UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD DE INGENIERIA INDUSTRIAL Y DE SISTEMAS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA

AGROINDUSTRIAL

Alumnos: Armas Daz, Alexandra Benavides Saldaa, Alejandro Barboza Tena, Marco Chero Floreano, Yonatan E. Profesor: Blga. Maribel Huatuco Curso: Biotecnologa Trabajo: Produccin Microbiana De Biosurfactantes Y Polisacridos Extracelulares

Produccin Microbiana De Biosurfactantes Y Polisacridos Extracelulares

Lima, 2013

INTRODUCCIN

La actividad comercial, industrial y militar, en el siglo XIX y XX, han considerado los problemas de contaminacin medioambiental que pueden amenazar la salud humana y el funcionamiento del ecosistema. El grado al que tales contaminantes estn disponibles a la biota ha sido largamente investigado para ver todas las implicaciones reguladoras, cientficas y toxicolgicas. La biorremediacin, el uso de organismos (especialmente

microorganismos o plantas) para eliminar estos problemas de polucin tiene un inmenso potencial para conocer las necesidades del control de la contaminacin.

En general, los surfactantes estn integrados a procesos que utilizan diversos tipos de industrias en reas agrcolas, alimenticias, de cosmticos y petroqumica. La demanda industrial de estas molculas es alta en la industria petrolera, donde pueden ser empleadas en la emulsificacin de bit-menes. Ello, por una parte, permite una manipulacin ms fcil de los petrleos pesados durante su extraccin y transporte y, por la otra, se pueden emplear para elaborar frmulas de mezclas de carburantes y agua.

Los surfactantes de origen biolgico tambin se pueden emplear para desarrollar procesos que se han denominado biodesulfuracin, biocraqueo y bioremediacin que requieren de medios de cultivo con fases acuosas continuas. La ventaja de estos biosurfactantes sobre los de origen qumico es que son degradables Ahora bien La posibilidad de obtener compuestos qumicos de manera biolgica ha llevado a los investigadores a experimentar nuevas alternativas para su produccin y ha sido entonces cuando los procesos biotecnolgicos han empezado a ocupar un lugar de privilegio en la industria mundial. Dentro de este grupo de compuestos se encuentran los biopolmeros, una diversa y muy verstil clase de nuevos materiales con potenciales aplicaciones en muchos de los sectores de la economa. Estos van desde polisacridos como Dextranos, Alginatos y Xantanos hasta polisteres como los Poli-hidroxialcanoatos (PHAs). Los polisacridos, definidos como polmeros de unidades de azcar unidas por enlaces glicosdicos, han adquirido una importancia cada vez mayor en el mercado debido

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a las ya reconocidas aplicaciones en campos como la farmacutica, medicina, alimentos y la industria petroqumica. La obtencin de este tipo de biopolmeros va fermentativa es un proceso que est siendo ampliamente estudiado; el nmero de polisacridos que se descubren cada da va en aumento y con ello la cantidad de nuevas estructuras con propiedades diversas que le abren las puertas a nuevas aplicaciones.

La bacteria Rhizobium leguminosarum que ha sido utilizada como biofertilizante en la industria agrcola por su capacidad para fijar nitrgeno atmosfrico en plantas leguminosas, es adems un microorganismo capaz de producir tres biopolmeros diferentes, que hasta el momento no han sido muy estudiados; dos de ellos son polisacridos extracelulares, que se encuentran en el medio de cultivo y un tercero que est adherido a la pared celular como polisacrido capsular.

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BIOSURFACTANTE

Qu es un biosurfactante?

Los surfactantes son compuestos antipticos, es decir que estructuralmente sus molculas presentan dos partes diferentes, una hidrofbica y otra hidrofilia. Los surfactantes de origen biolgico o biosurfactantes son un grupo estructuralmente diverso de molculas tensoactivas, que presentan en general menor toxicidad y mayor biodegradabilidad que los surfactantes sintticos. Entre las aplicaciones ms estudiadas de los biosurfactantes estn aquellas relacionadas con la industria del petrleo y la bioremediacin de sitios o residuos contaminados con hidrocarburos. Atendiendo (orgnica) a estos criterios un biosurfactante sera una molcula biolgica

con propiedades surfactantes o tensoactivas producidas sobre superficies

vivas, mayormente superficies de clulas microbianas, o excretados al medio extracelular.

En los ltimos aos ha crecido el inters por evaluar la potencial utilidad de los biosurfactantes en las disciplinas mdicas y veterinarias, dado que existen estudios que demuestran propiedades antibacterianas, antimicticas, antivirales e incluso antitumorales en estos compuestos. Adems, los biosurfactantes tambin han mostrado contrarrestar la adhesin y la formacin de biofilms de microorganismos patgenos. Algunos de esos biosurfactantes han sido aplicados con xito en el tratamiento de residuos oleosos.

Los biosurfactantes presentan varias ventajas con respecto a los surfactantes qumicos, entre ellas su biodegradabilidad, baja toxicidad, incompatibilidad, especificidad y la amplia variedad de estructuras qumicas disponibles. Estas caractersticas han permitido, en los ltimos aos, el desarrollo de tcnicas de remediacin y de recuperacin asistida del petrleo residual que incluyen el uso de biosurfactantes, tanto a escala de laboratorio como a campo.

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Cmo Se Clasifican Los Biosurfactantes?

Los surfactantes microbianos son molculas complejas que cubren un amplio rango de estructuras qumicas incluyendo pptidos, cidos grasos, fosfolpidos, glicolpidos, antibiticos, lipopptidos, etc Los microorganismos tambin producen en algunos casos, surfactantes que son combinaciones de muchas estructuras qumicas como los surfactantes microbianos polimricos. Muchos surfactantes microbianos han sido purificados y sus estructuras qumicas son conocidas. Mientras que los de alto peso molecular son generalmente heteropolisacridos polianinicos que contienen tanto polisacridos como protenas, los de bajo peso molecular suelen ser glicolpidos

Podemos clasificar los biosurfactantes atendiendo a tres criterios: naturaleza qumica, peso molecular y carga inica de la parte superficialmente activa de la molcula.

