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BIOQUIMICA 2013 CICLO DE NIVELACIN Y AVANCE (FACULTAD DE ENFERMERA)

Bioqumica

Representacin esquemtica de la molcula de ADN, la molcula portadora de la informacin gentica. La bioqumica es una ciencia que estudia la composicin qumica de los seres vivos, especialmente las protenas, carbohidratos, lpidos y cidos nucleicos, adems de otras pequeas molculas presentes en las clulas y las reacciones qumicas que sufren estos compuestos (metabolismo) que les permiten obtener energa (catabolismo) y generar biomolculas propias (anabolismo). La bioqumica se basa en el concepto de que todo ser vivo contiene carbono y en general las molculas biolgicas estn compuestas principalmente de carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno, fsforo y azufre. Es la ciencia que estudia la base qumica de la vida: las molculas que componen las clulas y los tejidos, que catalizan las reacciones qumicas del metabolismo celular como la digestin, la fotosntesis y la inmunidad, entre otras muchas cosas. Podemos entender la bioqumica como una disciplina cientfica integradora que aborda el estudio de las biomolculas y biosistemas. Integra de esta forma las leyes qumico-fsicas y la evolucin biolgica que afectan a los biosistemas y a sus componentes. Lo hace desde un punto de vista molecular y trata de entender y aplicar su conocimiento a amplios sectores de la Medicina (terapia gnica y Biomedicina), la agroalimentacin, la farmacologa La Bioqumica constituye un pilar fundamental de la biotecnologa, y se ha consolidado como una disciplina esencial para abordar los grandes problemas y enfermedades actuales y del futuro, tales como el cambio climtico, la escasez de recursos agroalimentarios ante el aumento de poblacin mundial, el agotamiento de las reservas de combustible fsil, la aparicin de nuevas formas de alergias, el aumento de cncer, las enfermedades genticas, la obesidad La bioqumica es una ciencia experimental y por ello recurrir al uso de numerosas tcnicas instrumentales propias y de otros campos, pero la base de su desarrollo parte del hecho de que lo que ocurre en vivo a nivel subcelular se mantiene o conserva tras el fraccionamiento subcelular, y a partir de ah, podemos estudiarlo y extraer conclusiones.

Ramas de la bioqumica

Esquema de una clula tpica animal con sus orgnulos y estructuras.

El pilar fundamental de la investigacin bioqumica clsica se centra en las propiedades de las protenas, muchas de las cuales son enzimas. Sin embargo, existen otras disciplinas que se centran en las propiedades biolgicas de carbohidratos (Glucobiologa)1 y lpidos (Lipobiologa)2 Por razones histricas la bioqumica del metabolismo de la clula ha sido intensamente investigado, en importantes lneas de investigacin actuales (como el Proyecto Genoma, cuya funcin es la de identificar y registrar todo el material gentico humano), se dirigen hacia la investigacin del ADN, el ARN, la sntesis de protenas, la dinmica de la membrana celular y los ciclos energticos. Las ramas de la bioqumica son muy amplias y diversas, y han ido variando con el tiempo y los avances de la biologa, la qumica y la fsica. Bioqumica estructural: es un rea de la bioqumica que pretende comprender la arquitectura qumica de las macromolculas biolgicas, especialmente de las protenas y de los cidos nucleicos (DNA y RNA). As se intenta conocer las secuencias peptdicas, su estructura y conformacin tridimensional, y las interacciones fsico-qumicas atmicas que posibilitan a dichas estructuras. Uno de sus mximos retos es determinar la estructura de una protena conociendo slo la secuencia de aminocidos, que supondra la base esencial para el diseo racional de protenas (ingeniera de protenas). Qumica bioorgnica: es un rea de la qumica que se encarga del estudio de los compuestos orgnicos (es decir, aquellos que tienen enlaces covalentes carbono-carbono o carbono-hidrgeno) que provienen especficamente de seres vivos. Se trata de una ciencia ntimamente relacionada con la bioqumica clsica, ya que en la mayora de los compuestos biolgicos participa el carbono. Mientras que la bioqumica clsica ayuda a comprender los procesos biolgicos con base en conocimientos de estructura, enlace qumico, interacciones moleculares y reactividad de las molculas orgnicas, la qumica bioorgnica intenta integrar los conocimientos de sntesis orgnica, mecanismos de reaccin, anlisis estructural y mtodos analticos con las reacciones metablicas primarias y secundarias, la biosntesis, el reconocimiento celular y la diversidad qumica de los organismos vivos. De all surge la Qumica de Productos Naturales (V. Metabolismo secundario). 3 Enzimologa: estudia el comportamiento de los catalizadores biolgicos o enzimas, como son algunas protenas y ciertos RNA catalticos, as como las coenzimas y cofactores como metales y vitaminas. As se cuestiona los mecanismos de catlisis, los procesos de interaccin de las enzimas-sustrato, los estados de transicin catalticos, las actividades enzimticas, la cintica de la reaccin y los mecanismos de

