Captulo 6.

Tcnicas diagnsticas en histopatologa Tcnicas diagnsticas en histopatologa

Si bien el objeto central del estudio terico de la Patologa es la enfermedad como ente, en la prctica el objeto ms importante es el diagnstico de enfermedades y lesiones, lo que tiene mucha trascendencia para el tratamiento y pronstico en pacientes. En lo que sigue se describirn las tcnicas que forman parte de los procedimientos habituales del patlogo para el anlisis de biopsias y autopsias. En este captulo, despus de una breve descripcin de la biopsia y la autopsia, se resumirn los aspectos bsicos de la microscopa de luz, microscopa electrnica, inmunohistoqumica, biologa molecular aplicada a histopatologa y citodiagnstico.

La Biopsia:
Puede definirse como el procedimiento en el que se remueve tejido de un organismo vivo para examen microscpico y as establecer un diagnstico. La muestra obtenida tambin se llama biopsia. La Patologa Quirrgica es la rama de la Anatoma Patolgica que se preocupa del estudio de las biopsias y difiere de la autopsia por la inmediatez del diagnstico. El diagnstico histopatolgico muchas veces precede y determina la actitud teraputica en un caso dado. Por consiguiente, el diagnstico de la biopsia es siempre URGENTE. Esto es importante no slo por la decisin teraputica, sino que tambin porque significa reducir gastos de hospitalizacin, ahorro de tiempo, etctera. Segn el tipo de muestra se distinguen: 1) Biopsia por puncin: se utiliza tanto en lesiones de tamao pequeo como en las ms grandes. Es recomendable no emplearla indiscriminadamente, pues la muestra que se obtiene puede no ser representativa y, en consecuencia, llevar a errores diagnsticos por interpretacin inadecuada. 2) Biopsia excisional: se extirpa la lesin completa en un solo tiempo. Esta biopsia incluye habitualmente tejido normal adyacente para tener un margen de seguridad. Es ideal para lesiones pequeas. 3) Biopsia incisional: se extirpa parte de la lesin, exclusivamente con un propsito diagnstico. Se recomienda en lesiones de gran tamao, en las que ser necesario programar ulteriormente una intervencin quirrgica de gran envergadura. 4) Formas especiales de biopsia. Biopsia percutnea es aquella en la cual el tejido se obtiene por puncin a travs de la piel; biopsia endoscpica: el tejido se obtiene con instrumentos (endoscopio) a travs de cavidades naturales; biopsia estereotxica: biopsia cerebral a travs de estereotaxis, o sea la localizacin del sitio de la biopsia se hace mediante anlisis externo de coordenadas; biopsia punch: biopsia de piel obtenida con instrumentos cilndrico hueco llamado punch, de dimetro variable (algunos mm) que permite el estudio de todas las capas de la piel e hipodermis; biopsia shave: biopsia de piel en la que la muestra se obtiene mediante corte paralelo a la superficie cutnea (afeitado). El desarrollo alcanzado por la Anatoma Patolgica, gracias a la incorporacin de nuevas tcnicas, ha significado no slo un aporte importante al diagnstico mdico, sino que tambin una exigencia cada vez mayor en cuanto a precisin y calidad del mismo. La toma de la muestra debe considerar contar con tejido representativo, en cantidad y condiciones adecuadas. Nunca estar de ms repetir que resulta imprescindible una conversacin y acuerdo previos para el estudio antomo-patolgico de las muestras. Idealmente, y si se puede hacer de manera rpida, es

