes volutifs ayant donn lieu lmergence des
organismes eucaryotes, de nombreux gnes de plantes trouvent leur plus proches homologues chez ces
nouvelles espces de Chlamydiae, suggrant que des vnements symbiotiques impliquant notamment des
Chlamydiae ancestrales et des cellules eucaryotes primitives ont donn naissance aux premires cellules de
plantes. Par ailleurs la plupart de ces nouvelles espces intracellulaires obligatoires ont t associes
diffrentes pathologies infectieuses chez l'homme et l'animal (Table 4). Des tudes srologiques et des
tudes de dtection par PCR ont permis de les associer des bronchopathies et des pneumonies
d'tiologie inconnue chez l'homme, ainsi qu' des avortements spontans chez l'homme et chez l'animal (42,
55).
Table 4 : Pathologies associes aux nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia.
Cette table est adapte de la revue du D
r
Greub publie en 2009 (38).
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Espce bactrienne Maladie/condition Preuve base sur
Infections respiratoires basses
Parachlamydia acanthamoebae Pneumonie d'origine communautaire Immunofluorescence, PCR & squenage
Pneumonie d'aspiration Immunofluorescence, western blot
Bronchite PCR & squenage
Bronchiolite PCR temps rel
Simkania negevensis Bronchiolite PCR, ELISA, culture
Pneumonie chez les enfants Immunofluorescence
Pneumonie chez les adultes ELISA
Exacerbation de bronchopneumopathie
obstructive chronique
ELISA
Protochlamydia naegleriophila Pneumonie d'origine communautaire
Immunofluorescence directe, PCR temps
rel spcifique, PCR & squenage
Protochlamydia amoebophila Pneumonie d'origine communautaire PCR & squenage
Waddlia chondrophila Pneumonie d'origine communautaire PCR & squenage
Rhabdochlamydia porcellionis Pneumonie d'origine communautaire PCR & squenage
Autres pathologies
Parachlamydia acanthamoebae Arteriosclrose PCR & squenage, srologie
Fausse couche Immunofluorescence, western blot
Sclrose multiple PCR
Waddlia chondrophila Fausse couche Immunofluorescence, western blot
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Figure 15 : Arbre phylogntique des Chlamydiales bas sur la squence codant pour l'ARN ribosomal 16S.
Les alignements ont t raliss avec le logiciel Muscle, l'arbre avec le logiciel PhyML (100 bootstraps).
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Les travaux brivement rsums ci-dessous sont de plusieurs natures : isolement et description de
nouvelles espces bactriennes apparentes aux Chlamydia, exploration de la pathognicit potentielle de
certaines de ces nouvelles espces et enfin capacit de survie de ces nouvelles espces dans
l'environnement. Ces travaux contribuent tous une meilleure comprhension de l'cologie et de
l'importance en sant humaine de ces nouvelles espces bactriennes.
4.2.1- Publication : Description d'une nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Criblamydia
sequanensis
Rfrence (91), publication en annexe
Lors de notre tude sur l'usine de potabilisation nous avons isol et dcrit la nouvelle espce
Criblamydia sequanensis partir d'un chantillon d'eau de Seine co-cultiv avec A. castellanii ATCC 30010.
Cette espce est rapidement lytique pour les amibes infectes. Elle est capable d'infecter de nombreuses
souches d'Acanthamoeba (Fig. 16B) mais nous n'avons pas pu mettre en vidence de croissance dans des
amibes appartenant d'autres genres amibiens (Hartmannella, Naegleria...) ou dans des cellules
mammifres (56, 91). Elle ne survit pas dans les kystes d'Acanthamoeba car les amibes infectes perdent
leur capacit d'enkystement (28). La confirmation qu'elle reprsente bien un nouveau genre (voire une
nouvelle famille) de Chlamydiae a t apporte par l'amplification, le squenage et l'analyse phylogntique
de plusieurs gnes. Nous avons mis au point et valid une sonde spcifique d'espce ciblant l'ARNr 16S de
C. sequanensis et l'avons utilise pour dtecter la bactrie dans les amibes. Cette nouvelle espce prsente
une morphologie typique en toile la fin du cycle de rplication intra-amibienne (Fig.16A & 16D). Par
ailleurs de nombreuses structures d'origine cellulaire remplies de bactries sont prsentes la fin de ce cycle
d'infection (Fig.16C), ce qui n'est gnralement pas observ pour les autres Chlamydiae environnementales.
L'quipe du D
r
Greub a rcemment dcrit une espce phylogntiquement proche : Estrella lausannensis,
qui prsente des similitudes (morphologie en toile) mais aussi des diffrences importantes (spectre d'hte
plus important) avec C. sequanensis (52, 56).
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Figure 16 : Infection d'Acanthamoeba castellanii par Criblamydia sequanensis.
Page prcdente : (A) Kystes amibiens non infects (flches noires) et structures remplies de bactries (flches
blanches) observs la fin du cycle d'infection ; (B) amibe infecte ;
Ci-dessus : (C) zoom sur une structure remplie de bactrie observe en 3A ; (D) forme typique en toile de la bactrie
la fin du cycle d'infection.
Barres : 20 m (A), 2 m (B&C) et 0,2 m (D).
De manire intressante, des tudes srologiques ralises chez des populations de patients
souffrant de diffrents types d'infections respiratoires ont mis en vidence une association entre la pathologie
asthmatique et une srologie positive Criblamydia (11).
4.2.2- Publication : Description d'une nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Rhabdochlamydia
crassificans (25)
Nous avons particip la description de la nouvelle espce apparente aux Chlamydia :
Rhabdochlamydia crassificans isole chez la blatte (25). Des tudes ultrieures ont montr que des bactries
appartenant au genre Rhabdochlamydia pourraient tre responsables d'infections respiratoires chez les
enfants et de naissances prmatures (srologies positives) (54). Par ailleurs des Rhabdochlamydia ont t
dtectes par PCR sur des chantillons cliniques de patients souffrant d'infection respiratoire d'tiologie
inconnue (44, 66).
4.2.3- Publication : Implication de la nouvelle espce apparente aux Chlamydia : Waddlia
chondrophila dans les avortements chez la femme
Rfrence (13), publication en annexe
L'espce Waddlia chondrophila a t isole pour la premire fois en 1990 d'un avorton de veau et
l'association avec des avortements chez le btail a depuis t confirme par plusieurs tudes (31, 32, 45,
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73). Nous avons pour notre part particip en 2007 une tude dmontrant que les femmes ayant subi des
avortements spontans uniques ou rptition prsentaient de manire plus frquente des srologies
positives Waddlia que les femmes ayant suivi une grossesse normale : 31,9% de femmes sropositives
dans le groupe ayant subi un avortement spontan unique, 33% dans le groupe ayant subi plusieurs
avortements spontans, et seulement 7,1% (P < 0,001) dans le groupe ayant suivi une grossesse normale
(13). Il faut signaler que des tudes de sero-ractivit de diffrentes espces de Chlamydia et Chlamydia-like
n'ont pas permis de mettre en vidence de raction croise entre W. chondrophila et les autres espces
testes (20). Ces rsultats de srologie suggrent donc une pathognicit de l'espce W. chondrophila pour
l'homme (13). Cette tude a depuis t complte par d'autres travaux mens par le D
r
Baud qui semblent
confirmer la pathognicit vis--vis de l'homme (9, 10, 12, 40). Les mcanismes de cette pathognicit
restent dcrire mais la capacit importante de W. chondrophila se multiplier dans de nombreux types
cellulaires aussi bien amibiens que mammifres et ventuellement persister sous forme de corps aberrants
ouvrent des pistes d'exploration.