1. Naturaleza qumica a) Lpidos b) Hidratos de carbono c) Aminocidos d) Glucolpidos e) Lipopptidos

2. Peso molecular a) Bajo peso molecular: Suelen ser glicolpidos. El ms estudiado es el rhamnolpido, producido por diversas especies como Pseudomonas. La funcin principal de estos biosurfactantes es reducir la tensin superficial entre fases (agua-roca por ejemplo). b) Alto peso molecular: Suelen ser polisacridos, protenas, lipoprotenas, lipopolisacridos o mezclas de estos polmeros. Estos biosurfactantes no son tan eficaces en cuanto a la reduccin de la tensin superficial entre

fases, pero si son bueno emulsionantes. Adems se ha demostrado que son muy eficaces a bajas concentraciones y poseen una considerable
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afinidad por el sustrato. Un ejemplo sera Alasan producido por Acinetobacter radioresistens.

3. Carga inica a) Agentes aninicos: Contiene generalmente uno de cuatro grupos polares

solubles-carboxilato, sulfonato, sulfato o fosfato- combinado con una cadena hidrocarbonada hidrfoba. Si esa cadena es corta son muy hidrosolubles y en el caso contrario tendrn baja hidrosolubilidad y actuaran en sistemas no acuosos como aceites lubricantes. Se usan principalmente en la industria de jabones y detergentes. b) Agentes catinicos: Estn compuestos por una molcula lipoflica y otra hidroflica, consistente de uno o varios grupos amonio terciario o cuaternario. Son utilizados comnmente en detergentes, agentes

limpiadores, lquido de lavaplatos, tratamiento de textiles, como sustancias activas antimicrobianas y en cosmtica. c) Agentes no inicos: No se disocian en iones hidratados en medio acuoso. Las propiedades hidroflicas son provistas por hidratacin de grupos amido, amino, eter o hidroxilo.

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d) Otros tipos de surfactantes: La combinacin en la misma molcula de un grupo con tendencia aninica y de un grupo con tendencia catinica produce un surfactante anfotrico, como por ejemplo los aminocidos, las betainas o los fosfolpidos. Segn el pH del medio una de las dos disociaciones prevalece. Este tipo de surfactante se usa slo en casos particulares debido a su alto costo. Estudio De La Produccin De Biosurfactantes

El estudio de la produccin de biosurfactantes es un punto a tomar en cuenta. Principalmente se usan tres mtodos para estudiar la produccin de estas sustancias por diversos microorganismos.

Estos tres mtodos son: drop collapse, oil spreading y blood agar lysis. El estudio comparativo de dichos mtodos se bas en la capacidad de los mismos de detectar la actividad tensoactiva de las sustancias estudiadas y aplicabilidad. Estos 3 mtodos se usaron para testar la produccin de biosurfactantes en 205 estirpes medio ambintales con diferentes afiliaciones filogenticas.

El 60% de las estirpes que dieron positivo con el mtodo blood agar lysis, dieron negativo con los otros dos mtodos, para la produccin de biosurfactantes. El 38% de las estirpes que dieron negativo con el mtodo del blood agar lysis resultaron positivas con los otros dos mtodos. As pues se pudo observar que exista una correlacin lineal negativa muy pronunciada entre el dimetro de la zona clara obtenida con el mtodo del oil spreading y la tensin superficial (rs=-0.959) y una leve correlacin entre el drop collapse y la tensin superficial (rs=-0.82) debido a la gran cantidad de falsos positivos y negativos obtenidos por la tcnica blood agar lysis y su pobre correlacin con la tensin superficial (rs=-0.15), no se utiliza como mtodo para detectar la produccin de biosurfactantes..

Esto nos sugiere que el mtodo del oil spreasing es ms preciso y ms fiable que el drop collapse. Visto los resultados se opta por usar como mtodo primario para la deteccin de biosurfactantes el mtodo drop collapse, seguido de una determinacin de las concentraciones de los mismos por medio del mtodo oil spreasing. Esto constituye
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un protocolo rpido y sencillo para escudriar y biosurfactantes cuantificar la produccin de

Para Qu Sirven Los Biosurfactantes?

Los contaminantes hidrofbicos presentes en los hidrocarburos del petrleo, suelos y aguas del medio ambiente requieren su solubilizacin antes de ser degradados por la clula microbiana. La mineralizacin est gobernada por la desorcin de los hidrocarburos del suelo. Los surfactantes pueden aumentar el rea de los materiales hidrofbicos, como pesticidas en suelos y agua del medio, aumentndose as su solubilidad en agua. Por tanto, la presencia de biosurfactantes puede aumentar la degradacin microbiana de los contaminantes.

Se le ha dado una atencin considerable a la produccin de molculas tensoactivas de origen biolgico por sus aplicaciones en el procesado de alimentos, aromatizacin de bebidas alcohlicas, reciclaje de papel, fabricacin de pulpa de papel, en farmacologa, y la industria del aceite. En relacin a esa ltima aplicacin, los accidentes que llevan a vertidos de aceite han llegado a ser numerosos y han causado catstrofes tanto sociales como ecolgicas.

La habilidad de los biosurfactantes para emulsionar hidrocarburos mezclados con agua ha sido ampliamente divulgada. Estas propiedades emulsionantes tambin se ha demostrado que favorecen la degradacin de los hidrocarburos en el medio ambiente, por tanto los hacen muy tiles para el control de la contaminacin por vertidos de aceites.

El

procedimiento mostrado en la figura es la flotacin por aire disuelto. En este

procedimiento se introduce por el fondo de la celda de flotacin una solucin acuosa saturada de aire bajo presin. Al suceder la expansin se forman burbujas de aire minsculas, las cuales colectan las gotas de aceite. Con surfactantes apropiados este mtodo se puede utilizar para separar una gran variedad de coloides.

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FIG.- Mtodos de separacin no convencional de pequeas gotas de aceite en medio acuoso

Desde el punto de vista de las cantidades producidas, la utilizacin principal de los surfactantes es la formulacin de jabones, detergentes y otros productos para el lavado y la limpieza. La figura muestra el caso de la accin detergente sobre un sucio slido. Las molculas de detergente deben poder adsorberse sobre el sucio y sobre el sustrato, y en particular situarse entre ellos para poder separarlos.