regulacin y expresin enzimticas, todo ello desde un punto de vista bioqumico. Estudia y trata de comprender los elementos esenciales del centro activo y de aquellos que no participan, as como los efectos catalticos que ocurren en la modificacin de dichos elementos; en este sentido, utilizan frecuentemente tcnicas como la mutagnesis dirigida. Bioqumica metablica: es un rea de la bioqumica que pretende conocer los diferentes tipos de rutas metablicas a nivel celular, y su contexto orgnico. De esta forma son esenciales conocimientos de enzimologa y biologa celular. Estudia todas las reacciones bioqumicas celulares que posibilitan la vida, y as como los ndices bioqumicos orgnicos saludables, las bases moleculares de las enfermedades metablicas o los flujos de intermediarios metablicos a nivel global. De aqu surgen disciplinas acadmicas como la Bioenergtica (estudio del flujo de energa en los organismos vivos), la Bioqumica nutricional (estudio de los procesos de nutricin asociados a rutas metablicas) 4 y la bioqumica clnica (estudio de las alteraciones bioqumicas en estado de enfermedad o traumatismo). La metabolmica es el conjunto de ciencias y tcnicas dedicadas al estudio completo del sistema constituido por el conjunto de molculas que constituyen los intermediarios metablicos, metabolitos primarios y secundarios, que se pueden encontrar en un sistema biolgico. Xenobioqumica: es la disciplina que estudia el comportamiento metablico de los compuestos cuya estructura qumica no es propia en el metabolismo regular de un organismo determinado. Pueden ser metabolitos secundarios de otros organismos (P. ejemplo las micotoxinas, los venenos de serpientes y los fitoqumicos cuando ingresan al organismo humano) o compuestos poco frecuentes o inexistentes en la naturaleza. 5 . La Farmacologa es una disciplina que estudia a los xenobiticos que benefician al funcionamiento celular en el organismo debido a sus efectos teraputicos o preventivos ( Frmacos). La farmacologa tiene aplicaciones clnicas cuando las sustancias son utilizadas en el diagnstico, prevencin, tratamiento y alivio de sntomas de una enfermedad as como el desarrollo racional de sustancias menos invasivas y ms eficaces contra dianas biomoleculares concretas. Por otro lado, la Toxicologa es el estudio que identifica, estudia y describe, la dosis, la naturaleza, la incidencia, la severidad, la reversibilidad y, generalmente, los mecanismos de los efectos adversos (efectos txicos) que producen los xenobiticos. Actualmente la toxicologa tambin estudia el mecanismo de los componentes endgenos, como los radicales libres de oxgeno y otros intermediarios reactivos, generados por xenobiticos y endobiticos. Inmunologa: rea de la biologa, la cual se interesa por la reaccin del organismo frente a otros organismos como las bacterias y virus. Todo esto tomando en cuenta la reaccin y funcionamiento del sistema inmune de los seres vivos. Es esencial en esta rea el desarrollo de los estudios de produccin y comportamiento de los anticuerpos. Endocrinologa: es el estudio las secreciones internas llamadas hormonas, las cuales son sustancias producidas por clulas especializadas cuyo fin es de afectar la funcin de otras clulas. La endocrinologa trata la biosntesis, el almacenamiento y la funcin de las hormonas, las clulas y los tejidos que las secretan, as como los mecanismos de sealizacin hormonal. Existen subdisciplinas como la endocrinologa mdica, la endocrinologa vegetal y la endocrinologa animal. Neuroqumica: es el estudio de las molculas orgnicas que participan en la actividad neuronal. Este trmino es empleado con frecuencia para referir a los neurotransmisores y otras molculas como las drogas neuro-activas que influencian la funcin neuronal. Quimiotaxonoma: es el estudio de la clasificacin e identificacin de organismos de acuerdo a sus diferencias y similitudes demostrables en su composicin qumica. Los compuestos estudiados pueden ser

