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Actualizado martes 08/05/2007 17:02 (CET) ANGEL DAZ MADRID.- La levadura de la cerveza, un hongo microscpico que habita en la piel de
algunas frutas, puede modificarse genticamente para convertirse en un eficaz detector de explosivos o agentes qumicos. El microorganismo, tras haber sido alterado, es capaz de olfatear como un roedor algunas sustancias y volverse de color verde fluorescente para alertar del peligro. El mtodo ya ha sido probado con xito para detectar dinitrotolueno (DNT), una sustancia que se encuentra en varios de los explosivos ms utilizados para realizar atentados, as como en las miles de minas antipersona que an permanecen enterradas en todo el mundo. Por ello, la levadura olfateadora podra usarse para prevenir ataques terroristas o para localizar y desactivar estos siniestros artefactos. Un equipo de investigadores de la Escuela de Medicina de la Universidad Temple, en Philadelphia, clon receptores olfativos de ratas y ratones y modific con ellos la levadura, creando varias cepas. Una de ellas, result ser sensible al DNT, de forma que cambiaba de color al detectarlo, pero en el futuro podra usarse el mismo mtodo para encontrar toda clase de sustancias. "El potencial de la va de seales olfatorias, que puede detectar innumerables agentes qumicos con sensibilidad y selectividad sin precedentes, debera ser de inmenso valor en la deteccin de toxinas ambientales y agentes blicos incluso a niveles subletales", segn indican Danny Dhanasekaran y su equipo, quienes aaden que su sistema tambin podra emplearse para "controlar un gran nmero de molculas de posible valor teraputico".
que salven al menos algunos de estos obstculos. En este sentido, las levaduras presentan una serie de ventajas: Son eucariotas, y por lo tanto ms semejantes a las clulas de los organismos superiores que los procariotas (por ejemplo, sus mecanismos de secrecin) A diferencia de las bacterias, producen cierto tipo de modificaciones postraduccionales en las protenas (glucosilaciones en ciertos aminocidos, eliminacin de la metionina inicial, rotura proteoltica de un precursor inactivo, etc.), lo que puede hacer que las protenas heterlogas de organismos superiores puedan alcanzar su actividad biolgica (aunque esto no siempre est garantizado) A semejanza de ciertas bacterias, la levadura Saccharomyces cerevisiae es muy fcil de manejar con mtodos microbiolgicos S. cerevisiae est muy bien estudiada al nivel gentico y molecular. No slo se puede realizar gentica clsica (mutagnesis y recombinacin meitica, alternancia de ciclo haploide y diploide), sino que cuenta con herramientas avanzadas de ingeniera gentica, y su genoma se secuenci totalmente en 1996 Desde hace decenios, las levaduras se cultivan a escala industrial, y participan en multitud de procesos biotecnolgicos. Adems, cuenta con la calificacin oficial de organismo reconocido como seguro (GRAS), indispensable para poder usarlo en obtencin de sustancias para consumo humano Por todo ello, las levaduras son los huspedes eucariticos de clonacin ms fciles de usar, y una buena alternativa para intentar la produccin industrial de protenas de inters. (Sin embargo, debido a que las levaduras poseen un sistema de splicing diferente y menos efectivo que el de eucariotas superiores, si queremos expresar estos genes, hay que recurrir no a la versin genmica, sino al ADNc tras retrocopia del correspondiente ARNm maduro). Existen varios mtodos artificiales para introducir ADN exgeno en levaduras: Obteniendo protoplastos en medio hipertnico y mezclndolos con el ADN en presencia de una sustancia fusognica como el polietilenglicol (PEG) Tratando clulas completas con sales de litio, seguido de mezcla con PEG y ADN, con choque trmico para estimular la transformacin Por electroporacin: el ADN entra en las clulas tratadas con cortos pulsos de corriente elctrica. Igualmente existe multitud de tipos diferentes de vectores, cada uno con una serie de caractersticas apropiadas para fines concretos. En general, los vectores de levadura, aparte de secuencias de levadura, contienen tambin secuencias de vectores bacterianos, previstas para su amplificacin y manejo sobre todo en E. coli. Por esta razn se suelen calificar como vectores bifuncionales o lanzadera (porque permiten pasar del husped bacteriano a la levadura, y viceversa). Daremos solo una breve lista de las principales clases de vectores y sus rasgos ms notables: Vectores integrativos (YIp): suelen contener un gen silvestre de levadura, lo que permite que el vector se inserte, por recombinacin homloga, con secuencias homlogas de la levadura husped. No se suelen emplear para la expresin de genes heterlogos Vectores de replicacin autnoma basada en componentes cromosmicos (YRp)