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FIG.- Fenmenos puestos en juego en la accin detergente

Las funciones

que haran estos biosurfactantes a

la

hora de aumentar la

biodisponibilidad seran

Dispersar el petrleo aumentando la superficie de contacto Aumenta la biodisponibilidad de compuestos hidrofbicos. Seran en este caso sobre todo los de bajo peso molecular. Poseen tambin funciones evolutivas para los propios microorganismos. Pueden ayudar a los microorganismos productores a desprenderse de las gotas de petrleo una vez se ha agotado la fuente de hidrocarburo que utilizaba.

Una propiedad de los biosurfactantes curiosa es su actividad bactericida. Dicha actividad se debe a su capacidad detergente. As pues, existen diferentes tipos de desinfectantes (Se suelen clasificar de acuerdo con su mecanismo de accin):

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I. Agentes que daan la membrana

1. Detergentes a) Catinicos b) aninicos c) no inicos

2. Compuestos fenlicos a) Fenol b) Cresoles c) difenilos halogenados d) alquilsteres del para-hidroxibenzoico e) aceites esenciales de plantas

3. Alcoholes a) Etanol b) b) isopropanol

II.

Agentes desnaturalizantes de protenas

1) cidos y bases fuertes 2) cidos orgnicos no disociables

III.

Agentes modificadores de grupos funcionales

1. Metales pesados a) Mercuriales b) compuestos de plata c) compuestos de cobre 2. Agentes oxidantes a) Halgenos

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b) agua oxigenada c) permanganato potsico d) cido peractico

3. Colorantes a) derivados de la anilina b) derivados de la acridina (flavinas)

4. Agentes alquilantes a) Formaldehido b) glutaraldehido c) xido de etileno c) -propionil-lactona

Surfactantes Microbianos

El inters por los surfactantes microbianos ha estado en aumento en los ltimos aos debido a sus diversas caractersticas deseables tales como una efectiva selectividad, respetuosos para la naturaleza, su estabilidad a elevadas temperaturas, a pH y concentracin de sales. Hay que aadir que los biosurfactantes han aumentado la versatilidad en comparacin a muchos surfactantes sintticos y tienen la ventaja de poder producirse por fermentacin.

Hay clulas microbianas intactas con una superficie celular altamente hidrofbica que son ellas mismas surfactantes. En algunos casos, los propios surfactantes juegan un papel natural en el crecimiento de las clulas microbianas sobre sustratos insolubles en agua. Los surfactantes extracelulares estn implicados en la adhesin celular, emulsin, dispersin, floculacin, agregacin celular y fenmenos de desorcin.

Aunque el tipo y cantidad de surfactante microbiana producido depende primeramente del organismo productor, factores como el carbono y el nitrgeno, elementos traza, temperatura, y aireacin, tambin afectan a su produccin por el organismo.

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Varios biosurfactantes producidos por bacterias:

Microorganismo Arthrobacter RAG-1 Arthrobacter MIS38 Arthrobacter sp. Bacillus licheniformis JF-2 Bacillus licheniformis 86 Bacillus subtilis Bacillus pumilus A1 Bacillus sp. AB-2 Bacillus sp. C 14 Candida antarctica Candida bombicola Candida tropicalis Candida lipolytica Y-917 Clostridium pasteurianum Corynebacterium hydrocarbolastus Corynebacterium insidiosum Corynebacterium lepus Strain MM1 Nocardia erythropolis Ochrobactrum anthropii Penicillium spiculisporum
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Biosurfactante hetropolisacridos lipopptidos trehalosa, sacarosa y fructosa lpidos lipopptidos lipopptidos surfactina surfactina ramnolpidos hidrocarbonolpido- proteina manosilertritol lpidos soforolpidos Manan-cido graso sophorolpidos Lpidos neutros proteinalpidocarbohidrato fosfolpidos . cidos grasos glucosa, lpidos cidos hidroxidecanoicos Lpidos neutros proteinas cido espiculosprico
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Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Phaffia rhodozyma Rhodococcus erythropolis Rhodococcus sp. ST-5 Rhodococcus sp. H13-A Rhodococcus sp. 33 Torulopsis bombicola ramnolpidos lipopptidos carbohidrato-lpido trehalosa dicorinomicol ato glicolpidos glicolpidos polisacridos soforolpidos

TABLA.- ejemplos de biosurfactantes y las bacterias que los producen.

Algunos Ejemplos De La Produccin De Biosurfactantes:

1. Bacillus pumilus (estirpe 28-11) produce biosurfactantes con una gran capacidad de emulsionar y eliminar compuestos hidrocarbonatos. Esto hace que se considere esta estirpe como prometedora en el campo de la tecnologa medio ambiental.

2. Candida

ishiwade

(Tailandia)

es

una

levadura

termotolerante

que

produce monoacilgliceroles y glicolpidos.

3. Pseudomonas

sp.

Pueden

reducir

la

tensin

superficial,

estabilizar

emulsiones, y promover la formacin de espumas y generalmente son no txicos, no peligrosos y biodegradables. Debido a su diversidad, inocuidad para el medio ambiente, posibilidad de produccin a gran escala, selectividad, efectividad bajo condiciones extremas en pequeas cantidades, produccin sobre recursos renovables, y sus aplicaciones potenciales para la proteccin del medio ambiente.

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4. Pseudomonas aeruginosa LBI es un ejemplo claro de estructura

qumica, propiedades superficiales y actividad biolgica en la produccin de biosurfactantes. La naturaleza qumica de los biosurfactantes producidos sera en este caso ramnolpidica, cuya estructura de ramnosa contiene propiedades biosurfactantes. En este caso se sintetizan diferentes homlogos que poseen caractersticas similares con respecto a sus propiedades superficiales.

5. Pseudomona putida PCL1445 produce biosurfactantes interesantes a nivel industrial. En este caso se caracteriz dos lipopptidos con

actividad biosurfactante: putisolvin I y putisolvin II; los cuales inhiben la formacin de biopelculas o provoca la destruccin de las mismas.