fosfolpidos, protenas, pptidos, hetersidos, alcaloides y terpenos. John Griffith Vaughan fue uno de los pioneros de la quimiotaxonoma. Entre los ejemplos de las aplicaciones de la quimiotaxonoma pueden citarse la diferenciacin de las familias Asclepiadaceae y Apocynaceae en base a la presencia de ltex; la presencia de agarofuranos en la familia Celastraceae; las sesquiterpenlactonas con esqueleto de germacrano que son caractersticas de la familia Asteraceae o la presencia de abietanos en las partes areas de plantas del gnero Salvia del viejo Mundo a diferencia de las del Nuevo Mundo que presentan principalmente neo-clerodanos.6 Ecologa qumica: es el estudio de los compuestos qumicos de origen biolgico implicados en las interacciones de organismos vivos. Se centra en la produccin y respuesta de molculas sealizadoras (semioqumicos), as como los compuestos que influyen en el crecimiento, supervivencia y reproduccin de otros organismos (aleloqumicos). Virologa: rea de la biologa, que se dedica al estudio de los biosistemas ms elementales: los virus. Tanto en su clasificacin y reconocimiento, como en su funcionamiento y estructura molecular. Pretende reconocer dianas para la actuacin de posibles de frmacos y vacunas que eviten su directa o preventivamente su expansin. Tambin se analizan y predicen, en trminos evolutivos, la variacin y la combinacin de los genomas vricos, que podran hacerlos eventualmente, ms peligrosos. Finalmente suponen una herramienta con mucha proyeccin como vectores recombinantes, y han sido ya utilizados en terapia gnica. Gentica molecular e ingeniera gentica: es un rea de la bioqumica y la biologa molecular que estudia los genes, su herencia y su expresin. Molecularmente, se dedica al estudio del DNA y del RNA principalmente, y utiliza herramientas y tcnicas potentes en su estudio, tales como la PCR y sus variantes, los secuenciadores masivos, los kits comerciales de extraccin de DNA y RNA, procesos de transcripcin-traduccin in vitro e in vivo, enzimas de restriccin, DNA ligasas Es esencial conocer como el DNA se replica, se transcribe y se traduce a protenas (Dogma Central de la Biologa Molecular), as como los mecanismos de expresin basal e inducible de genes en el genoma. Tambin estudia la insercin de genes, el silenciamiento gnico y la expresin diferencial de genes y sus efectos. Superando as las barreras y fronteras entre especies en el sentido que el genoma de una especie podemos insertarlo en otro y generar nuevas especies. Uno de sus mximos objetivos actuales es conocer los mecanismos de regulacin y expresin gentica, es decir, obtener un cdigo epigentico. Constituye un pilar esencial en todas las disciplinas biocientficas, especialmente en biotecnologa. Biologa Molecular: es la disciplina cientfica que tiene como objetivo el estudio de los procesos que se desarrollan en los seres vivos desde un punto de vista molecular. As como la bioqumica clsica investiga detalladamente los ciclos metablicos y la integracin y desintegracin de las molculas que componen los seres vivos, la Biologa molecular pretende fijarse con preferencia en el comportamiento biolgico de las macromolculas (ADN, ARN, enzimas, hormonas, etc.) dentro de la clula y explicar las funciones biolgicas del ser vivo por estas propiedades a nivel molecular. Biologa celular: (antiguamente citologa, de citos=clula y logos=Estudio o Tratado ) es una rea de la biologa que se dedica al estudio de la morfologa y fisiologa de las clulas procariotas y eucariotas. Trata de conocer sus propiedades, estructura, composicin bioqumica, funciones, orgnulos que contienen, su interaccin con el ambiente y su ciclo vital. Es esencial en esta rea conocer los procesos intrnsecos a la vida celular durante el ciclo celular, como la nutricin, la respiracin, la sntesis de componentes, los mecanismos de defensa, la divisin celular y la muerte celular. Tambin se deben conocer los mecanismos de comunicacin de clulas (especialmente en organismos pluricelulares) o las uniones intercelulares. Es un rea esencialmente de observacin y experimentacin en cultivos celulares, que, frecuentemente, tienen como objetivo la identificacin y separacin de poblaciones celulares y el