4.2.4- Publication : Capacit de survie dans l'environnement des nouvelles espces bactriennes
apparentes aux Chlamydia
Rfrence (28), publication en annexe
Malgr les soupons de plus en plus importants concernant la pathognicit des bactries
apparentes aux Chlamydia il n'existe que trs peu d'information quant la capacit de ces espces
survivre dans l'environnement. Les quelques travaux publis ce sujet concernent essentiellement l'espce
Simkania negevensis, dont Kahane et al ont montr qu'elle pouvait survivre au moins 7 jours dans de l'eau
distille strile temprature ambiante (51). Des tudes rcentes rapportent aussi que Parachlamydia
acanthamoebae (souche Bn9) peut survivre quelques jours l'tat sec sur une surface (37), et que les corps
lmentaires (extra-cellulaires) de Protochlamydia amoebophila prsentent une activit mtabolique
dtectable pendant plusieurs semaines (44). Inversement, quelques tudes rapportent une capacit trs
limite de survie des bactries du genre Chlamydia l'tat libre dans l'environnement : quelques heures
seulement pour Chlamydia pneumoniae (101). Il est donc tentant de spculer qu'une capacit de survie
extra-cellulaire leve caractrise les Chlamydia-like par rapport aux bactries du genre Chlamydia. Dans
cette tude nous avons explor la capacit de Waddlia chondrophila, Parachlamydia acanthamoebae
(souches Bn9 et Hall coccus), Protochlamydia naegleriophila et Criblamydia sequanensis survivre :
l'tat sec en prsence ou non de souillures organiques,
en suspension en milieu pauvre (eau du robinet strilise par autoclavage) ou en milieu riche
(bouillon PYG).
Par ailleurs la capacit de ces espces se multiplier dans 11 souches d 'Acanthamoeba a t explore,
ainsi que leur rsistance diffrents traitements de dsinfection (expositions ralises sur bactries en
suspension, pendant un temps de contact de 10 min). L'espce Chlamydia trachomatis (souche L2/434/BU
responsable de lymphogranulomatose vnrienne) a t utilise comme contrle dans tous ces tests.
Les rsultats des tests de survie dmontrent clairement une capacit plus importante de survie des
Chlamydia-like dans l'environnement en comparaison de C. trachomatis. Alors que cette espce est
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gnralement indtectable (par infection de cellues HEp-2) ds la fin de la premire semaine d'incubation
(Fig. 17), les Chlamydia-like survivent bien plus longtemps : 3 4 semaines l'tat sec en l'absence de
souillures organiques, 3 7 semaines l'tat sec en prsence de souillures organiques, de 6 > 10
semaines en suspension dans de l'eau du robinet strile et gnralement > 10 semaines en milieu PYG (Fig.
17). Concernant les spectres d'hte (Table 5) il est intressant de noter que les deux souches de P.
acanthamoebae ne prsentent pas exactement le mme spectre : la souche Bn9 n'est pas capable d'infecter
les deux souches d'Acanthamoeba lenticulata tandis que la souche Hall coccus l'est. Par ailleurs de
nombreuses vsicules (ou pseudo-kystes ?) sont observs la fin du cycle d'infection des amibes par
C. sequanensis, mis part lors de l'infection des deux souches d' A. lenticulata qui semble nettement moins
efficace. Enfin P. naegleriophila infecte efficacement toutes les souches amibiennes tandis que W.
chondrophila prsente un spectre plus limit avec une infection rellement productive chez seulement deux
souches d'amibes.
Table 5 : Efficacit de l'infection de diffrentes souches d'Acanthamoeba par les Chlamydia-like.
a: nombreuses vsicules observes la fin du cycle d'infection.
Table 6 : Efficacit des traitements de dsinfection sur les Chlamydia-like.
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Figure 17 : Survie extra-cellulaire des Chlamydia-like et de Chlamydia trachomatis.
C. trachomatis (ligne en pointills), P. acanthamoebae souche Bn9 (carrs blancs), P. acanthamoebae souche Hall
coccus (carrs noirs), P. naegleriophila (losanges noirs), W. chondrophila (triangles noirs) et C. sequanensis (ronds
noirs) ont t schs en microplaques 96 puits en l'absence de souillures organiques (A) ou en prsence de srum
albumine bovine + sang (B), ou suspendus en eau du robinet strile (C) ou en bouillon PYG (D).
Figure 18 : Dtection de Chlamydia trachomatis dans la souche d'Acanthamoeba sp2.
La dtection a t ralise l'aide du kit Bio-Rad Pathfinder (anticorps spcifiques) 7 jours aprs l'infection des amibes.
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L'infection des souches d'amibes par C. trachomatis n'a jamais donn lieu une prolifration
bactrienne dans les amibes directement visible au microscope comme pour la plupart des Chlamydia-like.
Par ailleurs l'utilisation de la PCR quantitative (50) n'a pas permis de mettre en vidence une augmentation
du nombre de copies d'ADN de C. trachomatis lors de l'infection des amibes : ce nombre de copies restait
gnralement relativement constant entre le premier jour et le douzime jour de l'infection. En revanche
l'utilisation du kit de dtection in situ des C. trachomatis a permis de mettre en vidence la prsence de ces
bactries dans les amibes infectes jusqu' 7 jours aprs l'infection (Fig. 18). Ce rsultat est intriguant est
appel des explorations complmentaires. Des exprimentations similaires avec Chlamydia abortus ont mis en
vidence une disparition rapide des bactries intra-amibiennes qui devenaient indtectables avec des
anticorps spcifiques (104). En revanche l'tude de Essig et al semble dmontrer une survie, voire une faible
multiplication de Chlamydia pneumoniae dans les amibes (33). Nos rsultats, combins au fait que certains
auteurs ont rcemment rapports l'identification de bactries proches de C. trachomatis dans des amibes
isoles de cornes infectes (48), peuvent laisser supposer que C. trachomatis est capable de survivre dans
les amibes pendant une dure significative. Concernant enfin l 'effet des traitements de dsinfection sur les
bactries extracellulaires (Table 6), l'observation la plus notable est la rsistance importante des Chlamydia-
like la chaleur en comparaison avec C. trachomatis : la rduction de titre observe aprs exposition 55C
pendant 10 min est de l'ordre de 0,5 Log10 pour Pa. acanthamoebae Bn9 et Pr. naegleriophila, de 1,5 2,0
Log10 pour W. chondrophila et P. acanthamoebae Hall coccus, et de 3,5 Log10 pour C. sequanensis.
L'inactivation est complte pour C. trachomatis. Comme pour la rsistance des kystes amibiens la chaleur
(cf paragraphe 3.2.3), cette apparente rsistance des Chlamydia-like la chaleur pose question car la
chaleur est souvent utilise pour contrler les flores microbiennes dans les rseaux de distribution d'eau (63).
