Evolucin Molecular

Tarea-Exmen 1 13 de marzo de 2009

Lee con cuidado la tarea, si no son suficientes las instrucciones, consulta el manual del programa. Es necesario bajar el programa DnaSP (http://www.ub.edu/dnasp/), es gratuito y es para Windows, aunque no es recomendable, pueden usar mquinas virtuales para correrlo en otros sistemas operativos (Mac, Linux) (ni modo, a veces es necesaria la mugre esa de microsoft). Los juegos de datos se encuentran en el archivo Datosevo.zip Los archivos vienen en distintos formatos con distintas extensiones, es importante no dar doble click a los archivos, ya que Windows puede asociarlos a otros programas y generar conflictos. A parte de obtener datos, la meta es dar un significado biolgico en trminos de evolucin molecular a los resultados obtenidos, esto implica que tendrn que investigar en la literatura para interpretar los resultados. NOTA: Mximo 1 cuartilla por ejercicio.

Ejercicio 1: Seleccin a Nivel Molecular en VIH-1

Planteamiento El tratamiento de la infeccin del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 con inhibidores de la reversa transcriptasa (RT), esta limitado por la emergencia de resistencia debido a cambios especficos de anminocidos en la secuencia de la RT. Marcador: 53 secuencias de la RT del VIH en diversos pacientes de E.U. Programa: DnaSP. Parmetros a calcular: Diversidad Nucleotdica (), Sitios segregantes (), D' Tajima. Instrucciones a) Abre desde DnaSP el archivo VIH.fas. b) Click en Analysis y click en DNA polymorphism, observa los valores de Nucleotide diversity, Pi y Theta (per site) from Eta. c) En Analysis, click en Tajima's Test poner OK observar los resultados. d) Repetir lo anterior, pero ahora en la seccin Sliding Window seleccionar Compute y en las casillas Window length y Step size poner 50 y 10 respectivamente. e) Observa en la tabla los puntos que son significativos (*P<0.05; ** P<0.01; ***P<0.001). f) Click en DnaSP Graph luego Select graph y luego D. Preguntas: 1. Qu puedes deducir a partir de los estimados de diversidad y ? Compara los resultados con la literatura. 2. Interpreta los valores de la D' Tajima, toma en cuenta el valor global y por ventanas de la grfica, toma en cuenta la significancia de cada pico. 3. Asumiendo neutralidad, calcula el tamao efectivo del VIH en esta muestra de pacientes con una tasa de mutacin de 1x10-3. Discute tu resultado. 4. Afirmaras que el marcador en cuestin obedece al modelo neutral de Kimura? Por qu? 5. Qu importancia tendran estos resultados en la bsqueda de una cura para el VIH?

Ejercicio 2: Diversidad del MHC en aves rapaces

Planteamiento El Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) est encargado de la respuesta inmune contra agentes infecciosos. En el caso particular de las aves rapaces se tienen registros de su suceptibilidad a enfermedades contagiosas provenientes de aves de corral. Marcador: 464 secuencias de 414 pb de exones del MHC de distintas especies de aves rapaces. Programa: DnaSP. Parmetros a calcular: Diversidad Nucleotdica (), Sitios segregantes (), D' Tajima. Instrucciones Usar las mismas instrucciones que el ejercicio anterior usando el archivo MHC_Rapaces.fas. Preguntas: 1. Compara la diversidad del MHC con otros genes reportados. Cmo consideras los niveles de diversidad? 2. Tomando en cuenta tus resultados, Cmo explicaras tal cantidad de variacin? 3. Observa con cuidado la grfica de la D' de Tajima e interprtala (tomando en cuenta tambin la significancia). Qu explicacin das a las diferencias de los valores de D' a lo largo del gen? 4. Crees que este marcador funcione para calibracin de reloj molecular? Fundamenta tu respuesta.

Ejercicio 3. El marcador misterioso.

Planteamiento Bonilla et al., (2009) reportaron en el Genbank este juego de secuencias tituladas como Unknown organism. Marcador: 100 secuencias de 300pb de un locus desconocido. Programa: DnaSP. Parmetros a calcular: Diversidad Nucleotdica (), Sitios segregantes (), D' Tajima. Instrucciones Igual que en los ejercicios anteriores pero usando el archivo Bicho_raro.phy. Preguntas: 1. Se comporta bajo un modelo neutral?Qu implicaciones tiene esto para el estudio de la evolucin de estos organismos desconocidos? 2. Qu fuerza(s) evolutiva(s) explica(n) la diversidad observada en este locus? Fundamenta tu respuesta. 3. Tomando en cuenta tus respuestas, Qu funcin supones que puede tener este locus (por ejemplo, en el metabolismo, replicacin, etc.)? 4. En base a los valores de diversidad Qu puedes decir del tamao efectivo de estos organismos?Podras afirmar que han sufrido de cambios en su tamao poblacional? 5. A qu grupo de organismos supones que pertenecen estas secuencias?

