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Biotecnologa de los Productos Agroindustriales 2013

INFORME DE LA PRACTICA DE LABORATORIO N 3 DETERMINACION DE CAPACIDAD FERMENTATIVA DE UNA LEVADURA I. INTRODUCCION


La presente practica de laboratorio nos es de mucha utilidad para su aplicacin en el contexto de la biotecnologa, puesto que al manejar microorganismos es necesario tener el conocimiento de cuanto metabolito deseado va a producir en una determinada cantidad de sustrato, es por esto que con este ensayo se hace el respectivo calculo en caso de necesitar una reproduccin mayor, en el amplio campo de la agroindustria.

II.

OBJETIVOS

Calcular el rendimiento real de produccin de alcohol mediante fermentacin en base al sustrato utilizado. Comparar dicho rendimiento real con el ideal o estequiometrico, obteniendo la eficiencia del proceso realizado.

III.

FUNDAMENTACION TEORICA

GLUCOLISIS Es una de las rutas ms importante por su frecuencia en los seres vivos. El metabolismo de la glucosa comienza con la gluclisis, (ciclo de Embden Meyerhof) acoplada a la ruta de las pentosas. Durante la gluclisis una molcula de glucosa rinde dos molculas de cido pirvico, es decir una molcula de seis tomos de carbono se escinde en dos de tres. Se puede estructurar en 2 etapas: 1. Pasar de Glucosa a Fructosa-1,6-difosfato. 2. Pasar de Fructosa-1,6-difosfato a dihidroxiacetona y gliceraldehido. La primera fase es una fase de alteracin qumica para dejar la molcula til para la clula.
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Primera fase de la gluclisis 1. La glucosa se fosforila en el alcohol por la hexoquinasa. La hexoquinasa une el fosfato del ATP mediante un enlace fosfoster y la transforma en Glucosa-6-fosfato. La Glucosa-6-P est preparada para los procesos que continan en la gluclisis. La fosforilacin transforma 1 molcula neutra en una molcula cargada negativamente. Hace que ahora, la glucosa-6-P no pueda volver a salir por la membrana debido a su carga negativa. 2. A la clula no le gusta la forma aldosa y hace la forma cetosa (Fructosa-6-P). Es realizado por la fosfoglucosa isomerasa. 3. Implica la adquisicin de un segundo fosfato que va a parar al C1 y forma la fructosa-1,6-bisfosfato. Lo relaiza la fosfofructoquinasa-1 (PFK-1). La fructosa-1,6-bisfosfato es completamente simtrica. La PFK-1 es un enzima clave en la gluclisis. 4. La fructosa-1,6-bisfosfato se parte por la mitad y da dos molculas (dihidroxiacetona-fosfato (DHAP) y gliceraldehido-3-fosfato (G3P)). La gluclisis se da a partir del gliceraldehido-3-P. El equilibrio est desplazado hacia la dihidroxiacetona-fosfato. Slo un 5% es Gliceraldehido-3-P. La desaparicin continua de G3P transforma la DHAP en G3P. Todo acaba siendo G3P. Segunda fase de la gluclisis A partir del G3P comienzan las transformaciones que dan lugar a Piruvato (Pyr) (reacciones de oxidacin). 1. La primera reaccin es que el enzima Gliceraldehido-3Fosfatodeshidrogenasa oxida el grupo aldehdo a cido (gasta un NAD, que se reduce a NADH). Produce un enzima que es capaz de incorporar un fosfato al cido carboxlico correspondiente. Se forma un ster. La fosforilacin a nivel de sustrato se consigue porque hay ATP con un fosfato ya activado. 2. El 1,3-Bisfosfoglicerato cede 1 fosfato para sintetizar ATP. La reaccin la cataliza la fosfogliceratoquinasa. El producto de la sntesis de ATP es el 3-fosfoglicerato. Sufre transformaciones que dan lugar a la sntesis de Pyruvato. El P3 debe pasar a la posicin 2. Se consigue
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mediante el enzima fosfogliceromutasa. La mutasa tiene un fosfato activo, que se lo da a la posicin 2. En un momento hay dos fosfatos, pero luego, se lo quita de la posicin 3. Todas las mutasas funcionan as. Se hace para liberar el OH en la posicin 3. 3. Se produce la deshidratacin del OH. Se transforma el alcohol en enol, por la enolasa. Es parecido a Pyruvato, pero con enol y un fosfato. Se llama fosfoenolpiruvato (PEP). Es una molcula muy inestable que se transforma en Pyruvato por la Pyruvatoquinasa y se acopla la energa que se desprende para sintetizar ATP. ANLISIS ESTEQUIOMTRICO DE LA GLUCLISIS Glucosa + 2Pi + 2 ADP + 2 NAD+ 2 Pyr + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ + 2 H2O