4.3- Interactions des amibes avec les mycobactries
Le genre Mycobacterium comprend un grand nombre d'espces pathognes pour l'homme, dont les
plus connues sont Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae et Mycobacterium ulcerans
responsables respectivement de la tuberculose, de la lpre et de l'ulcre de Buruli. Par ailleurs les espces
regroupes sous l'appellation mycobactries non tuberculeuses (NTM en anglais) reprsentent un
groupe d'espces diverses qui sont largement prsentes dans l'environnement et frquemment isoles des
sols et des eaux (eaux de surface, eaux de rseaux). Ces espces sont responsables d'un nombre croissant
d'infection respiratoires, cutanes et des tissus mous (19, 30, 103). Les NTM appartenant au complexe
Mycobacterium avium, ainsi que les espces M. abscessus, M. massiliense, M. chelonae, M. fortuitum, M.
kansasii et M. mucogenicum sont les plus frquemment isoles des patients. Les infections causes par ces
espces sont souvent considres comme opportunistes mais la prsence ubiquitaire de ces bactries dans
divers types d'eaux (y compris l'eau des rseaux hospitaliers) et la difficult qu'il y a traiter les infections
qu'elles causent en font un problme majeur de sant publique. Les tudes rapportant la capacit des
mycobactries survivre et / ou se multiplier dans les amibes libres de l'environnement sont de plus en plus
nombreuses. Nous en avons fait une revue en 2007, dmontrant clairement que la plupart des espces de
mycobactries pathognes, y compris M. leprae, sont capables de survivre voire de se multiplier dans les
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trophozoites d'Acanthamoeba, et ventuellement de survivre dans les kystes (95) (publication en annexe).
Les travaux d'Adekambi et al. (2006) rapportent notamment la capacit de 26 espces diffrentes de
mycobactries survivre dans les kystes d'A. polyphaga, tant ainsi protges vis--vis de traitements de
dsinfection au chlore (1). Les auteurs suggrent par consquent qu'il devient ncessaire de tester
l'efficacit contre ces kystes amibiens infects des traitements biocides utiliss pour traiter les endoscopes.
Par ailleurs, il semblerait que des mutations des gnes de porines confrant une rsistance accrue de
certaines souches de M. chelonae aux traitements de dsinfection base d'aldhydes mais aussi de
nombreux traitements antibiotiques pourraient aussi favoriser la survie intra-cellulaire (y compris intra-
amibienne) des ces souches de mycobactries (76, 84). Enfin la multiplication intra-amibienne des
mycobactries semble favoriser l'expression de gnes de virulences qui sont les mmes que ceux confrant
une virulence accrue vis--vis de l'homme ou de l'animal (23, 29, 86). Un tableau relativement inquitant
semble donc merger de ces diffrentes tudes : certains traitements de dsinfection couramment utiliss
(aldhydes, mais aussi autres traitements?) pourraient slectionner des souches de mycobactries
pathognes prsentant une rsistance plus leve aux antibiotiques et plus mme de survivre et de se
multiplier dans les amibes, exacerbant ainsi l'expression de gnes de virulence favorisant l'infection de
l'homme ou de l'animal. Cette description alarmiste est sans doute trs simplifie mais la plupart des tudes
publies rcemment vont dans ce sens. Dans ce contexte, nous avons particip plusieurs tudes portant
sur les interactions amibes mycobactries.
4.3.1- Publication : Test de la virulence de diffrentes souches cliniques de Mycobacterium kansasii
vis--vis d'Acanthamoeba castellanii
Rfrence (41), publication en annexe
L'espce Mycobacterium kansasii est, avec M. avium, l'une des espces de mycobactries non
tuberculeuses les plus frquemment responsables d'infections chez l'Homme. Cette espce est classe en
plusieurs sous-types sur la base du gne hsp65 : le sous-type 1 est considr comme virulent car isol chez
des patients immunocomptents ou immunodficients souffrant d'infections pulmonaires, le sous-type 2 est
considr comme opportuniste car principalement isol de patients infects par le VIH et souffrant
d'immunodficience, le sous-type 3 est gnralement considr comme commensal car isol de patients ne
souffrant pas d'infection (85). La pathognicit des autres sous-types (4 7) reste dterminer. Dans ce
contexte, nous avons tir parti de la prsence d'une large collection de souches de M. kansasii l'hpital de
Lausanne afin de tester la virulence vis--vis des amibes de souches appartenant ces diffrents sous-
types. Des souches appartenant aux sous-types 1, 3 et 6 ont t utilises pour infecter l'amibe
Acanthamoeba castellanii ATCC 30010. Le suivi de l'infection a ensuite t ralis en effectuant des
colorations de Ziehl-Neelsen permettant de rvler la prsence de mycobactries dans les amibes. Le
pourcentage d'amibes infectes ainsi que la progression du nombre de bactries par amibe ont t relevs
au fur-et--mesure de l'infection. Ces expriences relativement simples ont permis de mettre en vidence
une plus grande virulence du sous-type 1, avec un nombre d'amibes infectes et un nombre de bactries par
amibes plus importants que pour les sous-types 3 et 6 (Fig.19). Seule une souche appartenant au sous-type
3 prsentait un profil de virulence similaire celui des souches du sous-type 1 ; or cette souche tait la seule
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souche considre comme virulente parmi les souches du sous-type 3, car isole partir de prlvements
sanguins. Ces travaux semblent donc confirmer la pertinence du modle amibien dans l'tude de la virulence
des mycobactries.
Figure 19 : volution du pourcentage d'amibes infectes (A) et du nombre de bactries par amibe (B) en fonction des
sous-types. La souche 142 est une souche de sous-type 3 considre comme pathogne car isole d'une hmoculture.
4.4- Interactions des amibes avec les virus NCLDV
Les virus gants capables d'infecter les amibes ont suscit l'intrt de la communaut scientifique
ces dernires annes. La description du Mimivirus et de son gnome par l'quipe du P
r
Didier Raoult
Marseille a soulev de nombreuses questions et donn lieu des dbats passionns sur le rle de ces
nouveaux virus dans les changes gntiques entre eucaryotes et bactries (cf Fig.13), et sur leur place
ventuelle dans l'arbre volutif de la vie sur terre. En plus de ces questions volutives il a t propos que
ces nouveaux virus puissent tre responsables d'infection chez l'homme, avec la description d'un cas de
sroconversion positive Mimivirus lors de l'infection accidentelle d'un technicien de laboratoire (71). Quels
que soient leur place relle dans l'arbre volutif et leur rle en tant qu'agents infectieux ces virus constituent
un sujet d'tude passionnant. En plus de leur taille et de celle de leur gnome, proches de celles des plus
petites bactries, ces virus prsentent de nombreuses particularits dont la prsence de nombreux gnes
dorigines eucaryote et bactrienne dans leurs gnomes, donnant lieu des activits mtaboliques indites
chez des virus. Ils appartiennent au groupe des virus NCLDV (nucleocytoplasmic large DNA viruses)
comprenant notamment les Phycodnavirus (virus infectant des micro-algues marines), les Iridovirus (dont
plusieurs sont des pathognes de poissons, d'amphibiens et de reptiles), les Asfarvirus (virus de la fivre
porcine africaine) et les Poxvirus (nombreux pathognes humains et animaux) (Fig. 20). Ils sont supposs
agir comme de vritables taxis permettant lchange de gnes entre les amibes et les bactries
intracellulaires damibes (lgionelles, Chlamydia-like) et sont eux-mmes potentiellement infects par des
virophages (Fig.13). Il faut noter que bien que dcrit chez les amibes Mimivirus est affili de faon
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distante au groupe des Phycodnavirus. Par ailleurs deux nouveaux virus ont rcemment t affilis
Mimivirus : le Cafeteria roenbergensis virus (CroV) qui infecte un protiste microflagell prdateur de
bactries, et le Megavirus qui a t isol partir d'chantillons marins par co-culture sur amibes (5, 36).