recomendable enviar la muestra fresca sin fijar. En estos casos, lo mejor es enviarla envuelta en una gasa humedecida en suero fisiolgico, tan pronto como sea posible. Si la distancia es francamente larga, como el traslado interurbano, puede depositarse la muestra en estas condiciones en un recipiente relleno con cubos de hielo, para preservar la muestra fra durante el transporte. Las muestras fijadas en formalina e incluso las incluidas en parafina pueden eventualmente ser tiles para estudios ms elaborados como la inmunohistoqumica y la microscopa electrnica, pero su rendimiento es inferior, pues ambas tcnicas requieren condiciones de fijacin especiales. La fijacin en formalina produce artefactos importantes en la estructura fina de las clulas, lo que dificulta el examen ulterior, especialmente con microscopa electrnica. En ciertas circunstancias, cabe an la posibilidad de recuperar las muestras incluidas en parafina, revirtiendo todo el proceso para incluir en polmeros plsticos y obtener cortes ultrafinos para microscopa electrnica. Para las tcnicas inmunohistoqumicas pueden servir los cortes usuales, pero slo ser factible el estudio de antgenos citoplasmticos o nucleares y no el de membranas, como en en el estudio de poblaciones y subpoblaciones linfocitarias. La fijacin corriente de la muestra es en formalina neutra al 10%, que debe obtenerse en el servicio de Anatoma Patolgica. El volumen del fijador deber ser a lo menos 10 veces mayor que el del trozo de tejido. Las muestras pequeas (menos de 2 cm) son extremadamente susceptibles a la desecacin y deben colocarse inmediatamente en fijador o ser enviadas al laboratorio envueltas en una gasa humedecida en suero fisiolgico. Errores comunes y frecuentes son: sumergir la muestra en suero fisiolgico u otros lquidos, utilizar cantidad y concentracin inadecuadas de fijador, fijacin de rganos completos, todo lo cual acarrea fijacin deficiente con deterioro del material y mayores posibilidades de error en la interpretacin o, simplemente, inutilizacin definitiva del tejido. Si por razones excepcionales tiene que diferirse la fijacin, las muestras podrn mantenerse en refrigerador a 4C. Hay muestras que por la naturaleza del examen a realizar no deben fijarse y tienen que ser enviada en fresco al laboratorio: algunas biopsias de piel y rin, que requieren estudio de inmunofluorescencia directa, biopsias de msculo esqueltico para estudio enzimohistoqumico de miopatas y muestras de neoplasias para caracterizar inmunofenotipo como linfomas. Toda muestra para examen histopatolgico o citolgico debe ser identificada en el frasco, sobre o bolsa con el nombre completo del paciente y el rgano de donde procede. La muestra debe acompaarse de un formulario en el que se consigne el nombre completo y edad del paciente, rgano de donde se obtuvo, diagnstico y antecedentes clnicos y mdico que enva. Todo el material extirpado debe enviarse a examen y a un solo patlogo. No es raro que la muestra sea dividida en algn momento y enviada a dos patlogos distintos simultneamente. Este proceder es desaconsejable, porque una de las partes puede no ser representativa de la lesin en cuestin, lo que dar diagnsticos diferentes que slo inducirn a confusin en perjuicio del paciente. En casos excepcionales, es aconsejable la interconsulta del material de una biopsia a otro patlogo o a instituciones de reconocida y demostrada experiencia. Es recomendable en estos casos, que todas las opiniones queden por escrito y se debe exigir material apropiado y suficiente y, por supuesto, una pregunta precisa sobre cul es la duda o problema reales en el caso en cuestin. En lo posible, se debe guardar siempre el material sobrante hasta que se tenga un diagnstico. Despus del examen microscpico, no rara vez, es necesario reexaminar las piezas quirrgicas e incluso tomar nuevas muestras. Ms an, frecuentemente el mdico tratante o el cirujano, visitan la sala de biopsias para tener una visin ms detallada y provechosa del caso en cuestin junto al patlogo. Todo el material que llega a Anatoma Patolgica y los informes escritos correspondientes tienen que ser archivados y guardados por un tiempo prudente, a lo menos 5 aos segn la legislacin vigente, y estar a disposicin de las personas interesadas, ya sea para revisin o para investigacin.