Vectores con secuencias de replicacin autnoma (ARS): suelen ser vectores inestables, por lo que no tienen inters industrial Vectores YCp con ARS y secuencias centromricas (CEN): al disponer de secuencias de centrmeros de levadura, se segregan mejor a las clulas hijas, por lo que son ms estables, aunque se siguen perdiendo poco a poco, por lo que tampoco son demasiado tiles para la expresin a escala industrial Cromosomas artificiales de levadura (YAC): son vectores que cuentan con una secuencia ARS, una secuencia CEN y dos secuencias telomricas (TEL). Estn previstos para insertar grandes trozos de ADN (de ms de 100 kb). No se usan como vectores de expresin, sino como vectores de gran capacidad a la hora de generar genotecas de organismos complejos y preparar la secuenciacin (por ejemplo, los llamados megaYACs han sido muy tiles en el Proyecto Genoma Humano). Vectores basados en el crculo de 2m de levadura: se trata de vectores que se aprovechan de un plsmido natural de S. cerevisiae, conocido simplemente como crculo de 2m (por su tamao). Es un plsmido crptico (no codifica funciones fenotpicas aparte de su propia replicacin) existente en algunas cepas (cepas cir+) que se encuentra en unas 50 a 100 copias en el ncleo, constituyendo una especie de minicromosoma estable. Los vectores incorporan algunas de las secuencias del 2m implicadas en su replicacin y mantenimiento. La manipulacin gentica de S. cerevisiae ha permitido obtener molculas y procesos de gran inters comercial, sobre todo en el mbito clnico.
parecen funcionalmente a los potenciadores o intensificadores (enhancers) de los eucariotas superiores. Cuando se transform una levadura leu2- con este plsmido, se aislaron transformantes prototrofos en medio mnimo. Como el promotor del gen GAPD es constitutivo, la protena humana de Cu/Zn-SOD se expresaba continuamente, a grandes niveles. Adems, la levadura haba realizado una modificacin similar a las de la protena nativa de humanos, la acetilacin en el grupo amino de la alanina N-terminal. La mayora de vectores de expresin actuales recurre, sin embargo, a promotores de genes inducibles, como los de la respuesta al choque trmico, o el GAL1 y el GAL10 que se inducen 1000 veces en presencia de galactosa.
expresin gentica, sistema que est disponible comercialmente para investigacin a travs de la compaa Invitrogen. Las ventajas de este sistema son las siguientes: Ventajas derivadas de las caractersticas metablicas de esta levadura: Gran preferencia por el metabolismo respiratorio, lo que permite cultivos ms densos que otras levaduras Modificaciones postraduccionales mejores que los de S. cerevisiae: procesamiento proteoltico, glucosilacin y formacin de puentes disulfuro Altos rendimientos de protena, normalmente superiores a los sistemas de baculovirus y de clulas de mamfero Muy altos niveles de secrecin de protena heterloga, con apenas secrecin de protena nativa Sistema fcilmente escalable a escala industrial Sistema ms barato y ms rpido que los de eucariotas superiores El sistema original de expresin en P. pastoris est basado en el promotor de uno de los genes de la alcohol-oxidasa. La alcohol-oxidasa cataliza la primera reaccin de la ruta de degradacin del metanol, al oxidarlo hasta formaldehido y perxido de hidrgeno. La reaccin tiene lugar en el peroxima, orgnulo que secuestran el perxido del resto de la clula. La alcohol-oxidasa tiene poca afinidad por el metanol, pero esto lo compensa esta levadura sintetizando grandes cantidades de la enzima, determinada por dos genes, AOX1, AOX2. El producto del primero representa ms del 90% de la actividad total. El promotor de AOX1 est fuertemente regulado e inducido por metanol, pero est reprimido en otras condiciones, como hambre de carbono. La protena