La nouvelle famille Megaviridae est donc propose, incluant Mimivirus et ces deux nouveaux virus (5).
Plusieurs tudes mtagnomiques effectues sur milieu marin rapportent la prsence de gnes affilis
Mimivirus, suggrant que les membres de la nouvelle famille des Megaviridae sont prsents de faon
importante dans les ocans (24, 61, 62). Par ailleurs plusieurs photos de microscopie lectronique suggrent
que des virus relativement gros prsentant une morphologie semblable celle de nombreux NCLDVs sont
aussi prsents chez de nombreux autres micro-organismes eucaryotes, dont des parasites comme les
Giardia ou les Blastocystis (79-81).
Figure 20 : Arbre phylogntique de virus reprsentatifs du groupe des NCLDV (nucleocytoplasmic large DNA viruses).
L'arbre a t construit partir d'un alignement de concatnats de 5 core protines du groupe 1 retrouves chez une
vaste majorit de NCLDV : ATPase A32, protine majeure de capside, hlicase D5, ADN-polymrase B et facteur de
transcription A1L/VLTF2. Les virus rcemment dcrits : Cafeteria roenbergensis virus (CroV) et Megavirus ne sont pas
reprsents.
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4.4.1- Publication : Lausannevirus, un nouveau virus d'amibes
Rfrence (89), publication en annexe
Dans ce contexte, nous avons squenc et annot le gnome d'un virus isol partir d'une co-culture
d'eau de Seine et que nous avons par la suite nomm Lausannevirus. Le virus a t dtect par hasard alors
que nous ralisions des colorations de Gimenez pour dtecter des lgionelles infectant des amibes sur un
chantillon de co-culture amibienne (cf 3.1.1) (Fig.21). La prsence d'un virus a par la suite t confirme
en rinfectant des amibes avec un surnageant filtr 0,45 m afin de se dbarrasser des lgionelles et en
prparant les amibes ainsi infectes pour des observations en microscopie lectronique transmission (Fig.
22).
Figure 21 (ci-contre) : Observation de Lausannevirus en coloration de
Gimenez.
Les lgionelles co-infectant les amibes sont clairement visibles
(flches vertes) tandis que les virus apparaissent sous forme de petits
points (flches violettes). Barre : 10 m
Figure 22 (ci-dessous) : Observation de Lausannevirus en
microscopie lectronique transmission.
Des particules virales pleines ou vides (A, flches noires et
blanches, respectivement) peuvent tre observes dans de
nombreuses vacuoles rparties dans le cytoplasme des amibes
infectes (B). L'observation en coloration ngative rvle la prsence
de plusieurs couches dlimitant un corps condens (C). Les usines
virus dj dcrites pour d'autres virus (66) sont prsentes, elles
contiennent de nombreux virus en cours de formation (flches
blanches) et sont entoures de nombreuses mitochondries (D).
Barres : 500 nm (A), 2 m (B), 40 nm (C), 2 m (D).
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Le virus a un diamtre d'environ 200 nm. Les essais d'infection de divers types de cellules semblent
montrer que ce nouveau virus est spcifique de certaines amibes du genre Acanthamoeba (groupe T4) et
qu'il est apparemment incapable d'infecter des cultures de cellules mammifres. L'infection des amibes est
fulgurante, avec un effet cytopathique survenant en quelques heures seulement et une lyse des cellules
infectes survenant en moins de 24 h (Fig. 23).
Figure 23 : Droulement du cycle d'infection d'Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 par Lausannevirus.
Le virus est rvl par des anticorps polyclonaux induits chez la souris, eux-mmes marqus secondairement par des
anticorps anti-souris coupls FITC. Les amibes sont colores au bleu d'Evans. Lausannevirus n'est pas dtect durant la
phase d'clipse qui a lieu 2 heures aprs l'infection. La lyse des amibes intervient 16 24h aprs l'infection. Barre : 10
m.
Le squenage du gnome (346 kb, GC% 42,9) a permis de dtecter 450 gnes hypothtiques d'une
taille moyenne de 716 bp, reprsentant 92,6% de la taille du gnome et codant pour des protines dont la
taille varie de 44 1526 acides amins. Les analyses phylogntiques bases sur les core proteins du
groupe 1 retrouves chez la grande majorit des NCLDV montrent que Lausannevirus est
phylogntiquement proche de Marseillevirus dcrit en 2010 par l'quipe de Didier Raoult (Fig. 20). Parmi les
450 protines prdites chez Lausannevirus :
118 n'ont pas d'homologue dans les bases de donnes,
323 trouvent leur plus proche homologue chez Marseillevirus,
7 trouvent leur plus proche homologue ailleurs que chez Marseillevirus mais prsentent cependant des
homologues chez Marseillevirus,
2 n'ont pas d'homologue chez Marseillevirus.
De manire intrigante, alors que la majorit du gnome de Lausannevirus est colinaire de celle du
gnome de Marseillevirus avec seulement quelques zones inverses, les premires 150 kilobases du
gnome de Lausannevirus ne sont pas colinaires (Fig. 24). La rgion non-colinaire n'est pas
particulirement enrichie en protines d'origine bactrienne, eucaryote ou phagique. Par ailleurs cinq rgions
inverses sont clairement mises en vidence dans la partie colinaire du gnome (Fig. 24).
Plusieurs familles de protines ont t identifies : famille de protines contenant des motifs MORN-
repeats , endonuclases et srine/thronine protines kinases. Douze autres familles moins importantes
sont quasi-exclusivement constitues de protines dont la fonction est inconnue, l'exception des
ubiquitines. La doxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase (dUTPase) est une core protine du
groupe 2 retrouve chez la plupart des NCLDV (49). Son rle est d'hydrolyser le dUTP, gnrant ainsi du
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dUMP utile la synthse des nuclotides base de thymidine tout en diminuant la concentration de dUTP
qui pourrait tre incorpor par erreur dans l'ADN viral. Par ailleurs la dUTPase a t associe la capacit
de certains virus NCLDVs se multiplier dans des cellules au repos (ne se multipliant pas) (21). Chez
Lausannevirus la dUTPase est quasiment complte tandis que chez Marseillevirus elle est trs tronque et
donc srement inactive. Les analyses phylogntiques suggrent que la dUTPase de Lausannevirus aurait
pu tre acquise partir de bactries endosymbiotiques d'amibes telles que Ca Amoebophilus asiaticus. Il
reste dterminer si ces diffrences dans les squences des deux protines rsultent dans des diffrences
de mtabolisme et/ou de virulence entre les deux virus. Signalons enfin la prsence de deux intines chez
les deux virus. Les intines sont des lments gntiques mobiles transcrits en mme temps que la protine
hte mais qui sont ensuite exciss. Les intines situes dans les D6/D11-hlicases des deux virus sont trs
semblables, tandis que celles situes dans les ribonuclotides reductases sont trs diffrentes. Ces
diffrences peuvent ventuellement renseigner sur l'histoire volutive de ces deux virus.
