Tese v1.prn

ELAINE ROSECHRER CARBONERO
POLISSACARDEOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS CONTENDO DIFERENTES FOTOBIONTES

Tese apresentada ao Curso de PsGraduao em Bioqumica e Biologia Molecular, Setor de Cincias Biolgicas, Universidade Federal do Paran, como requisito parcial para a obteno do ttulo de Doutor em Cincias. Orientador: Prof. Dr. Marcello Iacomini Co-orientador: Prof. Dr. Philip A. J. Gorin
CURITIBA 2005
ELAINE ROSECHRER CARBONERO
POLISSACARDEOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS CONTENDO DIFERENTES FOTOBIONTES
Tese apresentada ao Curso de PsGraduao em Bioqumica e Biologia Molecular, Setor de Cincias Biolgicas, Universidade Federal do Paran, como requisito parcial para a obteno do ttulo de Doutor em Cincias. Orientador: Prof. Dr. Marcello Iacomini Co-orientador: Prof. Dr. Philip A. J. Gorin
CURITIBA 2005
Em especial ao Prof. Marcello Iacomini que tanto me ensinou e incentivou a concretizao deste trabalho.
Aos meus pais Joo e Zeni, e ao Valnir por serem presentes na minha vida.
AGRADECIMENTOS
Agradeo ao meu orientador Prof. Dr. Marcello Iacomini, pela palavra sempre amiga e confiante, pela dedicao, apoio e sobretudo por ter acreditado em mim, minha eterna gratido. Ao Prof. Philip A. J. Gorin, pelos ensinamentos cientficos, pelo contnuo estmulo, pela orientao e pelo exemplo de uma vida dedicada pesquisa. Patrcia Maria Stuelp-Campelo, pelos ensinamentos durante o incio como aluna de Iniciao Cientfica, pela amizade e pelos conhecimentos compartilhados. Aos meus pais Joo e Zeni, pelo apoio incondicional sempre presente e a preocupao para que os meus objetivos fossem alcanados. Ao Valnir pelo amor, apoio, amizade, incentivo incondicional, pacincia e compreenso da minha ausncia. Aos Professores Dr. Teuvo Ahti (Departamento de Botnica da Universidade de Helsinki, Helsinki, Finlndia), Dra. Sionara Eliasaro (Departamento de Botnica UFPR), Dra. Sandra Mara Woranovicz-Barreira (Departamento de Farmcia -UFPR), Dra. Selene Elfio Esposito (Pontifcia Universidade Catlica do Paran - PUC-PR) e Dra. Elfriede Stocker-Wrgtter (Institute of Plant Physiology, University of Salzburg, Salzburg, Austria) pela coleta e/ou identificao dos liquens estudados. Profa. Dra. Sionara Eliasaro pelas inmeras conversas sobre os fascinantes fungos liquenizados. Ao Anderson, Ana Helena, Fhernanda, Giovana e Rafaela (ordem alfabtica para no haver briga!!!) pela ajuda e pelos incansveis momentos experimentais, muito obrigado. Aos Professores Dr. Guilherme L. Sassaki e Dr. Miguel Daniel Noseda, pela disponibilidade para a realizao das anlises de RMN e/ou GC-MS. Ao Dr. Giangiacomo Torri e ao Sr. Cesare Cosentino (Istituto di Ricerche Chimiche e Biochimiche G. Ronzoni, Milano, Italy), pela realizao de inmeras anlises espectroscpicas.
Ao Csar A. Tischer pela amizade e pela realizao das anlises de RMN e GC-MS realizadas no nicio deste trabalho. Profa. Fany Reicher, pelo acompanhamento do trabalho, pelos conselhos e apoio nesta caminhada. s Professoras Juliana Maurer Menestrina e Fany Reicher, pela anlise crtica da tese, como integrantes da banca interna. Com muita admirao, agradeo as sugestes e auxlio nesta etapa to importante. s minhas eternas amigas Caroline Mellinger e Ana Helena, pela imensa amizade que conseguimos cultivar. Espero que, embora nossos caminhos possam tomar rumos distintos a partir de agora, ns consigamos manter a amizade sincera. Ao pessoal dos laboratrios 247, E-1 e 252: Thales, Ricardo, Fernanda (a metdica), Lucimara, Juliana, Lauro, Rodrigo Reis, Ana Helena, Caroline, Breno, Rodrigo Vassoler, Dirce, Ricardo, Andria, Fhernanda, Maria Luiza, Joo, Roger, entre outros, pelos momentos de convivncia e colaborao. Aos colegas de laboratrio anexos: Adriano, Paula, Rosiane, Ana Paula Newton, Tatiane, Marcos, Gerusa, Diogo, Juliana Cassolato, entre outros ( difcil lembrar de todos!!!), pelas horas de descontrao. Aos antigos amigos da Qumica de Carboidratos, Patrcia, Selene, Cntia, Sandra, Renato, Csar, Clarice, pela amizade e experincias compartilhadas. Ao meu grande amigo Fbio Rogrio Rosado, pela amizade, conversas, trabalhos em conjunto, etc. Andria Ticiane (T), pela amizade sincera em todos os momentos de nossa convivncia. Rosane pela amizade e disponibilidade para a realizao de inmeras anlises de GC-MS. companheira de trabalho dos finais de semana e feriado, Gracielle Viccini. Ao Thales (Baro), pela amizade sincera conquistada desde o curso de graduao. Ao meu amigo Ricardo, pela amizade, pacincia, disposio em ajudar a qualquer momento e aos bons momentos de convivncia.
s coordenadoras do Curso de Ps-Graduao, Profa. Leda Satie Chubatsu e Profa. Maria Eugnia R. Duarte, pelo empenho e dedicao prestados e ao crescimento e reconhecimento deste curso. minha madrinha Profa. Helena Simes Duarte por ter inspirado a escolher a minha profisso. Ao meu amigo Lus Antonio da Motta pelo incentivo dado durante o decorrer deste percurso. Ah, voc no conseguiu me convercer a escolher outra profisso. Ao meu irmo Joo Antonio Carbonero....com saudades.... s minhas filhas de corao, Michaela e Anne Eliz. Dona Marilza pela presena alegre e prestativa. A todos os professores, ps-graduandos e funcionrios do Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular UFPR, pela colaborao e amizade. famlia Pereira Gracher, pelos momentos de descontrao, ensinamentos e apoio prestados no perodo pr-defesa. CAPES, PRONEX- Fundao Araucria, pelo apoio financeiro. A todos que, de algum modo, influenciaram positivamente nesta caminhada, toda admirao e reconhecimento. A Deus, por permitir a realizao de todos os meus objetivos.
A mais bela experincia que podemos ter a do mistrio. a emoo fundamental existente na origem da verdadeira arte e cincia. Aquele que no a conhece e no pode se maravilhar com ela est praticamente morto e seus olhos esto ofuscados. Albert Einstein
SUMRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ XII LISTA DE TABELAS ............................................................................................XV LISTA DE LISTA DE SMBOLOS, ABREVIATURAS, SIGLAS ................... XVI RESUMO ............................................................................................................XVIII ABSTRACT .......................................................................................................... XIX 1 INTRODUO ..................................................................................................... 1 1.1 LIQUENS ........................................................................................................... 1 1.1.1 Histrico............................................................................................................ 1 1.1.2 Aspectos Gerais................................................................................................. 2 1.2 PRINCIPAIS CONSTITUINTES QUMICOS DOS LIQUENS........................... 6 1.2.1 Substncias Liqunicas ...................................................................................... 6 1.2.2 Carotenides...................................................................................................... 7 1.2.3 Carboidratos de Baixa Massa Molar .................................................................. 7 1.2.4 Carboidratos de Alta Massa Molar..................................................................... 8 1.3 IMPORTNCIA QUIMIOTAXONMICA DOS POLISSACARDEOS LIQUNICOS.................................................................................................... 18 1.4 CARACTERISTICAS GERAIS DOS LIQUENS ESTUDADOS....................... 19 1.4.1 Cladina spp (Famlia Cladoniaceae). ............................................................... 22 1.4.2 Dictyonema glabratum (Famlia Dictyonemataceae) ....................................... 22 1.4.3 Leptogium spp. (Famlia Collemataceae). ........................................................ 22 1.4.4 Parmotrema spp. e Rimelia spp. (Famlia Parmeliaceae). ................................ 23 1.4.5 Roccella decipiens (Famlia Roccellaceae) ...................................................... 23 1.4.6 Umbilicaria mamullata (Famlia Umbilicariaceae) .......................................... 24 2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 25 3 MATERIAL E MTODOS ................................................................................ 26 3.1 FUNGOS LIQUENIZADOS .............................................................................. 26 3.1.1 Cladina spp. .................................................................................................... 26 3.1.2 Dictyonema glabratum .................................................................................... 26
3.1.3 Leptogium spp. ............................................................................................... 27 3.1.4 Parmotrema spp. ............................................................................................. 27 3.1.5 Rimelia spp...................................................................................................... 27 3.1.6 Roccella decipiens ........................................................................................... 28 3.1.7 Umbilicaria mammulata .................................................................................. 28 3.2 PROCEDIMENTOS GERAIS DE EXTRAO ............................................... 28 3.2.1 Extrao Clorofrmio-Metanol ....................................................................... 28 3.2.2 Extrao Metanol-gua................................................................................... 29 3.2.3 Extrao Aquosa.............................................................................................. 29 3.2.4 Extrao Alcalina ............................................................................................ 29 3.2.5 Extrao com Dimetilsulfxido ....................................................................... 30 3.3 FRACIONAMENTO DOS POLISSACARDEOS............................................. 30 3.3.1 Separao dos Polissacardeos por Congelamento e Degelo............................. 30 3.3.2 Purificao dos Polissacardeos com Soluo de Fehling ................................ 30 3.3.3 Purificao dos Polissacardeos por Ultrafiltrao ou Dilise em Membranas.. 31 3.4 ANLISE ESTRUTURAL DOS POLISSACARDEOS.................................... 32 3.4.1 Composio Monossacardica.......................................................................... 32 3.4.1.1 Hidrlise cida total...................................................................................... 32 3.4.1.2 Reduo e acetilao dos produtos de hidrlise............................................. 32 3.4.2 Teste de Homogeneidade e Determinao da Massa Molecular ....................... 33 3.4.2.1 Cromatografia em gel permeao.................................................................. 33 3.4.2.2 Cromatografia de excluso estrica acoplada deteco por ndice de refrao e espalhamento de luz (HPSEC-MALLS)..................................................... 33 3.4.3 Metilao......................................................................................................... 34 3.4.3.1 Metanlise .................................................................................................... 34 3.4.3.2 Hidrlise para formar os produtos parcialmente O-metilados........................ 35 3.4.4 Dosagem de cidos Urnicos.......................................................................... 35 3.4.5 Carboxi-reduo do Heteropolissacardeo cido Isolado do Lquen Leptogium sp. .................................................................................................. 35 3.4.6 Degradao de Smith....................................................................................... 36
3.4.7 Hidrlise cida Parcial.................................................................................... 37 3.5 MTODOS ANALTICOS ................................................................................ 37 3.5.1 Cromatografia Gasosa Acoplada Espectrometria de Massa (GC-MS) ........... 37 3.5.2 Cromatografia de Partio em Papel (CP)........................................................ 38 3.5.3 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) .......................................... 38 3.5.4 Ressonncia Magntica Nuclear (RMN).......................................................... 38 4 RESULTADOS E DISCUSSES ....................................................................... 40 4.1 Polissacardeos de Cladina spp........................................................................... 40 4.1.1 Caracterizao Estrutural das Fraes IKP (insolveis em KOH 0,5%; nigeranas) ........................................................................................................ 41 4.1.2 Caracterizao Estrutural das Fraes SKP (solveis em KOH 0,5%; laminaranas) .................................................................................................... 43 4.1.3 Caracterizao Estrutural da Frao Precipitado de Fehling (PF; galactoglucomananas)...................................................................................... 44 4.1.4 Caracterizao Estrutural das Fraes Sobrenadantes de Fehling (SF; galactomanoglucanas)...................................................................................... 46 4.2 -Glucana (1 3)-ligada, -xilana (1 4)-ligada e -manana (1 6)-ligada de Dictyonema glabratum ....................................................................................... 49 4.3 Polissacardeos de Leptogium sp......................................................................... 55 4.3.1 Polissacardeos Obtidos por Extraes Aquosas .............................................. 56 4.3.2 Polissacardeos Obtidos por Extrao Alcalina ................................................ 66 4.3.2.1 Caracterizao estrutural da frao precipitado de Fehling (PFSK-La; galactomanana)............................................................................................. 66
4.4 Polissacardeos de Parmotrema spp. e Rimelia spp........................................................ 72 4.4.1 Liquenanas e nigeranas da Frao Precipitado de Congelamento-degelo (PK2) ........... 73
4.4.2 Galactoglucomananas da Frao Precipitado de Fehling (PFK2). .................... 79 4.4.3 -Glucana (1 6) da Frao Precipitado de Fehling (PFK10) de P. mantiqueirense ................................................................................................ 85 4.5 Polissacardeos de Roccella decipiens ................................................................ 88 4.5.1 Laminarana Presentes na Frao Insolvel em gua Fria ............................... 89
4.5.2 Caracterizao Estrutural das Galactofuranomananas Presentes na Frao Solvel em gua Fria...................................................................................... 90 4.6 -Glucana (1 6)-ligada, -glucana (1 3)-ligada e galactofuranomanana de Umbilicaria mammulata .................................................................................... 95 5 CONSIDERAES FINAIS ............................................................................ 105 REFERNCIAS .................................................................................................... 108 ANEXOS................................................................................................................ 121
LISTA DE FIGURAS
- Tipos de talos liqunicos: folioso (ex: Xanthoria polycarpa), crustoso (ex: Diploicia canescens) e fruticoso (ex: Usnea subfloridana)................ FIGURA 2 - Corte transversal de Canomaculina pilosa (Stiz.) Elix & Hale em eletromicrografia de varredura................................................................... FIGURA 3 - Principais estruturas observadas em galactomananas obtidas de liquens........................................................................................................ FIGURA 4 - Esquema da estrutura proposta para o core da galactomanana obtida de Lasallia pustulata aps remoo por hidrlise parcial das unidades de Galf............................................................................................................. FIGURA 5A - Fragmentos dos liquens dos gneros Cladina (C. arbuscula, C. confusa, C. substenius), Dictyonema (D. glabratum), Leptogium (L. azureum, Leptogium sp.), Parmotrema (P. austrosinense e P. delicatulum)............. FIGURA 5B - Fragmentos dos liquens dos gneros Parmotrema (P. mantiqueirense, P. schindlerii e P. tinctorum), Rimelia (R. cetrata e R. reticulata), Roccella (R. decipiens) e Umbilicaria (U. mammulata)........................................... FIGURA 6 - Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos de Cladina spp.............................................................................................................. FIGURA 7 - Espectros de RMN-13C da frao insolvel em KOH 0,5% (IKP; nigeranas) em Me2SO-d6 (70C) obtidos de Cladina arbuscula (A), C. confusa (B) e C. subtenius (C).................................................................. FIGURA 8 - Espectros de RMN-13C da frao solvel em KOH 0,5% (SKP; laminaranas) em Me2SO-d6 (70C) obtidos de C. arbuscula (A), C. confusa (B) e C. subtenius (C)................................................................... FIGURA 9 - Regies anomricas dos espectros de RMN-13C das fraes precipitado de Fehling (PF; galactoglucomanana) em D2O (30C) obtidas de C. arbuscula (A), C. confusa (B) e C. subtenius (C).. FIGURA 10 - Regies anomricas dos espectros de RMN 13C das fraes sobrenadante de Fehling (SF; galactomanoglucana) em D2O (30C) obtidas de Cladina arbuscula (A), C. confusa (B) e C. subtenius (C)........................ FIGURA 11 - Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos do lquen Dictyonema glabratum............................................................................... FIGURA 12 - Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos de Leptogium spp. FIGURA 13 - Espectros de RMN- 13C da frao PW (laminarana) em Me2SO-d6 (70C) obtida de L. azureum (A) e Leptogium sp. (B)............................... FIGURA 14 - Perfil de eluio das fraes SCW-La (A) e 16ESC-La (B) (solubilizadas em H2O MilliQ) em cromatografia de excluso estrica, acoplada a multideteco espalhamento de luz (LS) e ndice de refrao (IR) (HPSEC-MALLS)................................................................ FIGURA 15 - Perfil de eluio das fraes 14RSC-La (A) e 14ESC-La (B) (solubilizadas em H2O MilliQ) em cromatografia de excluso estrica, acoplada a multideteco espalhamento de luz (LS) e ndice de refrao (AUX) (HPSEC-MALLS)............................................................ FIGURA 16 - Espectros de RMN-13C das fraes 14RSC-La (A) e 14ESC-La (B) em D2O (30 C) obtidas de L. azureum............................................................. FIGURA 17 - Perfil de eluio, por HPSEC, das fraes PFHW-La (A) e PFHW-L2 (B) (solubilizadas em nitrito de sdio 0,1 mol.l-1, contendo azida sdica)........................................................................................................ FIGURA 18 - Espectros de RMN-13C (A) e DEPT (B) da frao PFHW-L2 em D2O (30C)......................................................................................................... FIGURA 1
3 4 11
13
20
21 41
43
44
45
47 49 55 56
58
59 61
62 63
FIGURA 19 FIGURA 20 FIGURA 21 FIGURA 22 FIGURA 23 FIGURA 24 FIGURA 25
FIGURA 26 FIGURA 27
FIGURA 28
- Espectro de RMN-13C da frao PFHW-La em D2O (30C)...................... - Espectro de RMN-13C da frao P1-L2 em D2O (30C)............................. - Perfil de eluio, por HPSEC, das fraes PFSK-La (em cinza) e RPFLa (em preto) (solubilizadas em H2O MilliQ)............................................ - Espectro de RMN-13C da galactomanana (RPF) isolada de L. azureum (em D2O, 50C)........................................................................................... - Espectro de 1H,13C HMQC da galactomanana isolada de L. azureum (em D2O, 50C).................................................................................................. - Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos de fungos liquenizados do gnero Parmotrema e Rimelia.......................................... - Espectros de RMN-13C da frao precipitado de congelamento e degelo (PGD) obtida de Parmotrema austrosinense (A), P. delicatulum (B), P. mantiqueirense (C), P. schindlerii (D), P .tinctorum (E), Rimelia cetrata (F) e R. reticulata (G)................................................................................. - Espectro de RMN- 13C da frao PIAA (nigerana), em Me2SO-d6 a 50 C, obtida de Rimelia cetrata................................................................. - Espectros de RMN-13C da frao PSAA (liquenanas) obtida de Parmotrema austrosinense (A), P. delicatulum (B), P. mantiqueirense (C), P. schindlerii (D), P. tinctorum (E), Rimelia cetrata (F) e R. reticulata (G).............................................................................................. - Perfil de eluio da frao obtida aps degradao de Smith de
64 65 67 69 70 72
74 75
75
PSAA (A) e dos padres: 2-O- -D-glucopiranosil-D-eritritol (B) e eritritol (C), obtido por HPLC (coluna HPX-87H 300 x 780 mm - AMINEX ion exclusion-BIO RAD)......................................
77
FIGURA 29
FIGURA 30
FIGURA 31 FIGURA 32 FIGURA 33 FIGURA 34 FIGURA 35 FIGURA 36
FIGURA 37
FIGURA 38
- Perfil de eluio, por HPSEC, das fraes precipitado de Fehling (PFK2) obtida de Parmotrema austrosinense (PF-Pa), P. delicatulum (PF-Pd), P. mantiqueirense (PF-Pm), P. schindlerii (PF-Ps), P. tinctorum (PF-Pt), Rimelia cetrata (PF-Rc) e R. reticulata (PF-Rr).......... - Espectros de RMN-13C da frao precipitado de Fehling (PFK2; galactoglucomanana) obtida de Parmotrema austrosinense (A), P. delicatulum (B), P. mantiqueirense (C), P. schindlerii (D), P. tinctorum (E), Rimelia cetrata (F) e R. reticulata (G)................................................ - Espectro de HSQC-DEPT do heteropolissacardeo isolado de Parmotrema austrosinense (em D2O a 30C)............................................. - Perfil de eluio, por HPSEC, da frao PFK10 (solubilizada em H2O MilliQ), obtida do lquen P. mantiqueirense.............................................. - Espectro de RMN-13C da frao PFK10 em D2O (30C).......................... - Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos do lquen Roccella decipiens...................................................................................... - Espectros de RMN-13C da frao IW (A) e IK (B) (laminaranas), em Me2SO-d6 a 70 C, obtida do lquen Roccella decipiens............................. - Perfil de eluio das fraes PFK (A), SFK (B) (solubilizadas em H2O MilliQ), RSF (C) e ESF (D) (solubilizadas em nitrito de sdio 0,1 mol.l1 , contendo azida sdica) obtidas do lquen R. decipiens, em HPSEC........................................................................................................ - Espectros de RMN-13C das fraes RSF (A), ESF (B), HRSF (C) (amostras solubilizadas em D2O, 30 C) e SmRSF (D) (em Me2SO-d6, 50 C).......................................................................................................... - Espectros de RMN-13C das fraes PFK (A) HPF (B) (em D2O, 30 C) e SmPF (B) (em Me2SO-d6, 50 C)................................................................
81
84 82 86 86 88 90
91
92 94
FIGURA 39 FIGURA 40
FIGURA 41 FIGURA 42
FIGURA 43
- Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos do lquen Umbilicaria mammulata............................................................................. 98 - Espectro de RMN-13C da frao PM (pustulana parcialmente Oacetilada), em Me2SO-d6 (70 C), obtida do lquen Umbilicaria mammulata................................................................................................. 99 - Espectro de RMN-13C da frao SF-SK (laminarana), em Me2SO-d6 (50 C), obtida do lquen Umbilicaria mammulata..................................... 100 - Perfil de eluio das fraes SF-SK (A) e TZeSF (B) (solubilizadas em nitrito de sdio 0,1 mol.l-1, contendo azida sdica) obtidas do lquen Umbilicaria mammulata, em cromatografia de excluso estrica, acoplada a multideteco espalhamento de luz (LS) e ndice de refrao (IR) (HPSEC-MALLS)................................................................ 101 - Espectros de RMN-13C das fraes TZeSF (A) e HP10 (B), em D2O (30 C), obtidas do lquen Umbilicaria mammulata.................................. 103
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 TABELA 2 TABELA 3 TABELA 4 TABELA 5 TABELA 6 TABELA 7 TABELA 8 TABELA 9 TABELA 10 TABELA 11 TABELA 12 TABELA 13 TABELA 14 TABELA 15 TABELA 16 TABELA 17 TABELA 18 TABELA 19 - Tipos de glucanas encontradas em fungos liquenizados...................... 9 - Tipos de heteropolissacardeos encontrados em fungos liquenizados.......................................................................................... 12 - Polissacardeos obtidos de fungos liquenizados................................... 14 - Composio monossacardica e rendimento dos polissacardeos obtidos de Cladina spp......................................................................... 42 - Dados de RMN-13C e 1H das nigeranas (IKP) e laminaranas (SKP), obtidos de Cladina spp......................................................................... 43 - Anlise por metilao da frao precipitado de Fehling (PF; galactoglucomanana) obtidas de Cladina spp...................................... 46 - Anlise por metilao da frao sobrenadante de Fehling (SF; galactomanoglucana) obtidas de Cladina spp...................................... 48 - Composio monossacardica das fraes isoladas de D. glabratum... 50 - Anlise por metilao dos polissacardeos obtidos de D. glabratum... 51 - Dados de RMN-13C e 1H para os polissacardeos isolados de D. glabratum.............................................................................................. 52 - Composio monossacardica e rendimento das fraes sobrenadante de gelo/degelo obtidas de Leptogium spp............................................. 57 - Composio monossacardica das fraes obtidas de Leptogium spp.. 60 - Anlise por metilao da galactomanana obtida de L. azureum........... 68 - Composio monossacardica e rendimento da frao PFK2 obtida dos liquens Parmotrema spp. e Rimelia spp......................................... 79 - Anlise por metilao da frao precipitado de Fehling (PFK2; galactoglucomanana) obtidas de Parmotrema spp. e Rimelia spp....... 82 - Composio monossacardica das fraes obtidas do lquen Roccella decipiens................................................................................ 89 - Anlise por metilao das fraes obtidas de Roccella decipiens........ 93 - Anlise por metilao das fraes TzeSF e HP10 obtidas de Umbilicaria mammulata....................................................................... 102 - Polissacardeos obtidos nas espcies de fungos liquenizados estudados............................................................................................... 105
LISTA DE SMBOLOS, ABREVIATURAS, SIGLAS
l m ~ 13 C 1 H 3-O-MeGal Ac2O Ag2CO3 AgNO3 BaCO3 CH3I CHCl3 COSY CuSO4 d.i. D2 O DEPT f Gal GC-MS Glc h H2 O H2SO4 HCl HMQC HOAc HPLC HPSEC-MALLS
HSQC Hz IR J kDa KOH LS M Man Me2SO Me2SO-d6
Microlitro Micrometro Aproximadamente Carbono treze Prton 3-O-metil-galactopiranose Anidrido actico Carbonato de prata Nitrato de prata Carbonato de brio Iodeto de metila Clorofrmio Correlation spectroscopy Sulfato de cobre Dimetro interno xido de deutrio Distiortionless enhancement by polarization transfer Furanosdico Galactose Cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massa Glucose Hora gua cido sulfrico cido clordrico Heteronuclear multiple quantum correlation spectroscopy cido actico Cromatografia lquida de alta eficincia Cromatografia de excluso estrica acoplada deteco por ndice de refrao e espalhamento de luz (HPSECMALLS) Heteronuclear single quantum correlation spectroscopy Hertz ndice de refrao Constante de acoplamento kilodaltons Hidrxido de potssio Espalhamento de luz Molar Manose Dimetilsulfxido Dimetilsulfxido deuterado
MeOH mg min ml NaB2H4 NaBH4 NaIO4 NaN3 NaNO2 NaOAc NaOH p p/v pH ppm RMN ROESY rpm TFA TOCSY v/v Xyl
Metanol Miligrama Minuto Mililitros Boroidreto de sdio deuterado Boroidreto de sdio Periodato de sdio Azida de sdio Nitrito de sdio Acetato de sdio Hidrxido de sdio Piranosdico Peso/volume Potencial hidrogeninico Partes por milho Ressonncia Magntica Nuclear Rotational nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Rotaes por minuto cido trifluoractico Total correlation spectroscopy Volume/volume Xilose
RESUMO As estruturas de polissacardeos obtidas de 15 espcies de fungos liquenizados (Cladina arbuscula, C. confusa, C. substenius, Dictyonema glabratum, Leptogium azureum, Leptogium sp., Parmotrema austrosinense, P. delicatulum, P. schindlerii, P. mantiqueirense, P. tinctorum, Rimelia cetrata, R. reticulata, Roccella decipiens e Umbilicaria mammulata) foram estudadas. Exceto liquens dos gneros Roccella, Leptogium e Dictyonema que apresentam a alga Trentepohlia ou cianobactrias dos gneros Nostoc e Scytonema, respectivamente, como fotobiontes, os demais contm algas dos gneros Trebouxia ou Asterochloris, sendo estes os mais estudados. A partir dos talos destes liquens, foram isoladas glucanas, xilanas, mananas, galactomananas, galactoglucomananas, galactomanoglucanas e um heteropolissacardeo cido. Os homopolmeros encontrados correspondem a uma -D-glucana contendo ligaes glicosdicas alternadas do tipo (1 3)- e (1 4) (1:1; nigerana), -D-glucana contendo ligaes do tipo (1 3)- e (1 4) (1:3.1; liquenana), -glucana (1 3) (pseudonigerana), -glucana (1 3) (laminarana), -glucana (1 6) (pustulana) podendo conter grupamentos O-acetil, -D-xilana linear ligada (1 4) e uma -Dmanana linear contendo ligaes do tipo (1 6). As galactomanoglucanas isoladas apresentaram cadeia principal contendo unidades de -D-Glcp ligadas (1 3) e especialmente substitudas em O-2,6 por cadeias laterais contendo unidades de Galf e Manp. Por outro lado, as galactoglucomananas e a maioria das galactomananas apresentaram uma cadeia principal composta por unidades de -D-Manp contendo ligaes glicosdicas do tipo (1 6), as quais encontram-se principalmente substitudas em O-2, O-4 e/ou O-2,4 por diferentes cadeias laterais. Alm dos polissacardeos clssicos observados em liquens, foi ainda caracterizada uma galactomanana, obtida de L. azureum, altamente substituda em O-2 por terminais no redutores de -D-Manp e/ou -D-Galp. As unidades de -D-Galp substituem as unidades de -D-Manp da cadeia principal em O-4 e no em O-2, como geralmente observado. Alm destes, foram ainda isolados polissacardeos contendo estruturas ainda no descritas em liquens, como galactomananas altamente ramificadas de R. decipiens, apresentando uma cadeia principal composta por unidades de -Manp (1 4) ligadas, parcialmente substitudas em O-2 por cadeias laterais de unidades de -Manp (1 2) e (1 6)ligadas. As duas galactomananas apresentaram contedo varivel de Galf. Uma das estruturas apresentou as unidades de Galf como terminais no-redutores, substituindo as unidades de Manp das cadeias laterais em O-6, enquanto que, a outra estrutura apresentou uma maior proporo de unidades de Galf como 5-O-, 6-O- e 5,6-di-O substitudas. Uma -D-manana linear contendo ligaes do tipo (1 6) e uma pseudonigerana foram caracterizadas de D. glabratum. Os liquens do gnero Leptogium apresentaram polissacardeos com caractersticas no usuais, como a presena das unidades de 3-O-Me-Galp e de altos teores de grupamentos cidos. Os dados obtidos reforam a utilizao dos polissacardeos como marcadores quimiotaxonmicos e sugerem um possvel envolvimento do fotobionte na biossntese de polissacardeos liqunicos, uma vez que estruturas no descritas anteriormente foram encontradas em liquens que apresentam as algas Trentepohlia, Nostoc e Scytonema como fotobiontes.
ABSTRACT
The structures of polysaccharides from 15 species of lichenized fungi (Cladina arbuscula, C. confusa, C. substenius, Dictyonema glabratum, Leptogium azureum, Leptogium sp., Parmotrema austrosinense, P. delicatulum, P. schindlerii, P. mantiqueirense, P. tinctorum, Rimelia cetrata, R. reticulata, Roccella decipiens, and Umbilicaria mammulata) were studied. Except for lichens of the genera Roccella, Leptogium, and Dictyonema that contain the algae Trentepohlia, Nostoc and Scytonema as photobionts, the other genera have algae from the well-studied genera Trebouxia and Asterochloris. Glucans, xylans, mannans, galactomannans, galactoglucomannans, galactomannoglucans, and an acidic heteropolysaccharide were isolated from the thalli of the lichens. Characterized homopolymers were an -D glucan, with alternate (1 3)- and (1 4)-linkages (1:1; nigeran), a -D-glucan with (1 3)- and (1 4)-linkages (1:3.1; lichenan), a (1 3)-linked -glucan (pseudonigeran), a (1 3)-linked -glucan (laminaran), a (1 6)-linked -glucan (pustulan) with possible O-acetyl groups, a linear (1 4)-linked -D-xylan and a (1 6)-linked -D-mannan. The isolated galactomannoglucans contained a main chain of (1 3)-linked -D-Glcp units, substituted at O-2,6 by side chains of Galf and Manp units. In contrast, the galactoglucomannans and most of the galactomannans had a main chain of (1 6)-linked -D-Manp units, mainly substituted at O-2, O-4 and/or O2,4 by various side chains. In addition to well-known lichen polysaccharides, some unusual ones were also characterized, such as a galactomannan from L. azureum, highly substituted at O-2 by non-reducing end units of -D-Manp and/or -D-Galp. D-Galp units substituted the -D-Manp units of the main chain at O-4 and not at O-2, as usually observed. Also found were two highly substituted galactomannans from R. decipiens that have not been previously observed. The main chain of these polymers is composed of (1 4)-linked -Manp units, partially substituted at O-2 by (1 2) and (1 6)-linked -Manp side-chains. These galactomannans had different contents of Galf units. One of them had Galf units as non-reducing ends, which substituted Manp units of the side chains at O-6, while the other contained a higher proportion of Galf units as 5-O-, 6-O- e 5,6-di-O- substituted units. A linear (1 6)-linked -D-mannan and pseudonigeran were also found in D. glabratum. Lichens from the genus Leptogium contained unusual polysaccharides, containing 3-O-methyl-galactopyranose units and high percentage of acidic groups. The data reinforce the use of polysaccharides as a chemotaxonomic tool and suggest an involvement of lichen photobionts in the biosynthesis of polysaccharides since new structures were found in lichens that have the algae Trentepohlia, Nostoc and Scytonema as photobionts.
1 INTRODUO
1.1 LIQUENS 1.1.1 Histrico
O nome lquen (do grego lieken) surgiu por volta do ano 300 a.C. quando Teofrastus, o Pai da Botnica, sentiu necessidade de atribuir um nome s excrescncias encontradas nos troncos das oliveiras, muitas das quais eram o que atualmente se conceitua como lquen (MARCELLI, 1995). Entretanto, apenas em 1868 foi reconhecida a verdadeira natureza dos liquens, quando o bilogo suo Schwendener demonstrou tratar-se, no de um organismo vegetal, mas de uma simbiose complexa de alga e fungo. No entanto, a idia inicial de simbiose fungo-alga, no foi aceita por todos. Botnicos como Bornet, Bonnier e Warning, inclinaram-se a considerar, nos liquens, a existncia de um parasitismo do tipo que Warning denominou helotismo: a alga seria parasitada pelo fungo, que dela retiraria seu alimento. Outros como Beijerink (1890), admitiram parasitismo, considerando a alga como parasita do fungo (XAVIER-FILHO e RIZZINI, 1976). Numerosas teorias foram propostas e as explicaes se sucederam atravs dos tempos. Atualmente, os liquens podem ser compreendidos como o resultado da associao simbitica entre alga e fungo, o que permite a formao de uma estrutura especfica, denominada talo liqunico (GARGAS et al., 1995), morfologicamente diferente da estrutura adquirida pela alga ou fungo quando em vida livre (HALE, 1979). Embora a literatura clssica inclua os liquens na diviso dos criptgamos, admitindo uma relao filogentica com algas pluricelulares, musgos e pteridfitas, h uma grande controvrsia quanto sua classificao, em nveis taxonmicos superiores (MARCELLI, 1995). Alguns liquenlogos discutem a classificao atual dos liquens e preferem referir-se a estes organismos como fungos liquenizados, devido a predominncia do micobionte dentro da associao simbitica (BARINAGA, 1995) e
pela ausncia de evidncias de um ancestral comum entre os fungos formadores de liquens (GARGAS et al., 1995). A sistemtica atual dos fungos liquenizados quanto ordem, famlia, gnero e espcie baseia-se, principalmente, na anlise e descrio de caracteres morfolgicos do talo liqunico e dos apotcios (MARCELLI, 1995; NASH, 1996). Contudo, a pesquisa de algumas substncias qumicas caractersticas dos liquens tambm tem sido utilizada como ferramenta da sistemtica (MARCELLI, 1995), o que tem despertado grande interesse no desenvolvimento de pesquisas nesta rea com o objetivo de isolar, purificar e caracterizar estruturalmente essas substncias presentes neste tipo de organismo (GORIN et al., 1993).
1.1.2 Aspectos Gerais
A simbiose liqunica uma estratgia evolucionria bem sucedida, resultando em uma rica diversidade de espcies fngicas (GRUBE; KROKEN, 2000). A significativa diversidade de espcies ilustra-se basicamente por trs tipos de talos: folioso, fruticoso e crustoso (AHMADJIAN, 1993; NASH, 1996) (Figura 1).
Crtex superior Camada algal
Medula
Crtex inferior Rizina
Substrato
FOLIOSO
Xanthoria polycarpa
Medula
Substrato
CRUSTOSO
Diploicia canescens
Medula
Camada algal Crtex inferior
Usnea subfloridana FRUTICOSO