La llamada biopsia contempornea a intervencin quirrgica o peroperatoria es la que se realiza durante el acto operatorio y tiene una sola indicacin, a saber, elegir entre dos o ms opciones quirrgicas, dependiendo de cual sea el informe antomo-patolgico intraoperatorio. En la mayora de los casos, al cirujano le basta que el patlogo establezca si se trata de una lesin benigna o de un cncer. En trminos generales, el diagnstico de malignidad no presenta mayores problemas para un patlogo con experiencia. Sin embargo, en un bajo porcentaje de casos, la decisin debe postergarse uno o dos das, hasta que se hayan examinado ms muestras procesadas con la tcnica corriente. Otro objetivo de la biopsia por congelacin es determinar la presencia de lesin en los bordes de reseccin quirrgica, particularmente en tumores benignos con tendencia a recidivar o en tumores malignos en los que se desea hacer ciruga curativa. La Autopsia: La palabra autopsia significa ver por s mismo y se usa como sinnimo de necropsia o examen post-mortem. Quizs si el mejor trmino sea examen post-mortem, porque representa en verdad un examen mdico despus de la vida, cuyos objetivos son la bsqueda de las causas de la muerte, el anlisis de la enfermedad bsica y de sus efectos y complicaciones en sus aspectos anatmicos y de las consecuencias de la intervencin mdica. La autopsia permite formular un diagnstico mdico final o definitivo, dar una explicacin de las observaciones clnicas dudosas y evaluar un tratamiento dado. Para el cirujano la autopsia proporciona informacin acerca de las causas de muerte en el postoperatorio, del estado de las suturas y de la presencia de complicaciones quirrgicas. El valor de la autopsia puede resumirse en los siguientes puntos: - cientos de enfermedades descubiertas y descritas - claisificaciones de innumerables lesiones - control de efectividad de los tratamientos mdicos - origen de ideas para tratamientos mdicos y quirrgicos - comprobacin del diagnstico mdico - fuente de enseanza de estudiantes y mdicos - fuente de informacin epidemiolgica Puede considerarse que la autopsia es el nico mtodo confiable que permite confirmar el acierto diagnstico mdico en 70 a 85% de los casos. Sin embargo, estudios sistemticos muestran que un 30% de los pacientes fallecidos y que llegan a a autopsia no fueron diagnosticados correctamente en vida. El porcentaje de error diagnstico "trascendental" de estos casos, o sea de diagnstico con implicaciones pronsticas y teraputicas importantes, que eventualmente podran haber modificado la evolucin en forma significativa, es de 10 a 12%. Ambos porcentajes se han mantenido prcticamente inalterados en las ltimas decadas. La autopsia, es irreemplazable por la informacin que aporta para confeccionar el certificado de defuncin, pues establece la mayora de las veces la causa de muerte en el caso individual. As, ha podido establecerse que las infecciones por grmenes oportunistas corresponden a la primera causa inmediata de muerte en pacientes inmunodeprimidos y que en los ltimos decenios esta frecuencia se ha quintuplicado. Microscopa de Luz:

Se estudian biopsias y muestras de autopsias con el microscopio de luz compuesto y los cortes histolgicos se examinan teidos con hematoxilina y eosina. Para ello, las muestras deben ser fijadas en formalina neutra al 10% e incluidas en parafina slida o equivalentes sintticos. De estas inclusiones en parafina se obtienen los cortes histolgicos de 5 a 6 micrones de espesor, que se tien con hematoxilina eosina y luego se montan sobre una lmina de vidrio o portaobjetos y se cubren con una delgada laminilla de vidrio llamada cubreobjeto.

Una ptima tcnica histolgica permite realizar un diagnstico adecuado en ms del 80% de los casos. En el 20% restante es necesario utilizar tcnicas complementarias como microscopa electrnica, inmunohistoqumica o biologa molecular aplicada a histopatologa. Las preparaciones histolgicas pueden teirse con otros colorantes para identificar estructuras especiales como fibras elsticas, colgeno, secreciones o pigmentos (Tabla).
EJEMPLOS DE TINCIONES HISTOQUIMICAS ESPECIALES Tincin especial van Gieson Fontana-Masson Perls Hall Churukian-Schenk Schmorl mucicarmn PAS azul alciano Verhoeff Bodian Luxol fast blue Estructuras o componentes identificados colgeno y msculo liso melanina, argentafinidad hierro bilis argirofilia melanina mucinas glicgeno, mucopolisacridos neutros mucopolisacridos cidos colgeno, fibras elsticas axones mielina