Figure 24 : Nuage de points construit partir de
l'emplacement dans le gnome des protines orthologues
entre Lausannevirus et Marseillevirus. Les gnes
prsentant la mme orientation sur le brin d'ADN sont
indiqus en bleu, ceux encods sur le brin complmentaire
sont reprsents en rouge. La premire partie du gnome
des deux virus est faiblement co-linaire tandis que la
seconde partie est trs largement co-linaire, avec
cependant 5 rgions inverses (flches).
Par ailleurs nous avons mis en vidence chez les deux virus 3 gnes codant pour des doublets
dhistones, avec deux singlets prsentant une homologie importante avec les histones H2A, un autre avec
les H2B, un autre avec les H3 et enfin un dernier avec des histones dArchaebactries (Fig. 25). La prsence
de ces doublets soulve de nouvelles questions car le codage de doublets dhistones par un mme gne na
jusquici t mis en vidence que chez des Archaebactries. Par ailleurs certains auteurs proposent que des
Archaebactries ancestrales (Thaumarchaeota, possdant aussi des gnes dhistones) pourraient avoir
particip aux premiers vnements symbiotiques ayant finalement donn naissance aux Eucaryotes. Comme
dans le cas des Chlamydia-like, ces nouvelles donnes apportent donc des lments qui peuvent contribuer
llaboration de scenarii visant expliquer lhistoire volutive des Eucaryotes.
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Figure 25 : Phylognie et rpartition des motifs d'histones trouvs chez Lausannevirus et Marseillevirus.
Le gne LAU_0051 encode un domaine inconnu et un domaine prsentant une homologie avec les histones H2A ; le
gne LAU_0386 encode un domaine prsentant une homologie avec les histones H2B et un domaine prsentant une
homologie avec les histones H2A ; le gne LAU_0387 encode un domaine prsentant une homologie avec les histones
archobactries et un domaine prsentant une homologie avec les histones H3. Cette rpartition en doublets (mme
gne codant pour deux domaines histones diffrents) n'est retrouve que chez certaines archobactries.
L'arbre phylogntique reprsente la position phylogntique des diffrents domaines d'histones prsents chez
Lausannevirus et Marseillevirus.
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Chapitre 5 : Perspectives
5.1- Synthse de nos travaux
Ces travaux, ainsi que de nombreux autres travaux publis par d'autres quipes sur des thmatiques
similaires, dmontrent clairement que :
Les amibes libres sont prsentes dans la plupart des environnements hydriques naturels ou
artificiels ;
Certaines de ces amibes (genre Acanthamoeba) sont susceptibles de prsenter des rsistances trs
leves certaines catgories de traitements de dsinfection. Cette rsistance trs leve concerne
les kystes amibiens la plupart du temps, mais les trophozoites peuvent aussi tre trs rsistants vis--
vis de certains traitements (glutaraldhyde...) ;
De nombreuses espces bactriennes pathognes connues sont capables de prolifrer en prsence
et/ou l'intrieur des trophozoites amibiens, et certaines survivent dans les kystes : lgionelles, mais
aussi mycobactries dont l'importance en sant humaine et animale est en constante augmentation ;
La virulence vis--vis des amibes est corrle la virulence vis--vis des htes suprieurs ;
Les changes gntiques entre micro-organismes intracellulaires et les cellules htes hbergeant ces
micro-organismes sont frquents ;
De nombreuses espces bactriennes pathognes mergentes sont aussi capables de prolifrer
dans les amibes : c'est le cas des bactries apparentes aux Chlamydia, pour lesquelles les preuves
directes ou indirectes de pathognicit vis--vis de l'Homme et/ou de l'animal sont de plus en plus
nombreuses ;
Certaines parmi ces espces pathognes mergentes prsentent des capacits importantes de
survie l'tat libre dans l'environnement ;
Par ailleurs les amibes hbergent aussi de nouveaux types de virus qui sont eux aussi susceptibles
d'tre pathognes et qui prsentent des caractristiques morphologiques et gntiques tout fait
remarquables.
5.2- Perspectives / dveloppements envisags
Comme nous l'avons vu ci-dessus les amibes (et plus largement les protozoaires) sont prsents dans
tous les cosystmes naturels (sols, rivires...) mais aussi artificiels (rseaux d'eau, surfaces de travail,
rfrigrateurs, levages de volaille... ). Ces eucaryotes unicellulaires prsentent une rsistance trs
importante de nombreux traitements de dcontamination utiliss couramment dans diffrentes activits,
dont la production/distribution d'eau potable et l'industrie agro-alimentaire. Ils sont en interaction constante
avec les biofilms et peuvent slectionner, protger et dissminer des micro-organismes pathognes avrs
ou mergents. Malgr ce contexte de risque lev l'cologie des protozoaires dans les cosystmes
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associs la production et la distribution d'eau potable mais aussi au conditionnement, la conservation et
la distribution des aliments est peu tudie, et il n'existe que peu de travaux publis dans la littrature.
Par consquent, il nous parat important d'tudier l'cologie des protozoaires dans les biofilms
complexes mis en place et/ou impacts par les activits humaines. L'objectif est notamment d'viter les
consquences nfastes d'une prolifration mal contrle des protozoaires dans ces cosystmes : slection
de bactries pathognes intracellulaires au dtriment de la flore saprophyte non pathogne, facilitation
d'changes de gnes de virulence et/ou de rsistance entre bactries intracellulaires pathognes,
prolifration de ces agents pathognes dans l'cosystme, risque infectieux accru pour l'homme et les
animaux et ncessit d'utiliser des concentrations importantes de biocides pour radiquer les micro-
organismes slectionns.
Notre projet de recherche court / moyen terme comporte trois parties principales.
5 .2.1- Protozoaires de l'environnement : interactions avec l'cosystme biofilm
Les travaux regroups sous cette thmatique ont pour objectif une meilleure comprhension des
interactions entre diffrents protozoaires frquemment rencontrs dans les environnements artificiels (eaux
de surface et de rseaux, surfaces de travail des industries agro-alimentaires, aliments issus de
l'agriculture...) et les biofilms prsents dans ces cosystmes.
Devenir des protozoaires dans les biofilms : les espces et les souches bactriennes prsentes dans
les biofilms ainsi que les diffrentes molcules produites par ces bactries (exopolysaccharides, ADN,
toxines...) jouent un rle important dans l'implantation et la croissance des protozoaires, et notamment des
amibes dans les biofilms (58). Actuellement, nous disposons d'une collection de plus de 40 souches
d'amibes qui ont t isoles de diffrents environnements et que nous avons identifi par squenage de
fragments de l'ADNr 18S. De nombreuses donnes ont dj t recueillies pour les souches appartenant au
genre Acanthamoeba : rsistance aux traitements de dcontamination usuels, permissivit l'infection par
des bactries pathognes et des virus d'amibes... La collecte de ces donnes sera complte pour des
souches appartenant d'autres espces amibiennes : Hartmannella vermiformis et Naegleria spp, et
ventuellement pour des souches de Tetrahymena. De nouvelles caractristiques seront ensuite
explores pour toute la collection : mobilit et vitesse de prdation des trophozoites, hydrophobicit et
adhsion des kystes diffrents types de surfaces (acier inox, cuivre, verre...), tolrance des trophozoites et
des kystes certains stress (temprature, osmolarit, salinit...). Sur la base de ces rsultats, nous
slectionnerons certaines souches de protozoaires et explorerons leur capacit coloniser et interagir avec
diffrents types de biofilms modles composs d'une ou plusieurs espces bactriennes non pathognes.