Conclusiones

Los biosurfactantes potencian la emulsin de hidrocarburos y por eso tienen el poder de solubilizar contaminantes hidrocarbonados y aumentar su disponibilidad para la degradacin microbiolgica.

Los microorganismos productores de biosurfactantes pueden jugar un importante papel en la biorremediacin acelerada de lugares contaminados con

hidrocarburos.

Debido al alto costo de los procesos de remediacin y otras aplicaciones potenciales, la necesidad de aumentar la produccin de biosurfactantes es determinada por la gentica del microorganismo.

Algunos tipos de produccin de Biosurfactantes: A) PRODUCCIN DE UN BIOSURFACTANTE MICROBIANO POR TORULOPSIS MAGNOLIAE EN CULTIVOS SUMERGIDOS POR CARGA.

Los biosurfactantes son molculas tensoactivas de origen biolgico obtenidas de clulas animales, vegetales y microbianas. Se estudi la produccin de biosurfactantes por varios microorganismos mediante tcnicas de fermentacin sumergida. Se seleccion a
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Torulopsis magnoliae y las condiciones de produccin ptima del surfactante por esta levadura en un fermentador de 15 litros y en medio melaza - aceite, fueron: Agitacin 500 rpm, aireacin 0,6 vvm, temperatura 30C y pH inicial 5,0. El surfactante, medido por disminucin de la tensin superficial, es excretado al medio durante el crecimiento de la levadura y la produccin se detiene al agotarse los azcares de la melaza. Este es soluble en agua aunque no lo es en ter dietlico a pH 9. No obstante, la extraccin y purificacin parcial se realiza con este solvente despus de acidificar hasta pH 2 el medio de cultivo. La preparacin de surfactante contiene azcares, disminuye la tensin superficial del agua hasta 40 dinas/cm, lisa glbulos rojos y forma rpidamente emulsiones acuosas de petrleo pesado (Tipo Cerro Negro 10 API).

MATERIALES Y MTODOS

1. Microorganismos:

Se utilizaron cepas de las bacterias Pseudomonas sp Mez 2 y Pseudomonas spMez 3 aisladas y caracterizadas previamente. Tambin se estudiaron las levaduras Torulopsis petrophylum ATCC 20225, Torulopsis magnoliae ATCC 12573 y Saccharomycopsis lipolitica ATCC 8662. Las bacterias fueron conservadas a 20C en cuas de agar nutritivo y las levaduras en agar papa-dextrosa

2. Seleccin del microorganismo productor de biosurfactantes:

Los inculos de cada uno de los diferentes microorganismos se hicieron en fiolas de 125 mL con 50 mL de medio de produccin (MP) que contiene peptona 5 g/L ,extracto de levadura 3 g/L y glicerol 10 g/L. El pH inicial fue de 5,0 para las levaduras y de 7,0 para las bacterias. Este medio fue esterilizado a 120C y 15 psi durante 30 min: una vez inoculados, los cultivos se incubaron en un agitador orbital TORMASAN a 160 rpm y 30C y a las 48 horas se centrifugaron a 5000 x g durante 10 min. A 40 mL de cada uno de los sobrenadantes se le agregaron 5,0 g de crudo pesado tipo Cerro Negro (10API). La mezcla se agit vigorosamente durante 30 segundos con un vortex y se observ a simple vista si se form
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o no una emulsin. En caso positivo se seleccion el microorganismo como probable productor Scientific Journal from the Experimental Faculty of Sciences at La Universidad del Zulia, Volume 9 N 3, JulySeptember 2001 306 Produccin de un biosurfactante microbiano por Torulopsis magnoliae del biosurfactante. Se hicieron observaciones al microscopio de luz de muestras dcada cultivo. El objetivo fue comprobar que la morfologa de los microorganismos fuera similar al inicio y al final del cultivo para eliminar la posibilidad de contaminacin. Como controles se dispusieron medios sin inocular y cultivos inoculados con microorganismos que no producen surfactantes. Como ser discutido posteriormente, se decidi escoger a Torulopsis magnoliae y con esta levadura se realizaron todas las experiencias que se indican en lo sucesivo.

3. Produccin de biosurfactantes por fermentacin sumergida en fermentadores de 2,5 y 15,0 litros

Cultivos de 200 mL de MP contenido en fiolas de 500 mL, se incubaron bajo las mismas condiciones indicadas arriba. A las 24 48 horas estos cultivos sirvieron como inculos para 2 litros del mismo medio dispuestos en un fermentador TORMASAN de 2,5 litros(6, 9) e incubados durante 24 horas a30C, 2,5 vvm y 500 rpm. Al final de las 24horas, 1,2 litros de este cultivo sirvieron, asu vez, como inculo de 12 litros del mismo medio contenidos en un fermentador L.K.BBromma Ultraferm modelo 1601 - 13 de 15litros. El cultivo creci a 30C, 1,5 vvm y 500rpm. En los casos donde se indica se cambi la composicin del medio de cultivo para lograr menores costos del proceso y para inducirla produccin del biosurfactante se aadi 10% de aceite de maz marca COPOSA. Todas las fermentaciones se hicieron por carga y los fermentadores no fueron esterilizados antes de la adicin del medio que se esteriliz bajo las condiciones antes sealadas. Cuando fue necesario la espuma se control con pequeas cantidades (0,5 - 3mL) de aceite de silicona.