Las preparaciones histolgicas se guardan en un archivo especial y sirven como respaldo del diagnstico histopatolgico, como material de referencia y tambin de estudio e investigacin. De igual manera, las inclusiones en parafina se archivan para eventuales revisiones. El estudio con microscopa de luz sigue siendo la base fundamental del diagnstico histopatolgico aplicado a la clnica, especialmente en biopsias y autopsias , donde este diagnstico histopatolgico sirve de referencia para identificar enfermedades, evaluar pronstico y tratamientos realizados, observa efectos de enfermedades y plantear tratamientos especficos.
Microscopia Electronica: La microscopa electrnica es una tcnica que requiere instrumentos de alta complejidad y personal altamente especializado. Se utilizan la microscopa electrnica de transmisin o convencional y la de barrido. Las muestras para microscopa electrnica deben fijarse en glutaraldehdo, que se solicita al laboratorio de Anatoma Patolgica con las instrucciones para la toma y fijacin de la muestra. Los fragmentos deben ser pequeos y tienen que fijarse en forma de varios trocitos cuboideos de tejido de no ms de 1 mm, obtenidos con hoja de afeitar o bistur limpios. Las muestras se incluyen en resinas sintticas (Epon) y se practican cortes 10 veces ms delgados que los de microscopa de luz llamados cortes ultrafinos. La tincin se realiza con sales de metales pesados como citrato de plomo, tetrxido de Osmio o acetato de uranilo, que permiten un contraste adecuado del tejido bajo el haz de electrones. Los cortes ultrafinos se montan sobre grillas de cobre, se tien y se observan al microscopio electrnico. Para documentar los hallazgos es necesario obtener fotografas en blanco y negro de las preparaciones. Las grillas, muestras, inclusiones y fotografas se guardan en un archivo especial durante aos.

Microscopa electrnica de transmisin En esta tcnica la preparacin teida es traspasada por un haz de electrones, lo cual proporciona la imagen ultrafina sobre una pantalla ad hoc. El microscopio electrnico de transmisin es capaz de generar un haz de electrones a alta tensin (80kV) y concentrarlo sobre la preparacin mediante un complejo sistema de campos electromagnticos equivalentes a las "lentes" del microscopio de luz. La mayor utilidad de la microscopa electrnica de transmisin es en Oncologa. Es particularmente til en el diagnstico de neoplasias malignas, ya que permite identificar la estirpe o diferenciacin de una neoplasia. Por ejemplo, al demostrar elementos de diferenciacin no apreciables a microscopa de luz como desmosomas, propios de clulas epiteliales, que orientan hacia carcinoma; microvellosidades bien desarrolladas, que sugieren adenocarcinoma; melanosomas en melanoma y grnulos densos rodeados por membrana en carcinoma neuroendocrino. En conjunto con la inmunohistoqumica permite identificar un alto procentaje de las neoplasias malignas (95%). Igualmente, en el diagnstico diferencial de metstasis tumor maligno indiferenciado en ganglio linftico ( melanoma maligno, carcinoma, linfoma). En el frecuente dilema adenocarcinoma versus mesotelioma maligno pleural; tambin en el diagnstico de la granulomatosis de clulas de Langerhans. Esta tcnica juega un papel muy importante en el estudio de las enfermedades del rin, en particular en glomerulopatas primarias y secundarias. Junto con la inmunofluorescencia directa representan el estudio bsico para llegar a un diagnstico preciso en cada caso. Otras aplicaciones son la identificacin de partculas virales intranucleares y citoplasmticas. Tambin en enfermedades metablicas para estudiar el tipo de inclusiones o cuerpos de inclusin en las clulas afectadas (Niemann-Pick, Tay-Sachs, amiloide, etctera). En enfermedades ampollares de la piel es el nico mtodo para diferenciar variedades de epidermlisis bulosa congnita. En ciertas enfermedades respiratorias se ha detectado un trastorno importante del transporte mucociliar. Ultraestructuralmente, se observan cilios con alteraciones en nmero y disposicin del esqueleto ciliar microtubular y ausencia de los brazos internos de dinena y de las espculas radiales del esqueleto microtubular constituyendo el llamado sndrome de cilios inmviles o disquinesia ciliar. Estas anomalas representan un trastorno de carcter congnito y la microscopa electrnica es el nico mtodo que permite hacer un diagnstico preciso en estos pacientes. En muchos casos la informacin negativa, o sea la ausencia de algn carcter morfolgico especfico, puede ser tambin muy til . El examen cuidadoso y la evaluacin de las caractersticas ultraestructurales a la luz del cuadro clnico y la imagen histopatolgica al microscopio de luz y los estudios inmunohistoqumicos, permiten un diagnstico de certeza en la mayora de los casos.