La gluclisi es una va que transforma la glucosa en Pyruvato y, a su vez, reduce 2 NAD+ del citosol a NADH y usa 2 ADP para formar 2 ATP. La clula en cuanto puede, transforma otros monosacridos a molculas que estn en la va de la gluclisis.

Figura 1. Diagrama de la glucolisis

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Limitaciones del Proceso La determinacin de los factores que limitan la gliclisis fermentativa del etanol son complejos debido a la interrelacin existente y a la naturaleza de los parmetros intervinientes durante el proceso de fermentacin. Algunos de ellos se deben tener en cuenta en la fermentacin alcohlica industrial. En las limitaciones que surgen durante el proceso se pueden enumerar algunos de los ms importantes como son:

Concentracin de etanol resultante: Una de las principales limitaciones del proceso, es la resistencia de las levaduras a las concentraciones de etanol (alcohol) que se llegan a producir durante la fermentacin, algunos microorganismos como el saccharomyces cerevisiae pueden llegar a soportar hasta el 20% de concentracin en volumen. En ingeniera bioqumica estos crecimientos se definen y se modelan con las ecuaciones de crecimiento celular dadas por las ecuaciones de Tessier, Moser y de la ecuacin de Monod. Acidez del substrato: El pH es un factor limitante en el proceso de la fermentacin ya que las levaduras se encuentran afectadas claramente por el ambiente, bien sea alcalino o cido. Por regla general el funcionamiento de las levaduras est en un rango que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos industriales procuran mantener los niveles ptimos de acidez durante la fermentacin usualmente mediante el empleo de disoluciones tampn. Los cidos de algunas frutas (cido tartrico, mlico) limitan a veces este proceso. Concentracin de azcares: La concentracin excesiva de hidratos de carbono en forma de monosacridos y disacridos puede frenar la actividad bacteriana. De la misma forma la baja concentracin puede frenar el proceso. Las concentraciones lmite dependen del tipo de azcar as como de la levadura responsable de la fermentacin. Las concentraciones de azcares afectan a los procesos de osmosis dentro de la membrana celular.

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Contacto con el aire: Una intervencin de oxgeno (por mnima que sea) en el proceso lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razn por la que los recipientes fermentadores se cierren hermticamente. La temperatura: El proceso de fermentacin es exotrmico, y las levaduras tienen un rgimen de funcionamiento en unos rangos de temperatura ptimos, se debe entender adems que las levaduras son seres mesfilos. Si se expone cualquier levadura a una temperatura cercana o superior a 55 C por un tiempo de 5 minutos se produce su muerte. La mayora cumple su misin a temperaturas de 30 C. Ritmo de crecimiento de las cepas - Durante la fermentacin las cepas crecen en nmero debido a las condiciones favorables que se presentan en el medio, esto hace que se incremente la concentracin de levaduras.

CICLO DE KREBS.

El ciclo de Krebs se desarrolla en las mitocondrias. El cido pirvico formado durante la gluclisis se convierte en acetil CoA, el cual a travs del ciclo de krebs se transforma en anhdrido carbnico. El paso de cido pirvico a acetil CoA tiene lugar en la matriz mitocondrial y es catalizado por la piruvato deshidrogenasa. El acetil CoA ahora entra en el ciclo de Krebs unindose al cido oxalactico para formar el cido ctrico, por medio de una isomerasa se transforma en isoctrico, el cual por medio de una descarboxilasa da lugar al alfa-cetoglutrico, este paso supone la liberacin de anhdrido carbnico y NADH.

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Figura 2.

Diagrama del ciclo de Krebs del piruvato,

El proceso comienza con la oxidacin produciendo un acetil-CoA y un CO2.