A diferentes tiempos durante la fermentacin se retiraron de los cultivos muestras de 6 mL y se centrifugaron a 5000 x durante 15 minutos. El sedimento se resuspendi en agua destilada y, con el fin de cuantificar el crecimiento celular, se determin en l densidad ptica (D.O Abs 410n.m), peso seco (estufa a 80C) y nmero de clulas (cmara de Neubauer) (6). En los sobrenadantes de esa centrifugacin se midieron pH (sonda combinada) y tensin superficial. Esta ltima mediante un tensimetro de superficie
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(marca Fisher, modelo 20). El procedimiento consisti en depositar 4mL dcada sobrenadante en una cpsula de Petri e introducir el anillo del tensimetro de manera que estuviera en contacto con la superficie de la muestra. Accionando la manilla del aparato se fue separando el anillo de la superficie. La fuerza requerida para lograr la separacin completa del anillo se registra como tensin superficial en un dial con una escala en dinas/cm . Como controles se midieron las tensiones superficiales del agua pura y del medio de cultivo antes de inocular. 4. Recuperacin y Propiedades del biosurfactantes

Los cultivos de 2 y de 12 litros, obtenidos como se indic anteriormente, se centrifugaron a 5000 x g en una centrifuga Sharples de Flujo continuo, n 77-T-1- 496. Los sedimentos se utilizaron en algunos casos como inculos para otras fermentaciones. Los sobrenadantes se acidificaron hasta pH = 3 con cido sulfrico 98% y se mezclaron en un embudo de decantacin con ter dietlico en relacin 2:1. Despus de agitar, las mezclas se dejaron en reposo durante 15 minutos. En cada caso el surfactante se extrajo completamente por la fase orgnica. Esta se retir y el ter dietlico se evapor a 40C, bajo vaco, en un evaporador rotativo marca BCHI modelo RE/B. El residuo slido, que denominamos Biosurfactante Parcialmente Purificado (BPP) se resuspendi (10:1) en una solucin 0,1 M de bicarbonato de sodio y la solucin se guard a 20C hasta su utilizacin. Para determinar la capacidad surfactante de los BPP, 0,1 mL de cada preparacin se aadieron en pozos abiertos en placas de agar sangre de conejo. Las placas Scientific Journal from the Experimental Faculty of Sciences at La Universidad del Zulia, Volume 9 N 3, JulySeptember 2001 J.M. Torres G. y J.A Snchez C. / Ciencia Vol. 9, N 3 (2001) 305-312 307incubaron a 30C y a las 24 horas se observ si haba halos de bbb hemlisis. Las capacidades de las diferentes muestras de BPP para disminuir la tensin superficial del agua fueron medidas con el tensimetro como se indic anteriormente. Cada experiencia consisti en mezclar 0,05mL de muestra con 10 mL de agua destilada. Los valores obtenidos fueron comparados con el valor medido para el agua pura. La diferencia entre este valor y los de las muestras, midi aquella capacidad. La emulsificacin de petrleo pesado Cerro Negro (10 API) por las muestras del BPP se midi cualitativamente. Para ello se aadieron 10 mL del BPP en una fiola que contena 5 g de petrleo pesado Cerro Negro (10 API) en 75 mL de agua, mantenida a30C.
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Despus de agitar durante 20 seg, se observ si exista o no emulsificacin del petrleo .La presencia de azcares en muestras de BPP se determin por el mtodo de Antrona 10). Resultados y Discusin

1. Seleccin del microorganismo productor

De acuerdo con sus capacidades de emulsionar petrleo pesado (Tabla 1), se preseleccionaron dos cepas de Pseudomonassp. y una de Torulopsis magnoliae. Por el aspecto de los filtrados de las emulsiones y por la capacidad observada de permitir o no la adsorcin del petrleo a las paredes de lasfiolas, se deduce que son diferentes los biosurfactantes producidos por ambos tipos demicroorganismos, bacterias y levaduras. Se siguieron tres criterios para escoger entrelas tres cepas preseleccionadas: El primero tiene que ver con el mayor tamao y densidad de la levadura. Este hecho puede contribuir una mayor facilidad para separarla de los cultivos que contienen surfactantes. Por otra parte, el nicho ecolgico de esta levadura est relacionado con las plantas de Magnoliasp. de cuyas flores ha sido aislada . Su inocuidad para los humanos no ha sido establecida pero es muy probable que como ocurre en otros casos similares de microorganismos aislados de vegetales, esta levadura no sea parsito de animales El tercer criterio se relaciona con Pseudomonas y es preventivo pues no pudimos precisar con exactitud la especie a la que pertenecen las dos cepas de Pseudomonas Mez 2 y Mez 3. En vista de su conocida capacidad para resistir los antibiticos (14) y de que no pudimos descartar la posibilidad de que pudieran ser patgenas, decidimos no utilizarlas en este trabajo, a pesar de ser buenas productoras de biosurfactantes. As, en todas las experiencias que siguen, se emple aT. magnoliae como agente productor de biosurfactantes.

2. Produccin de biosurfactantes por fermentacin sumergida

Resultados previos indican que las condiciones ptimas para el crecimiento de T. magnoliae son 30C y pH = 4 5 (11, 12,15). Nuestros resultados (no mostrados) confirman estos valores ptimos (6). La levadura es facultativa y utiliza una amplia variedad de fuentes de carbono (sacarosa, dextrosa, galactosa, xilosa y, glicerol) (6, 11,
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12,15). Las experiencias que realizamos en fiolas con agitacin en el MP, nos permitieron comprobar cualitativamente que T. magnoliae produce un surfactante que emulsiona petrleo y que el suministro de oxgeno es importante para la produccin del surfactante. En vista de que la agitacin en fiolas no lo aporta en las cantidades requeridas por la levadura, se decidi utilizar un fermentador TORMASAN de 2,5 litros provisto de un sistema de aspersin de aire y un agitador de tres aspas. Varias pruebas realizadas con este fermentador bajo similares condiciones que en las fiolas, pero modificando el medio con adicin de sacarosa como substrato complementario, nos permitieron seleccionar una agitacin de 500rpm y un aporte de aire de 2,5 vvm, como ptimos para producir el surfactante a 30C

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B)