Microscopa electrnica de barrido La microscopa electrnica de barrido permite el estudio de superficies celulares. La imagen se obtiene rastreando la superficie de la muestra con un haz electrnico ultrafino. Las seales generadas se recolectan, amplifican y captan en un tubo de rayos catdicos. Se utiliza en forma rutinaria en el estudio de enfermedades del tallo piloso. En estas condiciones hay anomalas estructurales y de superficie de los pelos, que pueden identificarse fcilmente con esta tcnica. De esta forma, es posible incluso establecer un pronstico de reversibilidad de las alteraciones utilizando esta tcnica. Inmunohistoqumica:

Corresponde a un grupo de tcnicas de inmunotincin que permiten demostrar una variedad de antgenos presentes en las clulas o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas tcnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse especficamente a los correspondientes antgenos. Esta reaccin es visible slo si el anticuerpo est marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloracin. En las tcnicas de inmunofluorescencia se utilizan como marcadores compuestos de fluorescena que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de onda visible, que depende de la naturaleza del compuesto. El isotiocianato de fluorescena emite luz verde amarillenta intensa. Estas tcnicas necesitan muestras en fresco y congeladas, sin fijacin convencional, pues los antgenos estn presentes en superficies celulares o son muy lbiles a la fijacin en formalina. La inmunofluorescencia directa, es decir con anticuerpos conjugados con fluorescena, se aplica corrientemente en el diagnstico de las enfermedades cutneas en donde tiene indicacin y utilidad muy precisas como en enfermedades ampollares, vasculitis y mesenquimopatas . Esta tcnica pese a ser muy sensible, presenta inconvenientes como la falta de permanencia de la fluorescencia, requiere de microscopa especializada y el detalle morfolgico es pobre. Para documentar cada caso, es necesario fotografiar la reaccin. En las tcnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas ms frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio (color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamene al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o protena A. El espectro de anticuerpos disponibles comercialmente crece da a da y actualmente es posible encontrar marcadores para una amplia gama de antgenos (Tabla).
EJEMPLOS DE MARCADORES INMUNOHISTOQUIMICOS

Anticuerpo CD1a CD4 CD8 CD30 CD45 CD68 S100 HMB-45 AE1 AE3 DESMINA GFAP CEA AFP

Clulas/antgenos detectados clula de Langerhans linfocito T de auxilio linfocito T citotxico clula de Reed-Sternberg leucocitos macrfagos clulas de Schwann melanocitos citoqueratinas de bajo peso molecular citoqueratinas de alto peso molecular clulas musculares gla antgeno carcino-embrionario alfa-fetoprotena

REN VIM

receptores nucleares de estrgenos sarcomas

Las tcnicas inmunohistoqumicas enzimticas permite una localizacin ms precisa de las reacciones, ya que la tincin es permanente, estable, puede contrastarse y puede ser evaluada con microscopio de luz. El material as estudiado puede archivarse por aos sin prdida de la intensidad de la reaccin. Los anticuerpos monoclonales ha permitido aumentar la especificidad, sensibilidad y gama de esta tcnica. Desventajas existen: presencia de reaccin inespecfica, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales, algunos reactivos son potencialmente carcingenos y su manipulacin debe ser cuidadosa, requieren estandarizacin precisa y estricto control de calidad. Existen diversos tipos de tcnicas, cuya indicacin depender del anticuerpo a utilizar (monoclonal o policlonal), material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y antgenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmticos o nucleares). Estas tcnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y negativos. El control negativo se obtiene realizando la misma tcnica, pero con omisin del paso de incubacin con anticuerpo primario. Existen sistemas automatizados que permiten la tincin de un gran nmero de casos simultneamente con la ventaja de pasos definidos y estandarizacin de las variable usuales con costo relativamente bajo y en mucho menor tiempo. La inmunohistoqumica tiene utilidad diagnstica en identificacin de diferenciacin y de marcadores pronsticos de neoplasias (marcadores tumorales). Por ejemplo, es posible la identificacin de los productos de oncogenes y de genes supresores de tumores con anticuerpos monoclonales, especialmente contra c-erbB-2, bcl-2, p21, Rb1 y p53; la identificacin de marcadores de diferenciacin como HMB-45 para melanocitos (melanoma), AE1 para carcinomas, vimentina para sarcomas y CD45 para leuocitos (linfomas). Un elemento importante a considerar es la ptima preservacin del tejido y por ende de los antgenos. La mayora de los antgenos se conservan adecuadamente despus de la fijacin en formalina e inclusin en parafina. Algunos son ms lbiles y slo se detectan en cortes de congelacin. Uno de los problemas actuales con estas tcnicas no es la tcnica en s, manual o automatizada, o la posibilidad de acceder a los numerosos anticuerpos existentes, sino la interpretacin de los resultados. Los errores de interpretacin disminuyen a nivel aceptable cuando el patlogo y sus colaboradores tiene experiencia en estas tcnicas y los resultados se analizan a la luz de los dems hallazgos clnico-patolgicos.
Biologa molecular aplicada a histopatologa