FIGURA 1 Tipos de talos liqunicos: folioso (ex: Xanthoria polycarpa), crustoso (ex: Diploicia canescens) e fruticoso (ex: Usnea subfloridana) (PRITCHARD; BRADT, 1984).
Os biontes liqunicos associados formam um talo ntegro no qual a alga e/ ou a cianobactria (fotobionte) esto localizadas extracelularmente hifa fngica (micobionte) (SMITH, D.C., 1992). A biomassa liqunica composta, principalmente, por hifas fngicas que, em espcies mais complexas, desenvolvem-se em estruturas com carter anatmico e morfolgico altamente especializadas. A respeito das caractersticas morfolgicas, as clulas fotobiticas so sempre envolvidas por hifas e localizam-se prximo superfcie inferior e acima do crtex fngico. Desta forma, os liquens apresentam uma organizao interna que mimetiza as folhas de plantas superiores, nas quais a absoro de luz pode ser maximizada (HONEGGER, 1993). A constituio do talo liqunico compreende algas microscpicas semelhantes s mesmas espcies de vida livre e filamentos fngicos (hifas), desenvolvendo-se simbioticamente (HALE, 1979; PURVIS, 2000). Um tecido resistente perifrico, denominado crtex, protege as clulas fotobiontes do ressecamento e luz excessiva, enquanto outro mais interno, chamado medula, frouxamente entrelaado, facilitando as trocas gasosas (Figura 2).
Crtex superior
Camada algal
Medula
Crtex inferior
FIGURA 2 - Corte transversal de Canomaculina pilosa (Stiz.) Elix & Hale em eletromicrografia de varredura (cedida pela Profa. Dra. Sionara Eliasaro, Departamento de Botnica- UFPR). Aumento de 1000 x.
A respeito do micobionte, faz-se necessrio salientar a diversidade destes organismos, sendo conhecidos 13.500 espcies de fungos liquenizados, dentre os quais 98% so ascomicetos (GALUN, 1988; HONEGGER, 1993, 1995, 1996; GARGAS et al., 1995). De acordo com HAWKSWORTH e HILL (1984), mesmo que os fungos liquenizados apresentem-se morfolgica e anatomicamente mais complexos que os fungos no liquenizados, no h diferenas fundamentais entre estes organismos e no h indicaes de crescimento diferenciado dentre estas hifas fngicas (HONEGGER, 1993). J em relao aos componentes fotobiontes da simbiose liqunica, dentre os 1600 gneros conhecidos de algas (GALUN, 1988), apenas 40 tem sido reportado como fotobiontes em liquens (TSCHERMACK-WOESS, 1988; BDEL, 1992). A maioria (90%) dos fotobiontes so algas verdes (Chlorophyta), sendo os gneros Trebouxia e Trentepohlia os mais freqentes. Nostoc o gnero mais comum de cianobactrias e capaz de fixar tanto CO2 quanto N2. Dentre a grande diversidade de fungos liquenizados, em aproximadamente 500 espcies de liquens ocorre a presena de dois fotobiontes associados a um nico fungo, sendo uma alga verde o bionte fotossinttico primrio e uma cianobactria o membro fotossintetizante secundrio, fixador de N2 (TSCHERMACK-WOESS, 1988). Este ltimo particularmente complexo e encontra-se nos cefaldios, regies de crescimento do talo liqunico (MARCELLI, 1995; PURVIS, 2000). Nesta simbiose, tem-se ento a contribuio da alga na produo de acares atravs da fotossntese e, no caso das cianofceas, a elaborao de aminocidos a partir de gs carbnico e nitrognio, em associao com a gua. (GOLA et al., 1965). Os liquens so principalmente rupcolas e epfitas, mas algumas espcies desenvolvem-se diretamente sobre o solo. So elementos importantes na desagregao das rochas devido eliminao de certos cidos orgnicos (cidos liqunicos), os quais reagem com elementos minerais da superfcie (JOLY, 1975). Alm disso, algumas espcies que fixam o nitrognio atmosfrico, ou seja, aquelas nas quais o ficobionte uma cianofcea, so comuns e valiosas para vrios ecossistemas (AHMADJIAN, 1993; PURVIS, 2000).
De distribuio cosmopolita, os liquens so especialmente diversificados nas regies tropicais e em reas polares, podendo constituir o nico tipo de vegetao, indicando uma grande adaptao a condies ambientais adversas. A excepcional resistncia a variaes de temperatura uma caracterstica inerente a esses organismos (XAVIER-FILHO; RIZZINI, 1976). Os liquens com fotobiontes verdes podem ser metabolicamente reativados quando so expostos somente ao vapor de gua. Ao contrrio, os cianoliquens precisam de gua para reativar seu metabolismo. Os liquens perdem rapidamente compostos inorgnicos e orgnicos aps serem re-hidratados. Fotobiontes verdes tm meios de proteger seus sistemas fotossintticos de repetidos ressecamentos e luz excessiva (AHMADJIAN, 1993). Muitos liquens vm sendo utilizados como medicamentos, bases fixadoras de perfumes, corantes, fontes de alimento (RAVEN, 1996; PURVIS, 2000), ou ainda, como indicadores de poluio ambiental devida a sua sensibilidade a SO2, NO2 e oznio e habilidade em absorver e acumular metais pesados (HAWKSWORTH, 1984; PURVIS, 2000).
1.2 PRINCIPAIS CONSTITUINTES QUMICOS DOS LIQUENS
Entre os principais constituintes qumicos encontrados nos liquens incluem as substncias liqunicas, os carotenides e carboidratos de baixa e alta massa molar.
1.2.1 Substncias Liqunicas Substncias liqunicas, conhecidas como cidos liqunicos, so produtos do metabolismo secundrio do micobionte (produzidos pela hifa), sendo depositados no crtex e ou medula, em concentrao de 0,1 a 10% em relao ao peso do lquen seco, embora em alguns casos a concentrao possa ser superior (HALE, 1983). Cerca de 630 compostos, provenientes do metabolismo secundrio de liquens, so conhecidos. Dentre estes, esto os cidos alifticos meta e para depsdeos, depsidonas, steres benzlicos, dibenzofuranos, xantonas, antraquinonas, cidos snicos, terpenos e derivados do cido pulvnico. Ainda que alguns destes compostos
sejam produzidos por fungos de vida livre e por plantas superiores, a maior parte considerada exclusiva de liquens (ELIX, 1996). Devido capacidade de reagirem com substncias qumicas especficas, produzindo na maioria das vezes reaes coloridas, e a sua grande especificidade de ocorrncia nos liquens, estas substncias vem sendo utilizadas com propsitos taxonmicos. Elas so estudadas rotineiramente pelos sistematas, atravs de cromatografia de camada delgada, sendo para vrios grupos (por ex. Parmeliaceae e Cladoniaceae) essenciais para a identificao das espcies (HONDA; VILEGAS, 1998). Embora muitas destas substncias liqunicas sejam conhecidas, o seu papel ainda no est bem definido. Porm, parece que estas esto envolvidas no mecanismo de proteo contra o ataque de animais e contra o desenvolvimento de bactrias, fungos e musgos. Alm disso, algumas substncias liqunicas, como os cidos snicos, apresentam tambm atividade antiistamnica, espasmoltica e antiviral (VARTIA, 1973).
1.2.2 Carotenides Os carotenides so pigmentos secundrios ou acessrios que absorvem luz, em comprimentos de onda diferentes da clorofila, que ocorrem regularmente em liquens. A ocorrncia destes compostos nos talos liqunicos pode ser influenciada por fatores ambientais como clima, altitude, latitude e principalmente, a intensidade da luz ambiental (CZECZUGA; XAVIER-FILHO, 1987; CZECUZA; SKULT, 1998). Seu papel em liquens no bem conhecido, porm, parece estar envolvido na proteo do lquen contra luminosidade excessiva e tambm na foto e termo-proteo evitando a dissipao de energia (ADAM et al., 1993).
1.2.3 Carboidratos de Baixa Massa Molar
Relativamente, poucos estudos tm sido realizados a cerca da distribuio destes carboidratos de baixa massa molar em diferentes espcies de liquens (NISHIKAWA et al., 1973). A investigao mais abrangente foi realizada por
LINDBERG e colaboradores (1953) em 60 espcies de liquens. Eles pesquisaram a presena de poliis arabinitol, manitol, e volemitol e de dissacardeos. Nesta classe de carboidratos encontram-se os monossacardeos redutores (pentoses, metilpentoses, hexoses e cetoses), poliis (com molculas contendo entre 3 a 7 tomos de carbono) e os oligossacardeos (GORIN et al., 1993).
1.2.4 Carboidratos de Alta Massa Molar
O primeiro relato descrevendo a presena de polissacardeos em liquens foi realizado por Berzelius, em 1815. Examinando o lquen Cetraria islandica, ele isolou um polissacardeo insolvel em gua, conhecido por liquenina (BERZELIUS1, citado por GORIN et al., 1993). Posteriormente, verificou-se que este era constitudo por unidades de glucose, com rotao ptica especfica de +18, compatvel com a configurao . Atravs de anlises de metilao e oxidao com metaperiodato de sdio, determinou-se que a estrutura era composta por ligaes (1 3) e (1 4) na proporo de 3:7 (MEYER; GRTLER, 1947). Durante o processo de purificao da liquenana (= liquenina) foi observado a presena de uma glucana solvel em gua. Utilizando-se de processos analticos e quantitativos, o polissacardeo foi identificado como sendo uma -D-glucana linear composta por ligaes (1 3), (1 4). Atravs da degradao controlada de Smith foi possvel elucidar a distribuio destas ligaes ao longo da cadeia da glucana, que indicou ser uma estrutura repetitiva preponderante com duas ligaes (1 3) consecutivas interceptadas por uma ligao (1 4) isolada (43%), embora uma seqncia de ligaes (1 3) e (1 4) alternadas estivesse amplamente distribudos (38%) alm de uma menor proporo de ligaes (1 4) adjacentes (6%), sendo denominada isoliquenana (CHANDA et al., 1957).
BERZELIUS, J.J. Versuche ber die Mischung des Islndischen Mosses und Seine Anwendung als Nahrungsmittel. J. Chem. Phys., v. 7, p. 317-353, 1815.
A partir destes estudos com a Cetraria islandica, em que foram isolados os polissacardeos liquenana e isoliquenana, muitos outros trabalhos sucederam com o objetivo de obteno de polissacardeos de diferentes espcies de liquens. Dentre os polissacardeos caracterizados, as glucanas so os homopolmeros comumente encontrados. Na Tabela 1 est ilustrado as estruturas de glucanas atualmente conhecidas. Pode-se verificar que a maioria destas apresenta estruturas lineares com diferentes tipos de ligaes, sendo pertencentes a srie alfa ( ) ou beta
( ). De acordo com o tipo de ligao e a proporo das ligaes as glucanas recebem

denominaes especficas (nigerana, isoliquenana, pustulana, entre outras).
TABELA 1 Tipos de glucanas encontradas em fungos liquenizados
Tipos de glucanas
Denominao Nigerana Isoliquenana
-D-Glucana (1 3), (1 4)
Acroscifana
-D-Glucana (1 -D-Glucana (1 -D-Glucana (1 -D-Glucana (1
4), (1 6) 3) 6) 3), (1 4)
Pululana Laminarana Pustulana Liquenana
Proporo das ligaes 1:1 1.2:1 3:1 3.8:1 4:1 6:1 2:3 2:5 1:1
Caractersticas estruturais Linear; algumas possuem ligaes (1 2) Linear Linear, distribuio irregular de ligaes Apresenta ramificao em O-2 (5%) Linear Possuem ligaes (1 6) Possuem ligaes (1 6) (~ 6%) Apresenta ramificao em O-3 (3%) Linear Linear Podem apresentar grupamentos O-acetil Linear Linear Linear Linear Apresentam cadeia principal formada por unidades de -D-Glcp (1 3), (1 6) ou cadeia principal formada apenas por unidades de -D-Glcp (1 3) ligadas; Contm altos teores de ramificao em O-6 (~ 20%)
-D-Glucana (1 3), (1 6)
1:2 1:3 3:1 3:7
Alm da intensiva pesquisa com as glucanas presentes nos fungos liquenizados, houve tambm um grande interesse em analisar heteropolissacardeos nestes tipos de organismos.
Os primeiros estudos foram realizados em 1906, por ULANDER e TOLLENS2, citado por GORIN et al. (1993), quando detectaram manose, galactose e glucose no lquen Cetraria islandica. Deste estudo, seguido por outros, foi deduzido que o referido lquen apresentava, alm da glucana, um heteropolissacardeo provavelmente constitudo por manose e galactose. Mas, devido utilizao de processos de purificao inadequados e de mtodos analticos rudimentares no foi possvel elucidar a estrutura qumica do referido polissacardeo. Apenas em 1984, com os trabalhos de GORIN, IACOMINI e colaboradores (GORIN; IACOMINI, 1984, 1985; IACOMINI et al., 1985) que as estruturas qumicas de galactomananas isoladas de liquens foram devidamente elucidadas, atravs de procedimentos de purificao mais adequados e principalmente de tcnicas analticas mais modernas, por exemplo, espectroscopia de ressonncia nuclear magntica de carbono treze (RMN-13C) e a cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS). O heteropolmero de Cetraria islandica foi o primeiro heteropolissacardeo estudado por estes autores, que mostrou ser uma galactomanana constituda por uma cadeia principal composta de unidades de -D-manopiranose unidas por ligaes (1 6) e com cadeias laterais de -D-galactopiranose e de -D-galactopiranose ligados (1 2) e (1 4), respectivamente (GORIN; IACOMINI, 1984). Os dados referentes aos heteropolissacardeos presentes na literatura at a presente data so mostrados, de maneira geral, na Tabela 2. Foram observados diferentes tipos de estruturas, sendo as galactomananas e as galactoglucomananas as mais comumente encontradas, que apresentam uma cadeia principal formada por unidades de -Manp-(1 6) substitudas, principalmente, em O-2, O-4 e/ou O-2,4 por
unidades de - ou - Galp ou -Manp ou Glcp e, mais raramente, por -Galf (Figura

3).
ULANDER, A.; TOLLENS, B. Untersuchungen ber die Kohlenhydrate der Flechten. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft, v. 39, p. 401, 1906
-D-Galp
1
-D-Manp
1
- -D-Manp-(1 6)-
4 - -D-Manp-(1 6)-
2 - -D-Manp-(1 6)-
-D-Galp
1
-D-Manp
1

2 - -D-Manp-(1 6)- -D-Manp-(1 6)4
2 - -D-Manp-(1 6)4
1 -D-Galp
1 -D-Galp
FIGURA 3 - Principais estruturas observadas em galactomananas obtidas de liquens
TABELA 2 Tipos de heteropolissacardeos encontrados em fungos liquenizados

Heteropolissacardeos Galactomananas e/ou Galactoglucomananas Composio Monossacardica Man:Gal:Glc com propores variveis, sendo Man e Gal sempre em maior proporo Cadeia principal Principais caractersticas estruturais Apresentam diferentes padres de substituio principalmente em O-2, O-4 e/ou O-2,4 por unidades de ou -Galp ou -Manp ou Glcp, mais raramente por -Galf. Substituda, principalmente, em O-2 por cadeias lateriais de -D-Manp e menor proporo de -D-Glcp no substitudas (10%) ou 4-O(10%) e 2,4-di-O-substitudas (10%) por unidades de -D-Xylp Substitudas,principalmente, em O2 e O-6 sob diferentes modelos por unidades D-Manp e D-Galp substitudas e ainda unidades de DGalf terminal no redutora Apresentam substituio em O-2 e O-6 por cadeias laterais altamente ramificadas Apresenta substituio em O-6 por diferentes tipos de cadeias laterais
-D-Manp (1 6)
Glucomanana
Man:Gal:Glc (93:00:07)

-D-Manp (1 6) -D-Manp (1 3)
Xilomanana
Gal:Rha:Glc:Xyl:Man:Fuc (17:04:08:32:29:10) Glc: Gal: Man com propores variveis
Galactomanoglucanas
-D-Glcp (1 3)
Arabinogalactomanoglucana
Ara:Gal:Man:Glc 12:34:40:14 Gal:Rha:Glc:Xyl:Man 40:31:13:10:06

-D-Glcp (1 3) -D-Galf-(1 3)
Ramnogalactofuranana (Thamnolana)
Recentemente, tem sido descritas estruturas de galactomananas contendo cadeias laterais altamente complexas. Molculas deste tipo foram isoladas de Lasallia pustulata, a qual apresentou uma cadeia principal formada por unidades de -D-Manp(1 6), parcialmente substitudas por Galf e/ou por cadeias laterais de -D-Manp(1 2), de diferentes tamanhos (Figura 4) (PEREYRA et al., 2003).
FIGURA 4 - Esquema da estrutura proposta para o core da galactomanana obtida de Lasallia pustulata aps remoo por hidrlise parcial das unidades de Galf (PEREYRA et al., 2003).
Finalizando esta abordagem geral sobre o estudo de polissacardeos obtidos de liquens, os homo e heteropolmeros j descritos nestes organismos esto listados na Tabela 3. Com a finalidade de visualizar melhor o padro de distribuio dos polissacardeos, a tabela est disposta em ordem alfabtica de famlias, gneros e espcies.
TABELA 3 POLISSACARDEOS OBTIDOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS

Famlia Gnero /espcies
Tipo de Glucanas -D-Glucana
-D-Glucana
Heteropolissacardeos contendo manose (Man:Gal:Glc)
Referncias
Alectoriaceae Alectoria sulcata A sarmentosa Caliaciaceae Acroscyphus sphaerophoroides Cladoniaceae Cladonia alpestris C. amaurocraea C. bellidiflora C. boryi C. clathrata C. confusa C. connexa C. crispata C. crispatula C. furcata C. gracilis C. ibitipocae C. imperialis C. miniata C. mitis C. pacifica C. penicillata C. rangiferina C. salmonea C. signata C. squamosa C. substellata C. uncialis Cladia agregata
Liquenana Liquenana
Isoliquenana Isoliquenana Acroscifana (2:3) (1) 66:24:09 (2) 50:29:20 (2) 46:41:10 (3) / 55:34:10 (4) 33: 63:04 (2) 47: 40:11 (3) / 55:38:05 (4) 38:44:15 (3) / 63:29:07 (4) 55:42:03 (4) 46:41:10 (3) /40:47:10 (4) 48:40:10 (3) / 65:21:12 (4)
TAKEDA et al., 1972. TAKEDA et al., 1972. YOKOTA; SHIBATA; SAIT, 1979.
Nigerana (1:1) Pustulana Laminarana Laminarana Laminarana Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Isoliquenana (3:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1) Nigerana (1:1)
IACOMINI; SCHNEIDER; GORIN, 1985. IACOMINI; SCHNEIDER; GORIN, 1985. CARBONERO et al., 2001; SHIBATA, 1973. CARBONERO et al., 2001. CARBONERO et al., 2001; WORANOVICZ-BARREIRA, 1999a,b. IACOMINI; SCHNEIDER; GORIN, 1985. CARBONERO et al., 2001; WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a,b. NISHIKAWA et al., 1974 CARBONERO et al., 2001; WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a,b. CARBONERO et al., 2001; WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a,b. CARBONERO et al., 2001 CARBONERO et al., 2001; WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a,b,c. CARBONERO et al., 2001; WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a,b. CARBONERO et al., 2001; WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a,b,d. NISHIKAWA et al., 1974 SHIBATA, 1973 CARBONERO et al., 2001; WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a,b. NISHIKAWA et al., 1974 CARBONERO et al., 2001; WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a,b,d. CARBONERO et al., 2001; WORANOVICZ-BARREIRA, 1999a NISHIKAWA et al., 1974 CARBONERO et al., 2001; WORANOVICZ-BARREIRA, 1999b,c. CARBONERO et al., 2001 WORANOVICZ, 1995.
Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana
Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana
39: 43:16 (3)/ 60:38:02 (4) 43:47:10 (3) / 62:28:10 (4) 48:37:13 (3)/ 57:39:04 (4) 40:49:10 (3) / 59:27:12 (4) 50:42:04 (2)
TABELA 3 POLISSACARDEOS OBTIDOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS (continuao)

-D-Glucana
Heteropolissacardeos contendo manose (Man:Gal:Glc) 82:18:00 (2)
Referncias
Collemataceae Collema leptosporum Dictyonemataceae Cora pavonia (6) (=Dictyonema glabratum) Lobariaceae Pilophoron ocicularis Pseudocyphellaria aurata P. clathrata (8) Sticta sp. Parmeliaceae Cetraria cucullata Cetraria islandica (9)
(1 3) (1 6) (5) (1 3) (1 6) (7) Isoliquenana (2:1)
PRADO et al., 1999. IACOMINI et al., 1987.
61:30:19 (4) 70:23:7 (4) 63:21:16 Liquenana (1:2) Liquenana (3:7) Isoliquenana (2:1) Isoliquenana (3:2) e (2:1) Isoliquenana Isoliquenana (3:2) Isoliquenana (4:1) e (3:2) Isoliquenana (6:1)(10) Nigerana (1:1) (11) Isoliquenana (3:2) Nigerana (1:1) Nigerana (1,2: 1) Isoliquenana (3:2) Isoliquenana Nigerana (1:1) Isoliquenana Isoliquenana Isoliquenana Nigerana (1:1) 55:35:10 43:44:17
(2)
YOKOTA; SHIBATA; SAIT, 1979. TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1992. CORDEIRO et al., 2004. CORRADI da SILVA et al., 1993. GORSHKOVA et al., 1997. MEYER; GRTLER, 1947a,b; FLEMING; MANNERS, 1966; GORIN; IACOMINI, 1984; INGOLFSDOTTIR et al., 1994; OLAFSDOTTIR et al., 1999. MITTAL; NEELAKANTAN; SESHADRI, 1952. YOKOTA; SHIBATA; SAIT, 1979 TAKEDA et al., 1972; TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1992; HRANISAVLJEVIC-JAKOVLJEVIC et al., 1975
C. nivaris C. richardsonii Evernia prunastri
Liquenana Liquenana (3:7) Liquenana (3:1)
49:42:09 (2)
Flavoparmelia caperata (=Parmelia caperata) Letharia vulpina Liquenana (1:3) Newropogon aurantiaco- Liquenana (2:1) ater P. cetrarioides P. conspersa P. hypotrypella P. laevior Liquenana Liquenana
41:28:31 (2) 45:55 (2)
NISHIKAWA et al., 1974; TAKEDA; NISHIKAWA; SHIBATA, 1970; SMRIGA et al., 1996. IACOMINI et al., 1988; GORIN; IACOMINI, 1985. BARON et al., 1991. SHIBATA, 1973. SHIBATA, 1973. SHIBATA, 1973. SHIBATA, 1973.
TABELA 3 POLISSACARDEOS OBTIDOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS (continuao)

-D-Glucana
Referencias SHIBATA, 1973. OLAFSDOTTIR; INGLFSDOTTIR, 2001.
P. nikkoensis P. saxatilis P. tinctorum Parmotrema cetratum (=Rimelia cetrata) P. araucaria P. sulcata Usnea barbata U. baylei U. fasciata U. longissima U. meridionalis U. rubescens Usnea sp. Peltigeraceae Peltigera aphthosa Pysciaceae Tornabenia intricata Ramalinaceae Ramalina celastri (= R. ecklonii) R. dendriscoides R. fraxinea R. gracilis R. peruviana R. usnea Roccellaceae Roccella montagnei
Liquenana
Liquenana Liquenana (1:1,19)
Isoliquenana Isoliquenana (2:1) Nigerana (1,3:1) Isoliquenana 47:44:09 (4) 50:44:06 (2)/ 49:44:07 (2) 49:40:10 (2)
SHIBATA, 1973. CORRADI da SILVA ; GORIN; IACOMINI, 1993. TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1992. GORIN; IACOMINI, 1985. MITTAL; NEELAKANTAN; SESHADRI, 1952. SHIBATA, 1973; NISHIKAWA et al., 1969. PEREIRA et al., 1994. MITTAL; SESHADRI, 1954. TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1992. NISHIKAWA et al., 1974. GORIN; IACOMINI, 1985; IACOMINI et al., 1988. GORIN; IACOMINI, 1985. TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1992. STUELP et al., 1999; MICENO; GORIN; IACOMINI, 1991. CORDEIRO et al., 2003a. CORDEIRO et al., 2003a. CORDEIRO et al., 2003a. CORDEIRO et al., 2003a. GORIN; IACOMINI, 1984. MITTAL; SESHADRI, 1954.
Liquenana Liquenana Liquenana Liquenana (3:7) Liquenana (1:3)
Isoliquenana Isoliquenana Isoliquenana Isoliquenana 35:42:23 / 52:35:13 43:42:14 (2) 58:39:02 (2) 93:00:09 (12)
Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Liquenana
Isoliquenana (3:1) Nigerana (1:1) Isoliquenana (3:1) Nigerana (1:1) Isoliquenana (3:1) Nigerana (1:1) Isoliquenana (3:1) Nigerana (1:1) Isoliquenana (3:1) Nigerana (1:1) Isoliquenana (3,8:1)(11) Isoliquenana
46:54:00 (2) 57:33:10 (2) 55:39:06 (2) 53:37:10 (2) 51:44:05 (2) 43:53:3 (2)
TABELA 3 POLISSACARDEOS OBTIDOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS (concluso)

-D-Glucana
Referncias
Stereocaulaceae Stereocaulon exutum S. japonicum S. paschale S. ramulosum S. sorediiferum Sphaerophraceae Sphaerophorus globosus Teloschistaceae Teloschistes flavicans Umbilicariaceae Actinogyra muehlenbergii Gyrophora esculenta Lasallia papulosa Lasallia pustulata L. pensylvanica Umbilicaria angulata U. caroliniana U. hirsuta U. polyphylla U. pustulata U. spodochroa Lquen imperfeito Thamnolia vermicularis (15)
Laminarana
Isoliquenana (3:1) Isoliquenana (2:7)(11) (2:1) (3:1) Acroscifana (2:5) Isoliquena (1,6:1) Isoliquenana (3:1) Acroscifana (2:3)
(1)
63:31:05 (2) 60:40:00 (2)
TAKAHASHI et al., 1981. YOKOTA; SHIBATA; SAIT, 1979; TAKAHASHI et al., 1981; YOKOTA; SHIBATA, 1978. HAUAN; KJLBERG, 1971; GORIN; IACOMINI, 1985. BARON; GORIN; IACOMINI, 1988. TAKAHASHI et al., 1981. YOKOTA; SHIBATA; SAIT, 1979. REIS et al., 2002.
(1 4) (1 6) (1:1) Pustulana (14) Pustulana (14) Pustulana (14) Pustulana (14) Laminarana Pustulana (14) Pustulana (14) Pustulana (14) Pustulana Pustulana (14) Pustulana (1 3) (1 6) (16)
(1 3) (1 6) (13) 62:30:08 (2) 52:18:06 (2)
GORIN; IACOMINI, 1985; IACOMINI et al., 1988. SHIBATA et al., 1968. SHIBATA et al., 1968. PEREYRA et al., 2003. NISHIKAWA et al., 1974. NISHIKAWA et al., 1970. NISHIKAWA et al., 1970. SHIBATA et al., 1968; LINDBERG; McPHERSON, 1954. NISHIKAWA et al., 1970. LINDBERG; McPHERSON, 1954; KJLBERG; KVERNHEIM, 1989. KJLBERG; KVERNHEIM, 1989. OLAFSDOTTIR et al., 2003.
40:20:30 32:19:32
(1) Contm 6% de ligaes (1 6); (2) Galactomanana [Cadeia principal formada por unidades de -D-Manp (1 6)]; (3) Galactomanoglucana [Cadeia principal formada por unidades de -D-Glcp (1 3)]; (4) Galactoglucomanana [Cadeia principal formada por unidades de -D-Manp (1 6)]; (5) Apresenta ramificaes em O-6 (23%); (6) Contm um hetopolissacardeo no-usual (xilomanana); (7) Apresenta ramificaes em O-6 (21%); (8) Contm uma arabinogalactoglucomanana (Ara:Gal:Man:Glc) 12:34:40:14;
(9) Apresentou uma galactomanana contendo 4% de ramnose (57:39:04) (Man:Gal:Glc); (10) Contm ligaes (1 6); (11) Contm ligaes (1 2); (12) Glucomanana [Cadeia principal formada por unidades de -D-Manp (1 6)]; (13) Apresenta ramificaes em O-6 (15%); (14) Parcialmente O-acetilada; (15) Possui uma ramnogalactofuranana denominada thamnolana; (16) Glucana com cadeia principal de unidades de -D-Glcp (1 3), substitudas em O-6.