BIOSURFACTANTES

PRODUCIDOS

POR

BACTERIAS

FIJADORAS

DE

NITROGENO ATMOSFERICO CRECIDAS EN HIDROCARBUROS

La biodisponibilidad de hidrocarburos para la degradacin microbiana es muy baja debido a su casi nula solubilidad y alta toxicidad. Por ello, la contaminacin ambiental por petrleo crudo es uno de los principales problemas con los que se enfrenta la zona sur de Mxico. En estudios previos para atacar este problema se encontr que algunas bacterias de vida libre fijadoras de nitrgeno atmosfrico (BFNA) procedentes de suelos de Tabasco contaminadas con petrleo crudo, removan hidrocarburos del queroseno con produccin simultnea de exopolmeros tenso activos o surfactantes. Dado que en varios estudios se ha encontrado que ese tipo de compuestos aumenta la biodisponibilidad de hidrocarburos hacindolos ms accesibles a ciertos grupos microbianos nativos del suelo sin incrementar los problemas de contaminacin, en este trabajo se seleccionaron varias de esas cepas BFNA para estudiar su produccin de exopolmeros y su potencial de uso en procesos de biorremediacin. El objetivo fue estudiar el perfil de crecimiento y produccin de exopolmeros, tanto en cultivos en agitacin como bajo condiciones estticas, determinando las caractersticas surfactantes del exopolmero. METODOLOGA

Las BFNA se cultivaron en medio de Rennie sin sacarosa pero con 5 g/L de queroseno o fenantreno a 120 rpm, 28oC, por 15 das. Para el cultivo esttico se conservaron las mismas condiciones pero sin agitacin. Se determin la remocin de hidrocarburos por CG, el crecimiento en base a peso seco y UFC, y la produccin de surfactantes mediante el ndice de emulsificacin (IE24) y tensin superficial.

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RESULTADOS Y DISCUSIN.

Algunas de las BFNA aisladas, etiquetadas de acuerdo al color de sus colonias, mostraron buen potencial para la produccin de surfactantes (Cuadro 1). Cuando los cultivos se aclimataron a crecer en queroseno, segn el ndice de emulsificacin1 (IE24), la mayora mostr una curva de crecimiento tpica tanto en agitacin como en cultivo esttico (Figura 1). Sin embargo, solo 4 de 7 tuvieron la capacidad de producir un exopolmero, siendo el cultivo crema quien a los cinco

das present el mayor poder emulsificante . Este fue seleccionado para estudiar la produccin usando fenantreno como nica fuente de carbono.Los resultados revelaron que, cuando se us fenantreno como nica fuente de carbono, la produccin de surfactante en los cultivos agitados se retard a los 8 das y slo se presenta si los cultivos se crecen previamente en queroseno (Figura 1).

Cuadro 1. ndice de Emulsificacin para cultivos agitados de BFNA utilizando queroseno como nica fuente de carbono

La capacidad emulsificante fue mayor en los cultivos crecidosen fenantreno, quiz debido a que este es un compuesto slido muy insoluble, lo que puede demandar ms emulsificante para mantenerlo soluble. Esta hiptesis requiere de ms estudios pero es soportada por lo observado en los cultivos estticos, donde el crecimiento y acumulacin de surfactante fue an tardo (12 das), quiz debido a que la solubilizacin del fenantreno fue ms difcil sin agitacin. El exopolmero se est caracterizando qumica y fisicoqumicamente.
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Figura 1. Determinacin del IE24 para la BFNA crema utilizando fenantreno como fuente de carbono. Agitacin, Esttico.

Conclusiones.

Se aislaron cultivos de BFNA con capacidad de producir biosurfactantes cuando crecen en queroseno o fenantreno como nica fuente de carbono. Un cultivo color crema presento remocin del 75% para queroseno, y 17 % para el fenantreno. Los resultados sugieren que esta BFNA es buena alternativa para la produccin biosurfactantes con potencial para usarse en procesos de biorremediacin.

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C) PRODUCCIN DEL BIOSURFACTANTE

Se seleccionaron seis cepas bacterianas del grupo de cepas aisladas en el Laboratorio de Microbiologa Industrial del Centro de Investigacin del Agua de la Universidad del Zulia (MI3, MI5, MI7, MI9, MI10, y MI11). Cada una de ellas fue transferida con un asa de platino a un medio fresco de caldo Tripticasa Soya y se incub a 37C durante 24h en una incubadora Memmert B-50 para su activacin. Luego, 1ml de cada una de las cepas se transfiri a 9ml de caldo Tripticasa Soya y se incubaron a 37C hasta alcanzar un crecimiento superior a 1108UFC/ml (Gerhardt et al., 1981; Kerr, 1981). Los cultivos se centrifugaron a 2000xg en una centrifuga MSE Med Oil-58199 por 10min para separar las clulas del medio de cultivo. Se descart el sobrenadante y el centrifugado fue lavado y re suspendido en solucin salina estril. La nueva suspensin fue centrifugada a 2000xg por 10min, se descart el sobrenadante y el centrifugado se resuspendi en un medio mnimo mineral, constituyendo as el inculo (Duvnjak et al., 1982). Se agreg cada inculo (3% v/v) en fiolas que contenan un medio mnimo mineral (MMM) (89% v/v) y gasoil (8% v/v) como nica fuente de carbono para un volumen total de 1 litro. El MMM usado para la biosntesis del surfactante estuvo integrado por 1,2g NH4CL, 2,4g KNO3, 0,0005g CaCl2.6H2O, 2,4g NaSO4, 1,2g MgSO4, 0,6g K2HPO4 y 0,002g FeSO47H2O por litro de agua destilada. El MMM fue esterilizado a 121C y 15lb de presin durante 15min. El gasoil utilizado fue esterilizado por filtracin. Seguidamente, la mezcla se coloc en una incubadora Memmert B-50, por 144h a 37C. Luego de la incubacin, la mezcla fue centrifugada a 2000xg por 15min en una centrfuga MSE Med Oil-58199, para separar las clulas del sobrenadante (biosurfactante). Se tom el sobrenadante y se adicion, en diferentes concentraciones, a una mezcla de gasoil con agua para determinar la tensin interfacial, utilizando el tensimetro de Lecomte Du noy (Duvnjak et al., 1982; Roberts et al., 1991). Las cepas, cuyo sobrenadante obtenido a las 144h fue ms eficiente en la disminucin de la tensin interfacial de la mezcla gasoil-agua (MI9, MI10 y un cultivo mixto de ambas) fueron escogidas para la produccin de surfactante en un perodo de incubacin de 192h, siguiendo la metodologa descrita inicialmente.