Les biofilms complexes pourront tre caractriss par utilisation de sondes spcifiques de groupes
bactriens couples la dtection en microscopie confocale. L'objectif est ici de dterminer si certaines
caractristiques propres aux souches de protozoaires permettent une meilleure implantation dans certains
types de biofilms, ceci afin de mieux comprendre les mcanismes de l'implantation des protozoaires dans
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ces biofilms. Les biofilms seront forms en modes statique (en microplaque) et dynamique ( flow cells ),
puis les protozoaires seront inoculs afin d'tudier plusieurs paramtres :
localisation des protozoaires dans les diffrents types de biofilms,
effet des protozoaires sur la croissance bactrienne et sur l'architecture des biofilms,
devenir des protozoaires une fois que le biofilm a t entirement consomm ,
dtachement ventuel des trophozoites ou des kystes pour coloniser d'autres parties du biofilm,
formation ventuelle d'un nouveau biofilm bactrien une fois que les protozoaires sont enkysts,
formation ventuelle de nouveaux trophozoites par les kystes qui seraient rests en place, et si
oui quel stade de dveloppement du nouveau biofilm a lieu ce dsenkystement,
consommation du biofilm nouvellement form,
influence de ces cycles de prdation amibienne sur l'architecture du biofilm et la virulence des
souches bactriennes vis--vis des protozoaires.
Signaux de communication protozoaires-biofilms : Un point important de cette partie du projet sera
l'tude des signaux qui dclenchent la diffrentiation des trophozoites en kystes et inversement des kystes
en trophozoites. Ces signaux sont pour le moment peu connus. Or cette diffrentiation reprsente un
paramtre critique qui doit tre mieux compris afin de permettre un meilleur contrle des populations
protozoaires et des bactries pathognes associes dans les biofilms. Nous avons observ que les kystes
amibiens se diffrencient beaucoup plus rapidement et en plus grandes proportions en prsence de
bactries vivantes qu'en prsence des mmes bactries inactives la chaleur ou dans des milieux
synthtiques (donnes non publies). Nous souhaitons donc explorer si des molcules scrtes par les
bactries favorisent le dsenkystement. Nous produirons des kystes amibiens en utilisant diffrentes
conditions exprimentales et nous observerons la vitesse de dsenkystement sur glose ensemences avec
des mutants de souches de P. aeruginosa ou d'E. coli non pathognes pour les amibes. Deux types
d'approches pourront tre envisages pour l'utilisation de ces mutants. Nous formulons l'hypothse que des
molcules impliques dans les mcanismes de quorum sensing bactrien sont impliques. Dans un
premier temps, des mutants dont les gnes codant pour les diffrentes protines impliques dans le quorum
sensing auront t inactivs pourront donc tre construits afin de vrifier si leur capacit promouvoir le
dsenkystement est modifie. Par ailleurs des molcules de quorum sensing purifies sont disponibles dans
le commerce (homosrine lactones notamment) ; leur effet sur les cintiques d'enkystement et de
dsenkystement des protozoaires pourra donc tre explor. Dans un deuxime temps, et en fonction des
rsultats obtenus dans la premire srie d'expriences, nous pourrons produire des banques de mutants
alatoires et tester la capacit de ces mutants promouvoir le dsenkystement. Llectrophorse
bidimensionnelle couple des techniques de spectromtrie de masse permettant l'identification des
protines (MALDI-TOF MS) seront utilises afin de dterminer l'identit des protines dont l'expression
diffre entre les mutants prsentant une capacit plus ou moins importante promouvoir le dsenkystement.
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5.2.2- P rotozoaires de l'environnement : rle dans la slection et la dissmination de bactries
pathognes
Dans cette partie, nous nous intresserons de manire plus prcise aux interactions entre
protozoaires et bactries pathognes dans l'cosystme biofilm. Des modles de laboratoire seront utiliss,
et des outils permettant l'tude d'cosystmes rels seront dvelopps. L'objectif est de mieux comprendre
le risque rel constitu par l'association protozoaires-bactries pathognes, ceci afin de permettre une
meilleure gestion et une meilleure prvention de ce risque.
Impact des protozoaires sur l'implantation et la prolifration des bactries pathognes dans les
biofilms : Plusieurs espces bactriennes pathognes potentiellement rencontres dans diffrents types de
biofilms pourront tre tudies dans cette partie, notamment Salmonella enterica, Listeria monocytogenes,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, diffrentes espces de mycobactries... (16). Nous disposons
dj d'une collection importante de souches pour plusieurs de ces espces, et d'autres souches pourront
tre collectes en fonction des besoins. Pour chaque espce bactrienne, la pathognicit de diffrentes
souches vis--vis de notre collection de protozoaires sera pralablement value en utilisant des essais de
croissance intra-protozoaire et d'inhibition de la croissance des protozoaires sur glose (2, 35). Nous
reprendrons ensuite les biofilms bactriens complexes dj utiliss dans le point prcdent et y ajouterons
diffrentes proportions d'espces bactriennes pathognes marques avec un gne codant pour une
protine fluorescente (GFP, mCherry...), ceci afin de suivre limplantation de ces espces dans le biofilm. De
nombreuses souches fluorescentes de Listeria, de mycobactries et de Pseudomonas sont dj disponibles
dans notre collection et d'autres pourront tre acquises ou construites si besoin. Une fois l'cosystme
quilibr, nous introduirons diffrents protozoaires et observerons l'ventuelle invasion de ces protozoaires
par les bactries pathognes, ainsi que l'volution des quantits et de la localisation des bactries
pathognes dans les biofilms sous l'influence de la prdation par les protozoaires. Alternativement, des
bactries pathognes issues d'une multiplication intra-protozoaire, ou mme des protozoaires pralablement
infects par des bactries pathognes marques pourront tre introduits dans les biofilms afin d'observer
l'implantation et l'volution de ces bactries dans l'cosystme, ceci en comparaison avec les mmes
bactries issues d'une rplication sur glose. Nous suspectons en effet que la croissance intra-protozoaire
pourrait avoir un effet important sur l'implantation et la localisation des ces bactries dans les biofilms car il a
t dmontr dans le cas des lgionelles que leurs proprits de surface (hydrophobicit...) et leur
mtabolisme sont largement modifis suite la croissance intracellulaire.