Ejercicio 4: Lacertilios y la prueba de Mcdonald-Kreitman

Planteamiento El gen mitocondrial ND4 codifica para la protena NADH deshidrogenasa 4. Esta protena es parte de un gran complejo conocido como Complejo 1, el cual est activo en la mitocondria y es responsable junto con otros complejos de la fosforilacin oxidativa y especficamente interviene en el transporte de electrones (para obtener ATPs). Se sabe que mutaciones en este gene son mortales y slo en algunos casos los organismos pueden sobrevivir como es el caso de la mutacin G11778A que es un remplazo de arginina por histidina en el sitio 340, lo que provoca la enfermedad de Leber, que es una neuropata que provoca la prdida de la visin. Por otra parte el ND4 ha sido utilizado con muy buenos resultados en estudios filogenticos y filogeogrficos en una amplia variedad de reptiles y anfibios. Marcador: 152 secuencias de ND4 provenientes de distintas especies (y poblaciones) de lacertilios del gnero Sceloporus, quiz el gnero de ms comn y de ms amplia distribucin en Mxico. Programa: DnaSP Parmetros a calcular: Diversidad Nucleotdica (), Sitios segregantes (), Substituciones sinnimas y no sinnimas, Polimorfismos sinnimos y no sinnimos, Prueba de McDonalKreitman (MK). Instrucciones Abre desde DnaSP el archivo Scel_Nd4.fas. Aparecer una pantalla con la informacin del gene, cirrala. Click en Data, despus click en Format. Observars una serie de recuadros, escoge las opciones de DNA, haploide y mitocondrial y click en OK, para as indicarle al programa con qu tipo de gene estamos trabajando. Click en Display y luego en View Data o simplemente oprime el cuadro que en su interior marca ATG en distintos colores, y que se encuentra por debajo del men principal. De esta manera podrs observar la matriz de datos que acabas de cargar. Vuele al men Data y click en Assign Coding Regions, aparecer un cuadro para asignar en donde quieres que comiencen los codones, escoge la posicin del nucletido 1, o sea desde el primer nucletido que aparece en tu matriz, y da OK. Aparecer un caudro preguntndote si quieres asignar ms regiones, dile que no. Nuevamente abre el menu Data y da click en Assign Genetic Code. Se abrir un cuadro en donde aparecern distintas opciones de cdigos genticos, escoge la de mtDNA mammals, que es el cdigo ms cercano a los reptiles, da OK. Ahora tenemos que definir los grupos de datos a comparar. Nuevamente en Data oprime la opcin Define Sequence Sets o da click en el cuadro que tiene dos tablas dibujadas y que esta junto al botn que tiene unas tijeras. Aparecer un cuadro con dos pantallas, en la primera estn todos los nombres de las secuencias en la matriz. Escoge todos los organismos con excepcin de Grammicus 1 y 2, luego oprime el botn >> y llvalos a la pantalla derecha (Included list). Despus da click en Select All (el que est bajo esta pantalla). Ahora oprime el recuadro que dice Add new Sequence set, aparecer una pequea pantalla en la cual le dars algn nombre corto o nmero para nombrar a este set de datos, despus da click en OK. La pantalla de la derecha se volver a llenar, ahora escoge a Grammicus 1 y 2 y vuelve a repetir los pasos anteriores para crear el nombre de un nuevo set de datos. Puedes jugar con el nmero de sub sets que tu desees, pero por ahora con estos dos es suficiente, da click en el cuadro Update All Entries que deber

aprecer en letras rojas. Ya tienes tus set de datos a comparar. Ve el men de Analysis y casi hasta el final da click en MacDonald-Kreirman test, aprecer una pantalla que indica la longitud de la secuencia y los set de datos. Deja los datos como estn y da click en OK. En caso que hayas creado ms set de datos, puedes escogerlos en el recuadro de Data Sets. Despus de marcar OK aparecer un recuadro dicindote que se encontr un codn de paro (el cual no aparece en la matriz de datos) o que un codn codifica para un a.a. no muy comn llamado Selenocysteina, da click en aceptar. Nota: Parece ser un bug en el programa ya que en otros programas como MaClade y con el adecuado marco de lectura no aparece este problema). Felicidades, en el fondo aparecer una pantalla verde con los resultados de tu anlisis. La Diversidad Nucleotdica () y los Sitios segregantes () se puedn calcular como se indico desde el ejercicio 1. Preguntas: 1. Qu te indican los resultados y los estadsticos de la prueba M-K? 2. Este tipo de prueba se basa en una suposicin bsica sobre la evolucin neutral, Cul es? (Pista: tiene que ver con la comparacin dentro y entre especies). 3. Cul es la diferencia entre polimorfismo y substituciones, y por qu son importantes en esta prueba? 4. Discute con fundamentos, cules seran las ventajas de este tipo de prueba en comparacin con la de Tajima y cules sus desventajas. (Pista: Se puede discutir en funcin de la sensibilidad a cambios demogrficos pasados y nmero de muestra). Dudas sobre este ejercicio: Comunicarse con Norberto Martinez o escribir al correo calaveracuantica@yahoo.com.mx