1.3
IMPORTNCIA LIQUNICOS
QUIMIOTAXONMICA
DOS
POLISSACARDEOS
A identificao e classificao dos fungos liquenizados foi originalmente realizada com base na morfologia. Desde 1860, a diferenciao das espcies foi auxiliada por reaes coloridas especficas, apresentadas pelas substncias liqunicas (AGHORAMURTH; SARMA; SESHADRI, 1961; PURVIS, 2000), ou, ainda por carotenides (CZEZUGA; SKULT, 1988; CZEZUGA; XAVIER-FILHO, 1987). Com relao a quimiotaxnomia, a identificao de liquens em gneros e espcies vem sendo conduzida por reaes de colorao no talo, microcristalizao, anlise cromatogrfica, anlise por fluorescncia e espectrometria de massa de metablitos secundrios (HONDA; VILEGAS, 1998). Recentemente, os avanos das tcnicas de biologia molecular em conjunto com a caracterizao estrutural fina de macromolculas, so uma importante ferramenta na classificao taxonmica de liquens, pois, na maioria das vezes, dados relativos apenas anlise morfolgica no elucidam a identificao de um dado espcime (HONDA; VILEGAS, 1998). Em termos de macromolculas, o estudo de polissacardeos como uma anlise auxiliar na taxonomia decorrente da diversidade estrutural tanto das glucanas quanto das galactomananas obtidas dos diferentes liquens. As estruturas destes polmeros, evidenciadas por anlises qumicas e espectroscpicas de RMN, mostram-se tpicas e podem, portanto, serem utilizadas em estudos quimiotaxonmicos (GORIN; BARON; IACOMINI, 1988; GORIN et al., 1993; TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1995; WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a,b,c). Dados obtidos at a presente data (Tabela 3) sugerem que os polissacardeos obtidos dos diferentes liquens apresentam um padro de distribuio. Como pode ser observado, a pustulana caracterstica para a famlia Umbilicariaceae, liquenana encontrado em Parmeliaceae, nigerana e laminarana so as glucanas presentes em Cladoniaceae, enquanto que nigerana, laminarana e isoliquenana so caractersticas em Ramalinaceae. Isto sugere que as glucanas desempenham um importante papel como marcadores taxonmicos para gnero e famlia. Assim como para as glucanas, os
heteropolissacardeos tambm vm sendo utilizados na classificao. Devido a complexidade estrutural, estes polmeros podem, em alguns casos, diferenciar entre gneros e at mesmo entre espcies. Dentre as 13.500 espcies de fungos liquenizados, no mais que 100 foram estudadas quanto aos polissacardeos e entre estes a maioria apresenta como fotobionte a alga verde do gnero Trebouxia. Devido a poucos estudos realizados na rea de qumica de carboidratos e a importncia destes como marcadores quimiotaxonmicos, o presente estudo procura ampliar os conhecimentos para a classificao de fungos liquenizados.
1.4 CARACTERISTICAS GERAIS DOS LIQUENS ESTUDADOS
Na presente pesquisa, foram estudadas 15 espcies de fungos liquenizados quanto aos seus componentes polissacardicos. Estes pertencem ao gnero Cladina, Dictyonema, Leptogium, Parmotrema, Rimelia, Roccella e Umbilicaria (Figuras 5A e 5B).
Cladina arbuscula
Cladina confusa
Cladina substenius
Dictyonema glabratum
Leptogium azureum
Leptogium sp.
Parmotrema austrosinense
Parmotrema delicatulum
FIGURA 5 A - Fragmentos dos liquens dos gneros Cladina (C. arbuscula, C. confusa, C. substenius), Dictyonema (D. glabratum), Leptogium (L. azureum, Leptogium sp.), Parmotrema (P. austrosinense e P. delicatulum).
Parmotrema mantiqueirense
Parmotrema schindlerii
Parmotrema tinctorum
Rimelia cetrata
Rimelia reticulata
Roccella decipiens
Umbilicaria mammulata
FIGURA 5 B - Fragmentos dos liquens dos gneros Parmotrema (P. mantiqueirense, P. schindlerii e P. tinctorum), Rimelia (R. cetrata e R. reticulata), Roccella (R. decipiens) e Umbilicaria (U. mammulata).
1.4.1 Cladina spp (Famlia Cladoniaceae)
Cladina um gnero da classe Ascomycetes, ordem Lecanorales, famlia Cladoniaceae que tem despertado muita dvida no meio cientfico quanto a sua classificao. Na Amrica, sia, Austrlia e Rssia. Cladina reconhecida, como um gnero a parte, muito embora, na maior parte da Europa, diversos autores a reconhecem apenas como um subgnero do gnero Cladonia (STENROOS; AHTI, 1996). Atualmente, o mesmo foi novamente considerado como Cladonia (AHTI; DEPRIEST, 2001). O fotobionte presente neste gnero de lquen a alga verde Asterochloris sp. e a morfologia apresentada do tipo fruticoso.
1.4.2 Dictyonema glabratum (Famlia Dictyonemataceae)
O lquen folioso Dictyonema glabratum (famlia Dictyonemataceae) conhecido comumente no Brasil como asa de papagaio (IACOMINI et al., 1987), e um dos poucos liquens onde o micobionte um basidiomiceto e no um ascomiceto. O fotobionte presente neste lquen a cianobactria Scytonema sp. Anteriormente, outras denominaes tais como, Dictyonema pavonium (Swartz) Parm; e Cora pavonia (Swartz) Fr. eram atribudas a este organismo (HAWKSWORTH, 1988). Ocorre principalmente sobre o solo e, eventualmente, sobre rochas e crtex de rvores onde se encontram distribudos, principalmente, nas regies tropicais.
1.4.3 Leptogium spp. (Famlia Collemataceae)
O gnero Leptogium (Ach.) Gray, pertencente a famlia Collemataceae, um gnero cosmopolita de 250 espcies. Este associa-se simbioticamente a cianobactrias do gnero Nostoc, formando os liquens gelatinosos. Ao contrrio da maioria dos
liquens, onde o fungo determina a morfologia, a caracterstica gelatinosa do talo liqunico conferida pela alga. Espcies pertencentes ao gnero Leptogium ocorrem sobre rvores e rochas, em ambientes normalmente mais midos que os liquens no-gelatinosos.
1.4.4 Parmotrema spp. e Rimelia spp. (Famlia Parmeliaceae)
Os liquens dos gneros Parmotrema e Rimelia pertencem a famlia Parmeliaceae. Esta famlia compreende mais de 2000 espcies (80 gneros), sendo principalmente do tipo folioso e fruticoso. Estes gneros so um exemplo de dados taxonmicos conflitantes, pois o gnero Rimelia foi segregado do gnero Parmotrema (HALE; FLETCHER, 1997) com base em reaes coloridas atribudas s diferenas estruturais de polissacardeos dentre diferentes grupos de liquens. CRESPO e CUBERO (1998) e LOUWHOFF e CRISP (2000) propuseram a reavaliao desta segregao, fazendo-se uso de anlises de DNA. Os gneros Parmotrema e Rimelia apresentam a alga Trebouxia como fotobionte e morfologia do tipo folioso.
1.4.5 Roccella decipiens (Famlia Roccellaceae)
Roccella decipiens Darb. (famlia Roccellaceae) apresenta uma morfologia do tipo fruticoso e associa-se simbioticamente a algas verdes do gnero Trentepohlia, uma alga verde filamentosa. Dentro do talo liqunico, este fotobionte sofre interessantes alteraes estruturais, formando apenas filamentos curtos e delgados ou consistindo de estgios unicelulares (FRIEDL; BDEL, 1996).
1.4.6 Umbilicaria mamullata (Famlia Umbilicariaceae)
Umbilicaria Umbilicariaceae)
mammulata uma
(Ach.)
Tuck. do
Gier tipo
Kendrick folioso e
(famlia associa-se
apresenta
morfologia
simbioticamente a algas verdes do gnero Trebouxia. Estes crescem sobre rochas e so conhecidos como rock tripe.
3 MATERIAL E MTODOS 3.1 FUNGOS LIQUENIZADOS
3.1.1 Cladina spp.
Cladina arbuscula (Wallr.) Hale & W. L. Culb. (36 g) foi coletada na Finlndia, Provncia de Uusimaa. Cladina confusa (Sant.) Follm. & Ahti (37 g), foi coletada na Ilha do Mel, Paran, Brasil, e Cladina substenius (Abbayes) Hale & W. L. Culb. (80 g) em Massachusetts, USA. As trs amostras foram coletadas em 1998. A coleta e a identificao de C. substenius e C. arbuscula foram realizadas pelo Prof. Dr. Teuvo Ahti (Departamento de Botnica da Universidade de Helsinki, Helsinki, Finlndia). C. confusa foi coletada pela Profa. Dra. Sandra Mara WoranoviczBarreira (Departamento de Farmcia da Universidade Federal do Paran - UFPR) e identificada pela Profa. Dra. Sionara Eliasaro (Departamento de Botnica UFPR). As exsicatas das trs espcies estudadas encontram-se depositadas no herbrio UPCB (Herbrio do Departamento de Botnica da UFPR) sob os nmeros 45901, 35700 e 45900, respectivamente (O nome do herbrio segue aquele determinado por HOLMGREN et al., 1990).
3.1.2 Dictyonema glabratum Dictyonema glabratum (Sprengel) D. Hawksw. (43 g) foi coletado pela Profa. Dra. Selene Elfio Espsito (Pontifcia Universidade Catlica do Paran - PUC-PR) na Estrada da Graciosa, PR, 1 Km aps o posto da Polcia Florestal, na direo de Morretes, numa altitude de 900 m. A coleta foi realizada em 2000 e a identificao foi feita Profa. Dra. Sionara Eliasaro. A exsicata encontra-se depositada no herbrio UPCB sob o nmero 49402.
3.1.3 Leptogium spp.
Foram coletadas 2 espcimes (Leptogium azureum (Sw.) Mont., 100 g; Leptogium sp. 30 g) de liquens deste gnero nas proximidades do Rio Nhundiaquara, localizado na Estrada da Graciosa, PR, em 2001. A identificao de uma das amostras (Leptogium azureum) foi feita Profa. Dra. Sionara Eliasaro, enquanto que a identificao quanto espcie da outra amostra est sendo realizada. As exsicatas dos lquens Leptogium azureum e Leptogium sp. encontram-se depositadas no herbrio UPCB sob n 49400 e 49403, respectivamente.
3.1.4 Parmotrema spp.
Parmotrema austrosinense (Zahlbr.) Hale (41 g), P. delicatulum (Vain.) Hale (32 g), P. schindlerii Hale (35 g), P. mantiqueirense Hale (43 g) e P. tinctorum (Nyl.) Hale (60 g) foram coletadas em 1996, no municpio da Lapa, Paran, Brasil. Sendo a coleta e identificao realizada pela Profa. Dra. Sionara Eliasaro. As exsicatas de todas as espcies encontram-se depositadas no herbrio UPCB sob os nmeros 33886, 33354, 33890, 33355, 28838, respectivamente.
3.1.5 Rimelia spp.
Rimelia cetrata (Ach.) Hale & Fletcher (31 g) e R. reticulata (Taylor) Hale & Fletcher (26 g) foram coletadas em Curitiba, PR, pela Profa. Dra. Sionara Eliasaro. As exsicatas encontram-se depositadas no herbrio UPCB sob os nmeros 38057 e 38118, respectivamente.
3.1.6 Roccella decipiens
Roccella decipiens Darb. (13 g) foi coletada na Pennsula Baja Califrnia (Cabo de San Lucas), Mxico, pela Profa. Dra. Elfriede Stocker-Wrgtter (Institute of Plant Physiology, University of Salzburg, Salzburg, Austria), em 2002. A exsicata foi depositada na sua coleo privada sob n 526 e uma duplicata (n 49052) no herbrio UPCB.
3.1.7 Umbilicaria mammulata
O fungo liquenizado Umbilicaria mammulata (Ach.) Tuck. Gier Kendrick (107 g) foi coletado em Wisconsin, USA, pelo Prof. Dr. Teuvo Ahti em 2002. A exsicata foi depositada no Herbrio do Departamento de Botnica, Universidade de Wisconsin, Madison, USA, sob n 61176; e uma duplicata no herbrio UPCB sob n 49053.
3.2 PROCEDIMENTOS GERAIS DE EXTRAO
Os liquens foram limpos manualmente com a finalidade de retirar os contaminantes presentes. Em seguida, os materiais foram submetidos aos processos seqnciais de extrao e purificao, conforme os itens descritos de forma geral a seguir. Os diferentes tipos de extrao realizados para cada gnero sero discutidos detalhadamente na seo resultados e discusses.
3.2.1 Extrao Clorofrmio-Metanol Os liquens limpos e secos foram deslipidificados com uma mistura de solvente clorofrmio-metanol (CHCl3: MeOH, 2:1, v/v), sob refluxo, durante 2 ou 3 horas na temperatura de ~60 C. Aps este procedimento, os extratos clorofrmio-metanlicos foram obtidos por filtrao a quente e evaporados em rotaevaporador at secura.
Os resduos liqunicos foram secos e ento submetidos ao prximo processo de extrao. 3.2.2 Extrao Metanol-gua
Os resduos liqunicos da extrao anterior foram submetidos extrao com uma mistura de solventes MeOH:H2O (4:1, v/v), sob refluxo, durante 2 ou 3 horas, na temperatura de ~80 C. Decorrido o tempo, os extratos foram obtidos por filtrao e evaporados at secura em rotaevaporador. Os materiais residuais foram ento submetidos aos processos extrativos descritos a seguir.
3.2.3 Extrao Aquosa
Os materiais remanescentes do processo anterior foram submetidos extraes aquosas a 25 C ou sob refluxo em banho com H2O fervente, durante 3 horas. Os materiais foram filtrados com a soluo ainda a quente. Os extratos obtidos foram concentrados em rotaevaporador e precipitados com etanol (3:1, v/v). Os precipitados etanlicos obtidos foram dialisados, em gua corrente, por 48 horas. Decorrido o tempo, as misturas polissacardicas em soluo foram congeladas e liofilizadas. Os liquens residuais foram submetidos ao prximo processo extrativo.
3.2.4 Extrao Alcalina
Os liquens residuais da extrao anterior foram tratados com soluo aquosa de hidrxido de potssio (KOH 1%, 2% e/ou 10%), sob refluxo em banho com H2O fervente, na presena de boroidreto de sdio (NaBH4) para evitar degradao das cadeias polissacardicas. Aps o tempo determinado (2, 3 ou 6 horas), os extratos obtidos foram filtrados por algodo ainda a quente. Este processo foi repetido sob as
mesmas condies, aps o que os extratos foram reunidos, dialisados e concentrados em rotaevaporador.
3.2.5 Extrao com Dimetilsulfxido
Uma alquota (7 g) do lquen Umbilicaria mammulata foi triturado e submetido extrao diretamente com Me2SO (300 ml) por 48 h a 25 C. Decorrido o tempo, o resduo liqunico foi separado por filtrao e ao filtrado foi adicionado EtOH em excesso (3:1, v/v). O precipitado obtido foi dialisado e liofilizado.
3.3 FRACIONAMENTO DOS POLISSACARDEOS
3.3.1 Separao dos Polissacardeos por Congelamento e Degelo
As fraes obtidas atravs das extraes aquosas e alcalinas foram submetidas, separadamente, ao processo de purificao por congelamento e degelo. Cada mistura polissacardica foi solubilizada em gua destilada e, a seguir, submetida ao processo de congelamento e posterior degelo na temperatura ambiente. O precipitado insolvel em gua fria foi separado dos demais componentes solveis por centrifugao (9000 rpm, 15 min, 25 C). Esse processo de purificao foi repetido diversas vezes at que o sobrenadante aquoso no apresentasse mais precipitado por congelamento e degelo.
3.3.2 Purificao dos Polissacardeos com Soluo de Fehling
Os sobrenadantes ou precipitados do processo de congelamento e descongelamento foram submetidos purificao com soluo de Fehling (JONES; STOODLEY, 1965). Esta soluo consiste de duas solues (A e B). A soluo A composta por tartarato de potssio e sdio e KOH (173 g + 125 g / H20 q.s.p. 500 ml, respectivamente), enquanto que a B consiste de sulfato de cobre 5.H20 (55,7 g / H20 q.s.p. 500 ml).
frao sobrenadante, que foi dissolvida em volume de gua suficiente para solubiliz-la, adicionou-se igual volume da soluo de Fehling (A+B). Aps vigorosa agitao manual, o material foi mantido sob refrigerao por 12 horas. Decorrido o tempo, o precipitado formado foi separado por centrifugao (9000 rpm, 15 min, 25 C). As fraes obtidas (precipitado e sobrenadante) foram neutralizadas com cido actico (HOAc) e dialisadas contra gua corrente (~ 48 horas) e ento deionizadas por resinas Dowex na forma catinica. Aps, os materiais foram concentrados sob presso reduzida e liofilizados. A frao insolvel em gua (precipitado do processo de congelamento e descongelamento) foi solubilizada na soluo A. Aps solubilizao foi adicionado igual volume da soluo B. O processo de separao e descomplexao foi idntico ao realizado para a frao sobrenadante, o qual foi descrito anteriormente.
3.3.3
Purificao dos Polissacardeos por Ultrafiltrao ou por Dilise em Membranas
As fraes, que se mostraram heterogneas aps precipitao por soluo de Fehling, foram submetidas ultrafiltrao em membranas de celulose regenerada ou polietersulfona com limite de excluso de 10 kDa e/ou 300 kDa (Millipore). As ultrafiltraes foram realizadas por um sistema de filtrao adequado (modelo 16249, Sartorius) acoplado a um cilindro de ar comprimido. A purificao destes polissacardeos tambm foi realizada por dilise fechada, contra gua destilada, atravs de membrana com limite de excluso de 16 kDa. O material a ser dialisado era mantido sob agitao magntica, sendo o processo interrompido quando a gua de dilise apresentasse reao negativa para carboidratos por meio do mtodo de fenol-cido sulfrico (DUBOIS et al., 1956).
3.4 ANLISE ESTRUTURAL DOS POLISSACARDEOS
3.4.1 Composio Monossacardica
3.4.1.1 Hidrlise cida total
Alquotas de polissacardeos (~ 1 mg) foram tratadas com 1,0 ml de TFA (cido trifluoroactico) 2 M, durante 8 horas a 100 C ou TFA 1 M a 100 C, overnight (12-15 h). Aps este tempo, o cido foi eliminado das amostras hidrolisadas por evaporao secura. Parte dos produtos hidrolisados foi solubilizada em gua e analisada por cromatografia de partio em papel e o restante foi levado a derivatizao (reduo e acetilao), conforme o item 3.4.1.2.
3.4.1.2 Reduo e acetilao dos produtos de hidrlise
Os produtos de hidrlise foram reduzidos com NaBH4 (boroidreto de sdio) ou NaB2H4 (boroidreto de sdio deuterado) (WOLFROM; THOMPSON, 1963a) em temperatura ambiente, pH 9-10, por 15 horas. Aps este perodo, as solues reduzidas foram tratadas com resina catinica (pH 7,0) (procedimento A) ou neutralizadas com HOAc (procedimento B). A soluo foi filtrada e levada secura sob presso reduzida. O cido brico formado foi eliminado por co-evaporao com metanol, na forma de borato de trimetila. Os alditis formados foram ento acetilados com uma mistura de anidrido actico (Ac2O)/piridina [1:1 (v/v)] overnight (WOLFROM; THOMPSON, 1963b), a temperatura ambiente (procedimento A) ou Ac2O/ NaOAc (acetato de sdio) a 120 C por 1 h (procedimento B) (WHITON et al., 1985). O processo foi interrompido por adio de gelo e o material acetilado extrado com clorofrmio. A piridina residual presente na frao clorofrmica foi removida por sucessivas lavagens deste extrato com uma soluo de sulfato de cobre 5%. Aps remoo total da piridina, a frao clorofrmica foi desidratada com sulfato de sdio anidro e filtrada por algodo
(procedimento A). Para o procedimento B, a mistura reacional foi removida por sucessivas lavagens com gua destilada. Aps secura, os acetatos de alditis obtidos foram analisados por cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massa (GCMS).
3.4.2 Teste de Homogeneidade e Determinao da Massa Molar 3.4.2.1 Cromatografia em gel permeao
Amostras de polissacardeos (2 mg) foram dissolvidas em NaOH 1M, e aplicadas em coluna de Sepharose CL-6B (32 cm x 1.0 i.d.). O eluente utilizado foi NaOH 0,1 M e o volume das fraes coletadas igual a 1 ml. As fraes coletadas foram monitoradas por meio do mtodo de fenol-cido sulfrico (DUBOIS et al., 1956). A calibrao da coluna foi efetuada com a eluio de dextranas padro (Sigma) de diferentes massas molares (40,2 x 103; 77,8 x 103; 2,66 x 105 e 4,78 x 105).
3.4.2.2 Cromatografia de excluso estrica acoplada deteco por ndice de refrao e espalhamento de luz (HPSEC-MALLS) As amostras foram solubilizadas em nitrito de sdio 0,1 mol.l-1 contendo azida de sdio (NaN3) 0,2 g.l-1 ou gua MilliQ para uma concentrao final de 2 mg.ml-1, sendo filtradas atravs de membrana de acetato de celulose com tamanho de poro equivalente a 0,22 m. Em seguida foram aplicadas em cromatgrafo de excluso estrica de alta presso (HPSEC) WATERS equipado com detector de ndice de refrao diferencial, modelo WATERS 2410, e com detector de espalhamento de luz em multingulos WYATT TECHNOLOGY, modelo DAWN DSP-F. Foram utilizadas, em srie, 4 colunas de gel permeao WATERS com limites de excluso de 1 x 106, 4 x 105, 8 x 104, 5 x 103. O eluente utilizado foi uma soluo de nitrito de sdio (NaNO2) 0,1 mol.l-1 contendo azida de sdio (NaN3) 0,2 g.l-1, com fluxo de 0,6 ml.min-1, monitorado atravs de bomba peristltica WATERS 515.
A taxa de variao do ndice de refrao com a concentrao (dn/dc) foi determinada para as amostras purificadas, sendo que para cada amostra foram utilizadas 5 concentraes. Para isto, foi preparada uma soluo na concentrao de 1 mg.ml-1 em NaNO2 0,1 mol.l-1 contendo NaN3 0,2 g.l-1, filtrada em membrana de tamanho de poro equivalente a 0,45 m, sendo ento diluda nas concentraes de 0,2, 0,4, 0,6 e 0,8 mg.ml-1.
3.4.3 Metilao
Uma alquota de cada polissacardeo (2-5 mg) foi metilada segundo CIUCANU e KEREK (1984). Nesta tcnica, a amostra a ser analisada foi dissolvida (1%, p/v) em dimetilsulfxido (Me2SO). Aps a solubilizao, foi adicionado hidrxido de sdio (NaOH) seco e triturado (4:1 de carboidrato). A soluo foi mantida sob agitao e, ento, foi adicionado iodeto de metila (CH3I) na proporo CH3I/NaOH/carboidrato recomendada (1:200:50). Aps 24 horas, a amostra foi neutralisada com HOAc, dialisada, exaustivamente, contra gua corrente, liofilizada e o processo foi repetido novamente. Terminada a metilao por este mtodo, fez-se a extrao dos produtos per-O-metilados com CHCl3, que aps secura, foi submetido metanlise (seo 3.4.3.1) ou diretamente hidrlise (seo 3.4.3.2).
3.4.3.1 Metanlise
Os produtos metilados foram metanolisados com cido clordrico (HCl) gasoso ~3% em metanol (1 ml) a 70-80 C por 2 horas. Decorrido o tempo, a soluo foi neutralizada com carbonato de prata (Ag2CO3), filtrada e evaporada. O material metanolisado obtido foi hidrolisado conforme descrito a seguir.
3.4.3.2 Hidrlise para formar os produtos parcialmente O-metilados
A hidrlise cida total dos polissacardeos metilados e metanolisados foi feita com cido sulfrico (H2SO4) 0,5 M (1 ml), por 14 horas a 100 C, e posteriormente, neutralizada com carbonato de brio (BaCO3). Os polissacardeos parcialmente metilados, que no foram submetidos metanlise, foram hidrolisados com H2SO4 50% (v/v; 0,5 ml) por 1 hora a 0 C, seguido por diluio at 5,5% (v/v; adio de 4,0 ml de gua destilada) o qual foi mantido a 100 C por 14-18 horas, seguido por neutralizao com BaCO3 (SAEMAN et al., 1954).
3.4.4 Dosagem de cidos Urnicos
O mtodo colorimtrico do sulfamato/m-hidroxibifenila (sensibilidade de 38,8
g de cido urnico em 0,4 ml de amostra) foi utilizado para as determinaes do