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Estudio de tratabilidad

A partir de las cepas MI5, MI7, MI9, MI10, MI11 activadas, se prepar el cultivo mixto para realizar el montaje de los diversos tratamientos del estudio de tratabilidad, como se muestra en la Tabla I. Cada tratamiento se prepar agregando el biosurfactante obtenido de las cepas MI9 y MI10 (20% v/v), cultivo mixto (10% v/v) y el hidrocarburo liviano (1% v/v) en fiolas que contenan agua del lago y fosfato de amonio para un volumen total de 100ml (Atlas, 1984). Los diferentes tratamientos fueron incubados en una incubadora con agitacin New Brunswick G25 durante 30, 60, y 90 das. Se realizaron anlisis fisicoqumicos y microbiolgicos (Tabla II), segn la metodologa establecida en APHA (1998).

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Para el anlisis estadstico de los resultados se aplic anlisis de varianza, utilizando un diagrama de bloque al azar y mediante la aplicacin de las pruebas de comparacin entre pares de medias por el mtodo de Dunnett, que compar todos los tratamientos con un control (SAS, 2002). Resultados y Discusin

Macro y micromorfologa de las cepas bacterianas Las caractersticas macro morfolgicas y micro morfolgicas de las colonias de cada una de las cepas bacterianas utilizadas para la produccin del biosurfactante y el estudio de tratabilidad fueron registradas segn el formato sugerido por Kerr (1981). Las cepas resultaron cocos y bacilos, siendo la mayora Gram negativas (Tabla III).

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POLISACRIDOS EXTRACELULARES MICROBIANOS

En forma genrica se conoce como polisacridos a los polmeros de origen biolgico constituidos por unidades de carbohidratos unidas por enlaces glicosdicos. Estas macromolculas se encuentran ampliamente distribuidas en plantas (terrestres y acuticas), hongos, bacterias, moluscos y mamferos, en donde se encuentran formando parte de la pared celular, espacio extracelular o de estructuras de reserva de energa. Los microorganismos producen por lo menos tres tipos diferentes de polisacridos: estructurales, (como los constituyentes de la pared celular); intracelulares de reserva (como el glicgeno) y los de naturaleza extracelular. Entre todos ellos, los polmeros extracelulares, como es el caso de la xantana, el alginato, el dextrano, etc., son los que hasta ahora se les ha dado mayor uso a nivel industrial. Las bacterias del genero Rhizobium tienen la capacidad de producir tipos diferentes de polisacridos, principalmente exopolisacridos (extracelulares), compuestos por carbohidratos que son secretados al medio a travs de la pared celular; estos a su vez pueden ser de carcter cido o neutro. Dentro de los exopolisacridos cidos encontrados a partir de Rhizobium se destacan el succinoglicano, galactoglucano y glucoronan; el primero es un biopolmero producido por Shell Co. que ha sido utilizado como espesante y como estabilizante de emulsiones. En general se ha identificado que los polmeros de carcter cido obtenidos estn compuestos por unidades de Dglucosa, D-galactosa y cido pirvico. Los exopolisacridos de carcter neutro son polmeros capsulares constituidos por D-glucosa, Dgalactosa y D-manosa en relaciones molares 1:3:2, formando unidades repetidas de hexasacridos con caractersticas muy similares a las que se reportan para el curdlan [3], reconocido polmero, compuesto por fibras insolubles de bajo valor calrico, que no posee olor ni sabor, usado como aditivo para alimentos y que adems tiene la propiedad de gelificar trmicamente y de forma irreversible. Este tipo de biopolmeros son tambin una alternativa en la microbiologa por ser ms elsticos y flexibles que el agar. Caractersticas y propiedades de los polisacridos microbianos Los polisacridos microbianos varan considerablemente en sus propiedades fsicas, incluyendo sus caractersticas reolgicas. Varios exopolisacridos presentan un comportamiento pseudoplstico, lo que significa que la viscosidad aparente disminuye conforme se incrementa la deformacin del fluido, esto es, las soluciones se adelgazan con la agitacin. Este comportamiento es caracterstico para el caso de la xantana y el alginato. Una de las propiedades ms importantes de varios polisacridos de inters industrial es su habilidad para formar geles y algunos de estos polmeros requieren la presencia de iones para ello. Los geles deben sus caractersticas a la formacin de redes entrecruzadas de cadenas de polmeros. El curdlan, por ejemplo, no es soluble en agua a temperatura ambiente, pero cuando se calienta a 54C es perfectamente soluble. Un incremento mayor de la temperatura lleva a la gelificacin de la molcula, la cual es altamente estable. Los alginatos forman geles en presencia de cationes divalentes, particularmente el calcio. La gelificacin de alginatos inducida por iones divalentes se basa en su capacidad para atar iones especficamente, acompaada por cambios conformacionales. Los iones calcio se unen especficamente a los residuos de cido gulurnico de la molcula debido a que stos adoptan una conformacin que favorece tal interaccin.

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La tabla 1 describe los principales polisacridos microbianos reconocidos hasta ahora, enunciando los principales organismos que los producen, el monmero por el que estn constituidos y la forma como se encuentra organizada la estructura del polmero.

Variables que afectan la produccin de polisacridos extracelulares. Concentraciones del Medio de cultivo.

Como ya se dijo las fuentes de carbono pueden ir desde mono y disacridos como manitol, glucosa, fructuosa y sacarosa, hasta cidos orgnicos como el succinato y el citrato entre otros. Lancheros compar glucosa, lactosa, manitol y sacarosa como fuentes de energa para la produccin de polisacridos por Rhizobium, determinando que la sacarosa en concentraciones de 10 g/l fue la que presento mayor rendimiento con respecto a la cantidad de producto obtenido. Sin embargo se sugiere que concentraciones mayores de la fuente de carbono favorecen la produccin de polisacridos . Pea y Galindo reportan la sacarosa en concentraciones de 20 g/l, como fuente de carbono en la produccin de alginato. Como fuente de nitrgeno Lancheros determin que utilizar una mezcla de nitrato de calcio y extracto de levadura en relacin 0.2 : 0.2 g/l favorece la formacin de producto.

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Temperatura y pH.