reconocimiento de orgnulos celulares. Algunas tcnicas utilizadas en biologa celular tienen que ver con el empleo de tcnicas de citoqumica, siembra de cultivos celulares, observacin por microscopa ptica y electrnica, inmunocitoqumica, inmunohistoqumica, ELISA o citometra de flujo. Est ntimamente ligada a disciplinas como histologa, microbiologa o fisiologa.

Tcnicas bioqumicas bsicas


Al ser una ciencia experimental la bioqumica requiere de numerosas tcnicas instrumentales que posibilitan su desarrollo y ampliacin, algunas de ellas se usan diariamente en cualquier laboratorio y otras son muy exclusivas.

Fraccionamiento subcelular, incluyen multitud de tcnicas


Centrifugacin Cromatografa Electroforesis Tcnicas radioisotpicas PCR Citometra de flujo Inmunoprecipitacin ELISA Microscopio electrnico Cristalografa de rayos X Resonancia magntica nuclear Espectrometra de masas

Expectativas y retos de la bioqumica


La bioqumica es una ciencia experimental que tiene un presente y un futuro prometedor, en el sentido, que se yergue como base de la biotecnologa y la biomedicina. La bioqumica es bsica para la formacin de organismos y alimentos transgnicos, la biorremediacin o la terapia gnica, y se constituye como faro y esperanza de los grandes retos que plantea el siglo XXI. No cabe duda de que los cambios que traer, beneficiarn enormemente a la humanidad, pero el hecho intrnseco de ser un conocimiento tan poderoso lo puede hacer peligroso, en este sentido es importante reas como la biotica que regulan la moralidad y guan el conocimiento biolgico hacia el beneficio humano sin transgresiones morales. El conocimiento bioqumico tiene grandes objetivos como progresar en la terapia gnica, por ejemplo contra el cncer o el VIH, desarrollar alimentos transgnicos ms eficientes, resistentes, seguros y saludables, aplicar los conocimientos bioqumicos a la lucha contra el cambio climtico y la extincin de especies, generar nuevos frmacos ms eficientes, investigar y buscar dianas de las enfermedades, conocer los patrones de expresin gnico, generar nuevos materiales, mejorar la eficiencia de la produccin industrial

Centrifugacin

La centrifugacin es un mtodo por el cual se pueden separar slidos de lquidos de diferente densidad mediante una fuerza centrfuga. La fuerza centrfuga es provista por una mquina llamada centrfugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento de rotacin que origina una fuerza que produce la sedimentacin de los slidos o de las partculas de mayor densidad. Los componentes ms densos de la mezcla se desplazan fuera del eje de rotacin de la centrfuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla se desplazan hacia el eje de rotacin. De esta manera los qumicos y bilogos pueden aumentar la fuerza de gravedad efectiva en un tubo de ensayo para producir una precipitacin del sedimento en la base del tubo de ensayo de manera ms rpida y completa.