contedo de cido urnico das amostras, conforme descrito por FILISETTI-COZZI e CARPITA (1991). Para tanto, a 0,4 ml de amostra adicionaram-se 40 l de uma soluo de cido sulfmico-sulfamato de potssio (4 mol/l, pH 1,6) e 2,4 ml de soluo de tetraborato de sdio 75 mmol.l-1 em H2SO4 concentrado. Aps aquecimento sob refluxo em banho com H O fervente, por 20 min, foram adicionados 80 l de m2
hidroxibifenila. O cromgeno obtido, cuja colorao estvel por 1 h, foi avaliado em 525 nm. A quantificao foi realizada com o auxlio de uma curva padro de cido glucurnico (Sigma) dentro da sensibilidade do mtodo.
3.4.5 Carboxi-reduo do Heteropolissacardeo cido Isolado do Lquen Leptogium sp.
O processo de carboxi-reduo foi realizado segundo TAYLOR e CONRAD (1972). O polissacardeo (200 mg) foi dissolvido em 10 ml de tampo MES [cido 2(N-morfolina)-etanosulfnico] (0,2 M, pH 4,75) e a este se adicionou, pouco a pouco e
sob agitao, 1,152 g de carbodiimida [ciclo-hexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida]. A mistura de reao ficou sob agitao por duas horas. Decorrido este tempo, o pH foi ajustado para 7,0 pela adio de tampo TRIS/HCl (2 M, pH 7,0; 10 ml). A amostra foi ento reduzida com NaBH4, para uma concentrao final de 2 M, durante 2 h, sendo interrompida pela adio de HOAc at pH 5,0. Finalmente, o material foi dialisado em membrana com limite de excluso de 8 kDa durante 48 horas, concentrado e liofilizado. O processo de carboxi-reduo foi novamente realizado, bem como a dosagem de cidos urnicos. O polissacardeo resultante foi denominado PFHW-CR.
3.4.6 Degradao de Smith
Alquotas de polissacardeos foram dissolvidos em gua e acrescidas de periodato de sdio (NaIO4) at atingir uma concentrao final de 0,05 M. Cada soluo foi mantida por 72 ou 96 horas sob ausncia de luz. O processo de oxidao foi interrompido pela adio de etileno glicol e dilise exaustiva contra gua corrente. A soluo foi reduzida com NaBH4 (pH 9-10) por 24 horas (ABDEL-AKHER et al., 1952; DYER, 1956; HAY; LEWIS; SMITH, 1965). Em seguida, a amostra foi tratada com resina catinica (pH 7,0), dialisada por 48 horas e submetida hidrlise cida parcial (TFA, pH 2,0, por 30 minutos sob refluxo em banho com gua fervente) ou total (TFA 1 M, 100 C por 8 h). Os polissacardeos previamente oxidados com NaIO4 foram submetidos hidrlise cida parcial com TFA, pH 2,0, por 30 minutos sob refluxo em banho com gua fervente. Aps, a soluo foi neutralizada e precipitada com EtOH (5:1, v/v), sendo o precipitado dialisado, em gua corrente, em membranas com limite de excluso de 2 kDa. Para a -glucana isolada do lquen Parmotrema austrosinense, o material hidrolisado (TFA, pH 2,0 por 30 minutos sob refluxo em banho com gua fervente) foi evaporado at secura em rotaevaporador, e ento analisado por HPLC, conforme descrito no item 3.5.3.
Os materiais submetidos a hidrlise total foram reduzidos (NaBH4) e acetilados conforme descrito na seo 3.4.1.1 e 3.4.1.2, respectivamente, e analisados por GC-MS.
3.4.7 Hidrlise cida Parcial
Com a finalidade de remoo das unidades furanosdicas presentes nas galactomananas obtidas dos liquens Roccella decipiens e Umbilicaria mammulata, as mesmas foram submetidas a hidrlises cidas parciais com TFA pH 2,0 sob refluxo em banho com H2O fervente, por 18 h. Decorrido o tempo, as solues foram dialisadas em membranas com limite de excluso de 2 kDa e ento liofilizadas.
3.5 MTODOS ANALTICOS
3.5.1 Cromatografia Gasosa Acoplada Espectrometria de Massa (GC-MS)
As anlises cromatogrficas em fase gasosa acoplada espectrometria de massa foram realizadas em cromatgrafo a gs VARIAN, modelo 3.300 acoplado a um espectrmetro de massa de marca FINNIGAN MAT, modelo ITD 800, equipado com coluna capilar de slica fundida (30 m x 0,25 mm d.i.) revestidas DB-225 ou DB 210. As injees nas colunas foram feitas partindo-se de 50 C (mantida por 1 min), seguindo-se um aumento gradual de 40 C.min-1 at 215 C (acetatos de alditis parcialmente O-metilados) ou 220 C (acetatos de alditis), sendo mantida isotermicamente at o final da anlise. Hlio ultra puro foi utilizado como gs de arraste, a um fluxo de 1,0 ml.min-1.
3.5.2 Cromatografia de Partio em Papel (CP) As anlises cromatogrficas qualitativas dos monossacardeos foram realizadas pela tcnica descendente, com o sistema de solvente 1-butanol-piridina-gua (5:3:3, v/v), em papel Whatman n 1 (HOUGH; JONES, 1962). A deteco dos carboidratos foi realizada com as solues de AgNO3 (nitrato de prata) saturada seguida por soluo alcolica de NaOH (NaOH 40%: EtOH, 1:250) (TREVELYAN et al., 1950).
3.5.3 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC)
As anlises de cromatografia lquida de alta eficincia foram realizadas em aparelho SHIMADZU com detector de ndice de refrao (RID 10A, SHIMADZU). Foi utilizada uma coluna para cidos orgnicos (coluna HPX-87H 300 x 780 mm AMINEX ion exclusion-BIO RAD) a 65 C. A fase mvel foi uma soluo de cido sulfrico 8 mmol.l-1 em gua ultrapura (Milli-Q), desgaseificada com gs hlio, com um fluxo de 0,6 ml.min-1. As amostras foram solubilizadas em gua ultrapura (concentrao final: 1 mg.ml-1), filtradas atravs de membrana de acetato de celulose (Millipore) com membrana de tamanho de poro equivalente a 0,22 m e, ento, analisadas. O volume de injeo foi de 50 l. A amostra foi identificada por comparao com o tempo de reteno dos padres (eritritol e 2-O- -D-glucopiranosilD-eritritol).
3.5.4 Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) Os espectros mono [RMN-13C, -1H e DEPT (Distiortionless enhancement by polarization transfer)] e bidimensionais [HMQC (Heteronuclear multiple quantum correlation spectroscopy), HSQC (Heteronuclear single quantum correlation spectroscopy), HSQC-DEPT, COSY (Correlation spectroscopy), TOCSY (Total correlation spectroscopy) e ROESY (Rotational nuclear Overhauser Effect
Spectroscopy)] foram obtidos pelo uso de espectrmetro BRUKER, modelo AvanceDRX-400 (Departamento de Bioqumica e Biologia Molecular UFPR) ou AvanceTM 500 (Istituto di Ricerche Chimiche e Biochimiche G. Ronzoni, Milano, Italy). As anlises foram realizadas a 30C, 50C ou 70C, com as amostras sendo solubilizadas em D2O (xido de deutrio), Me2SO-d6 ou NaOD 3% em D2O, dependendo da sua solubilidade. Os deslocamentos qumicos das amostras solveis em D2O ou NaOD - D2O foram expressos em ! (ppm) relativos aos sinais de 13C e 1H da acetona em ! 30.20 e 2.22, respectivamente, e aos sinais do Me2SO-d6 em ! (13C) e 2.40 (1H), para as amostras solveis no mesmo.
!3
9.70
4 RESULTADOS E DISCUSSES
Na presente pesquisa, foram estudadas 15 espcies de fungos liquenizados quanto aos seus componentes polissacardicos. Estes pertencem aos gneros Cladina, Dictyonema, Leptogium, Parmotrema, Rimelia, Roccella e Umbilicaria. Conforme descrito anteriormente (Material e Mtodos), cada lquen sofreu o processo de extrao e purificao exposto nos esquemas descritos a seguir. Em geral, os liquens estudados foram, primeiramente, deslipidificados e ento submetidos aos procedimentos de extraes e purificaes de carboidratos de alta massa molar. Com a finalidade de melhor entendimento, cada gnero em estudo ser discutido separadamente. 4.1 Polissacardeos de Cladina spp.
As amostras (Cladina arbuscula, 36 g; C. confusa, 37 g; C. substenius, 80 g) foram tratadas, de forma sucessiva, com CHCl3:MeOH (2:1, v/v) e MeOH:H2O (4:1, v/v), com a finalidade de remover os componentes de baixa massa molar. O material residual foi submetido extrao alcalina com soluo aquosa de KOH 10% sob refluxo em banho com gua fervente, durante 3 horas (3 x). Os extratos alcalinos obtidos de cada espcie de Cladina foram neutralisados (HOAc), dialisados contra gua corrente e precipitados com etanol (3:1, v/v). Os polissacardeos obtidos foram ressuspensos em gua, congelados e ento descongelados, resultando na formao de um precipitado (PGD) e um sobrenadante (SGD) (Figura 6).
Cladina spp.
Limpo, seco, modo e deslipidificado
KOH 10% sob refluxo em banho com H20 fervente, por 3 h (3x)
Resduo
Extrato alcalino
Neutralizao e dilise Precipitao EtOH (3:1; v/v)
Polissacardeos
Congelamento/Degelo
Precipitado (PGD)
KOH 0,5 % a 50 C
"
Sobrenadante (SGD)
Soluo de Fehling
Insolvel (IKP)
Solvel (SKP)
Precipitado (PF)
Sobrenadante (SF)
FIGURA 6 - Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos de Cladina spp.
A frao sobrenadante de gelo/degelo (SGD) foi submetida ao tratamento de purificao por precipitao com soluo de Fehling, resultando na formao de um sobrenadante (SF) e um precipitado (PF). Enquanto que, a frao obtida por precipitao no processo de gelo/degelo (PGD) foi submetida ao tratamento com soluo aquosa de KOH 0,5% a temperatura de 50C, resultando em uma frao insolvel em gua (IKP) e outra solvel (SKP) sob estas condies (Figura 6).
4.1.1
Caracterizao Estrutural das Fraes IKP (insolveis em KOH 0,5%; nigeranas)
Anlise de composio monossacardica da frao PGD revelou a presena de altos teores de glucose (Tabela 4), sugerindo a presena de glucanas.
TABELA 4 - Composio monossacardica e rendimento dos polissacardeos obtidos de Cladina spp. C. arbuscula Man:Gal:Glc g%(2) (1) (mol%) 02:00:98 2,5 63:32:05 8,5 57:40:03 3,2 41:47:12 1,5 C. confusa Man:Gal:Glc g%(2) (1) (mol%) 01:01:98 3,1 60:32:08 15,3 63:32:05 11,0 40:49:11 3,4 C. substenius Man:Gal:Glc g%(2) (mol%) (1) 00:01:99 1,6 58:36:06 10,9 55:41:04 3,2 47:40:13 3,4
FRAES
PGD SGD PF SF
(1) Analisado em GC-MS aps hidrlise cida total, reduo e acetilao. (2) Rendimento em relao ao peso seco do lquen.
Aps purificao, a frao IKP referente a cada espcie (~2 g%) forneceu um espectro de RMN-13C com 12 sinais (Figura 7; Tabela 5), correspondendo a uma -Dglucana contendo, alternadamente, ligaes glicosdicas do tipo (1 3)- e (1 4), previamente encontrada em vrias Cladonia spp. (WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a) e tambm em 4 espcies do gnero Cladina (IACOMINI et al., 1985; NISHIKAWA et al., 1974). Muitas outras -glucanas, isoladas usando o processo de gelo-degelo, tem sido estudadas. Com exceo daquelas de Flavoparmelia caperata (TAKEDA et al., 1970) e Ramalina spp. (STUELP et al., 1999; CORDEIRO et al., 2003a), que apresentam uma relao molar de 1:1, todas as demais mostraram diferentes propores molares de ligaes (1 3)- e (1 4), variando entre 2:1 e 3:1 (GORIN et al., 1988). Para confirmar se este polissacardeo um fingerprint para gnero Flavoparmelia, outras espcies devero ser investigadas, considerando que at a presente data somente uma espcie foi estudada. O gnero Ramalina contm nigeranas (1:1), isoliquenanas e laminaranas, enquanto que Cladina e Cladonia apresentam apenas nigeranas (1:1) e laminaranas como glucanas.
100.1 99.2
FIGURA 7 - Espectros de RMN-13C da frao insolvel em KOH 0,5% (IKP; nigeranas) em Me2SOd6 (70C) obtidos de Cladina arbuscula (A), C. confusa (B) e C. subtenius (C). TABELA 5 - Dados de RMN-13C e 1H das nigeranas (IKP) e laminaranas (SKP), obtidos de Cladina spp. Frao IKP
1
82.6 78.9
H/13C
1
# (1$ 4)
H (& ) 5.23 3.55 3.73 3.57 3.88 3.63
13
# (1$ 3)
13
60.5 60.1
Frao SKP
% (1$ 3)
1
C (& ) 100.1 70.6 72.6 78.9 73.1 60.5
H (& ) 5.14 3.48 3.70 3.52 4.03 3.76
C (& )
H (& )
13
C (& )
H-1/C-1 H-2/C-2 H-3/C-3 H-4/C-4 H-5/C-5 H-6/C-6
99.2 71.9 82.6 69.5 70.5 60.1
4.55 3.31 3.49 3.27 3.27 3.48/3.72
102.9 72.9 86.2 68.4 76.3 60.8
4.1.2
Caracterizao Estrutural das Fraes SKP (solveis em KOH 0,5%; laminaranas)
Nas espcies de Cladina que foram estudadas, a frao solvel em KOH 0,5% a 50 C (SKP; ~ 0,4 g%) forneceu glucanas idnticas quelas -glucanas (1 3), devido aos caractersticos espectros de RMN-13C (Figura 8, Tabela 5).
102.9
86.2
FIGURA 8 - Espectros de RMN-13C da frao solvel em KOH 0,5% (SKP; laminaranas) em Me2SOd6 (70C) obtidos de C. arbuscula (A), C. confusa (B) e C. subtenius (C).
-D-Glucanas do tipo laminarana so polissacardeos insolveis em gua fria e
foram isoladas das 15 espcies de Cladonia estudadas (CARBONERO et al., 2001). Isto indica que elas devero estar presentes em todos os liquens deste gnero. Estas tambm foram obtidas de Stereocaulon ramulosum (BARON et al., 1988) e Ramalina spp. (STUELP et al., 1999; CORDEIRO et al., 2003a).
4.1.3
Caracterizao Estrutural galactoglucomananas)
da Frao
Precipitado
68.4
76.3 72.9
60.8
de Fehling
(PF;
A frao PF foi obtida via precipitao de Fehling da frao solvel em gua. Heteropolissacardeos de C. arbuscula (3,2 g%), C. confusa (11,0 g%) e C. substenius (3,2 g%) apresentam Mw 1,9 x 106, e, como monossacardeos constituintes, manose, galactose e glucose numa relao molar de 57:40:3, 63:32:5 e 55:41:4 (Tabela 4), respectivamente. Seus espectros de RMN-13C (Figura 9) mostraram em comum os principais sinais, mas possuem algumas diferenas as quais so tpicas das espcies. Em geral, tem se demonstrado que os espectros de RMN-13C dos heteropolissacardeos so caractersticos de cada espcie de lquen (WORANOVICZ et al., 1997; WORANOVICZ-BARREIRA, 1999a,c), portanto tem sido discutida a utilizao desta tcnica para classificao e identificao destes organismos (TEIXEIRA et al., 1995).
101.1 100.7
101.9
103.3 103.2
100.5
102.1 101.9
98.3
103.3
102.6 101.9
103.3
100.9 100.8 99.4 98.2
99.2
104.3
99.3
FIGURA 9 - Regies anomricas dos espectros de RMN-13C das fraes precipitado de Fehling (PF; galactoglucomanana) em D2O (30C) obtidas de C. arbuscula (A), C. confusa (B) e C. subtenius (C).
Anlises de metilao mostraram estruturas complexas, com formao de um mnimo de 10 significantes acetatos de alditis parcialmente O-metilados (Tabela 6), similares queles obtidos para os heteropolissacardeos de Cladonia e Cladina spp. (WORANOVICZ et al., 1997; WORANOVICZ-BARREIRA, 1999a,c; IACOMINI et al., 1985) (esta complexidade foi refletida nos espectros de RMN-13C, os quais contm vrios sinais na regio anomrica; Figura 9). Estes sinais correspondem, de acordo com os dados de metilao (Tabela 6), aos terminais no redutores de Galp (2,3,4,6Me4Gal) e Manp (2,3,4,6-Me4Man) (C. confusa mostrou que os grupos terminais no redutores de Manp correspondem a 20%, ou seja, o derivado em maior proporo das trs espcies), e unidades de Manp 2-O- (3,4,6-Me3Man), 6-O- (2,3,4-Me3Man), 4,6O- (2,3-Me2Man) (neste caso, o polmero de C. confusa apresenta a menor proporo deste derivado), 2,6-O- (3,4-Me2Man) e 2,4,6-O- (3-MeMan) substitudas. Entretanto, o polissacardeo de C. confusa apresenta unidades de Galp substitudas em O-3, diferentes dos de C. arbuscula e C. substenius, os quais apresentam substituio em O4.
98.3
104.2
TABELA 6 - Anlise por metilao da frao precipitado de Fehling (PF; galactoglucomanana) obtidas de Cladina spp. Acetatos de alditis parcialmente O-metilados (1) 2,3,4,6-Me4Man 2,3,4,6-Me4Gal 3,4,6-Me3Man 2,4,6-Me3Glc 2,3,6-Me3Man 2,4,6-Me3Gal 2,3,4-Me3Man 2,3,6-Me3Gal 2,3,6-Me3Glc 2,3-Me2Man 3,4-Me2Man 3-MeMan
Precipitado de Fehling
Tipo de ligao (2) C. substenius 11 27 7 1 7 14 4 11 7 11 Manp-(1 $ Galp-(1 $ $ 2)-Manp-(1$ $ 3)-Glcp-(1$ $ 4)-Manp-(1$ $ 3)-Galp-(1$ $ 6)-Manp-(1$ $ 4)-Galp-(1$ $ 4)-Glcp-(1$ $ 4,6)-Manp-(1$ $ 2,6)-Manp-(1$ $ 2,4,6)-Manp-(1$ 20 24 4 1 2 6 5 2 4 4 12 16
C. arbuscula 8 29 9 3 5 11 3 12 9 11
C. confusa
(1) Analisado em GC-MS aps metilao, metanlise, hidrlise cida total, reduo (NaB2H4) e acetilao. 13 (2) Baseado nos derivados acetilados parcialmente O-metilados. Os espectros de RMN- C da
frao precipitado de Fehling obtida das trs espcies estudadas (Figura 9), contm sinais de C-1 que indicam estruturas, predominantemente, ramificadas com grupos terminais no redutores de -D-Galp-(1 4)- -D-Manp (! 104.3), -D-Galp-(1 2)- D-Manp (! 102.8) e tambm -D-Manp (! 103.3) ligados (1 2) a unidades de -DManp, assim como unidades de -D-Manp 2,4-di-O-substitudas (! 101.7) (GORIN; IACOMINI, 1984, 1985), 6-O- (! 100.5) e 2,6-di-O-substitudas (! 99.3) correspondentes cadeia principal do polissacardeo (GORIN, 1973).
4.1.4
Caracterizao Estrutural das Fraes Sobrenadantes de Fehling (SF; galactomanoglucanas)
Os sobrenadantes, obtidos aps precipitao com soluo de Fehling, forneceram polissacardeos similares e homogneos (C. arbuscula: 1,5 g% e 3,4 g% para os outras 2 espcies, Mw 1,75 x 106). Eles apresentaram similaridades em seus espectros de RMN
13
C (Figura 6) e Man, Gal, Glc numa proporo de 41:47:12 (C.
arbuscula), 40:49:11 (C. confusa) e 47:40:13 (C. substenius), respectivamente (Tabela 4). O espectro de RMN-13C de cada galactomanoglucana mostrou complexidade em relao s cadeias laterais com sinais de C-1 de -Galf em ! 106.0-108.3 (GORIN; BARRETO-BERGTER; CRUZ, 1981).
101.2
101.3
A
107.8
B
106.0
C
101.2 108.4 106.0
108.3
FIGURA 10 - Regies anomricas dos espectros de RMN 13C das fraes sobrenadante de Fehling (SF; galactomanoglucana) em D2O (30C) obtidas de Cladina arbuscula (A), C. confusa (B) e C. subtenius (C).
Estes resultados esto de acordo com os dados de metilao, os quais mostraram 16-26% de grupos terminais no redutores de Galf (Tabela 7). Esta anlise tambm sugere que as cadeias laterais so ramificadas (com unidades de Manp 2-O-, 4-O-, 6-O-, 2,3-di-O-substitudas; Galp 6-O-, 3,6-di-O-substitudas; e unidades de Glcp 2,3,6-tri-O-substitudas) as quais esto presentes em todas Cladina spp. investigadas.
106.0
103.9
108.4
TABELA 7 - Anlise por metilao da frao sobrenadante de Fehling (SF; galactomanoglucana) obtidas de Cladina spp. Acetatos de alditis parcialmente O-metilados (1) 2,3,4,6-Me4Man 2,3,5,6-Me4Gal 2,3,4,6-Me4Gal 3,4,6-Me3Man 3,4,6-Me3Glc 2,4,6-Me3Man 2,3,6-Me3Man 2,3,4-Me3Man 2,3,5-Me3-Gal 4,6-Me2Man 2,6-Me2Gal 2,3-Me2Man 3,4-Me2Man 2,3-Me2Gal 2,4-Me2Gal 4-MeGlc
Sobrenadante de Fehling
Tipo de ligao (2) C. substenius 4 16 12 19 4 11 6 6 5 1 2 2 4 9 Manp-(1 $ Galf-(1$ Galp-(1 $ $ 2)-Manp-(1$ $ 2)-Glcp-(1$ $ 3)-Manp-(1$ $ 4)-Manp-(1$ $ 6)-Manp-(1$ $ 6)-Galf-(1$ $ 2,3)-Manp-(1$ $ 3,4)-Galp-(1$ $ 4,6)-Manp-(1$ $ 2,6)-Manp-(1$ $ 4,6)-Galp-(1$ $ 3,6)-Galp-(1$ $ 2,3,6)-Glcp-(1$ 3 26 9 9 2 3 6 5 6 8 2 2 3 5 9
C. arbuscula 5 22 10 16 3 7 2 7 7 3 4 5 10
C. confusa
(1) Analisado em GC-MS aps metilao, metanlise, hidrlise cida total, reduo (NaB2H4) e acetilao. (2) Baseado nos derivados acetilados parcialmente O-metilados.
Estes resultados coincidem com aqueles obtidos para as diversas espcies de liquens do gnero Cladonia (WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999d), os quais forneceram espectros de RMN-13C e dados de metilao praticamente idnticos, ou seja, galactomanoglucanas com cadeia principal de unidades de -D-Glcp ligadas (1 3) e substitudas em O-2,6, principalmente, por cadeias laterais de unidades Galf e Manp. Estes dados sugerem que os gneros Cladonia e Cladina apresentam o mesmo heteropolmero encontrado na frao sobrenadante de Fehling.
4.2 -Glucana (1 3)-ligada, -xilana (1 4)-ligada e -manana (1 6)-ligada de

Dictyonema glabratum
O basidiolquen Dictyonema glabratum (43 g) foi submetido ao processo de extrao conforme descrito na Figura 11.
D. glabratum Limpo e modo (43 g)

Deslipidificao: CHCl3:MeOH (2:1, v/v) MeOH:H2O (4:1, v/v)
Resduo I
KOH 2% sob refluxo em banho com H2O fervente, 2h (3x)
Componentes de baixa massa molecular Extrato alcalino 2% K2

Congelamento/Degelo
Resduo II
KOH 10% sob refluxo em banho com H2O fervente, 2h (1 x)
Resduo III
Extrato alcalino 10% K10

Congelamento/Degelo
Sobrenadante SK2
Precipitado PK2
Tratamento com soluo de Fehling
Sobrenadante SK10
Precipitado PK10
Me2SO sob refluxo em banho com H2O fervente, por 2h
Precipitado PF2
Sobrenadante SF2
Frao solvel, Sob - Me2SO

Tratamento com soluo de Fehling
Frao insolvel, Ppt - Me2SO Sobrenadante SF10
Precipitado PF10
FIGURA 11 - Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos do lquen Dictyonema glabratum.
A amostra deslipidificada foi extrada, sucessivamente, com soluo aquosa de KOH 2% (3x) e 10% (1x) sob refluxo em banho com H2O fervente por 2 horas, com adio de NaBH4. Os extratos alcalinos obtidos (2 e 10%) foram neutralizados (HOAc) e dialisados contra gua corrente. Em seguida, os mesmos foram submetidos ao tratamento de purificao por congelamento e degelo. Os precipitados obtidos por
este processo foram separados por centrifugao. O precipitado de gelo e degelo- 2% (PK2) contm 94% glucose (Tabela 8).
TABELA 8 - Composio monossacardica das fraes isoladas de D. glabratum Rendimento (g %) PK2 PK10 Frao Solvel - Me2SO Frao Insolvel Me2SO PF10 SF10 0,8 2,3 0,6 1,7 0,56 0,04
(1)
FRAES
Monossacardeos (mol %) (2) Glc 94 58 6 64 100 Xyl 4 38 64 19 68 Man 2 4 30 17 32 -
(1) Rendimento em relao ao peso seco do lquen. (2) Analisado em GC-MS aps hidrlise cida total, reduo e acetilao.
Com a finalidade de purificao, a frao PK2 foi submetida ao processo de purificao por precipitao com o reativo de Fehling, o qual levou a glucana ao sobrenadante (SF2; 0,76 g%). Para verificar a homogeneidade desta frao, a mesma foi submetida cromatografia em gel permeao (Sepharose CL-6B) a qual mostrou a presena de apenas um pico (Mw ~7,0 x 105). Anlise de metilao desta frao forneceu os acetatos de alditis parcialmente O-metilados que correspondem a grupos terminais no redutores de Glcp (2,3,4,6Me4Glc, traos) e unidades de Glcp 3-O-substitudas (2,4,6-Me3Glc, 99,9%), mostrando uma estrutura linear (Tabela 9).
TABELA 9 - Anlise por metilao dos polissacardeos obtidos de D. glabratum

Polissacardeos (mol %) Acetatos de alditis (1) Glucana Xilana parcialmente O-metilados
Manana 0,3
Tipo de ligao (2) Glcp-(10 Manp -(10 Xylp-(1 0
2,3,4,6-Me4Glc 2,3,4,6-Me4Man 2,3,4-Me3Xyl 2,4,6-Me3Glc 2,3,4-Me3Man 2,3-Me2Xyl
(3)
tr
99,9 0,1 99,9
0 3)-Glcp-(10
99,7 -
0 6)-Manp-(10 0 4)-Xylp-(10
(1) Analisado em GC-MS aps metilao, metanlise, hidrlise cida total, reduo (NaB2H4) e acetilao. (2) Baseado nos derivados acetilados parcialmente O-metilados. (3) Traos.
O espectro de RMN-1H da frao SF2 indicou que a glucana com ligaes do tipo (1' 3) tem uma ( -configurao, por virtude de um sinal de H-1 em campo baixo () 5.20), que est de acordo com o tpico sinal de C-1 em campo alto em seu espectro de RMN-13C a ) 100.9. O espectro de RMN-13C contm 6 sinais, como esperado para um homopolissacardeo linear (Tabela 10) e estes foram assinalados por COSY, TOCSY, HMQC e DEPT. O espectro de HMQC mostrou 7 sinais correlatos (1H/ 13C). Neste foi possvel observar um sinal em campo baixo na regio a ) 83.7/3.77 confirmando a presena de unidades de ( -Glcp 3-O-substitudas e para C-6 no substitudo foi observado um duplete em ) 61.2/3.87, 3.77. Este foi confirmado pela presena de um sinal de -CH2 invertido na regio de ) 61.2, na anlise por RMN-13CDEPT.
TABELA 10 - Dados de RMN-13C e 1H para os polissacardeos isolados de D. glabratum (1) GLUCANA H/C H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-5 H-6 H-6
a b a b
Prton
0 3)-1 3 -Glcp-(10
5.20 3.87 3.87 3.39 3.51 3.57 3.87 100.9 71.3 83.8 70.8 73.1 61.2 -
0 4)- 2 3 -Xylp-(10
H/C 4.27 3.15 3.28 3.54 3.17 3.87 102.6 72.8 74.1 75.7 64.1 -
XILANA
0 6)- 2 3 -Manp-(10
H/C 4.29 3.07 3.32 3.17 3.18 3.07 3.74 104.8 72.9 73.8 77.6 77.6 66.6 -
MANANA
(1) Dados obtidos dos seguintes experimentos: 13C, 1H, COSY, TOCSY, HMQC e DEPT.
A frao constituda pelo precipitado de gelo e degelo obtida por extrao com soluo aquosa de KOH 10% a quente (PK10) apresentou glucose (58%), xilose (38%) e manose (4%) como monossacardeos (Tabela 8). Esta frao foi submetida ao tratamento com Me2SO a quente, resultando em uma frao insolvel (Ppt- Me2SO) uma solvel (Sob- Me2SO). A frao Sob-Me2SO mostrou ser composta por xilose (64%), manose (30%) e glucose (6%). Com a finalidade de purificao, a frao PK10 foi purificada por tratamento com soluo de Fehling, fornecendo uma frao solvel (SF10; rendimento 0,04 g%) e outra insolvel (PF10; rendimento 0,56 g%). A frao PF10 mostrou ser composta por manose e xilose (Tabela 8), sendo purificada por cromatografia de gel permeao. Este procedimento foi eficiente na separao, sendo obtida uma frao composta, principalmente, por manose e Mw 4 6,0 x 104 (manana) e outra apresentando, principalmente, xilose e Mw 4 1,8 x 105 (xilana). Anlise de metilao apresentou derivados referentes a terminais no redutores de Xylp (2,3,4Me3Xyl, 0,1%) e Xylp 4-O-substitudas (2,3-Me2Xyl, 99,9%), confirmada pelos fragmentos de massa m/z 118, 130 e 162 aps reduo com hidrlise, reduo com NaB2H4 e acetilao (Tabela 9). A estrutura da xilana foi confirmada atravs das anlises de RMN-13C e 1H. O espectro de RMN-13C contm apenas 5 sinais, consistente com um homopolmero linear (Tabela 10). A regio anomrica contm
apenas 1 sinal em campo baixo a ) 102.6, o qual sugere que as unidades de Xylp tem um configurao glicosdica do tipo 5 . O sinal em ) 76.4 corresponde ao C-4 das unidades 4-O-substitudas (GORIN, 1973). A anlise de RMN-13C-DEPT da xilana mostrou um sinal de CH2 invertido em ) 64.1, que corresponde ao C-5. Anlise de metilao da manana mostrou a presena de terminais no redutores de Manp (2,3,4,6-Me4Man, 0,3%) e unidades de Manp 6-O-substitudas (2,3,4-Me3Man, 99,7%) (Tabela 9). O espectro de RMN-13C da manana contm 6 sinais, mostrando assim a presena de um polissacardeo linear (Tabela 10). A configurao glicosdica tipo 5 foi indicada pela presena de um sinal de H-1 em campo alto a ) 4.23 no espectro de HMQC quando analisado em Me2SO-d6 (GORIN; SPENCER; BHATTACHARJEE, 1969). O sinal de C-6 em ) 66.6 indicou a presena de unidades de Manp 6-O-substitudas, confirmada por uma inverso do correspondente sinal de -CH2 na anlise RMN-13C-DEPT (HMQC: duplete em ) 66.6/3.40, 3.06). Um polmero constitudo por unidades de 57698 anp contendo ligaes glicosdicas do tipo (1 ' 6) foi ento demonstrado. Os trs polissacardeos lineares obtidos no haviam sido observados anteriormente para os liquens. A
( -glucana linear, tambm chamada de

commune, Paracoccidioides
pseudonigerana, tem sido descrita em muitos fungos como Aspergillus niger, A. nidulans, Tremella mesenterica, Schizophyllum
brasiliensis e outros (GORIN; BARRETO-BERGTER, 1983) A 5 -D-xilana linear ligada (1' 4) ocorre em plantas superiores e algumas algas (AHMADJIAN, 1993), bem como nos fotobiontes de R. celastri (CORDEIRO et al., 2003b). Entretanto, este polmero nunca havia sido detectado em liquens intactos, possivelmente, devido pequena proporo (1-10%) do fotobionte presente em fungos liquenizados (AHMADJIAN, 1993). Provavelmente, o polissacardeo mais interessante de D. glabratum a 5 -Dmanana linear contendo ligaes glicosdicas do tipo (1' 6) a qual no foi encontrado em nenhum organismo aps vasta reviso em literatura.
Mananas lineares com ligaes glicosdicas do tipo 5 ocorrem em plantas como polmeros contendo ligaes do tipo (1' 4) (STEPHEN, 1983) e com alternadas ligaes (1' 3)- e (1' 4)-, nas leveduras Rhodotorula spp. (GORIN; HORITSU; SPENCER, 1965) e no protozorio Crithidia deanii (PREVIATO; MENDONAPREVIATO; GORIN, 1979) e outros. Muitas mananas fngicas so ramificadas e possuem ( -ligaes, embora algumas delas contm misturas de ( (GORIN; SPENCER; BHATTACHARJEE, 1969). Estudos anteriores realizados com este fungo liquenizado (IACOMINI et al., 1987), mostrou a presena de polissacardeos no usuais como uma glucana ramificada contendo ligaes do tipo (1' 3) e (1 ' 6) e um heteropolissacardeo contendo uma cadeia principal composta por unidades de ( -D-Manp (1' 3)-ligadas, apresentando substituies em O-4 e O-2,4 por unidades de 5 -D-Xylp. e 5 - ligaes
4.3 Polissacardeos de Leptogium spp.
As amostras (Leptogium azureum, 100 g e Leptogium sp., 30 g) foram submetidas, sucessivamente, extraes aquosas (25C e sob refluxo em banho com H2O fervente) e alcalinas (com adio de boroidreto de sdio), conforme a Figura 12. Os extratos obtidos (aquoso a 25C: CW1 a CW6; aquoso a quente: HW1 a HW6; alcalino: K1) foram precipitados com etanol (3:1, v/v) e dialisados contra gua corrente. Em seguida, os mesmos foram submetidos ao tratamento de purificao por congelamento e degelo resultando na formao de precipitados que foram separados por centrifugao.
Leptogium spp. Limpo, seco e modo
Extrao aquosa a 25C, 3 h (6x)
Resduo I
H2O sob refluxo em banho com gua fervente, 3 h (6x)
Extrato Aquoso I (CW1 a CW6)