Analyse mtagnomique de la flore eucaryote des biofilms associs diffrents cosystmes, et de
la flore bactrienne associe ces eucaryotes : notion de virulome des cosystmes. La connaissance de la
flore microbienne eucaryote unicellulaire associe aux biofilms est encore trs parcellaire. La prsence de
diffrentes espces d'amibes libres phylogntiquement loignes (Heterolobosea, Amoebozoa...) est
rgulirement rapporte, ainsi que la prsence de diffrentes espces de protozoaires cilis
(Tetrahymena...). Cependant, et par analogie avec ce qui a dj t largement dcrit pour les bactries, il est
trs probable que les mthodes classiques d'isolement des protozoaires sur diffrents milieux de culture ne
permettent de recouvrer qu'une partie minoritaire de cette flore. Il nous semble donc pertinent d'utiliser les
mthodes rcentes de mtagnomique afin de permettre une approche plus exhaustive de la flore eucaryote
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de diffrents cosystmes : rseaux d'eau potable mais aussi surfaces de travail des ateliers dans l'industrie
agro-alimentaire (industrie laitire et de fermentation notamment), eau de boisson des animaux dans les
fermes d'levage, surface des lgumes verts issus de l'agriculture... En fonction des chantillons collects
(eau ou autres liquides, biofilms), nous procderons diffrentes tapes prliminaires de concentration des
micro-organismes eucaryotes unicellulaires. Les mthodes utilises devront tre pralablement valides sur
des biofilms modles dops avec diffrentes espces de protozoaires. Des traitements enzymatiques
(DNAse), chimiques (monoxyde d'azote) ou biologiques (phages) favorisant la dispersion des biofilms sans
dtruire les protozoaires pourront tre explors. Par la suite une premire tape de concentration des micro-
organismes eucaryotes unicellulaires pourra tre ralise l'aide de diffrentes techniques : filtration 5m
permettant d'vacuer une partie de la flore bactrienne, centrifugation basse vitesse permettant de
sdimenter les micro-organismes eucaryotes, sparation sur gradient Nycodenz ou Ludox (aprs calibration
pralable avec des protozoaires de diffrentes tailles)... Enfin, la cytomtrie couple un tri des cellules sur
des critres de taille et de marquage fluorescent (ADN, paroi cellulaire) pourra ventuellement tre utilise
sur les chantillons pr-concentrs afin d'apporter une tape supplmentaire de concentration et de
purification (nous avons dj utilis ces techniques pour trier diffrentes sous-populations amibiennes).
Diffrentes approches pourront ensuite tre envisages pour traiter les micro-organismes eucaryotes ainsi
concentrs en mtagnomique : utilisation d'amorces PCR universelles ciblant le gne codant pour l'ARNr
18S des eucaryotes, utilisation d'amorces PCR universelles ciblant le gne codant pour l'ARNr 16S des
procaryotes, utilisation de techniques d'amplification non slective amplifiant n'importe quel type d'ADN
prsent... Le but de ces expriences est de caractriser non seulement la flore protozoaire des cosystmes
tudis, mais aussi la flore bactrienne ventuellement pathogne directement associe aux protozoaires et
son virulome : gnes de virulence permettant la survie et la multiplication intracellulaire. Une fois valids,
ces outils permettront d'tudier ces deux populations et le virulome associ dans des cosystmes modles
ou rels soumis diffrents rgimes : composition physico-chimique varie (matire organique, minraux,
acidit...), traitements biocides chimiques ou physiques rguliers ou occasionnels, pollutions, changements
de tempratures... L'objectif principal est une meilleure comprhension de l'influence de ces facteurs sur la
prolifration des protozoaires et des bactries pathognes associes, et donc sur le virulome prsent dans
ces cosystmes.
5. 3.3- Protozoaires de l'environnement : amlioration des stratgies de contrle
Dans cette troisime partie nous nous attacherons mieux comprendre l'effet des traitements
biocides sur les protozoaires associs aux biofilms, mais aussi sur les virus d'amibes qui sont des
rgulateurs importants des flores amibiennes. L'objectif est de dterminer quels sont les traitements biocides
les plus pertinents pour contrler la flore protozoaire sans pour autant radiquer des lments essentiels de
rgulation de cette flore.
Effet des traitements de dsinfection sur la slection des protozoaires et des bactries pathognes :
Quelques tudes rapportent l'effet global des traitements de dsinfection sur protozoaires (amibes
principalement) et les biofilms. Cependant ces tudes sont souvent limites des conditions exprimentales
bien dfinies et d'importantes questions restent explorer. Notamment, il semblerait que certains traitements
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biocides pourraient slectionner des espces et/ou des souches bactriennes qui sont plus rsistantes ces
traitements mais aussi plus mme de crotre dans les protozoaires (amibes) et par voie de consquence
probablement plus pathognes pour l'homme et les animaux. Cela pourrait tre le cas par exemple pour les
mycobactries non tuberculeuses : des tudes rcentes dmontrent que des souches prsentant des
mutations des gnes codant pour les porines sont plus rsistantes aux biocides base d'aldhydes, plus
mme de survivre la phagocytose et de se multiplier dans les amibes et dans les macrophages, et plus
rsistantes diffrents traitements antibiotiques. Les amibes tant elles-mmes trs rsistantes aux biocides
base d'aldhydes, y compris sous leur forme trophozoite, l'utilisation de tels biocides peut thoriquement
avoir pour consquence une prolifration d'amibes et de mycobactries pathognes associes dans les
rseaux. C'est un point extrmement important car, comme nous l'avons dj mentionn plus haut, les
infections mycobactries non tuberculeuses sont en constante augmentation sans que l'on sache expliquer
quelles modifications de l'environnement ont pu entraner ce changement d'pidmiologie. Le mme type de
processus de slection par les traitements biocides pourrait tre luvre pour d'autres bactries
pathognes. Dans ce contexte, nous souhaitons tudier l'volution d'cosystmes complexes sous l'effet de
diffrents traitements biocides. La question est de savoir si certains traitements biocides peuvent promouvoir
l'apparition de flores bactriennes pathognes en slectionnant des amibes (Acanthamoeba, Hartmannella)
qui sont plus susceptibles l'infection par des bactries pathognes, alors que d'autres amibes (Willaertia...)
qui sont elles capables de digrer les espces bactriennes pathognes sont inactives par ces traitements
biocides. Diffrentes espces amibiennes dont le comportement vis--vis des bactries pathognes dans les
biofilms aura dj t explor (cf ci-dessus) seront implantes dans des biofilms modles dops en bactries
pathognes fluorescentes et l'cosystme sera soumis diffrents types de traitements biocides. Nous
utiliserons des techniques d'imagerie confocale ainsi que des quantifications classiques sur gloses afin
d'observer si les proportions relatives d'amibes et despces bactriennes pathognes augmentent pendant
le traitement et lors de la recroissance du biofilm aprs l'interruption du traitement.
Sensibilit de l'espce Hartmannella vermiformis aux traitements biocides : alors qu'un certain
nombre d'tudes ont t publies propos de la sensibilit aux biocides des espces amibiennes
appartenant au genre Acanthamoeba, il n'existe que trs peu de donnes concernant H. vermiformis. Seules
quelques tudes rapportent une rsistance trs leve des kystes d'H. vermiformis au chlore et des
tempratures leves. Hors nous avons montr que cette espce pourrait tre slectionne par les
traitements mis en uvre lors de certains processus de potabilisation de l'eau, et plusieurs tudes confirment
que cette espce est largement rpandue, voire mme prdominante dans les rseaux de distribution d'eau.