Fundamento terico
El objetivo de la centrifugacin es separar slidos insolubles (de partculas muy pequeas difciles de sedimentar) de un lquido. Para ello, se aplica un fuerte campo centrfugo, con lo cual las partculas tendern a desplazarse a travs del medio en el que se encuentren con la aceleracin = velocidad angular2 x radio.

Tipos de centrifugacin

Centrifugacin diferencial: Se basa en la diferencia en la densidad de las molculas. Esta diferencia debe ser grande para que sea observada al centrifugar. Las partculas que posean densidades similares sedimentarn juntas. Este mtodo es inespecfico, por lo que se usa como centrifugacin preparativa para separar componentes en la mezcla (por ejemplo, para separar mitocondrias de ncleos y membrana) pero no es til para separar molculas. Centrifugacin isopcnica: Partculas con el mismo coeficiente de sedimentacin se separan al usar medios de diferente densidad. Se usa para la separacin de ADN con mucha frecuencia. Centrifugacin zonal: Las partculas se separan por la diferencia en la velocidad de sedimentacin a causa de la diferencia de masa de cada una. La muestra se coloca encima de un gradiente de densidad preformado. Por la fuerza centrfuga las partculas sedimentan a distinta velocidad a traves del gradiente de densidad segn su masa. Se debe tener en cuenta el tiempo de centrifugacin ya que si se excede, todas las molculas podran sedimentar en el fondo del tubo de ensayo. Ultracentrifugacin: Permite estudiar las caractersticas de sedimentacin de estructuras subcelulares (lisosomas, ribosomas y microsomas) y biomolculas. Utiliza rotores (fijos o de columpio) y sistemas de monitoreo. Existen diferentes maneras de

monitorear la sedimentacin de las partculas en la ultracentrifugacin, el ms comn de ellos mediante luz ultravioleta o interferones.

Equipos para centrifugacin


La centrifugacin en el laboratorio se realiza por medio de un aparato llamado centrifuga, en el cual se colocan tubos de ensayo que contienen la mezcla; la centrifuga gira con tal velocidad que separa el slido y lo deposita en el fondo del tubo. Luego se efecta una filtracin o una decantacin. Este procedimiento, es muy til cuando el slido que esta disuelto en el lquido es muy fino y no sedimenta.

Cromatografa

Sistema de cromatografa de gases, para registrar concentraciones de acrilonitrilo en el aire.

La cromatografa es un mtodo fsico o de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia y la fsica. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Las tcnicas cromatogrficas1 son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Despus de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separndose, pasan por un detector que genera una seal que puede depender de la concentracin y del tipo de compuesto. Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de los compuestos da como resultado una retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla. La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas sntesis).

Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad analtica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeas.

Clasificacin Mtodos de separacin: Clasificacin de la cromatografa


Tipos Cromatografa en papel Cromatografa en capa fina Cromatografa de gases Cromatografa lquida en fase inversa Cromatografa lquida en fase normal Cromatografa lquida de intercambio inico Cromatografa lquida de exclusin Cromatografa lquida de absorcin Cromatografa de fluidos supercrticos Fase mvil Lquido Lquido Gas Lquido (polar) Lquido (menos polar) Lquido (polar) Lquido Lquido Lquido Fase estacionaria

Las distintas tcnicas cromatogrficas2 se pueden dividir segn cmo est dispuesta la fase estacionaria:

Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales tcnicas son: o Cromatografa en papel
o