El acetil-CoA reacciona con una molcula de oxalacetato (4 carbonos) para formar citrato (6 carbonos), mediante una reaccin de condensacin. A travs de una serie de reacciones el citrato se convierte de nuevo en oxalacetato. El ciclo consume netamente 1 acetil-CoA y produce 2 CO2. Tambin consume 2 NAD+ y 1 FAD, produciendo 3 NADH y 3 H+ y 1 FADH+. El resultado de un ciclo es (por piruvato): 1 GTP, 3 NADH, 1 FADH2, 2CO2 cada molcula de
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Cada molcula de glucosa produce (va gluclisis) dos molculas de piruvato, que a su vez producen dos acetilQuiroz Lozada, Melany del Pilar Alvarado Rivera, Jos Antonio | Ingeniera Agroindustrial

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CoA, por lo que por cada molcula de glucosa en el ciclo de Krebs se produce: 2 GTP, 6 NADH, 2 FADH2, 4CO2. Por cada molcula de acetil CoA se forman dos molculas de anhdrido carbnico, una GTP, tres NADH y un FADH2, el ciclo necesita la incorporacin de dos molculas de agua. En el ciclo de krebs se encuentran acopladas las lanzaderas, las cuales intervienen en diferentes procesos anablicos. De esta forma a partir del ciclo de krebs pueden formarse aminocidos, cidos grasos incluso glucosa (gluconeognesis). FERMENTACIN Todas las clulas estn capacitadas para sintetizar ATP por el proceso de la gliclisis. En muchas clulas, si el oxgeno no est presente, el piruvato es metabolizado en un proceso llamado fermentacin. La fermentacin complementa a la gliclisis y hace posible producir ATP continuamente en la ausencia del oxgeno. Por la oxidacin del NADH producido en la gliclisis, la fermentacin regenera el NAD+, el cual interviene otra vez en para producir ms ATP. C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP 2 CH3-CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 25.5 kcal Se puede ver que la fermentacin alcohlica es desde el punto de vista energtico una reaccin exotrmica, se libera una cierta cantidad de energa. Un clculo realizado sobre la reaccin qumica muestra que el etanol resultante es casi un 51% del peso, los rendimientos obtenidos en la industria alcanzan el 7%.

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Figura 3. Proceso de fermentacin En la fermentacin alcohlica, el cido pirvico de la gliclisis pierde un carbono en la forma de bixido de carbono para formas acetaldehdo, el cual es reducido a alcohol etlico, el NADH se convierte en NAD+ (es oxidado). Esta es la fermentacin que ocurre normalmente en las levaduras. Como en la fermentacin del cido lctico, la fermentacin alcohlica permite a la gliclisis continuar y asegurar que el NADH regresa a su estado oxidado (NAD+). La energa neta ganada en la fermentacin es de 2 molculas/glucosa de ATP. En ambas fermentaciones (lctica y alcohlica), todo el NADH producido en la gliclisis es consumido en la fermentacin, por lo tanto no hay produccin neta de NADH, y ningn NADH entra a la CTE y forma ATP. RESPIRACION: La reaccin siguiente: qumica global de la respiracin es la
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C6 H12 O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + energa (ATP) En este punto la clula ha ganado solo 4 ATP, 2 en la gluclisis y dos en el ciclo de Krebs, sin embargo ha capturado electrones energticos en 10 NADH2 y 2 FADH2. Estos transportadores depositan sus electrones en el sistema de transporte de electrones localizado en la membrana interna de la mitocondria. La cadena respiratoria est formada por una serie de transportadores de electrones situados en la cara interna de las crestas mitocondriales y que son capaces de transferir los electrones procedentes de la oxidacin del sustrato hasta el oxgeno molecular, que se reducir formndose agua. Como resultado de esta transferencia de electrones, los transportadores se oxidan y se reducen alternativamente, liberndose una energa que en algunos casos es suficiente para fosforilar el ADP y formar una molcula de ATP. Se trata de la fosforilacin oxidativa que permite ir almacenando en enlaces ricos en energa la energa contenida en las molculas NADH2, FADH2, NADPH2, que se liberan en la gluclisis y en el ciclo de Krebs y que ser ms tarde fcilmente utilizada. Toda cadena respiratoria que comience por el NAD conduce a la formacin de 3 ATP mientras que si comienza por el FAD produce slo 2 ATP. El rendimiento energtico del NADP es similar al del NAD, as como el del GTP lo es al del ATP.