representa hasta el 5% del total de protena soluble durante la induccin con metanol. Por lo tanto, el promotor era un buen candidato para la expresin controlada de genes heterlogos: es posible cultivar la levadura recombinante durante la mayor parte del tiempo en una fuente de carbono no inductora como la glucosa o el glicerol; cuando se alcanza una densidad buena, se aade metanol para la induccin de la expresin del gen clonado. Este sistema, disponible comercialmente y de fcil uso, ha permitido expresar ms de 400 tipos de protenas, desde endostatina humana hasta protena de tela de araa. Veamos un ejemplo concreto: la produccin de antgeno de superficie del virus de la hepatitis B: Se clon el gen del antgeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) entre las seales de inicio y trmino de transcripcin del gen AOX1 de P. pastoris. Se dise un plsmido lanzadera previsto para la integracin cromosmica de la construccin gentica, y cuya porcin de levadura consista (en este orden): Mdulo de expresin promotor de AOX1-gen HBsAg-terminador de AOX1 Gen marcador HIS4 (para seleccionar transformantes en el auxotrofo his4-) Secuencias del gen AOX1 correspondientes a la porcin no codificante distal (en 3) Con este plsmido se transform una cepa auxotrofa his4-. El diseo del vector es tal que, al carecer de secuencias de mantenimiento en la levadura, la nica manera de que se originen los transformantes es por recombinacin. Un doble entrecruzamiento por recombinacin
homloga en el que, por un extremo participen las secuencias de promotor, y por el otro las secuencias en 3 del gen AOX1 significa la integracin del mdulo levadura del plsmido, incluyendo el gen silvestre HIS4 y la construccin de expresin con el gen de HBsAg, pero con ello interrumpimos el gen AOX1 silvestre. La seleccin de este evento se hace en: medio mnimo sin histidina, para seleccionar la integracin del gen HIS4 con metanol: las colonias que han integrado el mdulo y que inactivan el gen AOX1 endgeno crecen lentamente en metanol (porque tienen otro el otro gen, menos efectivo, AOX2) Estos transformantes, cuando se crecen en metanol, sintetizan grandes cantidades del antgeno del virus de la hepatitis B, que se queda en el citoplasma. Un clon transformante lleg a producir el equivalente a casi 10 millones de dosis de vacuna cuando se cultiv en un recipiente de 240 litros. Adems, la construccin gentica era estable durante al menos varios das de cultivo. A pesar de lo anterior, este sistema de expresin presenta ciertas limitaciones, algunas de las cuales se estn resolviendo en los ltimos aos: 1. El metanol que se necesita para la induccin supone cierto riesgo de fuego y puede no ser adecuado para producir protenas alimentarias. Por lo tanto, se necesitan promotores fuertes que no necesiten metanol para su induccin. Ya se cuenta con algunos: a. Promotor del gen de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAP). Suministra un alto nivel constitutivo de expresin en glucosa o glicerol. El inconveniente es que al ser constitutivo, puede no ser adecuado para expresar protenas que supongan efectos negativos para el hospedador. b. Promotor del gen FLD1 de P. pastoris, codificador de una glutatindeshidrogensasa dependiente de formaldehido. Se puede inducir por metanol o por metilamina (una fuente inocua de N) en medios con glucosa. Los niveles inducidos de expresin con este promotor son parecidos a los del gen AOX1 en metanol. 2. Se necesitan promotores de expresin moderada. Algunos ejemplos: a. Del gen PEX8, que codifica una protena de biognesis del peroxisoma. Suministra expresin a bajo nivel sobre glucosa, y se induce moderadamente (unas 10 veces) cuando las clulas se pasan a metanol. b. Del gen YPT1: confiere expresin baja pero constitutiva en glucosa, metanol o manitol 3. Otra limitacin era la carencia de ms genes marcadores para seleccionar los recombinantes. Hasta hace poco, solo se dispona de HIS4, ARG4 y Sh ble (resistencia al antibitico zeocina). Ahora contamos con otros marcadores: ADE1, URA3. Otros sistemas de expresin en otras levaduras: Levaduras metilotrficas: Candida boidinii Hansenula polymorpha
Pichia methanolica Levaduras que usan lactosa: Kluyveromyces lactis Levaduras usadoras de alcanos y de cidos grasos: Yarrowia lipolytica