Cromatografa en capa fina

Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen:
o

Cromatografa de lquidos

o o

Cromatografa de gases Cromatografa de fluidos supercrticos

La cromatografa de gases , lo que incluye a numerosos compuestos orgnicos. En el caso de compuestos no voltiles se recurre a procesos denominados de "derivatizacin", a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilizen en las condiciones de anlisis. Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC, del ingls High Performance Liquid Chromatography ), que es la tcnica cromatogrfica ms empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carcter no polar, y la fase mvil posee carcter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporcin de la misma, o de otros disolvente polares, como por ejemplo metanol). El nombre de "reversa" viene dado porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de slice o almina, de carcter polar, y por tanto la fase mvil era un disolvente orgnico poco polar. Una serie eluotrpica, es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actan como fase mvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase estacionaria.

separacin de clorofilas mediante cromatografa en papel

A comienzos del ao 1903, Mijail Tsvet us columnas de adsorcin de lquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacan pasar a travs de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido de un material poroso que interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla, de forma que stos se separaban en distintas bandas coloreadas a lo largo de la columna.

Los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) comenz a desarrollarse en los aos 1960, aumentando su importancia en las dcadas siguientes, hasta convertirse en la tcnica cromatogrfica ms empleada. Sin embargo esto se ir modificando con el paso de los aos. Trminos empleados en cromatografa4

Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografa. Cromatografa analtica se emplea para determinar la existencia y posiblemente tambin la concentracin de un analito en una muestra. Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partculas de soporte o a las paredes internas de la columa. Cromatograma es el resultado grfico de la cromatografa. En el caso de separacin ptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la mezcla separada.

En el eje X se representa el tiempo de retencin, y en el eje Y una seal (obtenida, por ejemplo, a partir de un espectrofotmetro, un espectrmetro de masas o cualquier otro de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes analitos existentes en la muestra. En el caso de un sistema ptimo, la seal es proporcional a la concentracin del analito especfico separado.

Cromatgrafo es el equipo que permite una separacin sofisticada. Por ejemplo, un cromatgrafo de gases o un cromatgrafo de lquidos. Cromatografa es el mtodo fsico de separacin en el cual los componentes que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra (la fase mvil) se mueve en una direccin definida. Efluente es la fase mvil que atraviesa la columna. Serie eluotrpica es una lista de disolventes clasificados segn su poder de dilucin. Fase inmovilizada es una fase estacionaria que est inmovilizada sobre partculas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna.

Cromatograma correspondiente a una cromatografa liquida en fase reversa para compuestos fenlicos

Fase mvil es la fase que se mueve en una direccin definida. Puede ser un lquido (cromatografa de lquidos o CEC). un gas (cromatografa de gases) o un fluido supercrtico (cromatografa de fluidos supercrticos). La fase mvil consiste en la muestra que est siendo separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el interior de la columna. En el caso de la cromatografa lquida de alta resolucin, HPLC, la fase mvil es un disolvente no-polar como el hexano (fase normal) o bien algn disolvente polar (cromatografa de fase reversa) y la muestra que va a ser separada.. La fase mvil se mueve a travs de la columna de cromatografa (fase estacionaria) de forma que la muestra interacciona con la fase estacionaria y se separa. Cromatografa preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de sustancia para un uso posterior, ms que para anlisis. Tiempo de retencin es el tiempo caracterstico que tarda un analito particular en pasar a travs del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas. Vase tambin: ndice de retencin de Kovats Muestra es la materia que va a ser analizada en la cromatografa. Puede consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es tratada en el curso del anlisis, la fase o fases que contienen los analitos de inters es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya separacin no resulta de inters es llamada residuo. Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado. Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la fase lquidamvil en cromatografa de lquidos. Fase estacionaria es la sustancia que est fija en una posicin en el procedimiento de la cromatografa. Un ejemplo es la capa de silica en la cromatografa en capa fina.

Electroforesis

Electroforesis.