Gelo/Degelo Centrifugao
Resduo II
KOH 1% sob refluxo em banho com gua fervente, 3 h (1x)
Extrato Aquoso II (HW1 a HW6)
Precipitado (PCW)
Sobrenadante (SCW)
Extrato Alcalino (K)

Resduo III Precipitado (PHW) Precipitado (PK)
Dilise em membrana Mr 16 kDa cut-off
Sobrenadante (SHW)
Frao retida (16RSC)
Frao eluda (16ESC)
Sobrenadante (SK)
Soluo de Fehling
Soluo de Fehling
Filtrao em membrana Mr 10 kDa cut-off
Sobrenadante (SFSHW)
Precipitado (PFSHW) Frao eluda (10ESC)

Dilise em membrana Mr 14 kDa cut-off
Frao retida (10RSC)
Sobrenadante (SFSK)
Precipitado (PFSK)
Dilise em membrana de Mr 16 kDa cut-off
Frao retida (RPF)
Frao eluda (EPF)
Frao eluda Frao retida (14RSC) (14ESC)
FIGURA 12 - Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos de Leptogium spp.
4.3.1 Polissacardeos Obtidos por Extraes Aquosas
Os extratos aquosos (CW1 a CW6 e HW1 a HW6) obtidos dos liquens Leptogium azureum (denominado La) e Leptogium sp. (denominado L2) foram submetidos purificao por congelamento e degelo, fornecendo precipitados (PCW1 a PCW6 e PHW1 a PHW6) e sobrenadantes (SCW1 a SCW6 e SHW1 a SHW6). As fraes precipitadas (PCW1 a PCW6 e PHW1 a PHW6), obtidas para as espcies em estudo, apresentaram baixo rendimento (~ 0,12 g%) e glucose como principal monossacardeo (~94%). Devido similaridade apresentada, as fraes PCW1 a PCW6 e PHW1 a PHW6 foram reunidas, resultando nas fraes PW-La e PW-L2, e analisadas por RMN-13C. Os espectros de RMN-13C (Figura 13A e B, respectivamente) obtidos foram idnticos queles obtidos para as 5 -glucanas ligadas (1' 3).
A
102.8 86.0 60.7
FIGURA 13 - Espectros de RMN- 13C da frao PW (laminarana) em Me2SO-d6 (70C) obtida de L. azureum (A) e Leptogium sp. (B).
76.2 72.6
68.3
As fraes solveis em gua fria, obtidas para o lquen L. azureum, apresentaram-se similares quanto a composio monossacardica (Tabela 11) e ao perfil de eluio determinado por HPSEC. Portanto, as fraes sobrenadantes obtidas a partir de extraes aquosas a frio (SCW1 a SCW6) ou a quente (SHW1 a SHW6), foram reunidas fornecendo as fraes SCW-La e SHW-La, respectivamente. Esta similaridade tambm foi observada para as fraes obtidas para a outra espcie em estudo, sendo agrupadas e denominadas SCW-L2 e SHW-L2. Diferente dos fungos liquenizados previamente estudados, o referido gnero apresentou o derivado 3-O-metil galactose o qual foi confirmado pelos fragmentos de massa m/z 130 e 190 observados por GC-MS aps hidrlise, reduo com NaB2H4 e acetilao. Como pode ser observado (Tabela 11), um maior teor deste derivado foi encontrado para as fraes aquosas obtidas de Leptogium sp.
TABELA 11 - Composio monossacardica e rendimento das fraes sobrenadante de gelo/degelo obtidas de Leptogium spp. Fraes SCW1 SCW2 SCW3 SCW4 SCW5 SCW6 SHW1 SHW2 SHW3 SHW4 SHW5 SHW6 SCW1 SCW2 SCW3 SCW4 SCW5 SCW6 SHW1 SHW2 SHW3 SHW4 SHW5 SHW6 (g%) (1) 1,83 1,12 0,73 0,64 0,62 0,56 3,84 0,93 0,53 0,57 0,36 0,34 0,38 0,30 0,24 0,19 0,18 0,13 3,17 1,28 0,97 0,65 0,48 0,34 Xyl 23,6 19,0 15,8 20,7 22,1 20,6 18,5 14,3 13,4 12,6 10,1 8,3 24,2 19,0 17,8 20,7 23,9 20,6 15,6 14,3 14,4 12,6 10,4 7,9 Monossacardeos (mol%) (2) 3-O-MeGal(3) Man Gal 18,6 2,5 30,0 13,8 2,6 34,0 17,6 1,7 33,9 13,4 1,9 33,5 13,0 1,8 36,5 12,9 2,0 34,4 26,4 1,8 30,7 28.3 2,0 33,0 37,5 1,4 24,6 41,3 0,5 23,3 43,3 23,5 47,7 20,2 1,1 35,4 14,0 1,3 32,7 16,4 0,9 34,7 14,9 1,0 34,3 13,5 0,7 32,3 16,5 0,9 30,5 16,4 1,4 31,8 12,1 1,6 28,6 33,1 7,9 30,0 24,6 12,3 29,5 23,3 15,2 27,3 24,0 18,6 26,7 22,0
L. azureum
Leptogium sp.
Glc 25,3 30,6 31,0 30,5 26,6 30,1 22,6 22,4 23,1 22,3 23,1 23,8 25,3 30,6 31,7 30,5 26,6 31,6 39,4 22,4 23,1 22,3 23,1 24,8
(1) Rendimento em relao ao peso seco do lquen. (2) Analisado em GC-MS aps hidrlise cida total, reduo (NaB2H4) e acetilao. (3) Confirmado pelos fragmentos de massa m/z 130 e 190 aps reduo com NaB2H4.
Devido a heterogeneidade apresentada pela frao SCW-La (Figura 14A), esta foi submetida ao processo de purificao por precipitao com soluo de Fehling, mas no houve formao de complexo. Em seguida, a mesma foi submetida dilise em membranas com limite de excluso de 16 kDa, resultando em uma frao retida (16RSC-La) e outra eluda (16ESC-La) (Figura 14B). Devido ao perfil de eluio heterogneo apresentado pela frao 16ESC-La, a mesma foi dialisada em membrana com cut off 14 kDa, fornecendo as fraes 14RSC-La (retida) e 14ESC-La (eluda), as quais mostraram-se homogneas por HPSEC-MALLS (Figura 15A e B,
respectivamente).
0.3 LS, IR (volts)
A
0.2
IR LS
0.1
0.0
-0.1 0 10 20 30 40 Volume (ml) 50
0.8 LS, IR (volts)
B
0.6
IR LS
0.4
0.2
0.0
-0.2 0
10
20
30
40 Volume (ml)
50
FIGURA 14 Perfil de eluio das fraes SCW-La (A) e 16ESC-La (B) (solubilizadas em H2O MilliQ) em cromatografia de excluso estrica, acoplada a multideteco espalhamento de luz (LS) e ndice de refrao (IR) (HPSEC-MALLS).
As fraes 14RSC-La e 14ESC-La apresentaram-se similares quanto sua composio monossacardica (Tabela 12) e anlise de RMN-13C (Figura 15A e B, respectivamente).
0.25 LS, IR (volts)
A
0.20 0.15
IR LS
0.10 0.05 0.00 -0.05 0
20
40
60 Volume (ml)
80
0.4 LS, IR (volts)
B
0.3
IR LS
0.2
0.1
0.0
-0.1 0
20
40
60 Volume (ml)
80
FIGURA 15 Perfil de eluio das fraes 14RSC-La (A) e 14ESC-La (B) (solubilizadas em nitrito de sdio 0,1 mol.l-1, contendo azida sdica) em cromatografia de excluso estrica, acoplada a multideteco espalhamento de luz (LS) e ndice de refrao (IR) (HPSEC-MALLS).
Os espectros de RMN-13C das fraes 14RSC-La e 14ESC-La apresentaram sinais na regio anomrica referentes a unidades piranosdicas () 103.9 - 95.6) e 5 furanosdicas () 107.1). O sinal intenso em campo alto em ) 19.8, sugere a presena de
grupamentos acetil (referente ao CH3), mas esta hiptese foi descartada devido resistncia do mesmo aps o tratamento alcalino (KOH 1 M sob refluxo em banho com H2O fervente, por 2 h). O sinal em ) 175.1 refere-se ao grupamento -CO2H, sugerindo a presena de grupamentos cidos na estrutura. Estes dados foram confirmados pela dosagem de cidos urnicos a qual foi de 24,0% e 28,5% para L. azureum e Leptogium sp., respectivamente.
TABELA 12 - Composio monossacardica das fraes obtidas de Leptogium spp. Fraes 16ESC-La 14ESC-La 14RSC-La PFHW-La PFHW-L2 Monossacardeos (mol%) (1) 3-O-MeGal (2) Man Gal 11,7 0,8 32,1 8,0 31,4 16,3 27,9 20,9 tr (3) 39,6 (3) tr 31,8 11,8
Xyl 26,4 30,6 22,3 21,0 15,6
Glc 29,0 30,0 33,5 18,5 40,8
(1) Analisado em GC-MS aps hidrlise cida total, reduo e acetilao. (2) Confirmado pelos fragmentos de massa m/z 130 e190 do acetato de 3-O-metilgalactitol-1-d. (3) Traos.
O material hidrolisado das referidas fraes quando analisado por HPLC, mostrou um pico, com tempo de reteno de 7,77 min, no identificado, alm daqueles correspondentes aos monossacardeos detectados por GC-MS (Tabela 12). Devido ao baixo rendimento destas fraes e pela presena deste composto nas amostras obtidas por extraes aquosas a quente, o isolamento e o estudo dos mesmos sero discutidos a seguir.
102.8
107.1 103.9
180
175.1
160
95.6
97.6
83.8
140
120
100
80
60
40
20
FIGURA 16 - Espectros de RMN-13C das fraes 14RSC-La (A) e 14ESC-La (B) em D2O (30@ C) obtidas de L. azureum.
As fraes sobrenadante de gelo/degelo obtidas a partir das extraes aquosas a quente para as duas espcies em estudo (SHW-La e SHM-L2) foram submetidas purificao com soluo de Fehling, resultando em precipitados (PFHW-La e PFHWL2) e sobrenadantes (SFHW-La e SFHW-L2). Os precipitados obtidos (PFHW-La e PFHW-L2) apresentaram-se
homogneos, por HPSEC (Figuras 17A e B, respectivamente).
18.9
0.16 IR (volts)
A
0.12
IR
0.08
0.04
0.00
-0.04 0
20
40
60 Volume (ml)
80
0.16 IR (volts)
B
0.12
IR
0.08
0.04
0.00
-0.04 0
20
40
60 Volume (ml)
80
FIGURA 17 Perfil de eluio, por HPSEC, das fraes PFHW-La (A) e PFHW-L2 (B) (solubilizadas em nitrito de sdio 0,1 mol.l-1, contendo azida sdica).
A frao PFHW-La, quando analisada por GC-MS, apresentou xilose, manose, galactose e glucose como principais monossacardeos enquanto que PFHW-L2 mostrou ser composta por xilose, 3-O-MeGal, galactose e glucose (Tabela 12). Os espectros de RMN-13C das fraes PFHW-L2 e PFHW-La mostraram-se similares (Figuras 18A e 19, respectivamente). Os sinais observados na regio anomrica correspondem a unidades na forma piranosdicas. Os sinais em ) 18.9 e 175.1 tambm foram observados nestas fraes. A partir do espectro de RMN-13CDEPT (Figura 18B) da frao PFHW-L2 foram observados os sinais invertidos em )
69.0, 63.2 e 61.4 que correspondem a grupos -CH2. O sinal em ) 57.8 observado no espectro de RMN-13C e DEPT da frao PFHW-L2 refere-se aos OCH3 das unidades de 3-O-MeGalp, confirmando os dados observados por GC-MS.
84.4 79.9 79.0 75.4 74.4 72.5 66.9 64.9 61.4 57.8
103.8
175.1
ppm
180
160
140
120 72.5
100
98.0 96.6
80
60
40
20
18.9
103.8
84.4
75.4 74.4
96.6
98.0
79.9 79.0
69.0
67.9
110
100
90
80
70
61.4
63.2
66.9 64.9
60
57.8
50
40
30
20
FIGURA 18 - Espectros de RMN-13C (A) e DEPT (B) da frao PFHW-L2 em D2O (30C).
18.9
103.8
78.9
66.9 63.3 61.4
73.5
74.4
180
175.1
160
140
120
100
98.0
96.4
84.6
80
60
40
20
FIGURA 19 - Espectro de RMN-13C da frao PFHW-La em D2O (30C).
As fraes PFHW-L2 e PFHW-La foram submetidas dosagem de cidos urnicos (FILISETTI-COZZI; CARPITA, 1991), apresentando um teor de 29,0% para as duas espcies. Devido presena de grupamentos cidos na estrutura, a frao PFHW-L2 foi submetida ao processo de carboxi-reduo pelo mtodo de TAYLOR e CONRAD (1972), resultando a frao PFHW-CR, que aps dosagem apresentou apenas 1% de grupamentos cidos. Na anlise da composio monossacardica de PFHW-CR foi detectado, alm dos monossacardeos observados na frao original (xilose, 20,7%; 3-O-MeGal, 23,7%; galactose, 11,8% e glucose, 36,1%), um outro pico (7,7%; principais fragmentos de massa m/z 81, 98, 109, 115, 127, 157 e 169) sugerindo que o
18.9
monossacardeo cido foi reduzido ao seu correspondente acar neutro, o qual no corresponde aos acares padres. Na tentativa de determinar a estrutura deste composto, o mesmo foi isolado por HPLC a partir da hidrlise total da frao PFHW-L2. O espectro de RMN-13C da frao isolada (P1-L2) (Figura 20) manteve alguns sinais observados anteriormente para o polissacardeo original, como os sinais em ) 175.1 e 18.9. O sinal em ) 84.6, que no espectro do polissacardeo nativo sugeria ligao glicosdica do tipo (1' 3), tambm est presente no espectro de P1-L2 sugerindo que este sinal seja referente a presena de um substituinte em C-3. O possvel substituinte trata-se de um grupamento carboxil. De acordo com os dados obtidos por SPELLMAN et al. (1983), os quais isolaram e caracterizaram o composto denominado cido acrico (AceA) que corresponde a 3-C-carboxil-5-desoxi-L-xilose, esta estrutura apresenta C-3 deslocado para campo baixo. Este composto foi identificado como um componente da parede celular de plantas, sendo constituinte das ramnogalacturonanas II isoladas de Acer pseudoplatanus. Ao contrrio do cido acrico, o composto isolado em estudo apresenta-se como uma hexose. Alm disso, no foi observado nenhum sinal correspondente a grupos -CH2 em concordncia com a estrutura proposta.
73.6
84.6
76.8
96.6
92.4
82.0
79.3
72.8
FIGURA 20 - Espectro de RMN-13C da frao P1-L2 em D2O (30C).
175.1
De acordo com os dados obtidos, o referido composto apresenta grupamentos metil (-CH3) e carboxil (-COOH). Estes provavelmente esto ligados ao C-5 e C-3, respectivamente. Considerando os resultados obtidos, o referido composto pode corresponder ao 3-C-carboxi-6-desoxi-hexose. Mas, anlises adicionais devero ser realizadas para a elucidao do tipo de hexose, bem como, da configurao enantiomrica. Embora as fraes obtidas por extraes aquosas a frio e a quente apresentarem composies monossacardicas similares e o referido composto, provavelmente estas no apresentam a mesma estrutura, pois comportam-se de maneira diferente quando tratadas com soluo de Fehling.
4.3.2 Polissacardeos Obtidos por Extrao Alcalina
71.2
18.9
O extrato alcalino obtido (K-La e K-L2) foi submetido ao processo de gelo e degelo resultando em um sobrenadante (SK-La e SK-L2) e um precipitado (PK-La e PK-L2). As fraes PK-La e PK-L2 foram analisadas por GC-MS e apresentaram glucose (~97%) como principal monossacardeo. Estas foram solubilizadas em Me2SO-d6 e analisadas por RMN-13C, apresentam-se idnticas quelas obtidas por extraes aquosas (Figura 13). frao sobrenadante de gelo/degelo (SK-La e SK-L2) foi adicionado o reativo de Fehling, originando um precipitado (PFSK-La e PFSK-L2) e um sobrenadante (SFSK-La e SFSK-L2).
4.3.2.1
Caracterizao estrutural da frao precipitado de Fehling (PFSK-La; galactomanana)
O precipitado obtido aps precipitao com o reativo de Fehling (PFSK-La; 2,8 g%), contm xilose, manose, galactose e glucose em uma relao molar de 1:11:3:2. Este mostrou-se heterogneo quando analisado por HPSEC-MALLS, com dois picos principais (Figura 21). Com a finalidade de purificao, esta frao foi dialisada, contra gua destilada, em membranas com limite de excluso de 16 kDa fornecendo 2 fraes: retida (RPF-La, 2,3 g%) e eluda (EPF-La, 0,4 g%). A frao RPF-La apresentou-se homognea quando analisada por HPSEC (Figura 21) e Mw 4,6 x 105 (dn/dc = 0,150), e composta por manose e galactose em uma relao molar de 5:1.
0.4
IR (volts)
RPF-La PFSK-La
0.3
0.2
0.1
0.0 0
10
20
30
40
50
10
Volume (ml)
FIGURA 21 Perfil de eluio, por HPSEC, das fraes PFSK-La (em cinza) e RPF-La (em preto) (solubilizadas em H2O MilliQ).
Os resultados obtidos por anlise de metilao (Tabela 13) indicaram a presena de um polissacardeo altamente ramificado, contendo grupos terminais no redutores de Manp (29,0%) e Galp (17,2%), alm de unidades de Manp 2,6 di-Osubstitudas (32,6%) e 2,4,6-tri-O-substitudas (4,5%). Dados obtidos pela degradao de Smith mostraram altos teores de glicerol (87%) que so referentes aos grupos terminais no redutores de Manp e Galp, bem como unidades de Manp 2-O-, 6-O- e 2,6 di-O-substitudas. A produo de eritritol (8%) devido a unidades 4-O-substitudas enquanto que o manitol (5,0%) refere-se as unidades de Manp 2,4,6-tri-O-substitudas. Estes dados juntamente com aqueles obtidos por metilao esto de acordo na determinao da estrutura deste polissacardeo.
TABELA 13 - Anlise por metilao da galactomanana obtida de L. azureum
Acetatos de alditis parcialmente O-metilados (1) 2,3,4,6-Me4Man 2,3,4,6-Me4Gal 3,4,6-Me3Man 2,3,6-Me3Man 2,3,4-Me3Man 3,4-Me2Man 3-MeMan
mol% 29,0 17,2 3,3 6,0 7,4 32,6 4,5
Tipo de ligao (2) Manp-(10 Galp-(10 20 )-Manp-(10 40 )-Manp-(10 60 )-Manp-(10 2,60 )-Manp-(10 2,4,60 )-Manp-(10
(1) Analisado em GC-MS aps metilao, metanlise, hidrlise cida total, reduo (NaB2H4) e acetilao. (2) Baseado no derivados acetilados parcialmente O-metilados.
O espectro de RMN-13C da galactomanana (RPF-La; Figura 22) contm sinais na regio de C-1 em ) 104.7, 103.5/103.2, 100.5 e 99.6, os quais correspondem aos grupos terminais no redutores de 5 -D-Galp, ( -D-Manp-(1' 2)- ( -Manp, unidades de ( -D-Manp da cadeia principal 6-O- e 2,6-di-O-substitudas, respectivamente (GORIN; IACOMINI, 1985; PRADO et al., 1999). A configurao glicosdica ( ( e 5 ) foi determinada pelos deslocamentos de 1H (HMQC: Figura 23) e constantes de acoplamento (JC1,H1) observadas no espectro de RMN-13C acoplado (PERLIN; CASU, 1969). O terminal no redutor de Galp apresenta uma configurao do tipo 5 em virtude do sinal de H-1 em campo alto em ) 4.42 (104.7), o qual est de acordo com o valor JC-1,H-1 de 158.9 Hz. Os sinais de H-1 em campo baixo a ) 5.07 (103.5 e 103.2; JC-1,H-1 = 170.5), 5.16 (100.5) e 5.11 (99.6; JC-1,H-1 = 174.4 Hz) indica que as unidades de Manp tem uma configurao glicosdica do tipo ( , de acordo com os tpicos sinais de C-1 em campo alto no espectro de RMN-13C e os valores de JC-1,H-1 obtidos.
103.5
80.0
71.8 71.4
104.7 103.2 100.5 99.6
67.0
79.4
61.8
62.5
FIGURA 22 - Espectro de RMN-13C da galactomanana (RPF) isolada de L. azureum (em D2O, 50C).
Atravs das anlises de HMQC (Figura 23), COSY e RMN-13C-DEPT da frao RPF-La foram obtidas informaes referente aos tipos de ligaes. O sinal invertido no espectro tipo DEPT o qual aparece como um duplete no HMQC em ) 67.0 com H-6 em 4.02 e H-6 em 3.70 sugere a presena de grupos -CH2 substitudos referente as unidades de ( -Manp, de acordo com a anlise de metilao (3,4-Me2Man, 32,6%). Os C-6s no substitudos aparecem como um duplete em 62.5 (3.89; 3.79) e com sinal em 61.8/3.89 dos terminais no redutores de ( -Manp e 5 -Galp. Estes foram confirmados pela presena dos sinais de -CH2 invertidos em 62.5 e 61.8 ppm na anlise tipo DEPT. O espectro de COSY apresentou acoplamento de 5 prtons anomricos (H-1) com seus respectivos H-2. Somente o sinal de H-2 em ) 3.59 (C-2,
) 71.8) mostrou acoplamento com o sinal em ) 4.42, H-1 de unidades de 5 -Galp

(GORIN; MAZUREK, 1975). Similarmente, H-1 dos grupos terminais no redutores de ( -Manp em ) 5.07 mostrou acoplamento com H-2 em ) 4.08 (HMQC: C-2, ) 71.4). O mesmo foi observado para os acoplamentos entre o sinal de H-1 em ) 5.11 e H-2 em ) 4.04 (HMQC: C-2, ) 80.0) correspondente aos grupos terminais no redutores de Manp os quais substituem na posio O-2 as unidades de Manp da cadeia principal (1' 6) ligada.
B B B B
B
62.5/3.89 67.0/4.02
B 61.8/3.89 62.5/3.79
67.0/3.70
60
71.2/4.15 71.4/4.08
B B
71.8/3.59
70
79.4/4.15
80.0/4.04
80
90
B B
ppm
100.5/5.16
99.6/5.11
B
103.2/5.07
104.7/4.42
100 ppm
5.0
4.0
3.0
FIGURA 23 - Espectro de 1H,13C HMQC da galactomanana isolada de L. azureum (em D2O, 50C).
O sinal pouco intenso em ) 79.4 (4.15), observado no HMQC, pode ser atribudo ao C-2 das unidades de Manp substitudas por grupos terminais no redutores de 5 -Galp. Como confirmao, o sinal de H-1 de 5 -Galp em ) 4.42 observado no espectro ROESY mostrou correlao com o sinal de H-2 referente as unidades de Manp ligadas (1 ' 6) e substitudas em O-2 () 4.15A da cadeia principal. O sinal de H-1 em ) 5.16, o qual apresentou acoplamento com o sinal de H-2 em ) 4.15 () 71.2) (GORIN; MAZUREK, 1975), refere-se as unidades de Manp da cadeia principal no substitudas, estando de acordo com a presena do derivado parcialmente O-metilado 2,3,4-Me3Manp (7,4%) observado na anlise de metilao. A partir dos dados obtidos concluiu-se que a galactomanana (frao RPF-La) apresenta uma cadeia principal composta por unidades ( -D-Manp contendo ligaes glicosdicas do tipo (1' 6), as quais encontram-se quase totalmente substitudas, preferencialmente, em O-2 por terminais no redutores de ( -D-Manp e/ou 5 -D-Galp. Entretanto, galactomanana com alto nvel de substituio e elevado teor de manose foi encontrado somente para o cianolquen Collema leptosporum (PRADO et al., 1999),
sugerindo que estruturas similares podem ser tpicas de fungos liquenizados da famlia Collemataceae.
4.4 Polissacardeos de Parmotrema spp. e Rimelia spp.
Amostras de fungos liquenizados pertencentes aos gneros Parmotrema (P. austrosinense, 41 g; P. delicatulum, 32 g; P. schindlerii, 35 g; P. mantiqueirense, 43 g e P. tinctorum, 60 g) e Rimelia (R. cetrata, 31 g e R. reticulata, 26 g) foram submetidos ao processo de purificao de acordo com a Figura 24.
Lquen (Parmotrema spp. ou Rimelia spp.) Limpo, seco e deslipidificado

Deslipidificao: CHCl3:MeOH (2:1, v/v) MeOH:H2O (4:1, v/v)
Resduo I
KOH 2% sob refluxo em banho com H2O fervente, 3 h (x3)
Componentes de baixa massa molecular
Resduo II
KOH 10% sob refluxo em banho com H2O fervente, 3 h (x3)
Extrato alcalino (K2)

Gelo/Degelo
Extrato alcalino (K10)

Gelo/degelo
Resduo III
Precipitado (PK2)
Sobrenadante (SK2)
Soluo de Fehling
Sobrenadante (SK10)
Precipitado (PK10)
KOH 2% , 100C por 2 h c. actico 4%, ~80C, 30 min Centrifugao e dilise
Sobrenadante (SFK2)
Precipitado (PFK2)
Soluo de Fehling
Frao insolvel (IAA)

Gelo/Degelo
Precipitado (PFK10)
Sobrenadante (SFK10) Precipitado (PIAA)
Frao solvel (SAA)