Elle pourrait donc tre aussi largement prsente dans tous les systmes en contact direct ou indirect avec
l'eau potable : canalisations, systmes d'arrosage et d'irrigation, surfaces des ateliers, bassins d'levage... Il
a aussi t dmontr qu'H.vermiformis pouvait servir de Cheval de Troie pour L . pneumophila, P.
aeruginosa, Francisella novicida... L'tude de l'efficacit des biocides sur les trophozoites et les kystes d' H.
vermiformis est donc importante afin de mieux comprendre la distribution de cette espce dans les
cosystmes soumis ces diffrents types de traitements biocides. Afin de raliser cet objectif nous
utiliserons des mthodes simples de mise en contact des kystes d'une dizaine de souches d'H. vermiformis
diffrentes avec les produits tester suivie d'une neutralisation et d'un dnombrement sur gloses
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ensemences avec E. coli. Cette mthode est dcrite dans notre tude publie en 2010 dans Journal of
Clinical Microbiology . Les souches prsentant des rsistances leves seront tudies de manire plus
fine : microscopie lectronique, composition de la paroi des kystes
Importance des virus d'amibes dans la colonisation des biofilms par les amibes et impact des biocides
sur ces virus : De nouveaux virus infectant les amibes du genre Acanthamoeba ont rcemment t dcrits.
L'infection des amibes susceptibles est trs efficace, entranant une inhibition de l'enkystement, un
dtachement des amibes infectes et une lyse complte en 12 16h. Il est donc tout fait plausible que ces
virus jouent un rle primordial dans la rgulation des flores amibiennes. A titre de comparaison, les
populations de micro-algues marines (Emiliania huxleyi) qui sont capables de produire de vastes
efflorescences alguales dans l'ocan (blooms visibles depuis l'espace) sont rgules par des virus
appartenant au mme groupe que les virus d'amibes. L'tude des interactions amibes-virus est donc
essentielle afin de permettre la comprhension de l'cosystme biofilm dans sa globalit, avec la cl une
meilleure gestion des risques infectieux lis ces biofilms. Dans un premier temps, la capacit de survie
extracellulaire des virus d'amibes sera tudie. En effet il n'existe que trs peu de donnes publies sur ce
sujet. Il a seulement t rapport que l'un d'entre eux (Mimivirus) est capable de survivre en suspension en
labsence d'amibes pendant plusieurs mois et qu'il est significativement rsistant diffrents stress tels que
la chaleur et la dessiccation (70). Nous tudierons la capacit de survie extracellulaire de plusieurs virus en
suspension dans diffrents milieux mais aussi l'tat sec sur diffrentes surfaces et en prsence de matire
organique. L'effet des traitements biocides sur les virus d'amibes sera aussi tudi. Du fait de l'apparente
incapacit des amibes infectes par les virus s'enkyster, ces virus ne peuvent pas tre protgs par les
kystes amibiens. Les traitements biocides peuvent donc potentiellement avoir un impact important sur ces
rgulateurs des populations amibiennes. Nous tudierons l'effet de traitements de dcontamination usuels
sur ces virus, en utilisant les mthodologies classiques des tests de virucidie : mise en contact du virus avec
le biocide, neutralisation et ensemencement des dilutions sries sur un hte cellulaire sensible l'infection.
Nous chercherons dterminer quels sont les traitements biocides les plus efficaces pour contrler la
prolifration des amibes (trophozoites et kystes) tout en permettant la survie des virus qui pourront rinfecter
les amibes afin dviter leur prolifration aprs larrt du traitement biocide. L'cologie des virus dans les
biofilms sera galement aborde. Des techniques de spectroscopie corrlation spatiale de fluorescence
seront utilises afin d'tudier si ces virus gants (250 500 nm de diamtre) peuvent diffuser et
s'implanter dans les biofilms. La survie des virus dans diffrents types de biofilms sera galement tudie,
ainsi que l'impact des virus sur la flore amibienne en relation avec ces cosystmes complexes. Des biofilms
comprenant plusieurs espces bactriennes seront constitus, inoculs avec des virus d'amibes puis par la
suite avec diffrentes espces d'amibes. Nous suivrons l'volution de la flore amibienne en utilisant des
mthodes d'ensemencement sur glose et/ou des mthodes d'hybridation des amibes avec des sondes
spcifiques (sondes ciblant l'ARNr 18S par exemple). Enfin l'effet global des traitements biocides sur les
virus, les biofilms et la flore amibienne associe sera tudi.
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5.3- Collaborations en cours et envisages
L'quipe du Dr Romain Briandet (UMR763 INRA-AgroParisTech, Bioadhsion et Hygine des
Matriaux, Massy) fait partie du ple Risques de l'Institut Micalis (MICrobiologie de l'ALImentation au
service de la Sant humaine). Cette quipe a dvelopp une expertise importante dans l'tude des biofilms
bactriens en relation avec les activits industrielles agro-alimentaires, et dans l'tude de l'effet des
traitements biocides sur ces biofilms. Nous avons dj eu l'occasion de collaborer avec l'quipe du Dr
Briandet dans le cadre d'un projet ple de comptitivit, avec six publications communes la cl. Les
techniques utilises dans la caractrisation des souches bactriennes ainsi que dans l'observation et
l'analyse des biofilms en microscopie confocale seront trs utiles la mise en uvre du projet.
Les expriences de mtagnomique en vue de caractriser le virulome intra-protozoaires des
cosystmes s'inscrivent dans le programme Mta-omiques des cosystmes microbiens du
dpartement MICA de l'INRA. Ces analyses pourront tre ralises sur la Plateforme bioinformatique
MIGALE du Centre INRA de Jouy. Nous avons aussi des collaborations de recherche en cours avec l'quipe
du Dr Greub, situe l'hpital de Lausanne (Suisse). Cette quipe est spcialise dans l'tude des micro-
organismes pathognes mergents en sant humaine et animale, elle travaille notamment sur les nouvelles
Chlamydiae et les nouveaux virus d'amibes. L'quipe du Dr Greub pourra tre sollicite pour l'tude de
facteurs de virulence particuliers issus des virulomes caractriss.
L'tude des interactions protozoaires-mycobactries suscite un vif intrt aussi bien dans le domaine
de la sant humaine que dans celui de la sant animale, il nous semble donc intressant d'approfondir cette
thmatique notamment concernant l'espce M.avium sbsp paratuberculosis. Nous collaborons actuellement
avec l'quipe du Dr Mary Jackson, du collge de mdecine vtrinaire et de sciences biomdicales de
l'Universit du Colorado, localise Fort Collins (tats-Unis). Cette quipe s'intresse aux mcanismes de
virulence de certaines espces de mycobactries, mais aussi aux mcanismes de rsistance aux biocides et
leur survie dans l'environnement. A ce titre le Dr Jackson est trs intress par les relations mycobactries-
amibes et souhaite dvelopper ce modle d'tude de la virulence dans son laboratoire.
Concernant l'tude des diffrences de sensibilit des souches de protozoaires aux biocides, nous
envisageons ventuellement de collaborer avec le Pr Yann Hchard, du Laboratoire de Chimie et
Microbiologie de lEau de l'Universit de Poitiers (CNRS UMR 6008). Ce laboratoire utilise notamment des
techniques de cytomtrie en flux couples des marquages de viabilit, ainsi que des techniques d'analyse
de la composition de la paroi des kystes.
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