Segn trabajos realizados en la produccin de Alginatos, Dextranos y Xantanos [5] [6] [7] [8] a valores de la temperatura que estn entre 29 y 34 C se obtiene la mayor produccin de polisacridos. As mismo cuando se utiliza Rhizobium como microorganismo, la temperatura no tiene un efecto significativo sobre la produccin del biopolmero cuando se trabaja en rango entre 28 y 32 C. En las mismas referencias se reporta que un valor neutro de pH favorece la formacin de polisacridos, como es el caso de Lancheros [3] donde se mencionan valores entre 6.5 y 7.2 para fermentaciones industriales con cepas de Rhizobium. Aireacin y mezclado:

Estos dos factores son determinantes en la produccin de polisacridos sobre todo a gran escala en donde surgen dificultades que no son apreciables a nivel laboratorio, debido a que al incrementar el tamao del equipo, cambia la relacin superficie volumen y la presin hidrosttica. Si se considera un fermentador como un cilindro se tiene que el rea, que determina la transferencia de calor y el nivel de aireacin superficial, se incrementa al cuadrado con la escala; mientras que el volumen es funcin cbica de la escala lo que hace que la relacin rea volumen se modifique con el solo aumento de tamao del equipo. Lo que significa entonces que la transferencia de oxgeno que ocurre a travs de la superficie del lquido sea muy importante en el fermentador pequeo y prcticamente despreciable en fermentadores de gran escala. En cuanto a la presin hidrosttica se tiene que en las fermentaciones industriales la presin en el fondo es muy alta mientras que en fermentadores de laboratorio la diferencia de presin entre la superficie y el fondo es prcticamente despreciable. Debido a esta situacin, gases como el CO2, el cual es producto de la fermentacin, incrementan su presin parcial en el fondo de los fermentadores donde la presin hidrosttica es elevada, dando como consecuencia cambios importantes en el rendimiento del proceso y en las caractersticas moleculares del polmero producto. Con respecto al mezclado uno de los aspectos ms importantes en el escalamiento de fermentaciones de exopolisacridos es la seleccin y empleo de impulsores adecuados. El impulsor ptimo debe ser formador de burbujas pequeas y lograr el mayor nivel de homogeneidad posible. Para el caso de algunos cultivos donde se producen polisacridos, el uso combinado de impulsores de tipo axial y de agitadores de tipo turbina Rushton, proveen una adecuada transferencia de oxgeno, adems de un excelente mezclado. Por qu producir polisacridos. Aplicaciones reconocidas de estos polmeros microbianos Desde un punto de vista tecnolgico, los polisacridos constituyen productos de alto valor agregado, cuyo rango de aplicaciones se extiende cada vez ms. En los ltimos aos se ha intensificado el inters en el uso de polisacridos microbianos, principalmente propiciado por las propiedades nicas de estas macromolculas y la posibilidad de obtener un producto con una calidad constante y un precio relativamente estable. Sin duda alguna la industria de los alimentos ha liderado el uso de polisacridos de origen microbiano, con la aprobacin para que productos como el dextrano, la goma xantana y el curdlan pudieran ser utilizados en alimentos; la comercializacin de estos biopolmeros ha venido creciendo, abrindole las puertas en nuevos mercados industriales.

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La posibilidad de caracterizar estos productos y determinar sus propiedades fsicas, permite comprender la relacin entre su estructura, la funcin que estos pueden llegar a cumplir y su uso industrial. El caso especfico de la goma xantana, que debido a sus excelentes propiedades reolgicas es usado como aditivo para estabilizar emulsiones aceite agua, estabilizar la espuma formada en procesos de produccin de cerveza y como inhibidor para la formacin de cristales en alimentos, es una muestra clara de cmo estos productos se han establecido con un mercado a nivel industrial. Otros polisacridos como el glucano, usado para mejorar la textura de alimentos como pastas, el pullulan, polmero altamente soluble en agua que es usado para mantener el sabor y la apariencia de frescura en los alimentos, el gelano utilizado como agente gelificante en la industria de los elementos de aseo personal y como reemplazo del agar como medio de mantenimiento para cultivos celulares, son muestra de cmo productos diferentes a los polisacridos microbianos tradicionales tambin han encontrado un espacio importante en el mercado industrial. Ms all estn las aplicaciones que estos productos pueden presentar en la medicina y biomedicina, caso concreto la celulosa de origen microbiano que puede actuar como sustituto de piel temporal en el ser humano gracias a sus altas propiedades mecnicas en estado hmedo [4] o el mismo glucano que puede ser usado como una droga biomdica contra algunas infecciones virales. Nuevas y posibles aplicaciones para estos productos estarn supeditadas a las estructuras y propiedades fsico qumicas que puedan llegar a tener estos polisacridos microbianos. Los nuevos polisacridos tal vez encuentren aplicacin en la industria de cosmticos y farmacutica, sin embargo, estos productos microbianos siempre tendrn que competir contra los polmeros provenientes de plantas o polmeros sintticos, que, a pesar de tener inferiores propiedades fsicas y ecolgicas, cuentan con procesos de produccin mucho ms econmicos. BIBLIOGRAFA 1. Flemming, H.C. and J. Wingender, Relevance of microbial extracellular polymeric substances (EPSs) Part II: Technical aspcets. Water Science and Technology, 2001 2. Bitton, G., Wastewater Microbiology. Wiley Series in Ecological and Applied Microbiology, ed. R. Mitchell. 2005, New York: Wiley. 3. Laspidou, C.S. and B.E. Rittmann, A unified theory for extracellular polymeric substances, soluble microbial products, and active and inert biomass. Water Research, 2002. 4. de Silva, D.G.V. and B.E. Rittmann, Interpreting the Response to Loading Changes in a MixedCulture Completely Stirred Tank Reactor. Water Environment Research, 2000. 5. Barker, D.J. and D.C. Stuckey, A review of soluble microbial products (SMP) in wastewater treatment systems. Water Research, 1999. 33(14): p. 30633082. 6. Arabi, S. and G. Nakhla, Impact of molecular weight distribution of soluble microbial products on fouling in membrane bioreactors. Separation and Purification Technology, 2010. 73(3): p. 391396.

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