Gelo/Degelo
Sobrenadante (SIAA)
Precipitado (PSAA)
Sobrenadante (SSAA)
FIGURA 24 - Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos de fungos liquenizados do gnero Parmotrema e Rimelia 1
Aps deslipidificao, por sucessivas extraes com CHCl3-MeOH e MeOHH2O, cada resduo foi ento extrado com soluo aquosa de KOH 2% sob refluxo em banho com H2O fervente por 3 h (3x), neutralizado com HOAc, dialisado contra gua
1
A extrao e purificao dos polissacardeos extrados com soluo aquosa KOH 10%, sob refluxo em banho com H2O fervente, foi realizada apenas para o lquen Parmotrema mantiqueirense.
corrente por 2 dias e liofilizado. Cada extrato foi ento ressuspendido em gua e submetido ao processo de purificao por congelamento e degelo, resultando na formao de um precipitado (PK2) e um sobrenadante (SK2).
4.4.1 Liquenanas e nigeranas da Frao Precipitado de Congelamento-degelo (PK2) Cada frao insolvel em gua fria (PK2) foi investigada quanto a sua composio monossacardica e respectivos rendimentos. Todas as espcies estudadas apresentaram glucose como principal componente monossacardico (~99%), indicando a presena de glucanas. Os rendimentos obtidos foram de 4-4,5% para todas as espcies estudadas. Os espectros de RMN-13C obtidos para todas as espcies (Figura 25) foram similares e apresentaram 5 sinais na regio anomrica, demonstrando uma mistura de glucanas. Com a finalidade de purificao, estas fraes foram ento submetidas a um similar tratamento alcalino (KOH 2% sob refluxo em banho com H2O fervente por 2 h), dialisadas e ento tratadas com HOAc 4% a ~80 C C por 30 min. Este processo resultou na formao de uma frao insolvel (IAA) e outra solvel (SAA). IAA e SAA foram dialisadas e ento submetidas a um novo processo de congelamento e degelo. O precipitado da frao IAA foi denominado PIAA enquanto que o da frao SAA foi PSAA (Figura 24). Atravs deste procedimento, foi possvel purificar a mistura de glucanas, onde a frao PIAA consiste de uma ( -glucana, enquanto que a frao PSAA corresponde a uma 5 -glucana. A frao PIAA obtida foi idntica para todas as espcies estudadas (representada pelo espectro de RMN-13C de R. cetrata; Figura 26), correspondendo a uma ( -D-glucana contendo, alternadamente, ligaes glicosdicas do tipo (1 ' 3)- e (1' 4), previamente encontrada em Cladonia spp. (WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a) e Cladina spp. (IACOMINI et al., 1985; NISHIKAWA et al., 1974). Espectros similares (RMN-13C) tambm foram observados para todas as fraes PSAA (Figura 27). Neste caso, o sinal anomrico em ) 103.6 corresponde s
unidades 3-O-substitudas, enquanto que queles em ) 102.7 e 102.6 referem-se s unidades de 5 -Glcp 4-O-substitudas.
60.4 80.1 80.0 79.2 76.3 99.6 87.0 90 82.6 80 70 68.4
103.5 102.6 100.5 102.5
100
FIGURA 25 - Espectros de RMN-13C da frao precipitado de congelamento e degelo (PGD) obtida de Parmotrema austrosinense (A), P. delicatulum (B), P. mantiqueirense (C), P. schindlerii (D), P .tinctorum (E), Rimelia cetrata (F) e R. reticulata (G).
100.5 99.6 82.6 79.2 60.1 60.5
60.8 60
FIGURA 26 - Espectro de RMN- 13C da frao PIAA (nigerana), em Me2SO-d6 a 50 @ C, obtida de Rimelia cetrata.
103.5 102.6 102.5
80.1 80.0
76.3
100
90
87.0
80
70
68.4
FIGURA 27 - Espectros de RMN-13C da frao PSAA (liquenanas) obtida de Parmotrema austrosinense (A), P. delicatulum (B), P. mantiqueirense (C), P. schindlerii (D), P. tinctorum (E), Rimelia cetrata (F) e R. reticulata (G).
60.8 60
60.4
A configurao glicosdica do tipo 5 - foi confirmada em virtude dos sinais de H-1 em campo alto em ) 4.38 e 4.28, referente s unidades de Glcp 3-O- e 4-Osubstitudas, respectivamente, determinadas pelas suas reas relativas. Os sinais de 13C desta 5 -glucana puderam ser assinalados com o auxlio dos espectros de laminarana e de celulose (GORIN, 1981). Os sinais em ) 80.1 e 80.0 so referentes ao C-4 das unidades de Glcp 4-O-substitudas, enquanto que aquele em ) 60.4 corresponde ao C-6 no substitudo das mesmas unidades. Os sinais em ) 87.0, 76.3, 68.4 e 60.8 correspondem ao C-3, C-5, C-4 e C-6 no substitudo das unidades 3O-substitudas, respectivamente. A configurao 5 , junto com os sinais referentes s substituies em O-3 e O-4 demonstra a presena de liquenanas em todas as espcies estudadas. Devido similaridade observada nos espectros de RMN-13C da frao PSAA ( 5 -glucana) obtida das espcies estudadas, somente aquela isolada de P. austrosinense foi submetida a anlises adicionais. A integrao das reas correspondentes ao H-1 () 4.28 e 4.38) forneceu a proporo de ligaes (1 ' 4)- (1' 3), no valor de 3.1:1. Esta relao est acordo com a proporo dos derivados parcialmente O-metilados, 2,3,6Me3Glc e 2,4,6-Me3Glc, observados na anlise de metilao. A seqncia de ligaes desta 5 -glucana puderam ser determinada pelo procedimento de degradao de Smith controlada (ABDEL-AKHER et al., 1952; HAY et al., 1965). Com a glucana isolada de P. austrosinense, este procedimento forneceu os derivados 2-O- 5 -D-glucopiranosil-D-eritritol (9,6 min) e eritritol (13,1 min), detectado por HPLC e determinados por comparao com padres (Figura 28 A, B e C, respectivamente), como descrito na seo Material e Mtodos. A ausncia de glucobiosil eritritol sugere que as unidades de Glcp 3-O-substitudas esto situadas entre aquelas 4-O-substitudas, com nenhuma ligao (1' 3)-consecutiva. De acordo com os dados obtidos, as espcies estudadas dos gneros Parmotrema e Rimelia contm ( - e 5 -glucanas, correspondentes a nigerana e liquenana, respectivamente, sendo o teor de liquenana (~4,2 g%) superior ao da nigerana (~0,4 g%).
FIGURA 28 Perfil de eluio da frao obtida aps degradao de Smith de PSAA (A) e dos padres: 2-O- D -D-glucopiranosil-D-eritritol (B) e eritritol (C), obtido por HPLC (coluna HPX-87H 300 x 780 mm - AMINEX E ion exclusion-BIO RAD).
As nigeranas, com relao molar de 1:1, so polissacardeos, amplamente conhecidos em liquens, como espcies de Cladonia (WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a), Ramalina (STUELP et al., 1999; CORDEIRO et al., 2003) entre outras. WORANOVICZ-BARREIRA et al, (1999a) sugeriu que as nigeranas podem ser
utilizadas como marcadores quimiotaxonmicos em Cladonia spp. Na famlia Parmeliaceae, elas tem sido descritas em Letharia vulpina (IACOMINI et al., 1988) e algumas espcies de Parmelia s. lat. (SHIBATA, 1973) entre outras. Liquenanas tm sido caracterizadas de diversas espcies de fungos liquenizados, porm diferentes das nigeranas, havendo uma variao na relao de ligaes (1 ' 3)-, (1' 4) dependendo do gnero e/ou espcie. Embora esta relao seja constante entre algumas espcies de Parmeliaceae, como Cetraria islandica (3:7) (MEYER; GRTLER, 1947a), C. richardsonii (3:7) (YOKOTA et al., 1979) e Usnea rubescens (3:7) (NISHIKAWA et al., 1974), em outras h diferenas, como em uma Usnea sp.(1:3) (IACOMINI et al., 1988). Espcies do gnero Parmelia s. lat. tambm so conhecidas por conterem liquenanas (SHIBATA, 1973), mas a proporo entre as ligaes no conhecida. OLAFSDOTTIR e INGLFSDOTTIR (2001) sugerem que alguns polissacardeos de fungos liquenizados apresentam importncia taxonmica com relao famlia uma vez que eles so amplamente distribudos da seguinte maneira: a pustulana caracterstica para Umbilicariaceae, a nigerana para Cladoniaceae e a liquenana para Parmeliaceae. Em Parmeliaceae, o gnero Parmotrema conhecido por ter uma liquenana tipo Cetraria (Cetraria-type) (3:7) na parede celular, enquanto que o gnero Rimelia, o qual foi segregado, contm uma liquenana tipo intermediria (intermediatetype) (COMMON, 1991; ELIX, 1994). Outra importante diferena, de acordo com os liquenologistas, em polissacardeos de Parmeliaceae refere-se as reaes com iodo. O gnero Parmotrema conhecido por apresentar colorao no talo liqunico, enquanto que o gnero segregado, Rimelia, no apresenta a mesma resposta. Estas diferenas so atribudas presena de diferentes glucanas. Os resultados obtidos mostraram que os liquens dos gneros Parmotrema e Rimelia (P. austrosinense, P. delicatulum, P. schindlerii, P. mantiqueirense, P. tinctorum, R. cetrata e R. reticulata) contm nigeranas e liquenanas as quais foram idnticas para todas as espcies. As liquenanas isoladas apresentaram uma proporo de ligao de 3.1:1, confirmada por anlise de metilao e RMN-1H. Estudo anterior com Rimelia cetrata (conhecido anteriormente como Parmotrema cetratum), mostrou
uma relao de 2:1 (CORRADI da SILVA; GORIN; IACOMINI, 1993), sendo esta diferena atribuda presena de contaminantes na amostra, uma vez que os autores citaram que o procedimento de fracionamento no foi totalmente efetivo. Os resultados obtidos junto com os dados das anlises de DNA (CRESPO; CUBERO, 1998; LOUWHOF; CRISP, 2000) devem ser considerados para reavaliar a segregao do gnero Rimelia. 4.4.2 Galactoglucomananas da Frao Precipitado de Fehling (PFK2)
Como observado na Figura 24, o sobrenadante de gelo/degelo obtido a partir da extrao com soluo aquosa de KOH 2%, para todas as espcies em estudo, foi submetido ao processo de purificao por precipitao com soluo de Fehling, resultando na formao de um precipitado (PFK2) e um sobrenadante (SFK2). Como podemos observar (Tabela 14) todas as fraes PFK2 mostraram-se similares contendo manose, galactose e glucose como componente monossacardico.
TABELA 14 - Composio monossacardica e rendimento da frao PFK2 obtida dos liquens Parmotrema spp. e Rimelia spp. Fungo liquenizado Parmotrema austrosinense P. delicatulum P. mantiqueirense P. schindlerii P. tinctorum Rimelia cetrata R. reticulata Rendimento (g%) (1) 6.7 3.8 5.6 3.2 5.4 3.4 5.2 Monossacardeos (2) Gal 44 44 43 43 42 40 40
Man 51 49 51 50 52 53 52
Glc 5 6 6 7 6 7 8
(1) Rendimento em relao ao peso seco do lquen. (2) Analisado em GC-MS aps hidrlise cida total, reduo e acetilao.
As mesmas apresentaram perfil de eluio homogneo quando analisadas por HPSEC (Figura 29), com as seguintes massas molares (dn/dc = 0,148): Parmotrema austrosinense, Mw 53,7 x 103; P. delicatulum, 68,2 x 103; P. schindlerii, 62,7 x 103; P. mantiqueirense, 64,5 x 103; P. tinctorum, 39,4 x 103; Rimelia cetrata, 38,5 x 103; R. reticulata, 59,7 x 103.
Baseado nos acetatos de alditis parcialmente O-metilados (Tabela 15), esta frao mostrou-se altamente ramificada, contendo altas propores de terminais no redutores de Galp, alm de pequenas porcentagens de Manp, Galf e Glcp. Tambm foram observados os derivados 2,3,4-Me3Man, 2,3-Me2Man, 3,4-Me2Man e 3-MeMan, correspondentes as unidades da cadeia principal. Esta constituda por unidades de ( Manp-(1' 6), substitudas em O-2, O-4 ou disubstitudas em O-2,4, alm de, unidades no substitudas. Tambm foi observado, pequenas quantidades de unidades de Manp altamente substitudas. Substituies em O-2, O-3 e O-6 e di-substituies em O-2,3, O-2,4 e O-4,6 foram observadas para as unidades de Galp. As unidades de Glcp apresentaram-se como terminais no redutores e 3-O-substitudas.
Chromatograms
0.12 0.12
PF-Pa
Chromatograms
0.16 0.16
PF-Pd
PF-Pa
IR (volts)
PF-Pd
0.12 0.12
IR (volts)
0.08 0.08
IR (volts)
0.04 0.04
IR (volts)
0.08 0.08
0.04 0.04
0.00
0.00 0.00 0.00
-0.04 -0.04 0 0
20
20
40 Volume (mL)
40
60 Volume (ml)
60
80
80
-0.04 -0.04 0 0
20
20
40 Volume (mL)
40
60 Volume (ml)
60
80
80
Chromatograms
0.20 0.20
PF-Pm
Chromatograms
0.3 0.3
PF-Ps
PF-Pm
IR (volts)
PF-Ps
0.15 0.15
IR (volts)
0.2 0.2
LS, AUX (volts)
IR (volts)
0.10 0.10
0.1 0.1
0.05 0.05
0.00 0.00
0.0 0.0
-0.05 -0.05 0 0
20
20
Volume (mL)
40
40
60 Volume (ml)
60
80
80
-0.1 -0.1 0 0
20 20
Volume (mL)
40 40
60 60
80 80
Volume (ml)
Chromatograms
0.20 0.20
PF-Pt 0.16 0.16
Chromatograms
PF-Rr
PF-Pt
0.12 0.12
PF-Rc
IR (volts)
0.15 0.15
IR (volts)
IR (volts)
IR (volts) 0.04 0.04 0.00 0.00 -0.04 -0.04 0 0
0.10 0.10
0.08 0.08
0.05
0.00 0.00
0.05
-0.05 -0.05 0 0
20
20
40 Volume (mL)
40
60 Volume (ml)
60
80
80
20
20
40 Volume (mL)
40
60 Volume (ml)
60
80
80
Chromatograms
0.25 0.25
PF-Rc
PF-Rr
0.20 0.20
IR (volts)
0.15 0.15 LS, AUX (volts)
0.10 0.10
0.05 0.05
0.00 0.00
-0.05 -0.05 0 0
20
20
40 Volume (mL)
40
60 Volume (ml)
60
80
80
FIGURA 29 Perfil de eluio, por HPSEC, das fraes precipitado de Fehling (PFK2) obtida de Parmotrema austrosinense (PF-Pa), P. delicatulum (PF-Pd), P. mantiqueirense (PFPm), P. schindlerii (PF-Ps), P. tinctorum (PF-Pt), Rimelia cetrata (PF-Rc) e R. reticulata (PF-Rr) (4).
Os picos observados aps ~65 ml so referentes aos solventes utilizados (nitrito de sdio 0,1 mol.l-1, contendo azida sdica) ou H2O MilliQ (inverso do pico).
TABELA 15 - Anlise por metilao da frao precipitado de Fehling (PFK2; galactoglucomanana) obtidas de Parmotrema spp. e Rimelia spp. Acetatos de alditis parcialmente O-metilados
(1)
mol % Pa (2) 1,1 1,6 40,0 3,3 0,4 0,4 0,2 22,0 1,1 0,2 0,6 0,5 1,9 7,2 0,2 0,4 0,4 18,1 0,4 Pd 0,9 1,4 0,6 40,3 3,6 0,3 0,1 21,4 0,5 0,2 0,2 0,5 4,4 7,8 0,2 0,1 0,1 16,4 0,2 Pm 0,9 3,1 0,5 39,6 2,5 0,4 1,7 15,7 0,7 0,3 0,3 0,9 3,8 6,1 0,1 0,2 0,8 19,3 0,7 Ps 1,3 2,4 0,7 39,7 3,8 0,3 0,3 0,4 19,7 0,8 0,5 0,4 0,4 3,6 6,6 0,3 18,4 0,4 Pt 1,3 1,7 0,2 39,2 3,2 0,5 0,9 20,9 1,2 0,3 0,4 0,7 2,4 7,4 0,4 0,4 0,3 18,3 0,3 Rc 1,0 3,8 0,3 38,4 4,1 0,2 1,3 17,9 0,6 0,3 0,1 0,3 6,2 7,6 0,3 0,2 17,1 0,3 Rr 0,9 4,1 0,7 38,1 3,9 0,5 1,7 14,1 1,1 0,2 0,3 1,0 6,5 8,7 0,4 0,3 16,8 0,7
2,3,4,6-Me4Man 2,3,4,6-Me4Glc 2,3,5,6-Me4Gal 2,3,4,6-Me4Gal 2,4,6-Me3Glc 2,4,6-Me3Man 2,4,6-Me3Gal 2,3,6-Me3Man 3,4,6-Me3Gal 2,3,4-Me3Man 2,3,4-Me3Gal 2,6-Me2Man 4,6-Me2Gal 3,6-Me2Gal 2,3-Me2Man 3,4-Me2Man 2,4-Me2Man 2,3-Me2Gal 2-MeMan 3-MeMan Man
(1) Analisado em GC-MS (coluna DB-225) aps metilao, metanlise, hidrlise cida total, reduo (NaB2H4) e acetilao. (2) As siglas so: Pa (P. austrosinense), Pd (P. delicatulum), Pm (P. mantiqueirense), Ps (P. schindlerii), Pt (P. tinctorum), Rc (R. cetrata), Rr (R. reticulata).
Os espectros de RMN-13C da frao PFK2 obtida das espcies estudadas (Figura 30) apresentaram em comum os principais sinais, porm os sinais de pequena intensidade so tpicos de cada espcie. Eles contm sinais de C-1 correspondentes a terminais no redutores de 5 -D-Galp-(1 ' 4)- ( -D-Manp () 104.6), ( -D-Galp-(1 ' 2)- ( D-Manp () 102.8) (GORIN; IACOMINI, 1984, 1985), e de unidades de ( -D-Manp da
cadeia principal 6-O- ()
101.6) e 2,6-di-O- e 2,4,6-tri-O-substitudas ()
99.8)
(GORIN; IACOMINI, 1985; GORIN, 1973). O sinal em ) 80.8 refere-se ao C-2 das unidades de Manp ligadas (1' 6) e substitudas em O-2 da cadeia principal (CORRADI da SILVA; GORIN; IACOMINI, 1993).
A
104.6 102.8 101.6 101.1 99.8 81.4 80.8 77.5 77.1 68.2 67.7 67.4 74.5
FIGURA 30 - Espectros de RMN-13C da frao precipitado de Fehling (PFK2; galactoglucomanana) obtida de Parmotrema austrosinense (A), P. delicatulum (B), P. mantiqueirense (C), P. schindlerii (D), P. tinctorum (E), Rimelia cetrata (F) e R. reticulata (G).
62.4
62.9 62.7
As configuraes glicosdicas ( ( - e 5 -) foram determinadas atravs dos valores de H-1 observados no espectro de HSQC-DEPT da galactoglucomanana isolada de P. austrosinense (Figura 33). As unidades terminais no redutores de Galp apresentaram uma configurao glicosdica do tipo 5 devido o sinal de H-1 em campo alto em ) 4.42 (C-1: ) 104.6) alm de configurao ( decorrente do sinal de H-1 em campo baixo em ) 5.17 (102.8). Os sinais de H-1 em ) 4.98 (101.6) e 5.23 (99.8) indicaram que as unidades de Manp apresentam configurao tipo ( .
B B B
62.4/3.92
B B
62.9/3.74 65 67.9/3.73 70 75
67.3/4.04 67.9/3.90
80.8/5.23
80 81.4/3.96 85 90 95
B B
99.8/5.23 102.8/5.17
B B
101.1/4.92
100
101.6/4.98
103.8/4.54 104.6/4.42
105
5.8
5.4
5.0
4.6
4.2
3.8
3.4
FIGURA 31 - Espectro de HSQC-DEPT do heteropolissacardeo isolado de Parmotrema austrosinense (em D2O a 30C).
O espectro de HSQC-DEPT apresentou sinais invertidos em ) 67.9 e ) 67.3 referentes a grupos -CH2 substitudos das unidades ( -Manp da cadeia principal, estando de acordo com os derivados, 3-MeMan e 2,3,4-Me3Man, observados na anlise de metilao. Os sinais em ) 62.4 (3.92), ) 62.7 (3.78) e ) 62.9 (3.74) correspondem aos C-6s das unidades terminais no redutoras de Galp, Glcp e Manp. De acordo com os dados apresentados, esta frao corresponde a galactoglucomanana sendo esta similar para os dois distintos gneros, Parmotrema e
Rimelia, apresentando diferenas tpicas das espcies. A mesma apresentou uma cadeia principal de unidades de ( -D-manopiranose ligadas (1' 6) sendo, na maioria, no substitudas e 2,4-di-O-substitudas por unidades de ( -Galp e 5 -Gal, respectivamente. Estes resultados esto de acordo com estudos anteriores com outras espcies destes gneros (CORRADI da SILVA; GORIN; IACOMINI, 1993; TEIXEIRA; IACOMINI; GORIN, 1995), e indicam que a caracterizao estrutural de polissacardeos til como uma ferramenta adicional na classificao de fungos liquenizados. 4.4.3 5 -Glucana (1 ' 6) da Frao Precipitado de Fehling (PFK10) de P. mantiqueirense Conforme descrito anteriormente (Figura 24), o lquen P. mantiqueirense tambm foi submetido extrao com KOH 10% sob refluxo em banho com gua fervente. Os polissacardeos obtidos foram submetidos a purificao por congelamento e degelo. A frao solvel em gua fria (SK10) obtida foi tratada com reativo de Fehling, resultando na formao de um sobrenadante (SFK10) e um precipitado (PFK10). A frao PFK10 (2,1 g%) apresentou glucose como principal componente monossacardico e um perfil de eluio homogneo, por HPSEC (Figura 32), com Mw 4,2 x 105 (dn/dc = 0,141).
0.4 IR (volts) PFK10 0.3
0.2
0.1
0.0
-0.1 0
10
20
30
40 Volume (ml)
50
FIGURA 32 Perfil de eluio, por HPSEC, da frao PFK10 (solubilizada em H2O MilliQ), obtida do lquen P. mantiqueirense.
O espectro de RMN-13C (Figura 33) contm seis sinais, idntico queles da 5 glucana (1 ' 6) (SASSAKI et al., 2002), denominada de pustulana.
76.1 75.4 73.6
103.5
70.2 69.3
FIGURA 33 - Espectro de RMN-13C da frao PFK10 em D2O (30C).
A configurao glicosdica foi confirmada em decorrncia do sinal de H-1 em campo alto em ) 4.51 (observado no espectro de RMN-1H) e um sinal de C-1 em campo baixo em ) 103.5. O sinal em ) 69.3 de C-6 refere-se ao C-6 substitudo, o qual foi confirmado pela inverso do sinal correspondente na anlise RMN-13C-DEPT. Os sinais observados em ) 73.6, 76.1, 70.2 e 75.4 correspondem ao C-2, C-3, C-4 e C-5, respectivamente. Estes dados esto de acordo com a anlise de metilao, a qual apresentou apenas os derivados 2,3,4,6-Me4Glcp (0,6%) e 2,3,4-Me3Glcp (99,4%).
De acordo com os dados apresentados, esta frao consiste em uma 5 -glucana (1' 6) linear, denominada de pustulana. Esta molcula, ao contrrio da maioria das glucanas lineares, apresenta alta solubilidade em gua.
4.5 Polissacardeos de Roccella decipiens Com a finalidade de remover os lipdeos, pigmentos e compostos hidrofbicos, o talo liqunico (13 g) foi extrado sucessivamente com CHCl3-MeOH e MeOH-H2O. O lquen deslipidificado foi ento submetido a sucessivas extraes com H2O e KOH 2% sob refluxo em banho com gua fervente (Figura 34). Aps neutralizao (HOAc) os polissacardeos extrados (fraes W e K, respectivamente) foram obtidos por precipitao com etanol. O rendimento da extrao alcalina a quente foi de 8,1 g%, enquanto que a aquosa foi de apenas 2,5 g%.
Roccella decipiens Limpo, seco e modo (13 g)

CHCl3 -MeOH (2:1,v/v) / MeOH-H2O (4:1, v/v)
Resduo I
H2O sob refluxo em banho com gua fervente por 3 h (3x)
Compostos de baixa massa molar
Resduo II
KOH 2% sob refluxo em banho com gua fervente por 3 h (3x)
Extrato aquoso (W)

Gelo-Degelo
Extrato alcalino (K)

Gelo-Degelo Centrifugao
Resduo III
Frao solvel (SW)
Frao insolvel
(IW)
Frao insolvel (IK)
Frao solvel (SK)

Tratamento com soluo de Fehling Centrifugao
Sobrenadante de Fehling (SFK)

Ultrafiltrao em membranas de limite de excluso de 10 kDa
Precipitado de Fehling (PFK)
Frao dialisada (ESF)
Frao retida (RSF)
FIGURA 34 - Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos do lquen Roccella decipiens
As fraes W e K foram ressuspendidas em gua destilada e submetidas ao fracionamento por congelamento e degelo. Este procedimento resultou em fraes insolveis (IW; 0,6 g% e IK; 1,7 g%, respectivamente) e solveis (SW; 1,7 g% e SK; 5,4 g%) em gua fria.
4.5.1 Laminaranas Presentes na Frao Insolvel em gua Fria
As fraes insolveis em gua fria (IW e IK), obtidas aps processo por congelamento e degelo, apresentaram altos teores de glucose (Tabela 16).
TABELA 16 - Composio monossacardica das fraes obtidas do lquen Roccella decipiens Fraes IW IK PFK HPF SmPF ESF RSF HPRSF SmRSF Monossacardeo (mol %) (1) Manose Galactose Glucose 8,2 6,3 85,5 1,4 1,0 97,6 80,6 19,1 0,3 95,5 3,4 1,1 100 46,2 53,3 0,5 43,1 55,7 1,2 97,6 2,1 0,3 100 -
(1) Analisado em GC-MS aps hidrlise cida total, reduo e acetilao.
Os espectros de RMN-13C destas fraes (IW e IK; Figura 35) foram similares, apresentando seis sinais intensos que correspondem queles de laminaranas. Dados similares foram obtidos para o gnero Cladina (item 4.1).
103.1
110
100
90
86.3
80
70
68.5
76.5
73.0
FIGURA 35 - Espectros de RMN-13C da frao IW (A) e IK (B) (laminaranas), em Me2SO-d6 a 70@ C, obtida do lquen Roccella decipiens.
4.5.2
Caracterizao Estrutural das Galactofuranomananas Presentes na Frao Solvel em gua Fria As fraes solveis em gua fria (SW e SK), obtidas aps processo por
congelamento e degelo da extrao alcalina (aquoso e alcalino) foram similares quanto composio monossacardica. Porm, devido ao maior rendimento apresentado pela frao SK, esta foi submetida aos processos de caracterizao estrutural, descritos a seguir. A frao SK foi tratada com soluo de Fehling, originando um precipitado (PFK, 3,4 g%) e um sobrenadante (SFK, 2,0 g%).
61.0 60
A frao PFK mostrou ser composta por manose e galactose (Tabela 16) e forneceu um nico pico (Figura 36A) quando analisado por HPSEC, apresentando Mw 20,5 x 104 (dn/dc 0,114). Enquanto que, a frao SFK apresentou perfil de eluio heterogneo (Figura 36B), sendo purificada por ultrafiltrao (membranas com limite de excluso de 10 kDa), resultando em uma frao retida (RSF; Figura 36C) e outra dialisada (ESF; Figura 36D).
Chromatograms 0.12 0.12 PFK Chromatograms
IR (volts)
IR (volts)
A
0.08 0.08
IR
0.10 0.10
SFK
0.08 0.08
IR
0.06 0.06 IR (volts)
IR (volts)
0.04
0.04
0.04 0.04
0.02 0.02 0.00 0.00 0.00 0.00
-0.04 -0.04 0 0
10
10
20
20
Volume (ml)
30
30
40
40
50
50
-0.02 -0.02 0 0
10
10
20
20
30 Volume (ml)
30
40
40
50
50
Volume (ml)
Chromatograms 0.12 0.12 RSF
Volume (ml)
IR (volts)
IR (volts)
C
0.08
0.08 0.04 0.04
IR
0.4 0.3 0.2 0.1
IR
IR (volts)
0.00 0.00
0.0 -0.04 -0.04

0
20
20
40
Volume (ml)
40
60
60
80
80
-0.1 0
10
20
30
40
50
Volume (ml)
Volume (ml)
FIGURA 36 Perfil de eluio das fraes PFK (A), SFK (B) (solubilizadas em H2O MilliQ), RSF (C) e ESF (D) (solubilizadas em nitrito de sdio 0,1 mol.l-1, contendo azida sdica) obtidas do lquen R. decipiens, em HPSEC 5.
As composies monossacardicas (Tabela 16) e os espectros de RMN-13C das fraes RSF e ESF (Figura 37A e 37B, respectivamente) foram similares, sugerindo que elas podem apresentar o mesmo polissacardeo, mas com diferentes massas molares (ESF, Mw 27,8 x 103; RSF, Mw 46,4 x 103; dn/dc 0,132). De acordo com PEREYRA et al. (2003) as diferenas das massas molares so justificadas como um resultado das diferentes condies ambientais, as quais os talos liqunicos esto
5
Os picos observados aps ~40 ml (A, B e D) 60 ml (C) so referentes aos solventes utilizados (nitrito de sdio 0,1 mol.l-1, contendo azida sdica) ou H2O MilliQ (inverso do pico).
expostos durante o seu perodo de vida, que promovem uma parcial degradao de seus componentes.
63.8 62.1 62.1 61.8 62.1 102.2 101.3 100.2 99.6 101.5 71.9 71.4 73.8 78.6 77.9 77.4 75.4 75.0 73.9 73.3 71.8 71.4 71.0 67.8 67.6 61.8
A
108.8 108.0 107.9 82.3 82.0 77.8 77.5 77.4 73.7 76.5 73.1 71.9 71.5 70.8 67.8
109.0
102.3 101.3
107.3
99.5
100
FIGURA 37 - Espectros de RMN-13C das fraes RSF (A), ESF (B), HRSF (C) (amostras solubilizadas em D2O, 30 @ C) e SmRSF (D) (em Me2SO-d6, 50 @ C).
88.9
84.2 84.0 83.6
Anlise de metilao da frao PFK sugere a presena de uma estrutura altamente ramificada. Unidades de Galf foram detectadas principalmente como terminais no redutores e, em menores propores, como unidades 2-O-, 5-O-, 6-O- e 5,6-di-O- substitudas. Terminais no redutores de Manp, e unidades de Manp 2-O-, 4O, 6-O- e 2,4-di-O-substitudas tambm foram observadas (Tabela 17).
TABELA 17 - Anlise por metilao das fraes obtidas de Roccella decipiens Acetatos de alditis parcialmente O-metilados (1) 2,3,5,6-Me4Gal 3,5,6-Me3Gal 2,3,6-Me3Gal 2,3,5-Me3Gal 2,3-Me2Gal 2-MeGal 2,3,4,6-Me4Man 3,4,6-Me3Man 2,3,6-Me3Man 2,3,4-Me3Man 4,6-Me2Man 2,6-Me2Man 3,6-Me2Man 2,3-Me2Man 3,4-Me2Man 3-MeMan Fraes (mol%) Tipo de ligao(2) SmPF RSF HRSF SmRSF 18,6 0,8 Galf-(1F 0,3 F 2)-Galf-(1F 23,6 F 5)-Galf-(1F 7,8 F 6)-Galf-(1F 11,0 F 5,6)-Galf-(1F 0,4 F 3,5,6)-Galf-(1F 2,1 7,7 35,2 8,0 Manp-(1 F 5,3 15,5 F 2)-Manp-(1F 96,0 1,8 13,5 92,0 F 4)-Manp-(1F 5,5 2,8 F 6)-Manp-(1F F 2,3)-Manp-(1F 0,2 F 3,4)-Manp-(1F 1,9 16,4 30,7 F 2,4)-Manp-(1F 0,2 F 4,6)-Manp-(1F 0,8 1,1 F 2,6)-Manp-(1F 0,4 0,4 F 2,4,6)-Manp-(1F
PFK 13,7 0,5 0,9 0,7 0,8 16,1 11,0 7,8 12,2 0,3 33,7 0,3 1,3 0,7
HPF 1,8 29,1 11,2 17,7 2,7 37,5 -
(1) Analisado em GC-MS (DB 225) aps metilao, metanlise, hidrlise cida total, reduo (NaB2H4) e acetilao. (2) Baseado no derivados acetilados parcialmente O-metilados. O espectro de RMN-13C da frao PF contm inmeros sinais na regio anomrica, consistente com uma estrutura complexa (Figura 38A).
84.1 82.0
76.4 73.2 73.1 73.8
109.1
101.3 100.2 99.6
107.3 106.8 102.2
80.3 78.7
88.9
68.3
71.0 67.8 67.4 70 62.1 60 61.7 62.1
B
101.3 100.3 99.5
C
101.5 71.9 71.4
ppm
100
90
80
60
FIGURA 38- Espectros de RMN-13C das fraes PFK (A) HPF (B) (em D2O, 30G C) e SmPF (B) (em Me2SO-d6, 50G C).
Os sinais de C-1 das unidades de H -Galf (JC-1,H-1 = 175,5 Hz) em I 109.1 refere-se as unidades terminais no redutores (PERLIN; CASU, 1969; GORIN; MAZUREK, 1975), e os sinais, de menores intensidades, em I 108.0-106.8
correspondem as unidades substitudas em O-2, O-5, O-6 e O-5,6, estando de acordo com os dados obtidos pela anlise de metilao (Tabela 17). Os sinais em I 84.1, I 82.0, I 77.9 e 63.8 e 63.6 correspondem, respectivamente, ao C-4, C-2, C-3 e C-6 das unidades terminais no redutores de H -Galf (GORIN; MAZUREK, 1975).
73.8
78.5 78.0 75.2 77.4 75.0 73.8 73.2 71.8 71.0 71.3 67.8 67.4 63.8
102.4
72.0 71.4 71.7
77.9
63.6 62.1
63.8
Os sinais de C-1 em I 99.6 a I 102.2 so referentes aos carbonos anomricos das unidades de Manp, sendo o sinal em I 102.2 referente s unidades terminais no redutoras, e aqueles em I 101.3, 100.3, 100.2 e 99.6 correspondem s unidades 2-O-, 6-O-, 4-O- e 2,4-di-O-substitudas (GORIN et al., 1977; GORIN et al., 1993). Estas unidades apresentaram uma configurao glicosdica do tipo P 1969). Os sinais de 13C em I 68.3, 63.8 e 62.1/61.8, correspondem, respectivamente, ao C-6 substitudo das unidades de Manp-(1 Q 6) ligadas, C-6 no substitudo das unidades de H -Galf, e grupos -CH2 no substitudo das unidades de Manp terminais no redutores, 2-O-, 4-O- e 2,4-di-O-substitudas. Estes assinalamentos foram confirmados pela inverso dos referidos sinais no experimento HSQC-DEPT. Anlise de metilao da frao RSF (Tabela 17), quando comparado com a frao PF, apresentou altos teores de unidades terminais no redutoras e 5-O-, 6-O- e 5,6-di-O-substitudas de Galf. Entretanto, os derivados parcialmente O-metilados de Manp foram os mesmos, porm em menores quantidades. O espectro de RMN-13C (Figura 39A) apresentou, na regio anomrica, intensos sinais de H -Galf em I 109.0 e 108.8 [ H -Galf-(1 Q ], I 108.0 [Q 107.3 [Q 5,6)- H -Galf-(1Q ], I 107.9 [Q 5)- H -Galf-(1Q ] e I 6)- H -Galf-(1Q ] (LEAL et al., 1993; NAGAOKA et al., 1996). Os sinais de em decorrncia do
valor da constante de acoplamento de C-1/H-1 (JC-1,H-1 = 172.7 Hz) (PERLIN; CASU,
menor intensidade em I 102.3, I 101.3, I 100.2 e I 99.5 so referentes a unidades de Manp. Com a finalidade de remover as unidades de Galf destas fraes (PF e RSF), as mesmas foram submetidas hidrlise cida parcial. Os produtos resistentes obtidos foram denominados de HPF e HRSF, respectivamente. Como pode ser observado (Tabela 17, Figura 37B e 38B), este procedimento eliminou seletivamente estas unidades, restando apenas o core deste polmero, o qual composto, principalmente, por manose (Tabela 16). Anlise de metilao das fraes HPF e HRSF (Tabela 17) mostrou apenas o derivado 2,3,5,6-Me4Gal em pequenas quantidades, indicando que a hidrlise cida
parcial foi eficiente na remoo das unidades de Galf. Tanto a frao HPF quanto a HRSF, apresentaram similares teores de unidades de Manp terminais no redutoras, 2O-, 4-O- e 2,4-di-O-substitudas. O aumento da proporo das unidades terminais no redutoras de Manp e o decrscimo das unidades de Manp 6-O-substitudas obtidos aps hidrlise parcial sugerem que as unidades de Galf, as quais foram removidas, esto ligadas quelas Manp (provavelmente, ligadas em O-6) das cadeias laterais, e no da cadeia principal. Estes dados foram observados para as duas fraes. Os sinais observados na regio anomrica do espectro de RMN-13C das fraes HRSF e HPF (Figura 37B e 38B, respectivamente) esto de acordo com os dados de metilao, apresentando apenas os sinais de C-1 em I 99.5-102.4 referentes s unidades de Manp. A estrutura da cadeia principal destas fraes foi determinada atravs de uma degradao controlada de Smith, resultando nas fraes SmPF e SmRSF, que so compostas somente por manose (Tabela 16). Anlise de metilao indicou a presena de uma manana linear contendo ligaes do tipo (1 Q 4) (Tabela 17), estando de acordo com seu espectro de RMN-13C (Figura 37C e 38C), com sinais em I 101.5 (C-1), I 73.8 (C-4 e C5), I 71.9 (C-3), I 71.4 (C-2) e I 62.1 (C-6) (GORIN; MAZUREK, 1975). De acordo com os dados obtidos, a frao PF consiste em uma galactomanana altamente ramificada com uma cadeia principal composta por unidades de P -Manp (1Q 4) ligadas, parcialmente substituda em O-2 por cadeias laterais de unidades de P Manp (1Q 2) e (1 Q 6)-ligadas. As unidades de Galf esto ligadas nas extremidades das unidades (provavelmente em O-6) de Manp das cadeias laterais. A estrutura da RSF basicamente a mesma, mas com uma maior proporo de unidades de Galf, principalmente, como 5-O-, 6-O- e 5,6-di-O-substitudas. At a presente data, no foi observado similaridade com outros heteropolissacardeos previamente isolados de liquens, os quais usualmente apresentam cadeia principal de unidades de P -manopiranose contendo ligaes do tipo (1Q 6), substitudas principalmente em O-2, O-4 ou O-2,4 por unidades de P - ou H Galp, P -Manp ou Glcp e, mais raramente, por H -Galf (GORIN; BARON; IACOMINI,
1988; GORIN et al., 1993; OLAFSDOTTIR; INGLFSDOTTIR, 2001; GORIN; IACOMINI, 1985), Heteropolissacardeos contendo manose tm sido isolado de algumas espcies de liquens, principalmente das famlias Cladoniaceae, Parmeliaceae, Umbilicariaceae, Ramalinaceae e Stereocaulaceae (GORIN et al., 1993; OLAFSDOTTIR;
INGLFSDOTTIR, 2001; CORDEIRO et al., 2003), os quais esto associados com uma alga trebouxioide como fotobionte primrio (TSCHERMAK-WOESS, 1988; FRIEDL; BDEL, 1996). De outro lado, R. decipiens, contm galactomananas com estruturas novas, e est liquenizado com um fotobionte do gnero Trentepohlia (uma alga verde filamentosa).
4.6
H -Glucana (1 Q 6)-ligada, H -glucana (1 Q 3)-ligada e galactofuranomanana de