IV.
MATERIALES

MATERIALES Y METODOS

Levadura simple Agua destilada Sacarosa INSTRUMENTOS Vasos de precipitacin Balones de vidrio Balanza analtica Potencimetro Refractmetro

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METODOLOGIA DE TRABAJO Se preparo 400 g de solucin de sacarosa de 20 y 10 Bx, a las cuales se aadi el 0.5% de levadura (1.5g), agitando vigorosamente a fin de homogenizar correctamente las muestras. Se separaron alcuotas de 100 g en los vasos de precipitacin con las cuales se tomaron los datos requeridos. Se tomo medidas de pH y Bx iniciales, as como peso exacto. Luego, estos datos se fueron tomando progresivamente durante una semana hasta obtener los Bx y pH finales. Las soluciones de 300 g iniciales puestas en los balones fueron utilizadas para medir cambios de peso a travs de la semana de fermentacin. Con estos datos se hizo el clculo respectivo para obtener la cantidad de alcohol producido por fermentacin.

V.

RESULTADOS Y DISCUSION

No todos los datos respectivos fueron tomados pero al ser referenciales no alteran nuestros resultados, los mismos datos que se muestran a continuacin: Tabla 1. Datos obtenidos con soluciones de sacarosa para hallar produccin de alcohol mediante levadura.
DIAS Da 1 (inicial) Da 2 Da 3 Da 4 Da 5 Da 6 Da 7 Da 8 (final) SOLUCION 10 Bx Bx REALES pH PESO (g) 10 5,3 300,6 ----293,3 ----------------286,2 ----285,8 ----285,6 2,8 --285,4 SOLUCION 20 Bx Bx REALES pH PESO (g) 19,7 5,45 300,1 ----292,6 ----------------278,4 ----274,9 ----273,2 7,1 --271,9 10

Los datos en lneas punteadas no se tomaron por ser fin de semana o no hubo instrumento disponible, de los Bx solo se requiri el inicial y final de cada solucin por lo que tenemos los datos necesarios para nuestros clculos.
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Sabemos que el rendimiento estequiometrico de fermentacin proviene de la reaccin qumica siguiente: la

Y el de la respiracin seria: Donde lo ideal sera que toda el azcar de la solucin se transforme en alcohol se tiene el rendimiento ideal que seria:

Luego:

El rendimiento real viene de la misma proporcin entre alcohol producido y sacarosa consumida, pero como las soluciones tuvieron ciertos grados Bx al ltimo da, se asume que no todo el azcar fue consumida por lo que se hallo el rendimiento real en base a los siguientes clculos:

Y
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De lo que se tiene para las soluciones:

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10 Bx Dixido 20 Bx Dixido -> 22.0688 g azcar de carbono producido -> 39.8148 g azcar de carbono producido consumido, consumido, 15.2 28.2 g g de de

Tambin se tiene:

( ( Luego:

) )

( (

) )

10 Bx -> 23.230316 g glucosa consumida 20 Bx -> 41.910316 g glucosa consumida

Adems, de la reaccin inicial de glucosa y productos: 180 g glucosa ---- 88 g Dixido de carbono X ---------------- A

180 g glucosa ---- 264 g Dixido de carbono Y ---------------- B

Ahora, de la glucosa consumida y el CO2 total producido: 10 Bx ->

Donde nos interesa hallar el valor de X, que seria la glucosa consumida en el proceso de fermentacin y no el Y que seria de respiracin: X = 19.3000195 g de glucosa consumida por la fermentacin.
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20 Bx ->

Luego, X seria: X = 34.0245649 g de glucosa consumida por la fermentacin. Despus de esto hallamos el rendimiento real del proceso: ( )

10 Bx -> ( )

Rendimiento real solucin de sacarosa de 10 Bx R. real = 44.6986443 % 20 Bx -> ( )