Este conjunto de tcnicas, que han sido tomadas tanto de la gentica molecular como de la bioqumica, nos permite analizar fenmenos biolgicos y patolgicos en el nivel molecular. Al igual que la microscopa electrnica y la inmunohistoqumica, estas tcnicas pueden aplicarse para refinar el diagnstico en Anatoma Patolgica. Pueden enumerarse las siguientes tcnicas: hibridacin in situ, reaccin en cadena de polimerasa (PCR), in situ-PCR , anlisis de polimorfismo de fragmentos de restriccin,

Southern blot, Western blot y Northern blot. Todas las tcnicas mencionadas pueden aplicarse al material obtenido por biopsia, autopsia e incluso muestras citolgicas. La tcnica de Southern blot permite el anlisis de ADN genmico o fragmentos definidos de ADN despus de digestin con endonucleasas de restriccin. La tcnica de Northern blot permite estudiar ARN en forma anloga. El Western blot es una tcnica inmunolgica derivada , que se utiliza para analizar antgenos proteicos. Las protenas se separan mediante electroforesis y se transfieren a una membrana slida o membrana o filtro. La membrana se incuba con anticuerpos, los que se detectan ulteriormente con sondas marcadas radioactivamente o con enzimas.
Hibridacin in situ:

La hibridacin in situ es la hibridacin de fragmentos marcados de ADN de una hebra o de ARN con secuencias complementarias (sondas) a ADN/ARN celular, que en condiciones apropiadas forman hbridos estables. En general, la hibridacin puede hacerse sobre soportes slidos (filtros de nylon o nitrocelulosa), en solucin (in vitro) o en cortes de tejido o preparaciones celulares (in situ). Se pueden utilizar sondas marcadas con elementos radioactivos, pero como se necesita proteccin y manipulacin especiales , no son de eleccin para su uso rutinario. Las tcnicas no-isotpicas o colorimtricas son ms rpidas y permiten una localizacin ms precisa de la reaccin. Las sondas marcadas sin elementos radioactivos son ms estables y ms baratas. La sensibilidad es igual o levemente inferior a la de los mtodos isotpicos. Se han utilizado sondas marcadas con biotina y digoxigenina. La sensibilidad de la tcnica depende de: 1) efecto de la preparacin del tejido sobre la retencin y accesibilidad de ADN celular blanco o ARN, 2) tipos de sondas, eficiencia de la marcacin de la sonda y sensibilidad del mtodo utilizado para la deteccin de la seal y 3) efecto de las condiciones de hibridacin in situ sobre la eficiencia de la hibridacin. La hibridacin in situ se utiliiza primordialmente en la deteccin de bajo nmero de copias de virus, en particular virus como agentes infecciosos (CMV) y como agentes carcingenos (HPV, HBV, EBV). En la tcnica de in PCR-in situ se realiza primero amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma viral.
Reaccin en cadena de la Polimerasa [PCR] Es un mtodo enzimtico para hacer mltiples copias de un segmento predeterminado de ADN. Las muestras pueden obtenerse de material de autopsia, biopsias y muestras citolgicas. Es una tcnicas extremadamente sensible capaz tericamente de amplificar 1 copia del segmento blanco de ADN. Uno de los problemas ms frecuentemente citados es la contaminacin de las muestras que pueden producir falsos positivos. El control negativo consiste en realizar la reaccin con todos los componentes excepto ADN blanco. La contaminacin debe controlarse estrictamente: mascarilla, doble guante, reactivos esterilizados, micropipetas esterilizadas con puntas con filtro, cuarto aislado y, en lo posible, slo un experimentador. Una vez amplificado el ADN, ste puede identificarse mediante electroforesis en gel de agarosa o mediante Southern blot. En Anatoma Patolgica se ha aplicado en:

1) Expresin de oncogenes y genes supresores de tumores en neoplasias 2) Clonalidad de linfomas 3) Identificacin de agentes infecciosos y virus oncognicos como virus, bacterias y micobacterias 4) Estudio de mutaciones y prdida de heterozigocidad (LOH). Citodiagnstico: El citodiagnstico, tambin llamado examen citolgico o simplemente citologa, es el diagnstico morfolgico basado en los caracteres microscpicos de clulas y componentes extracelulares, desprendidos de los rganos espontneamente u obtenidos por procedimientos que, en general, son menos invasivos que la biopsia.

Objetivos del Citodiagnstico 1) Colaboracin en el diagnstico y tipificacin de neoplasias malignas, mediante la evaluacin de las alteraciones de la morfologa del ncleo, del citoplasma y de las relaciones entre las clulas. 2) Diagnstico especfico de algunas lesiones benignas, por ejemplo: tumores benignos, hiperplasias, ciertas infecciones virales o micticas. 3) Eleccin de pacientes que deben ser estudiados ms profundamente en grupos de alto riesgo para un tipo especfico de cncer. 4) En hematologa, examen cualitativo y cuantitativo de los elementos figurados de la sangre perifrica (hemograma) y de la mdula sea (mielograma).

Mtodos de Obtencin de la Muestra 1) Citologa exfoliativa Se recoge material desprendido espontneamente o en forma inducida de las superficies de los rganos. En la mayora de los casos, la toma de la muestra se hace recogiendo material de un rea amplia, sin visin directa de una zona sospechosa, como se aprecia en los siguientes ejemplos. Muestra de mucosa crvico-vaginal, por raspado con esptula de madera. Este es el examen citolgico ms usado. Se aplica en programas de deteccin de cncer del cuello uterino, examinando mujeres asintomticas ("examen de Papanicolaou"). Las mujeres cuyo frotis contiene clulas atpicas son luego sometidas a examen clnico dirigido del cuello y biopsia, para confirmar si se trata de lesiones preneoplsicas o carcinoma infiltrante. Muestra de lquido de una serosa aspirado con aguja, en caso de derrame (acumulacin anormal de lquido) peritoneal, pleural o pericrdico. Se utiliza para el diagnstico diferencial entre inflamacin y tumor maligno. Los tumores malignos generalmente son metstasis de carcinoma en la serosa. El recuento de los diferentes tipos de clulas en el lquido de las serosas y en el cfalorraqudeo es importante tambin para el diagnstico diferencial entre procesos patolgicos benignos, por ejemplo: leucocitos polinucleares neutrfilos, eosinfilos, monocitos, linfocitos. Muestra de superficie del peritoneo por lavado en una intervencin quirrgica para detectar metstasis Muestra de esputo, espontneo o inducido, o de lavado broncoalveolar.

Se utiliza para detectar carcinoma bronquial o bien infecciones especficas en pacientes inmunodeprimidos (Pneumocystis carinii, hongos, alteraciones citopticas virales) Muestra de orina obtenida por miccin espontnea. Se usa como mtodo complementario para el dianstico de cncer de la vejiga, en particular el tipo plano, o para el control despus del tratamiento. En otros casos, la toma de muestra se hace con ayuda de un instrumento que permite ver una zona sospechosa, de la que se recoge material mediante cepillado o lavado. Se practica al paciente una endoscopa, del rbol bronquial o del tubo digestivo. Al encontrar una zona sospechosa de la mucosa, el mdico puede introducir un cepillo y obtener material para hacer un frotis. Tambin puede lanzar un chorro de suero a la lesin y aspirar el lquido que contiene clulas desprendidas. Con frecuencia el endoscopista tambin puede introducir una pinza y tomar una pequea biopsia; en estos casos el examen citolgico es complementario de la biopsia.