Umbilicaria mammulata
O fungo liquenizado Umbilicaria mammullata (100 g) foi submetido, sucessivamente, extraes aquosas e alcalinas (KOH 2%), como descrito na Figura 39. Alm destas, foi realizado uma extrao com Me2SO (temperatura ambiente por 48 h) utilizando apenas uma alquota (7 g) do lquen modo. Este procedimento foi realizado, uma vez que, sabe-se que este gnero pode apresentar molculas parcialmente O-acetiladas e que extraes aquosas a quente e alcalinas podem promover a migrao ou remoo destes grupos, respectivamente (REICHER; CORRA; GORIN, 1984).
Resduo Umbilicaria mammulata Limpo, seco e modo (100 g)
Me2SO a 25C por 48 h (7 g)
Extrato - Me2SO
EtOH (3:1; v/v) Dilise Gelo-Degelo Centrifugao
H2O sob refluxo em banho com gua fervente por 3 h (3x)
Resduo I
KOH 2% sob refluxo em banho com gua fervente por
Extrato aquoso
Precipitado Sobrenadante (SM) (PM)
Resduo II
Extrato alcalino
Sobrenadante (SW)
Precipitado (PW)
Precipitado (PK)
Soluo de Fehling Centrifugao
Sobrenadante (SK)
Soluo de Fehling Centrifugao
Sobrenadante Fehling Precipitado Fehling Precipitado Fehling (PF-SK) (SF-PK) (PF-PK)
Sobrenadante Fehling (SF-SK)
Ultrafiltrao em membrana com cut off 10 kDa
Frao retida (DrSF)

Ultrafiltrao em membrana com cut off 300 kDa
Frao dialisada (DeSF)
Frao dialisada (TZeFS)
Frao retida (TZrFS)
FIGURA 39 - Fluxograma de extrao e purificao dos polissacardeos do lquen Umbilicaria mammulata
Os polissacardeos obtidos, por extraes aquosas e com Me2SO seguido por precipitao com etanol, contm os mesmos polmeros sendo compostos,
principalmente, por glucose (~97%). Aps processo de congelamento e degelo, as fraes insolveis obtidas (PW e PM, para as extraes aquosas e Me2SO, respectivamente) apresentaram alto rendimento (19,6 g%) correspondendo a uma H glucana (1 Q 6) parcialmente O-acetilada. O espectro de RMN-13C (Figura 40) da frao PM apresentou seis sinais principais correspondentes queles da H -glucana (1Q 6): I 103.1 (C-1), 76.4 (C-3), 75.4 (C-5), 73.3 (C-2), 69.9 (C-4) e 68.4 (C-6) Sinais em I 77.7 e 71.2 correspondem aos carbonos substitudos por grupos acetil, e os sinais em I 20.8 e 175.0 correspondem ao -CH3 e -C=O destes grupos,
respectivamente (BARON, 1989).
75.4 73.3 69.9
103.1
76.4
FIGURA 40 - Espectro de RMN-13C da frao PM (pustulana parcialmente O-acetilada), em Me2SOd6 (70 G C), obtida do lquen Umbilicaria mammulata..
O extrato alcalino tambm foi submetido ao processo de purificao por congelamento e degelo. O precipitado obtido (PK, 7,9 g%) foi submetido precipitao com soluo de Fehling, resultando em um sobrenadante (SF-PK, 0,5 g%) e um precipitado (PF-PK, 7,1 g%). Tanto a frao solvel quanto a insolvel correspondem a glucanas. A frao PF-PK apresentou a mesma pustulana a qual foi isolada a partir de extraes aquosas e com Me2SO, exceto pela ausncia dos grupos O-acetil os quais foram removidos pelo tratamento alcalino. A frao SF-PK apresentou um espectro de RMN-13C (Figura 41) idntico queles, referentes a H glucana (1 Q 3)-ligada (laminarana), obtidos para os liquens Cladina spp., Leptogium
77.7
68.4
20.8
spp. e Roccella decipiens. Os sinais observados no espectro de RMN-13C foram: I 102.8 (C-1), 86.0 (C-3), 76.2 (C-5), 72.7 (C-2), 68.3 (C-4) e 60.7 (C-6) (CARBONERO et al., 2001).
76.2
102.8
86.0
72.7
FIGURA 41 - Espectro de RMN-13C da frao SF-SK (laminarana), em Me2SO-d6 (50 G C), obtida do lquen Umbilicaria mammulata.
Glucanas so polissacardeos amplamente conhecidos e foram encontradas em todas as espcies de liquens estudados. As H -glucana (1Q 6)-ligada (pustulana) parcialmente O-acetiladas so polissacardeos tpicos de Umbilicariaceae, sendo descrita para diversas espcies de liquens do gnero Umbilicaria, como U. pustulata, U. hirsuta (DRAKE, 1943), U. angulata, U. caroliniana e U. polyphylla (NISHIKAWA et al., 1970), bem como Lasallia pustulata (PEREYRA et al., 2003) e Actinogyra muehlenbergii (BARON, 1989). Glucanas do tipo laminarana so comumente encontradas em liquens pertencentes a diferentes famlias
(OLAFSDOTTIR; INGLFSDOTTIR, 2001), fungos de vida livre (BARRETOBERGTER; GORIN, 1983) e algas (PAINTER, 1983). A frao solvel (SK) em gua fria tambm foi analisada. Esta foi submetida precipitao com o reativo de Fehling, apresentando uma frao sobrenadante (SFSK, 4,6 g%) e uma precipitado (PF-SK, 0,8 g%). A principal frao foi a SF-SK a qual apresentou-se heterognea (Figura 42A), sendo purificada por ultrafiltrao em membranas com limite de excluso 10 e 300 kDa, respectivamente (Figura 39). A frao TZeSF (3,1 g%) mostrou um perfil de eluio homogneo quando analisado por HPSEC-MALLS (Figura 42B), apresentando uma Mw 48 x 103 (dn/dc = 0,133) e
68.3
60.7
manose (65,2%), galactose (33,3%) e glucose (1,5%) como componentes monossacardicos.
FIGURA 42 Perfil de eluio das fraes SF-SK (A) e TZeSF (B) (solubilizadas em nitrito de sdio
Chromatograms 0.20 0.20 SF-SK IR 0.3 0.3 Chromatograms TZeSF
IR (volts)
0.15 0.10
0.05 0.05 0.10
0.15
IR (volts)
B
0.2 0.2 LS, AUX (volts) 0.1 0.1
LS IR
IR (volts)
0.00 0.00
0.0 0.0
-0.05 -0.05 0 0
-0.1 -0.1
20 20 40 Volume (ml)
40
60 60
80 80
20
20
40 Volume (ml)
40
60
60
80
80
Volume (ml)
-1
Volume (ml)
0,1 mol.l , contendo azida sdica) obtidas do lquen Umbilicaria mammulata, em cromatografia de excluso estrica, acoplada a multideteco espalhamento de luz (LS) e ndice de refrao (IR) (HPSEC-MALLS).
Baseado nos derivados parcialmente O-metilados obtidos por anlise de metilao (Tabela 18), esta frao consiste em uma estrutura altamente ramificada, sendo observado altos teores de unidades terminais no redutoras de Manp (14,5%) e Galf (23,8%). Todas as unidades de galactose foram encontradas na forma furanosdica, sendo em sua maioria terminais no redutores (23,8%) e unidades 2-O(2,3%) e 5-O- (1,4%) substitudas. A cadeia principal constituda por unidades de P Manp (1Q 6) ligadas, as quais so no substitudas (4,1%) ou 3-O- (4,0%), 4-O(8,3%), 2-O-(11,8%), 2,4-di-O- (14,1%) e 2,3-di-O-substitudas (3,5%). O espectro de RMN-13C deste heteropolissacardeo (Figura 43A) apresentou inmeros sinais na regio anomrica, reforando os dados de metilao. Os sinais de C-1 em campo baixo em I 108.8 a 105.2 referem-se a unidades de H -Galf, sendo o sinal intenso em I 108.8 referentes s unidades terminais no redutoras de Galf, enquanto que os outros correspondem s unidades de Galf substitudas (LEAL et al., 1993; NAGAOKA et al., 1996). Tambm foram observados sinais na regio anomrica de unidades de P -Manp, os quais correspondendo a unidades terminais no redutoras (I 103.3) e 2-O-substitudas das cadeias laterais (I 101.6). Alm de unidades
de P -Manp (1 Q 6) ligadas da cadeia principal no substitudas (I 100.1), ou di- ou triO-substitudas (I 99.2) (GORIN et al., 1993).
TABELA 18 - Anlise por metilao das fraes TzeSF e HP10 obtidas de Umbilicaria mammulata Acetatos de alditis parcialmente O-metilados (1) 2,3,4,6-Me4Man 2,3,4,6-Me4Glc 2,3,5,6-Me4Gal 3,4,6-Me3Man 3,5,6-Me3Gal 2,3,6-Me3Man 2,3,6-Me3Gal 2,3,4-Me3Man 2,3,6-Me3Glc 2,3,5-Me3Gal 4,6-Me2Man 3,6-Me2Man 2,3-Me2Man 3,4-Me2Man 2,4-Me2Man 2,3-Me2Gal 2-MeMan 2-MeGal 3-MeMan 4-MeMan mol% TZeSF 14,5 23,8 6,4 2,3 0,4 1,4 4,1 1,6 4,0 0,2 8,3 11,8 0,6 0,7 1,0 0,3 14,1 3,5 HP10 15,5 0,2 2,8 38,5 1,6 22,6 0,7 0,6 0,4 0,7 14,1 0,5 0,6 0,4
Tipo de ligao(2) Manp-(1F Glcp-(1 F Galf-(1F F 2)-Manp-(1F F 2)-Galf-(1F F 4)-Manp-(1F F 5)-Galf-(1F F 6)-Manp-(1F F 4)-Glcp-(1F F 6)-Galf-(1F F 2,3)-Manp-(1F F 2,4)-Manp-(1F F 4,6)-Manp-(1F F 2,6)-Manp-(1F F 3,6)-Manp-(1F F 5,6)-Galf-(1F F 3,4,6)-Manp-(1F F 3,5,6)-Galf-(1F F 2,4,6)-Manp-(1F F 2,3,6)-Manp-(1F
(1) Analisado em GC-MS (DB 225) aps metilao, metanlise, hidrlise cida total, reduo (NaB2H4) e acetilao. (2) Baseado nos derivados acetilados parcialmente O-metilados.
71.6 71.1
63.8 74.3 108.8 103.3 103.1 101.6 100.1 99.2 84.3 83.9 82.0 77.9 75.7 77.3 71.9 84.9 79.6 106.8 106.1 105.2
110
100
90
80
79.4
70
66.7
67.5
67.8
62.1
60
B
74.3
71.1
71.5
101.6 100.5 99.2
79.8 79.6 79.1
72.1
104.0
76.7 76.0
110
100
90
84.1
80
70
63.8
66.9 66.2
73.8
70.6 68.1 67.8 67.6
103.2
62.1
60
FIGURA 43 - Espectros de RMN-13C das fraes TZeSF (A) e HP10 (B), em D2O (30 G C), obtidas do lquen Umbilicaria mammulata.
Com o objetivo de elucidar este complexo polmero, esta frao foi submetida a uma hidrlise cida parcial (TFA pH 2,0 sob refluxo em banho com H2O fervente por 10 h). A frao resistente a este procedimento (HP10) apresentou manose (93,6%), galactose (3,2%) e glucose (3,2%), quando analisado por GC-MS. O espectro de RMN-13C de HP10 (Figura 43B) mostrou uma eliminao dos sinais referentes as unidades de Galf, e uma melhor definio dos sinais de P -Manp. Os sinais de 13C em I 66.9 a 62.1 aos grupos CH2. Os sinais em I 66.2, 67.7 e 66.9 referem-se aos C-6s substitudos das unidades de P -Manp da cadeia principal e o sinal em I 62.1 corresponde ao C-6 dos terminais no redutores e das unidades de
Manp 2-O-substitudas. Estes assinalamentos foram confirmados pela inverso dos mesmos na anlise de RMN-13C-DEPT. Os resultados de metilao obtidos concordaram com as anlises espectroscpicas, sendo possvel observar um decrscimo significante do derivado 2,3,5,6-Me4Gal. O teor do derivado parcialmente O-metilado 2,3,4,6-Me4Man foi mantido aps hidrlise cida parcial, sugerindo que as unidades de Galf no esto ligadas s unidades de Manp das cadeias laterais, e sim da cadeia principal. Em adio, um aumento de 2,3,4-Me3Man junto com um decrscimo de 2,3-Me3Man refora a idia de que as unidades de galactose podem estar substituindo as unidades de Manp em O-4.
A partir deste estudo foi possvel isolar e caracterizar duas glucanas tpicas encontradas em liquens. A pustulana foi encontrada em maior proporo, quando comparada aos outros polissacardeos isolados, uma vez que esta um polmero tpico de Umbilicariaceae. Tambm foi obtido uma galactofuranomanana a partir do extrato alcalino, sendo similar quelas encontradas nas espcies pertencentes famlia Umbilicariaceae, como U. pustulata, U. spodochroa (KJLBERG; KVERNHEIM, 1989), Lasallia pustulata (PEREYRA et.al., 2003).
5 CONSIDERAES FINAIS A partir das 15 espcies de fungos liquenizados estudados foram isolados e caracterizados vrios polissacardeos, como glucanas, xilanas, mananas,
galactomananas, galactofuranomananas, galactoglucomananas, galactomanoglucanas e um heteropolissacardeo cido. Para um melhor entendimento os resultados obtidos encontram-se agrupados na Tabela 19.
TABELA 19 Polissacardeos obtidos nas espcies de fungos liquenizados estudados
Famlia Gnero/espcie Cladoniaceae Cladina arbuscula C. confusa C. substenius Collemataceae Leptogium azureum Leptogium sp. Dictyonemataceae D. glabratum Fotobionte Homopolmeros Heteropolissacardeos 57:43:03 (1,2) / 41: 47:12 (1,3) 63:32:05 (1,2) / 40: 49:11 (1,3) 55:41:04 (1,2) / 47: 40:13 (1,3) 83:17:00 (1,4) Heteropolissacardeo cido (5) Heteropolissacardeo cido (5)
Asterochloris
Laminarana Nigerana (1:1) Laminarana Nigerana (1:1) Laminarana Nigerana (1:1) Laminarana Laminarana
Nostoc
Scytonema
Pseudonigerana U -D-xilana (1V 4) U -D-manana (1V 6) Nigerana (1:1) Liquenana (1: 3.1) Nigerana (1:1) Liquenana (1: 3.1) Nigerana (1:1) Liquenana (1: 3.1) Nigerana (1:1) Liquenana (1: 3.1) Nigerana (1:1) Liquenana (1: 3.1) Nigerana (1:1) Liquenana (1: 3.1) Nigerana (1:1) Liquenana (1: 3.1) Laminarana Laminarana Pustulana 51:44:05 (1,2) 49:44:06 (1,2) 51:43:06 (1,2) 50:43:07 (1,2) 52:42:06 (1,2) 53:40:07 (1,2) 52:40:08 (1,2) 81:19:00 (1,6)/ 43:56:01 (1,6) 65:33:02 (1,7)
Parmeliaceae Parmotrema austrosinense P. delicatulum P. mantiqueirense P. schinderii P. tinctorum Rimelia cetrata R. reticulata Roccellaceae Roccella decipiens Umbilicariaceae Umbilicaria mammulata
Trebouxia
Trentepohlia Trebouxia
(1) Proporo molar de Man:Gal:Glc; (2) Galactoglucomanana [Cadeia principal formada por unidades de -D-Manp (1 6)]; (3) Galactomanoglucana [Cadeia principal formada por unidades de -D-Glcp (1 3)]; (4) Galactomanana altamente substituda [Cadeia principal formada por unidades de -D-Manp (1 6)]; (5) Heteropolissacardeo composto por Xyl:Man:Gal: 3-O-MeGalp:Glc e um composto cido no identificado; (6) Galactofuranomanana [Cadeia principal formada por unidades de -D-Manp (1 4)]; (7) Galactofuranomanana [Cadeia principal formada por unidades de -D-Manp (1 6)];
R R
S S
Analisando o gnero Cladina, o qual foi segregado de Cladonia, apresentou nigeranas, laminaranas, galactomananoglucanas e galactoglucomananas, sendo similares queles obtidos para as diversas espcies do gnero Cladonia (WORANOVICZ et al., 1997; WORANOVICZ-BARREIRA et al., 1999a,b,c,d). Estes resultados, juntamente com os dados obtidos pelas anlises de DNA (AHTI; DEPRIEST, 2001), sugerem que estes gneros devero ser reagrupados. Os gneros Parmotrema e Rimelia, os quais foram segregados anteriormente, apresentaram liquenanas, nigeranas e galactoglucomananas. Para as espcies estudadas, as glucanas apresentaram-se idnticas, enquanto que as
galactoglucomananas apresentaram-se similares com diferenas tpicas entre espcies. Portanto, a caracterizao qumica dos polissacardeos dos gneros Parmotrema e Rimelia, associada aos dados das anlises de DNA (CRESPO; CUBERO, 1998), sugerem uma reconsiderao da segregao do gnero Rimelia. Somente para P. mantiqueirense foi realizada uma extrao com KOH 10% a quente, obtendo-se uma
H -glucana (1 Q 6) linear, denominada de pustulana, o que poder ser investigado nas