La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico.1 La separacin puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte slido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a travs de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis libre). Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta medida a la carga elctrica de las molculas y a su masa. La electroforesis se usa en una gran mayora en la materia del ADN recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipptidos, y separar los diferentes polipeptidos resultantes de las variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso ms comn para el anlisis de mezclas de protenas o de cidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la protena. Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que las pequeas se movern mejor, ms rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida.

Electroforesis
La gran mayora de macromolculas estn cargadas elctricamente y, al igual que los electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y dbiles dependiendo de la constante de ionizacin de grupos cidos y bsicos. Por ejemplo los cidos nucleicos son policidos fuertes. Por lo general, para caracterizar la molcula se determina la velocidad a la que esta se mueve en un campo elctrico y se utiliza para determinar, en el caso de protenas, la masa molecular o para detectar cambios de aminocidos y separar cuantitativamente distintas especies moleculares; en el caso de cidos nucleicos se determina su tamao, medido en pares de bases

Velocidad de una molcula


Para separar distintas especies moleculares, se crea un campo elctrico para la molcula colocada en un lquido portador. Al generar este campo existir una intensidad pasando constantemente del polo positivo al polo negativo, por lo tanto, actuar una fuerza sobre la molcula y esta experimentar una aceleracin

hasta obtener una velocidad en la que la resistencia, por viscosidad del medio, neutraliza la fuerza impulsora, es decir, la molcula se desplaza con una velocidad constante.

Donde q es carga y E es la intensidad del campo elctrico. Se asume que la partcula es esfrica y a partir de la Ley de Stokes se obtiene que

donde R es el radio de la esfera, su velocidad y la viscosidad del fluido. Por lo tanto la velocidad ser:

Esta velocidad se alcanza a los pocos segundos, por consiguiente se puede concluir que es constante durante todo el experimento.

Movilidad molecular
La movilidad molecular ( ) es una magnitud caracterstica de la partcula o molcula que refleja la velocidad relativa a la fuerza del campo.

A partir de la ecuacin de velocidad se obtiene que:

Que tambin puede ser expresada por:

Donde

el nmero de electrones y

es la carga del electrn.

La movilidad depende de la carga de la partcula que, a su vez, depende del pH del medio en el que se encuentre. Por esta razn es necesario indicar el electrolito o el pH utilizado para determinar la movilidad.

Factores que afectan a la electroforesis


En general la electroforesis depende directamente del campo elctrico y este depende de distintos parmetros. Basndose en la ley de Ohm se tiene que

Diferencia de potencial (V): define el campo elctrico; la velocidad de avance es directamente proporcional a ella. Resistencia (R): la movilidad de las molculas es inversamente proporcional a ella. Intensidad (I) : cuantifica el flujo de carga elctrica, se relaciona directamente con la distancia recorrida por las molculas. Por ltimo, otro factor que afecta significativamente a la electroforesis es la temperatura, esta es importante puesto que por el efecto Joule el paso de una corriente elctrica va a producir calor y este es directamente proporcional a la diferencia de potencial y a la resistencia. Por lo tanto, es necesario controlar de manera estricta la temperatura para que esta no afecte a la muestra desnaturalizndola.

Reaccin en cadena de la polimerasa

Gel de agarosa teido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad. La reaccin en cadena de la polimerasa , conocida como PCR por sus siglas en ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. NOTA: (TRABAJO ENCARGADO) 1.- Hacer un resumen de esta lectura, ENVIAR AL CORREO YA INDICADO. 2.- Hacer una lista de 30 trminos o palabras (frases) utilizadas en dicha lectura con su respectivo Significado o explicacin terica.

3.- Fecha de presentacin MARTES 05 DE Febrero 2013. 5 p.m. 4.- Las clases del da martes se postergan para el da jueves 07 de Febrero 2013 de 8 a 1 pm. Hunuco 01 de Febrero 2013 Atte: Lic. Csar Acosta Ingaruca UNHEVAL 3013.