R. real = 43.6780624 % Despus de esto se hall la eficiencia: 10 Bx ->

20 Bx ->

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Es sabido que a elevadas concentraciones de soluto, algunas levaduras experimentan una plasmlisis celular, y otras alteraciones que disminuyen el crecimiento microbiano lo cual sugerira la baja o nula produccin de etanol (Casas, 1999). Para nuestro caso solo se utilizaron concentraciones de 10 y 20 Brix las cuales son ideales para que la levadura produzca alcohol evitando que la levadura se estrese, lo cual lo podemos verificar con el rendimiento obtenido para la muestra de 10Brix tuvo un rendimiento de 44.6% y de la de 20 Brix tuvo un rendimiento de 43.6 % el cual est cerca al rendimiento ideal; obtenindose como eficiencia el y el respectivamente para cada muestra, de esto podemos decir que la levadura tuvo un buen rendimiento en la produccin de alcohol. La fermentacin alcohlica es un proceso muy complejo; el incremento de la concentracin de etanol a medida que transcurre la fermentacin supone un obstculo para el correcto crecimiento y desarrollo microbiano por los efectos negativos que esto conlleva (Oviedo et al, 2009).Esto se relaciona con lo dicho por (Casas, 1999) ya que a altas concentraciones de azcar la levadura va a tener problemas ya que se incrementa la presin osmtica el cual sera un problema al inicio, y el otro problema sera que a mayor concentracin de azcar la concentracin de alcohol en el medio va a ser ms alto entonces la levadura quedara inhibida. Segn Concepcin M (1999), la fermentacin es un proceso mediante el cual la levadura convierte azcares en alcohol, CO2 y otros metabolitos secundarios, teniendo en cuenta que los fermentos alcohlicos son productos biolgicos, la interrelacin de los eventos microbiolgicos, bioqumicos y de ingeniera, as como su conocimiento y cuidadoso manejo son los llamados a jugar el papel esencial en el xito del proceso fermentativo, siendo este ltimo el causante de las principales prdidas en la produccin.

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La fermentacin est influenciada por varios factores como la temperatura, pH, concentracin de azcares y otras variables que influyen en el crecimiento de los microorganismos (Gmez, et al 2007).

La temperatura ptima para la formacin de alcohol se estima en el rango de 32 C a 35 C (Navarro et al, 1986). El xito de una buena fermentacin depende de la eficacia del tratamiento preliminar: concentracin del azcar, pH y temperatura ptimos; la adicin de sustancias nutritivas al mosto, contaminacin por otros microorganismos, empleo de un organismo resistente a altas concentraciones de alcohol, mantenimiento de condiciones anaerobias y la inmediata destilacin del producto fermentado (Prescott y Cecil, 1992).

VI.

CONCLUSIONES
Se logr hacer la medida respectiva de grados Brix y masa de las soluciones con las cuales se trabaj obteniendo el rendimiento terico o estequiomtrico, a su vez comparndolo con el rendimiento real basado tambin en calculo, obtenindose una eficiencia de 83.083% y 81.186% entre ambos rendimientos para cada solucin respectivamente. Nuestro rendimiento real se diferencia un tanto con el ideal por lo que se concluye que falto un mayor tiempo de proceso fermentativo para que dicha eficiencia se acerque al 100%.

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VII. BIBLIOGRAFIA
Casas, E. 1999. en Microorganismos alimentos de Madrid. responsables Tesis de

alteraciones Universidad Facultad de

altamente

azucarados. Doctoral. de

Complutense Ciencias

Biolgicas,

Departamento

Microbiologa. Madrid, Espaa.

Gmez, S. 2007. Capacidad fermentativa de cepas de Saccharomyces Cerevisiae nativas de la regin productora de mezcal de Durango. XII Congreso Nacional de Biotecnologa y Bioingeniera. Mxico.

Navarro,

A.

1986.

Produccin

de

etanol

por

fermentacin con alta concentracin levaduras. Revista Argentina de Microbiologa 18 (1): 7-11.

Oviedo, L. et al; 2009.

Levaduras autctonas con

capacidad fermentativa en la produccin de etanol a partir de pulpa de excedentes de pltano Musa (AAB Simmonds) en el Revista 40-47. departamento de de Crdoba, Colombia. Universidad Colombiana Biotecnologa.

Nacional de Colombia. Vol. XI, Nm. 1. Colombia. pp.

Prescott

Cate,

Samuel,

Cecil

Gordon,

Dunn.