outras espcies. Com relao ao fungo liquenizado Roccella decipiens, o qual est associado a alga do gnero Trentepohlia, foi obtido uma laminarana e duas galactofuranomananas. At a presente data, no foi observado similaridade com outros heteropolissacardeos previamente isolados de liquens.
O gnero Leptogium (fotobionte do gnero Nostoc) contm laminaranas e um polissacardeo no usual, contendo grupamentos cidos e o derivado 3-O-Me-Galp, no observados anteriormente em liquens. Foi caracterizado a partir de Leptogium azureum uma galactomanana altamente substituda em O-2 por terminais no redutores de P -D-Manp e/ou H -D-Galp. As unidades de H -D-Galp substituem as unidades de P D-Manp da cadeia principal em O-2 e no em O-4, como geralmente observado. No basidiolquen D. glabratum, o qual encontra-se associado a alga Scytonema sp., foi observado uma
H -D-xilana linear ligada (1Q 4), uma
pseudonigerana e uma H -D-manana contendo ligaes do tipo (1Q 6), sendo os ltimos no observados anteriormente nestes organismos. O gnero Leptogium (fotobionte do gnero Nostoc) contm laminaranas e um polissacardeo no usual, contendo grupamentos cidos e o derivado 3-O-Me-Galp, no observados anteriormente em liquens. Foi caracterizado a partir de Leptogium azureum uma galactomanana altamente substituda em O-2 por terminais no redutores de P -D-Manp e/ou H -D-Galp. As unidades de H -D-Galp substituem as unidades de P D-Manp da cadeia principal em O-2 e no em O-4, como geralmente observado. No basidiolquen D. glabratum, o qual encontra-se associado a alga Scytonema sp., foi observado uma
H -D-xilana linear ligada (1Q 4), uma
pseudonigerana e uma H -D-manana contendo ligaes do tipo (1Q 6), sendo os ltimos no observados anteriormente nestes organismos. Polissacardeos tpicos da famlia Umbilicariaceae foram caracterizados no lquen Umbilicaria mammulata (Trebouxia sp.), sendo estes uma laminarana, uma pustulana (parcialmente O-acetilada) e uma galactofuranomanana. Avaliando os resultados obtidos, verifica-se um padro caracterstico de distribuio dos polissacardeos dentro de famlia e/ou gneros. Desta forma, os dados reforam a utilizao de polissacardeos como uma ferramenta adicional para a quimiotaxnomia. Neste trabalho foram observadas diferenas estruturais significativas em polissacardeos de fungos liquenizados associados a fotobiontes pouco explorados do ponto de vista cientfico (Scytonema, Trentepohlia e Nostoc), quando comparadas quelas mais comuns (Trebouxia e Asterochloris). A influncia do fotobionte sobre os polissacardeos presentes nos talos liqunicos ainda no conhecida. Portanto, estudos adicionais com fungos liquenizados contendo fotobiontes no usuais devero ser realizados com a finalidade de um melhor entendimento da associao micobiontefotobionte na determinao estrutural dos polissacardeos.
REFERNCIAS
ABDEL-AKHER, M.; HAMILTON, J. K.; MONTGOMERY, R.; SMITH, F. A new procedure for the determination of the fine structure of polysaccharides. J. Amer. Chem. Soc., v. 74, p. 4970-4971, 1952. ADAM, W. W.; DEMIMING-ADAMS, B.; LANGE, O. L. Carotenoid composition and metabolism in green and blue-green algal lichens in the field. Oecologia, v. 94, n. 4, p. 576-584, 1993. AGHORAMURTH, K.; SARMA, K. G.; SESHADRI, T. R. Chemical investigation of Indian lichens. J. Sci. Ind. Res., v. 20, p. 166-168, 1961. AHMADJIAN, V. The Lichen Symbiosis. 2 ed. New York: John Wiley & Sons, 1993. AHTI, T.; DEPRIEST, P. T. New combination of Cladina epithets in Cladonia (Ascomycotina, Cladoniaceae). Mycotaxon, v. 78, p. 499-502, 2001. ASPINALL, G.O. General Introduction. In: ASPINALL, G. O. (Ed.). The Polysaccharides. New York: Academic Press, 1982. v. 1. p. 1-18. BARINAGA, M. Origins of lichen fungi explored. Science, v. 268, p. 1437, 1995. BARRETO-BERGTER, E; GORIN, P. A. J. Structural chemistry of polysaccharides from fungi and lichens. Adv. Carbohydr. Chem., v. 41, p. 67-103, 1983 BARON, M.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Isolation and identification of a linear (1Q 3)-linked H -D-glucan and other carbohydrate components of the lichen Stereocaulon ramulosum (Sw.) Rasch. Carbohydr. Res., v. 177, p. 235-239, 1988. BARON, M.; IACOMINI, M.; FANTA, E. S.; GORIN, P. A. J. Galactomannan, lichenan and isolichenan from the polysaccharide-rich lichen Newropogon aurantiacoater. Phytochemistry, v. 30, n. 9, p. 3125-3126, 1991. BARON, M. Estudo comparativo entre polissacardeos isolados dos liquens Stereocaulon ramulosum (Sw.) Rusch, Newropogon aurantiaco-ater e Actinogyra muehlenbergii. Curitiba, 1989. 199 p. Tese (Doutorado em Bioqumica) Setor de Cincias Biolgicas, Universidade Federal do Paran.
BDEL, B. Taxonomy of lichenized procaryotic blue-green algae. In: REISSER, W. (Ed.) Algae and symbiosis. Bristol: Biopress, 1992. p. 301-324. CARBONERO, E. R.; SASSAKI, G. L.; STUELP, P.; GORIN, P. A. J.; WORANOVICZ-BARREIRA, S. M.; IACOMINI, M. Comparative studies of the polysaccharides isolated from lichenized fungi of the genus Cladonia: significance as chemotypes. FEMS Microbiol. Lett., v. 194, p. 65-69, 2001. CARPITA, N. C.; SHEA, E. Linkage structure of carbohydrates by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) of partially methylated alditol acetates. In: BIERMANN, C. J.; McGINNIS, G. D. (Ed.). Analysis of carbohydrates by GLC and MS. Boca Raton: CRC Press, 1987. p. 157-216. CHANDA, N.B.; HIRST, E.L.; MANNERS, D. J. A comparison of isolichenin and lichenin from Iceland moss (Cetraria islandica). J. Chem. Soc., London, p.19511958, 1957. CIUCANU, I.; KEREK, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr. Res., v.131, p. 209-217, 1984. COMMON, R. S. The distribution and taxonomic significance of lichenan and isolichenan in the Parmeliaceae (Lichenized Ascomycotina), as determined by iodine reactions. I. Introduction and methods. II. The genus Alectoria and associated taxa. Mycotaxon, v. 41, p. 67-112, 1991. CORDEIRO, L. M. C.; STOCKER-WRGTTER, E.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Comparative studies of the polysaccharides from species of the genus Ramalinalichenized fungi-of three distinct habitats. Phytochemistry, v. 63, p. 967-975, 2003a. CORDEIRO, L. M. C.; REIS, R. A.; TISCHER, C. A.; GORIN, P. A. J.; FERREIRA, J. C.; IACOMINI, M. Linear H -mannose-containing polysaccharide, H -xylan, and amylose from the cultured photobiont Trebouxia sp. of the ascolichen Ramalina celastri. FEMS Microbiol. Lett., v. 220, p. 89-94, 2003b. CORDEIRO, L. M. C.; MONTAI, A. M.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Investigation on the polysaccharide production by the chlorolichen Pseudocyphellaria clathrara (de Not.) Malme. The Bryologist, 2004 (in press).
CORRADI da SILVA, M. L.; IACOMINI, M.; JABLONSKI, E.; GORIN, P. A. J. Carbohydrate, glycopeptide and protein components of the lichen Sticta sp. and effect of storage. Phytochemistry, v. 33, p. 547-552, 1993. CORRADI da SILVA, M. L.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Unusual carbohydrates from the lichen, Parmotrema cetratum. Phytochemistry, v. 34, n. 3, 715-717, 1993. CRESPO, A.; CUBERO, O. F. A molecular approach to the circumscription and evaluation of some genera segregated from Parmelia s. lat. The Lichenologist, v. 30, p. 369-368, 1998. CZEZUGA, B.; XAVIER FILHO, L. Investigations on carotenoids in lichens. VII. Some lichens from Brazil. Rev. Bras. Biol., v. 47, p. 243-246, 1987. CZEZUGA, B.; SKULT, H. Carotenoids in lichens of Southern Finland. Ann. Bot. Fennici, v. 25, p. 229-232, 1988. DRAKE, B. Some polyglucides of lichens, particularly lichenin and newly discovered pustulin. Biochem., v. 313, p. 338-399, 1943. DUBOIS, M.; GILLES, K. A.; HAMILTON, J. K.; REBERS, P. A.; SMITH, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem., v. 28, p. 350-356, 1956. DYER, J. R. Use of periodate oxidations in biochemical analysis. Methods Biochem. Anal., v. 3, p. 112-149, 1956. ELIX, J. A. Parmeliaceae. Flora of Australia, v. 55, p. 140-186, 1994. ELIX, J. A. Biochemistry and secondary metabolites. In: NASH III, T. H.(Ed.). Lichen Biology. Cambridge: Cambridge University Press, 1996. FILISETTI-COZZI, T. M. C.; CARPITA, N. C. Measurement of uronic acids without interference from neutral sugars. Anal. Biochem., v. 197, p. 157-162, 1991. FRIEDL, T.; BDEL, B. Photobionts. In: NASH III, T. H. (Ed). Lichen biology. Cambridge: Cambridge University Press, 1996; p. 113-119.
GORIN, P. A. J. Rationalization of carbon-13 magnetic resonance spectra of yeast mannans and structurally related oligosaccharides. Can. J. Chem., v. 51, p. 23752383, 1973. GARGAS, A.; DePRIEST, P. T.; GRUBE, M.; TEHLER, A. Multiple origins of lichen symbiosis in fungi suggested by SSU rDNA phylogeny. Science, v. 268, p. 1492-1495, 1995. GALUN, M. Lichenization. In: GALUN, M. (Ed.). CRC Handbook of Lichenology. Boca Raton: CRC Press, 1998. v. 2. p. 153-159. GOLA, G.; NEGRI, G.; CAPPELLETI, C. Tratado de Botnica. Barcelona, 2. ed., p. 793-805, 1965. GORIN, P. A. J.; HORITSU, K.; SPENCER, J. F. T. An exocellular mannan alternately linked 1,3- H and 1,4- H from Rhodotorula glutinis. Can. J. Chem., v. 43, p. 950-954, 1965. GORIN, P. A. J.; SPENCER, J. F. T.; BHATTACHARJEE, S. S. Structures of yeast mannans containing both P and H -linked mannopyranose units. Can. J. Chem., v. 47, p. 1499-1505, 1969. GORIN, P. A. J.; SPENCER, J. F. T. Proton magnetic resonance spectroscopy: an aid in identification and classification of yeasts. Adv. Appl. Microbiol., v. 13, p. 25-89, 1970. GORIN, P. A. J.; MAZUREK, M. Further studies on the assignment of signals in 13C magnetic resonance spectra of aldoses and derived methyl glycosides. Can. J. Chem., v. 53, n. 8, p. 1212-1223, 1975. GORIN, P. A. J.; HASKINS, R. H.; TRAVASSOS, L. R.; MENDONA-PREVIATO, L. Further studies on the rhamnomannans of Sporothrix schenckii and Ceratocystis stenoceras. Carbohydr. Res., v. 55, 21-33, 1977. GORIN, P. A. J. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy of polysaccharides. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., v. 38, p. 13-104, 1981. GORIN, P. A. J.; BARRETO-BERGTER, E. The chemistry of polysaccharides of fungi and lichens. In: ASPINALL, G.O. (Ed.). The Polysaccharides. New York: Academic Press, 1983. v. 2. p. 365-409.
GORIN, P. A. J.; BARON, M, da SILVA, M. L. C.; TEIXEIRA, A. Z. A.; IACOMINI, M. Lichen carbohydrates. Cincia e Cultura, v. 45, p. 27-36, 1993. GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Polysaccharides of the lichens Cetraria islandica and Ramalina usnea. Carbohydr. Res., v.128, p. 119-132, 1984. GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Structural diversity of D-galacto-D-mannan components isolated from lichens having ascomycetous mycosymbionts. Carbohydr. Res., v. 142, p. 253-267, 1985. GORIN, P. A. J.; BARON, M.; IACOMINI, M. Storage products of lichens. In: GALUN, M. (Ed.). Boca Raton: CRC Press CRC Handbook of Lichenology, 1988. v. III, p. 9-23. GORSHKOVA, R. P.; NAZARENKO, E.L.; ZUBKOV, V. A.; STEPANENKO, L.S.; ISAKOV, V. V. Structural studies of polysaccharides from Cetraria cucullata and Cetraria islandica lichens. J. Bioorg. Chem., v. 23, n. 2, p. 122-125, 1997. GRUBE, M.; KROKEN, S. Molecular approaches and the concept of species and species complexes in lichenized fungi. Mycol. Res., v. 11, p. 1284-1294, 2000. HALE, M.E. How to know the lichens. 2. ed., Iowa: Brown Company Publishers, 1979. HALE, M. E.; FLETCHER, A. Rimelia Hale & Fletcher, a new lichen genus (Ascomycotina: Parmeliaceae). Bryologist, v. 93, p. 23-29, 1990. HAUAN, E.; KJLBERG, O. Studies on the polysaccharides of lichens. I. The structure of a waterinsoluble polysaccharide in Stereocaulon paschale (L.) Fr. Acta Chem. Scand., v. 25, p. 2622-2628, 1971. HAY, G. W.; LEWIS, B. A.; SMITH, F. Periodate oxidation of polysaccharides: general procedures. Meth. Carbohydr. Chem., v. 5, p. 357-360, 1965. HAWKSWORTH, D. L.; HILL, D. J. The lichen forming fungi. Glasgow: Blackie, 1984.
HAWKSWORTH, D. L.; HILL, D. J. A new name for Dictyonema pavonium (Swartz) Parmasto. The Lichenologist, v. 20, p. 101, 1988.
HOLMGREN, P. K.; HOLMGREN, N. H.; BARNETT, L. C. Index Herbariorum. 8. ed. Part I: The herbaria of the world. Regnum Veg., v. 120, p. 1-693, 1990. HONDA, N. K.; VILEGAS, W. A qumica dos liquens. Qumica Nova, v. 21, n. 6, p. 110-125, 1988. HONEGGER, R. Develomental biology of lichens. New Phytologist, v. 125, p. 659677, 1993. HONEGGER, R. Experimental studies with foliose macrolichens: fungal responses to spatial disturbance at the organismic level and to spacial problems at the cellular level during drought stress. Canadian Journal of Botany, v. 73, p. 569-578, 1995 HONEGGER, R. Mycobionts. In: NASH, T. H (Ed.). Lichen Biology. Cambridge: Cambridge University Press, 1996. p. 24-36. HONEGGER, R.; HAISH, A. Immunocytochemical location of the (1 Q 3) (1Q 4)- H glucan lichenin in the lichen-forming ascomycete Cetraria islandica (Icelandic moss). New Phytologist, v. 150, n. 3, p. 739-746, 2001. HOUGH, L.; JONES, J. K.N. Chromatography on paper. Meth. Carbohydr. Chem., v. 1, p. 21-31, 1962. HRANISAVLJEVIC-JAKOVLJEVIC, M.; MILJKOVIC-STOJANOVIC, J.; DIMITRIJEVIC, R.; MICOVIC, V.M. Water- and alkali-soluble glucans from oak lichen. Carbohydr. Res., v. 39, p. 115-123, 1975. IACOMINI, M.; SCHNEIDER, C. L.; GORIN, P. A. J. Comparative studies on the polysaccharides of Cladonia alpestris (Reindeer moss), Cladonia confusa, and Cladonia amaurocraea. Carbohydr. Res., v. 142, p. 237-251, 1985. IACOMINI, M; ZANIN, S. M. W.; FONTANA, J. D.; HOGGE, J.; GORIN, P. A. J. Isolation and characterization of H -D-glucan, heteropolysaccharide, and trehalose components of the lichen Cora pavonia. Carbohydr. Res., v. 168, p. 55-65, 1987. IACOMINI, M.; GORIN, P. A. J.; BARON, M.; TULLOCH, A. P.; MAZUREK, M. Novel D-glucans obtained by dimethyl sufoxide extraction of the lichens Letharia vulpina, Actinogyra muehlenbergii, and an Usnea sp. Carbohydr. Res., v. 176, p.117 - 126, 1988.
JOLY, A. B. Introduo taxonomia vegetal. 2.ed. So Paulo, Companhia Editora Nacional. p. 100-106, 1975. INGOLFSDOTTIR, K.; JURCIC, K.; FISCHER, B.; WAGNER, H. Immunologically active polysaccharide from Cetraria islandica. Planta Medica, v. 60, p. 527-531, 1994. JANSSON, P.; KENNE, L.; LIEDGREN, H.; LINDBERG, B.; LNNGREN, J. A pratical guide to the methylation analysis of carbohydrates. J. Chem. Soc. Chem. Commun. (Univ. of Stockholm), v. 48, p. 1-70, 1976. JONES, J. K. N.; STOODLEY, R. J. Fractionation using copper complexes. Methods Carbohydr. Chem., v. 5, p. 36-38, 1965. KJLBERG, O.; KVERNHEIM, A. L. Studies on the polysaccharides of lichens. III. The structure of alkali-soluble polysaccharides in Umbilicaria pustulata (L.) Hoffm. and Umbilicaria spodochroa (Ach.) Hoffm. Acta Chem. Scand., v. 43, p. 280-285, 1989. LEAL, J. A.; PRIETO, A.; GMEZ-MIRANDA, B.; JIMNEZ-BARBERO, J.; BERNAB, M. Structure and conformational features of an alkali- and water-soluble galactofuranan from the cell walls of Eupenicillium crustaceum. Carbohydr. Res., v. 244, p. 361-368, 1993. LINDBERG, B.; MISIORNY, A.; WACHTMEISTER, C. A. Studies on the chemistry of lichens. IV. Investigation of the low-molecular carbohydrate constituents of different lichens. Acta Chem. Scand., v. 7, n. 4, p. 591-595, 1953. LINDBERG, B.; McPHERSON, J. Studies on the chemistry of lichens VI. The structure of pustulan. Acta Chem. Scand., v. 8, p. 985, 1954. LOUWHOFF, S. H. J. J.; CRISP, M. D. Phylogenetic analysis of Parmotrema (Parmeliaceae: Lichenized Ascomycotina). The Bryologist, v. 103, p. 541-554, 2000. MARCELLI, M.P. Fungos liquenizados: taxonomia e caractersticas de importncia taxonmica. So Paulo, Dep. Botnica/USP, 1995. MEYER, K. H.; GRTLER, P. Recherches sur Iamidon. XXXI. La constitution de la lichnine. Helv. Chim. Acta, v. 30, p. 751-761, 1947(a).
MEYER, K. H.; GRTLER, P. Recherches sur Iamidon. XXXII. Lisolichnine. Helv. Chim. Acta, v. 30, p. 761-765, 1947(b). MICENO, A. M.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Galactomannan and isolichenan components of the carbohydrate-rich lichen Ramalina ecklonii. Agric. Biol. Chem. (Japan), v. 55, p. 1391-1392, 1991. MITTAL, O. P.; NEELAKANTAN, S.; SESHADRI, T. R. Chemical investigations of Indian lichens. Part XIV. Journal of Scientific and Industrial Research (India), v. 11B, p. 386-387, 1952. MITTAL, O. P.; SESHADRI, T. R. Chemical investigations of Indian lichens. XVI. Purification and composition of lichenin and isolichenin from Indian lichens. Journal of Scientific and Industrial Research (India), v. 13B, p. 344-245, 1954. NASH, T.H.. Lichen Biology. Cambridge: United Kingdom, p. 225-233, 1996. NAGAOKA, M.; HASHIMOTO, S.; SHIBATA, H.; KIMURA, I.; KIMURA, K.; SAWADA, H.; YOKOKURA, T. Structure of a galactan from cell walls of Bifidobacterium catenulatum YIT4016. Carbohydr. Res., v. 281, p. 285-291, 1996. NISHIKAWA, Y.; TAKEDA, T.; SHIBATA, S.; FUKUOKA, F. Polysaccharides in lichens and fungi. Further investigation on the structures and the antitumor activity of the polysaccharides from Gyrophora esculenta Miyoshi and Lasallia papulosa (Ach.) Llano. Chem. Pharm. Bull., v. 17, p. 1910-1916, 1969. NISHIKAWA, Y.; TANAKA, M.; SHIBATA, S.; FUKUOKA, F. Polysaccharides of lichens and fungi. Antitumor active O-acetylated pustulan-type glucans from lichens of Umbilicaria species. Chem. Pharm. Bull., v. 18, p. 1431-1434, 1970. NISHIKAWA, Y.; MICHISHITA, K.; KURONO, G. Studies on the water soluble constituents of lichens. I. Gas chromatographic analyses of low molecular weight carbohydrates. Chem. Pharm. Bull. , v. 21, n. 5, p. 1014-1019, 1973. NISHIKAWA, Y.; OHKI, K.; TAKAHASHI, K.; KURANO, G.; FUKUOKA, F.; EMORI, M. Studies on the water soluble constituents of lichens. II. Antitumor polysaccharides of Lasallia, Usnea, and Cladonia species. Chem. Pharm. Bull., v. 22, p. 2692-2702, 1974.
OLAFSDOTTIR, E. S.; INGOLFSDOTTIR, K.; BARSETT, H.; SMETAD P. B.; JURCIC, K.; WAGNER, H. Immunologically active (1Q 3) (1Q 4)- P -D-glucan from Cetraria islandica. Phytomedicine, v. 6, n. 1, p. 33-39, 1999. OLAFSDOTTIR, E. S.; INGLFSDOTTIR, K. Polysaccharides from lichens: structural characteristics and biological activity. Planta Med., v. 67, p. 99-208, 2001. OLAFSDOTTIR, E. S.; OMARSDOTTIR, K.; SMETAD PAULSEN, B.; WAGNER, H. Immunologically active O-6 branched (1 Q 3)- H -D-glucan from the lichen Thamnolia vermicularis var. subuliformis. Phytomedicine, v. 10, p. 318-324, 2003. PAINTER, T. J. Algal polysaccharides. In: ASPINALL, G. O. (Ed.). The Polysaccharides. New York: Academic Press, 1983. v. 2. p. 195-285. PEREIRA, E. C.; NASCIMENTO, S.C.; LIMA, R.C.; SILVA, N.H.; OLIVEIRA, A.F.; BANDEIRA, E.; BOITARD, M.; BERIEL, H.; VICENTE, C.; LEGAZ, M.E. Analysis of Usnea fasciata crude extracts with antineoplastic activity. Tokai Journal of Experimental and Clinical Medicine, v. 19, p. 47-52, 1994. PEREYRA, M. T.; PRIETO, A.; BERNAB, M.; LEAL, J. A. Studies of new polysaccharide from Lasallia pustulata (L.) Hoffm. The Lichenologist, v. 35, p. 177185, 2003. PERLIN, A. S.; CASU, B. Carbon-13 and proton magnetic resonance spectra of Dglucose-13C. Tetrahedron Lett. 34, 2919-2924, 1969. PRADO, S. R. T.; GORIN, P. A. J.; STUELP, P. M.; HONDA, N. K.; IACOMINI, M. An unusual juxtaposition of polysaccharide components of Collema leptosporum. Carbohydr. Polym., v. 40, 271-276, 1999. PREVIATO, J. O.; MENDONA-PREVIATO, L.; GORIN, P. A. J. A novel H -D(1Q 2)-linked mannopyranan from Crithidia deanii. Carbohydr. Res., v. 70, p. 172174, 1979. PRITCHARD, H., N.; BRADT, P., T. Biology of nonvascular plants. St. Louis: Times Mirror/Mosby College Publishing, 1984. p. 424. PURVIS, W. Lichens. Singapore: Craft Print, 2000.
RAVEN, P.H.; EVERT, R.F.; EICHEHORNS, S.E. Biologia Vegetal. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996. p. 206-210. REICHER; F.; CORRA, J. B.C.; GORIN, P. A. J. Location of O-acetyl groups in the acidic D-xylan of Mimosa scabrella (bracatinga). A study of O-acetyl group migration. Carbohyd. Res., v. 135, p. 129-140, 1984. REIS, R. A.; TISCHER, C. A.; GORIN, P. A. J; IACOMINI, M. A new pullulan and a branched (1 Q 3)-, (1 Q 6)-linked H -glucan from the lichenized ascomycete Teloschistes flavicans. FEMS Microbiol. Lett., v. 210, p. 1-5, 2002. SAEMAN, J. F.; MOORE, W. E.; MITCHELL, R. L.; MILLET, M.A. Techniques for the determination of pulp constituents by quantitative paper chromatography. Tech. Assoc. Pulp Pap. Ind., v. 37, p. 336-343, 1954. SASSAKI, G. L.; FERREIRA, J. C.; GLIENKE-BLANCO, C.; TORRI, G.; DE TONI, F.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Pustulan and branched H -galactofuranan from the phytopathogenic fungus Guignardia citricarpa, excreted from media containing glucose and sucrose. Carbohyd. Polym., 48 (4), 385-389, 2002. SASSAKI, G. L.; REIS, R. A.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. The glucans of lichenized fungi. Mitt. Inst. Allg. Bot. (Hamburg), v. 30, p. 195-211, 2002. SHIBATA, S.; NISHIKAWA, Y.; TAKEDA, T.; TANAKA, M.; FUKUOKA, F.; NAKANISHI, M. Studies on the chemical structures of the new glucans isolated from Gyrophora esculenta Miyoshi and Lasallia papulosa (Ach.) Llano and their inhibiting effect on implanted sarcoma 180 in mice. Chem. Pharm. Bull., v. 16, p. 1639-1641, 1968. SHIBATA, S. Polysaccharides of lichens. J. Nat. Science Council Sri Lanka, v. 1, p. 183-188, 1973. SMITH, D. C. The symbiotic condition. Symbiosis, v. 14, p. 3-15, 1992.
SMRIGA, M.; SAITO, H.; SHIBATA, NARUI, T.; OKUYAMA, T.; NISHIYAMA, N. PC-2, linear homoglucan with P -linkages, peripherally enhances the hippocampal long-term potentiation. Pharm. Res., v. 13, n. 9, p. 1322-1326, 1996.
SPELLMAN, M.W.; McNEIL, M.; DARVILL; A. G; ALBERSHEIM, P. Isolation and characterization of 3-C-carboxy-5-L-xylose, a naturally occurring, branchedchain, acidic monosaccharide. Carbohydr. Res., v. 122, p. 115-129, 1983.
STEPHEN, A. M. Other plant polysaccharide. In: ASPINALL, G. O. (Ed.). The Polysaccharides. New York: Academic Press, 1983. v. 2. p. 98-180.
STENROOS, S.; AHTI, T.; HYVNEN, J. Phylogenetic analysis of the genera Cladonia and Cladina (Cladoniaceae, lichenized Ascomycota). Plant. Syst. Evol., v. 207, p. 43-58, 1997. STUELP, P. M.; CARNEIRO-LEO; A. M. C.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. The glucans of Ramalina celastri: relation with chemotypes of other lichens. Carbohydr. Polym., v. 40, p.101-106, 1999. TAKAHASHI, K.; KON, K.; YOKOTA, I.; SHIBATA, S. Chemotaxonomic studies on the polysaccharides of lichens. Polysaccharides of Stereocaulaceous lichens. Carbohydr. Res., v. 89, p. 166-173, 1981. TAKEDA, T.; FUNATSU, M.; SHIBATA, S.; FUKUOKA, F. Polysaccharides of lichens and fungi. Antitumor active polysaccharides of Evernia, Acroscyphus and Alectoria species. Chem. Pharm. Bull. (Japan), v. 20, p. 2445-2449, 1972. TAKEDA, T.; NISHIKAWA, Y.; SHIBATA, S. A new P -D-glucan from the lichen Parmelia caperata (L.) Ach. Chem. Pharm. Bull. (Japan), v.18, n. 5, p. 1074-1075, 1970. TAYLOR, R. L.; CONRAD, H. E. Stoichiometric depolymerization of polyuronides and glycosaminoglycuronans to monosaccharides following reduction of their carbodiimide-activated carboxyl groups. Biochem., v. 11, n. 8, p. 1383-1388, 1972. TEIXEIRA, A. Z. A.; IACOMINI, M.; GORIN, P. A. J. Mannose-containing heteropolysaccharides of lichens: an unusual glucomannan from Tornabenia intricata. Phytochemistry, v. 31, p. 3467-3470, 1992. TEIXEIRA, A. Z. A.; IACOMINI, M.; GORIN, P. A. J. Chemotypes of mannosecontaining polysaccharides of lichen mycobionts: a possible aid in classification and identification. Carbohydr. Res., v. 266, p. 309-314,1995.
TREVELYAN, W. E.; PROCTER, D. P.; HARRISON, J. S. Detection of sugars on paper chromatograms. Nature, v. 166, p. 444-445, 1950. TSCHERMAK-WOESS, E. The algal partner. In GALUN, M. (Ed.). Handbook of Lichenology. Boca Raton: CRC Press, 1988. v. I. p. 39-92. VARTIA, K. O. Antibiotics in lichens. In: AHMADJIAN, V.; HALE, M. E. (Ed.). The lichens. New York: Academic Press, 1973. p. 547. WHITON, R. S.; LAU, P.; MORGAN, S. L.; GILBART, J.; FOX, A. Modifications in the alditol acetate method for analysis of muramic acid and other neutral and amino sugars by capillary gas chromatography-mass spectrometry with selected ion monitoring. J. Chromatogr., v. 347, p. 109-120, 1985. WOLFROM, M. L.; THOMPSON, A. Reduction with sodium borohydride. In: WHISTLER, R. L.; WOLFROM, M. L. (Ed.). Meth. Carbohydr. Chem., New York: Academic Press, v. 2, p. 65-68. 1963(a). WOLFROM, M. L.; THOMPSON, A. Acetylation. In: WHISTLER, R. L.; WOLFROM, M. L. (Ed.). Meth. Carbohydr. Chem., New York: Academic Press, v. 2, p. 211-215, 1963(b). WORANOVICZ, S. M. Estudo comparativo de heteropolissacardeos isolados dos liquens Cladonia signata (Eschw.) Vainio, Cladonia furcata (Hudson) Schrader e Cladia aggregata (Sw.) Nyl. Curitiba, 1995. 109 p. Dissertao (Mestrado em Bioqumica) Setor de Cincias Biolgicas, Universidade Federal do Paran. WORANOVICZ, S. M.; GORIN, P. A. J.; MARCELLI, M. P.; TORRI, G.; IACOMINI, M. Structural studies on the galactomannans of lichens of the genus Cladonia. The Lichenologist, v. 29, n. 5, p. 471-481,1997. WORANOVICZ-BARREIRA, S. M.; GORIN, P. A. J.; SASSAKI, G. L.; TISCHER, C. A.; AHTI, T.; IACOMINI, M. Chemotyping studies on the glucans of lichens of the genus Cladonia. Phytochemistry, v. 52, p. 1069-1074, 1999a. WORANOVICZ-BARREIRA, S. M. Estudo comparativo de polissacardeos e oligossacardeos de liquens do gnero Cladonia. Curitiba, 1999b. 170 p. Tese (Doutorado em Bioqumica) Setor de Cincias Biolgicas, Universidade Federal do Paran.
WORANOVICZ, S M.; PINTO, B. M.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Novel structures in galactoglucomannans of the lichens Cladonia substellata and Cladonia ibitipocae: significance as chemotypes. Phytochemistry, v. 51, p. 395-402, 1999c. WORANOVICZ-BARREIRA, S. M.; GORIN, P. A. J.; SASSAKI, P. L.; MARCELLI, M. P.; IACOMINI, M. Galactomannoglucans of lichenized fungi of Cladonia spp.: significance as chemotypes. FEMS Microbiol. Lett., v. 52, p. 313317, 1999d. XAVIER FILHO, L.; RIZZINI, C.T. Manual de liquenologia brasileiro. Recife, Universidade Federal do Pernambuco; 431 p., 1976. YOKOTA, I.; SHIBATA, S. A polysaccharide of the lichen, Stereocaulon japonicum. Chem. Pharm. Bull., v. 26, p. 2668-2670, 1978. YOKOTA, I.; SHIBATA, S.; SAIT, H.A. 13C-n.m.r. analysis of linkages in lichen polysaccharides: an approach to chemical taxonomy of lichens. Carbohydr. Res., v. 69, p. 252-258, 1979. ZANIN, S. M. W.; FONTANA, J. D.; HOGGE, L.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Isolation and characterization of H -D-glucan, heteropolysaccharide, and trehalose components of the basidiomycetous lichen Cora pavonia. Carbohydr. Res., v. 168, p. 55-65, 1987.
PUBLICAES
CARBONERO, E. R.; SASSAKI, G. L.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. A (1F 6)-linked W -mannopyrananan, pseudonigeran, and a (1F 4)-linked W -xylan, isolated from the lichenized basidiomycete Dictyonema glabratum. FEMS Microbiological Letters. v. 206, n.02, p.175 178, 2002. (ANEXO 1) CARBONERO, E. R.; MONTAI, A. V.; WORANOVICZ-BARREIRA, S. M.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Polysaccharides of lichenized fungi of three Cladina spp.: significance as chemotypes. Phytochemistry. v. 61, p. 681 - 686, 2002. (ANEXO 2) CARBONERO, E. R.; TISCHER, C. A.; COSENTINO, C.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Structural characterization of a galactomannan from the cyanolichen Leptogium azureum. Carbohydrate Polymers. v. 53, p.469 - 473, 2003. (ANEXO 3) CARBONERO, E. R.; MONTAI, A. V.; MELLINGER, C. G.; ELIASARO, .S.; SASSAKI, G. L.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Glucans of lichenized fungi: their significance in chemotyping the genera Parmotrema and Rimelia. Phyochemistry, 2004 (trabalho aceito publicao). (ANEXO 4) CARBONERO, E. R.; MELLINGER, C. G.; ELIASARO, S.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Chemotypes significance of lichenized fungi by structural characterization of heteropolysaccharides from the genera Parmotrema and Rimelia. FEMS Microbiology Letters, 2004. (trabalho submetido publicao) (ANEXO 5) CARBONERO, E. R.; CORDEIRO; L. M. C.; MELLINGER, C. G.; SASSAKI, G. L.; STOCKERWRGTTER, E.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Galactomannans with novel structures from the lichen Roccella decipiens Darb. Carbohydrate Research, 2004. (trabalho submetido publicao) (ANEXO 6) CARBONERO, E. R., SMIDERLE, F. R.; GRACHER, A. H. P.; MELLINGER, C. G., AHTI, T.; GORIN, P. A. J., IACOMINI, M. Structure of two glucans and a galactofuranomannan from the lichen Umbilicaria mammulata (Ach.) Tuck. Gier Kendrick. Carbohydrate Polymers, 2004. (trabalho submetido publicao) (ANEXO 7) MARTINICHEN-HERRERO, J. C.; CARBONERO, E. R.; GORIN, P. A. J.; IACOMINI, M. Anticoagulant and antithrombotic activity of a sulfate obtained from a W -(1F 6)-linked glucan component of the lichen Parmotrema mantiqueirense Hale. Carbohydrate Polymers, 2004. (trabalho aceito publicao) (ANEXO 8)
ANEXOS

Tese v1.prn

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Tese v1.prn

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

ELAINE ROSECHRER CARBONERO

POLISSACARDEOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS CONTENDO DIFERENTES FOTOBIONTES

ELAINE ROSECHRER CARBONERO

POLISSACARDEOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS CONTENDO DIFERENTES FOTOBIONTES

FIGURA 19 FIGURA 20 FIGURA 21 FIGURA 22 FIGURA 23 FIGURA 24 FIGURA 25

FIGURA 31 FIGURA 32 FIGURA 33 FIGURA 34 FIGURA 35 FIGURA 36

LISTA DE SMBOLOS, ABREVIATURAS, SIGLAS

HSQC Hz IR J kDa KOH LS M Man Me2SO Me2SO-d6

1.1 LIQUENS 1.1.1 Histrico

1.1.2 Aspectos Gerais

Crtex superior Camada algal

Crtex inferior Rizina

Crtex superior Camada algal

Crtex superior Camada algal

Camada algal Crtex inferior

Usnea subfloridana FRUTICOSO

1.2 PRINCIPAIS CONSTITUINTES QUMICOS DOS LIQUENS

1.2.3 Carboidratos de Baixa Massa Molar

1.2.4 Carboidratos de Alta Massa Molar

( ). De acordo com o tipo de ligao e a proporo das ligaes as glucanas recebem

Denominao Nigerana Isoliquenana

-D-Glucana (1 -D-Glucana (1 -D-Glucana (1 -D-Glucana (1

Pululana Laminarana Pustulana Liquenana

1:2 1:3 3:1 3:7

unidades de - ou - Galp ou -Manp ou Glcp e, mais raramente, por -Galf (Figura

FIGURA 3 - Principais estruturas observadas em galactomananas obtidas de liquens

TABELA 2 Tipos de heteropolissacardeos encontrados em fungos liquenizados

-D-Manp (1 6) -D-Manp (1 3)

Gal:Rha:Glc:Xyl:Man:Fuc (17:04:08:32:29:10) Glc: Gal: Man com propores variveis

Ara:Gal:Man:Glc 12:34:40:14 Gal:Rha:Glc:Xyl:Man 40:31:13:10:06

-D-Glcp (1 3) -D-Galf-(1 3)

TABELA 3 POLISSACARDEOS OBTIDOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS

Tipo de Glucanas -D-Glucana

Heteropolissacardeos contendo manose (Man:Gal:Glc)

Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana

Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana

TABELA 3 POLISSACARDEOS OBTIDOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS (continuao)

Tipo de Glucanas -D-Glucana

Heteropolissacardeos contendo manose (Man:Gal:Glc) 82:18:00 (2)

(1 3) (1 6) (5) (1 3) (1 6) (7) Isoliquenana (2:1)

PRADO et al., 1999. IACOMINI et al., 1987.

C. nivaris C. richardsonii Evernia prunastri

Liquenana Liquenana (3:7) Liquenana (3:1)

41:28:31 (2) 45:55 (2)

TABELA 3 POLISSACARDEOS OBTIDOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS (continuao)

Tipo de Glucanas -D-Glucana

Heteropolissacardeos contendo manose (Man:Gal:Glc)

Referencias SHIBATA, 1973. OLAFSDOTTIR; INGLFSDOTTIR, 2001.

Liquenana Liquenana (1:1,19)

Liquenana Liquenana Liquenana Liquenana (3:7) Liquenana (1:3)

Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Laminarana Liquenana

TABELA 3 POLISSACARDEOS OBTIDOS DE FUNGOS LIQUENIZADOS (concluso)

Tipo de Glucanas -D-Glucana

Heteropolissacardeos contendo manose (Man:Gal:Glc)

63:31:05 (2) 60:40:00 (2)

(1 3) (1 6) (13) 62:30:08 (2) 52:18:06 (2)

1.4 CARACTERISTICAS GERAIS DOS LIQUENS ESTUDADOS

1.4.1 Cladina spp (Famlia Cladoniaceae)

1.4.2 Dictyonema glabratum (Famlia Dictyonemataceae)

1.4.3 Leptogium spp. (Famlia Collemataceae)

1.4.4 Parmotrema spp. e Rimelia spp. (Famlia Parmeliaceae)

1.4.5 Roccella decipiens (Famlia Roccellaceae)

1.4.6 Umbilicaria mamullata (Famlia Umbilicariaceae)

-D-Manp (1 6) -D-Manp (1 3)

-D-Glcp (1 3) -D-Galf-(1 3)

(1 3) (1 6) (5) (1 3) (1 6) (7) Isoliquenana (2:1)

(1 3) (1 6) (13) 62:30:08 (2) 52:18:06 (2)