2) Citologa por aspiracin con aguja fina Se introduce en la lesin una aguja ms fina que las empleadas para biopsia. El corte por el filo de la aguja y la aspiracin por la presin negativa que se produce dentro de ella desprenden un lquido sanguinolento que contiene grupos de clulas; con este lquido se prepara el frotis. Se pueden distinguir dos tipos de muestras por puncin aspirativa con aguja fina: a) Puncin directa de lesiones superficiales palpables. Generalmente la practica un mdico en el consultorio con una aguja fina corriente. Se usa frecuentemente en casos de quistes y ndulos mamarios o tiroideos, para el diagnstico diferencial entre lesin benigna y cncer. Otro ejemplo es la puncin de ganglios linfticos superficiales (linfoadenopatas), como parte del diagnstico diferencial entre inflamacin, hiperplasia, linfoma o metstasis. b) Puncin de lesiones profundas no palpables, dirigida por imgenes. Es realizada por mdico radilogo en paciente hospitalizado, utilizando agujas finas largas, de diseos especiales. La puncin se practica bajo control de imgenes ecogrficas o de tomografa computada. Se emplea en masas hepticas, pancreticas, pulmonares, mediastnicas o retroperitoneales, para el diagnstico diferencial entre lesiones benignas y malignas.

Preparacin y Examen de la Muestra El material obtenido por raspado, cepillado o puncin aspirativa se extiende sobre un portaobjeto en forma de una delgada capa y se fija inmediatamente en alcohol de 96. Los lquidos (orina, ascitis, material de lavado) se fijan con un volumen igual de alcohol de 50%; a continuacin se centrifugan. Parte del sedimento se extiende sobre un portaobjeto. Los frotis o extendidos as preparados se colorean con el mtodo de Papanicolaou o con hematoxilina-eosina. En hematologa los frotis se secan al aire y se tien el mtodo de May-Grnwald- Giemsa y se examinan al microscopio.En los laboratorios que procesan muchos exmenes, un citotecnlogo hace un examen preliminar y marca las zonas del extendido que contienen clulas sospechosas (screening); luego el patlogo examina dichos elementos y formula el diagnstico citolgico.Se pueden guardar extendidos adicionales por si es necesario practicar mtodos auxiliares de tincin para identificar elementos especficos como bacterias, hongos, o practicar reacciones de inmunocitqumica.Se recomienda incluir en parafina los grumos de material o sedimento sobrantes, para hacer cortes histolgicos que completan el examen citolgico ("blocks celulares"). Ejemplos de Diagnsticos Citolgicos

Examen citolgico negativo para clulas neoplsicas malignas (Se observan elementos celulares compatibles con fibroadenoma) (Se observan estructuras micticas del gnero Candida) (Se observa abundante exudado purulento compatible con peritonitis aguda) Examen citolgico no concluyente (Se observan atipias celulares sospechosas, pero no diagnsticas, de carcinoma; se sugiere practicar biopsia) Examen citolgico positivo para clulas neoplsicas malignas (Alteraciones compatibles con carcinoma espinocelular) (Alteraciones compatibles con metstasis de melanoma) (Alteraciones compatibles con tumor maligno indiferenciado) Muestra insuficiente para examen citolgico

Ventajas del Examen Citolgico En comparacin con la biopsia, la toma de muestra citolgica es ms fcil, ms econmica y menos cruenta. El procesamiento es tambin ms sencillo y el resultado se puede obtener con ms rapidez. La muestra citolgica en general, abarca un rea mucho ms amplia que la de una biopsia. En muchos casos permite detectar lesiones no visibles a ojo desnudo (Ejemplos: lavado peritoneal, examen de Papanicolaou).

Limitaciones del Examen Citolgico Para el diagnstico de tumores malignos, se basa fundamentalmente en los caracteres celulares de malignidad (heterotipa); el extendido no permite ver directamente la distorsin de la microarquitectura ni la invasin. En algunos casos es difcil distinguir entre caracteres citolgicos de cncer y anaplasia de regeneracin. La aplicacin de tcnicas de inmunohistoqumica es ms dificultosa que en los cortes histolgicos. Finalmente, es necesario destacar que un diagnstico negativo para cncer no descarta la existencia de un tumor maligno, especialmente cuando ese diagnstico no demuestra una lesin benigna especfica (tumor benigno, agente etiolgico de un proceso infeccioso). Esta aseveracin es vlida para todos los mtodos de diagnstico