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Jornal de Pesquisa em Gesto da Inovao e Tecnologia. CINCIA, TECNOLOGIA E UNIVERSIDADE. Nmero 29, Maio de 2005.

Nmero 29, maio de 2005

C I N C I A , T E C N O L O G I A E U N I V E RSI D A D E >> I nnovations

INGENASA
Criado em 1981 com o um a em presa dedicada a aplicaes industriais de biotecnologia. Seus objetivos so: pesquisar, desenvolver e com ercializar produtos para o diagnstico e preveno de doenas infecciosas de m aior im portncia econm ica nas reas de Anim al e Sanidade Vegetal.

Carmen Vela Olmo

C EO

Imunologia e GENTICA APLICADA SA, INGENASA , foi criada em 1981 como uma empresa dedicada a aplicaes industriais de biotecnologia. Seus objetivos so: pesquisar, desenvolver e comercializar produtos para o diagnstico e preveno de doenas infecciosas de maior importncia econmica nas reas deSanidad Animal e Sanidade Vegetal. A combinao de equipes multidisciplinares em Imunologia, Gentica e Biologia Molecular alcana uma melhor integrao e resoluo de problemas, usando tcnicas de anticorpos monoclonais, clonagem e expresso de protenas recombinantes em microrganismos, PCR, etc. A empresa tambm oferece um diagnstico de servios externos. Depois de vrios anos de esforos em pesquisa e graas colaborao frutfera com nacional pblico e privado e internacional INGENASA desenvolvido procedimentos de diagnstico e de agentes teraputicos para vrias doenas, incluindo alguns que causam grandes perdas econmicas no setor pecurio. O ltimo a artrite viral eqina (EVA), que INGENASA est atualmente trabalhando atravs de um projeto financiado pela Direco-Geral de Investigao da Comunidade de Madrid, que h anos trabalham conosco de forma eficaz e contnua. O objetivo deste projeto o desenvolvimento de um teste de diagnstico com base em protenas recombinantes e anticorpos produzidos em E. coli ou baculovrus manter e melhorar a sensibilidade e especificidade dos testes atuais e aumentar o seu nvel de padronizao e robustez. O vrus da arterite equina (EAV) um membro do gnero Arterivirus, pertencendo famlia de Arteriviridae. Apresentado como um genoma de RNA de fita simples e polaridade positiva protegido por um nucleocapsdeo e lipoprotena envolvida (fig. 1). O AVE afecta cavalos de todas as idades e podem resultar no desenvolvimento de sintomas ou infeces inaparentes, dependendo da estirpe viral. Quando a infeco visvel, os sintomas podem variar dentro do alcance e gravidade. Casos tpicos AVE apresentou, entre outros, os seguintes sintomas: febre, leucopenia, anorexia e depresso, corrimento nasal e ocular, edema e abortos em guas pode ser ambas as fases precoces e tardias da gestao. O AVE adquiriu recentemente uma grande importncia, exigindo certificados que garantam que os animais no possuem, tanto para assegurar a implementao de um plano para controlar a doena.

Figura 1. Arterivirus esquema com quatro principais glicoprotenas estruturais: GL, GS, M e N. INGENASA est atualmente disponvel no mercado apenas ELISA para deteco de anticorpos especficos para o vrus da arterite eqina. um ensaio ELISA indirecto, em que os anticorpos presentes no soro de cavalos infectados ligam vrus purificado adsorvido no poo, para detectar a sua presena adiciona um anticorpo monoclonal especfico marcado com a enzima peroxidase de IgG de cavalo e subsequentemente O substrato adequado que reage com estaenzima ( fig. 2 ). Com esta reaco colorimtrica detecta a presena de anticorpos para VAE e, portanto, da infeco. Testes, embora eficaz para a sua correlao com a tcnica de referncia (neutralizao) o factor limitante no elevado custo da produo de antignio viral.

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Figura 2. ELISA esquema atual para o diagnstico de AVE Ingenasa O objetivo do projeto foi abordado a partir de duas frentes: 1. Foram clonadas e expressas as principais protenas virais ( fig1 sistema) em E. coli ou de baculovirus para tentar substituir o antignio viral, as protenas recombinantes. 2. Foi construda por PCR de um recombinante de cadeia simples (scFv) para uso em lugar do anticorpo monoclonal IgG de cavalo presente. Comeando com um isolado de vrus foram amplificadas pelas sequncias da tcnica de RT-PCR que codificam as protenas mais imunognica EAV GL glicoprotena, protena N e M ( fig. 1 ). Os trs foram clonados a ser expressa na bactria E. coli. Alm disso, duas sequncias pertencentes ao exterior ou glicoprotena ectodominiode GL, um dos mais imunognico do vrus, foram clonados e expressos em clulas de insectos. Para a construo de anticorpo monoclonal recombinante de uma nica cadeia (scFv) contra a cavalo IgG dividir hibridoma clulas secretoras de anti-IgG de cavalo. O RNA total foi extrado a partir das clulas e, por meio da tcnica de RT-PCR, foram recolhidos separadamente as regies variveis das cadeias pesada e leve do anticorpo (VH e VL, respectivamente). Subsequentemente modificado por meio de dois PCRs ambas as regies de modo que se adicionou uma sequncia de reconhecimento de protena extreptavidina (que ir detectar a presena do anticorpo). Finalmente, juntou-se, que as duas cadeias VH e VL por meio de uma ligao peptdica numa PCR final, dando origem a scFv ( Fig.. 3 )

Figura 3. ScFv esquema e sua construo utilizando a tcnica de PCR. Ectodomnio da protena foi testada por ELISA e os resultados preliminares indicam que os soros de cavalo pode ser apropriado para substituir o vrus EAV como um antignio em ensaios de diagnstico. Atualmente estamos trabalhando na melhoria da purificao de protenas e as condies de ELISA para melhores resultados. O scFv foi construdo, clonado e sequenciado para verificar que a sequncia estava correcta. Tem sido expressa como uma protena de fuso no citoplasma de E. coli foi detectada por imunotransferncia. No entanto, existem algumas dificuldades na obteno de quantidade adequada de protenas para que est estudando como obter um melhor desempenho. Alm disso, estamos a avaliar a capacidade do anticorpo para reconhecer IgGs cavalo recombinantes presentes no soro de animais infectados AVE, e, por outro lado, sua capacidade de ser detectado se no ensaio de ELISA. At agora, obtivemos a base para desenvolver um teste de diagnstico de AVE, que capaz de melhorar a um em uso hoje em dia. Ser necessrio determinar quais so as melhores condies para a utilizao de protenas recombinantes, para a combinao dos produtos expressos permitir a criao de um teste de diagnstico sensvel e especfico para o vrus da arterite equina, o qual resolve os problemas de baixo rendimento na produo de antgeno e reaes cruzadas devido inespecificidades alguns soros cavalo. Alm disso, a substituio do anticorpo monoclonal impedir a actual utilizao de animais experimentais.

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