1992.
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Microbiologa Industrial. Aguilar Madrid. p: 110-158

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VIII. ANEXOS Imgenes de la prctica realizada

Figura 1. Soluciones de sacarosa con las que se trabaj Figura 2. Medicin de pH

Figura 4. Medida de grados Bx

Figura 3. Pesado de soluciones 17

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INFORME DE LA PRACTICA DE LABORATORIO N 4 DETERMINACION DE CONTENIDO ALCOHOLICO DE SOLUCION DE SACAROSA FERMENTADA POR LEVADURA I. INTRODUCCION

Ya hemos estudiado la capacidad fermentativa de la levadura, mediante clculos estequiometricos de lo que se debera producir, no siendo este rendimiento tan alto por diversos factores, en la presente prctica se trabaj con una de las soluciones fermentadas mediante destilacin y densimetra de tal forma que se halle la cantidad de alcohol producido en dicha solucin, a su vez que podamos comparar esta cantidad con lo calculado en la primera practica para ver que tanto se asemejan nuestros resultados.

II.

OBJETIVOS

Determinar mediante densimetra el contenido alcohlico de la solucin fermentada, a su vez que se tome como referencia la temperatura de la misma. Determinar mediante el mismo mtodo el contenido alcohlico del destilado de la muestra, apoyndose en tablas hidroalcoholicas. Comparar resultados con los de la prctica anterior.

III.
MATERIALES

MATERIALES Y METODOS

Solucin de sacarosa de 20Bx proveniente de la prctica anterior. Agua destilada INSTRUMENTOS

inicial

fermentada

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Equipo de destilacin simple Baln de destilacin Matraz Erlenmeyer

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Vasos de precipitacin Picnmetros Balanza analtica Alcoholmetro

METODOLOGIA DE TRABAJO De la solucin de sacarosa fermentada se hall mediante tablas hidroalcoholicas, la cantidad de alcohol presente en dicho mosto mediante densidad y temperatura, adems de tomar el dato de grados Gay Lussac mediante el uso del alcoholmetro. Esta solucin se pas al equipo de destilacin, donde se obtuvo alcohol, luego se enraso en una fiola a 100 ml de esta solucin se volvi a tomar dichos datos, comparando con los valores de la tabla hidroalcoholica. Adems de comparar dicha cantidad con el alcohol producido estequiometricamente de la prctica anterior.

IV.

RESULTADOS Y DISCUSION

Los datos con los que se trabaj fueron los siguientes: Tabla 1. Datos bsicos de mosto utilizado y destilado para determinar contenido alcohlico

MUESTRA GL (Alcoholmetro) MOSTO FERMENTADO INICIAL SOLUCION DESTILADOAGUA 8 ---

DATOS Densidad (g/ml) 0.997786 0.987779 Temperatura (C) 23 26

RESULTADO Contenido alcohlico (tabla) 0.141833333 % 4.94796878 %

Como podemos observar, lo que nos muestra el alcoholmetro es un valor muy alto para lo que nos seala la tabla, estos valores se hallaron mediante interpolacin utilizando como base la temperatura y densidad de la solucin (Anexo 1). De aqu notamos que hay una diferencia profunda entre dicho rendimiento obtenido mediante destilacin y el obtenido
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estequiometricamente, por lo que se asume que no toda la sacarosa presente en el mosto fue degradada para que pase a convertirse en alcohol.

Luego podemos inferir que la diferencia de resultados entre el alcoholmetro y la tabla se debe a que la solucin no es una muestra especfica de agua y alcohol si tambin presenta otras sustancias orgnicas las cuales hacen que se obtenga resultados errneos, lo cual hizo aumentar la densidad que no es baja, como es la caracterstica del alcohol, de aqu que haya equilibrio entre dicha densidad y la del azcar hacindola parecida a la del agua, por tanto al comparar estas densidades con la tablas nos arrojan contenidos alcohlicos diferentes a los encontrados en los clculos estequiometricos de la prctica anterior

V.

CONCLUSIONES
Se encontraron valores inferiores a los encontrados por el mtodo estequiometrico. Se pudo observar que hubo diferencia en los clculos de contenido alcohlico.

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VI. ANEXOS Imgenes de la prctica realizada

Figura 1. Determinacin de grados Gay Lussac mediante alcoholimetro

Figura 2. Destilacin de muestra fermentada

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Figura 3. Tabla hidroalcohlica utilizada

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