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Analizadores de m/z

Caractersticas Caractersticas
Resoluo
Sensibilidade (Ciclo de trabalho) Sensibilidade (Ciclo de trabalho)
Discriminao
Exatido (erro de massa)
Tipo de feixe (contnuo pulsado) Tipo de feixe (contnuo, pulsado)
Possibilidade de acoplamento
Analisadores Analisadores
Setor Magntico
Quadrupolo Quadrupolo
Ion trap 3D
Ion trap Linear
Tof Tof
ICR
Orbitrap
Resoluo
Diferentes definies Diferentes definies
Depende do instrumento
Setor Magntico
Tof Tof
Quadrupolo
MSTerms:
Mass Resolution Mass Resolution
Smallest mass difference Am between two equal magnitude peaks so that the valley
between them is a specified
fraction of the peak height. p g
Mass resolving power
In a mass spectrum, the observed mass divided by the difference between two masses
that can be separated: m/Am.
The procedure by which Am was obtained and the mass at which the measurement was
made should be reported.
Parmetros de MS Parmetros de MS
Massa
Resoluo (FWHM)
Massa
A Massa
=
100
9.21e12 180.0634
180 0634 / 0 1107 = 1626
%
0.1107
180.0634 / 0.1107 = 1626
mass
179.800 180.000 180.200 180.400
0
Resoluo: 5000
100
( ) ( ) ( )
9.21e12 180.0634
100
4.39e12 1800.6339
1801.6339
%%
1802.6417
1803 6417
mass
180 181 182
0
181.0634
mass
1799 1800 1801 1802 1803 1804 1805 1806
0
1803.6417
1804.6417
180
1800
100
2.79e12 3602.2678
3601.2991
3603.2756
100
2.77e12 6004.3940
%
3604.2756
3605.2522
%
mass
3598 3600 3602 3604 3606 3608 3610
0 mass
5995 6000 6005 6010 6015 6020
0
3600
6000
Res
min
= 2 x Massa / Distncia
Resoluo: 10000 3000 e 1000 Resoluo: 10000, 3000 e 1000
Exatido de Massa (Erro) Exatido de Massa (Erro)
6
Erro (ppm) = Massa Medida Massa Terica x 10
6
Massa Terica
100
23.6 700.4645
Massa Terica = 700.4728
Erro = 700.4645 - 700.4728
%
701.4622
700.4728
702.4294
703.4597
- 11.8 ppm
m/z
700 701 702 703 704
0
Setor Magntico Setor Magntico
Setor Magntico Setor Magntico
Setor Eltrico Setor Eltrico
Dupla focalizao Dupla focalizao
EBE EBE
Francis Aston Francis Aston
1919
Francis Aston constri o primeiro
espectrgrafo de massa com focalizao espectrgrafo de massa com focalizao
de velocidade com poder de resoluo de
130.
1937
Aston constri um espectrgrafo de massa
com poder de resoluo de 2000 com poder de resoluo de 2000
Descobriu 212 dos 287 istopos naturais
1922 Nobel Prize in Chemistry "for his discovery, by means of his mass spectrograph,
f i t i l b f di ti l t d f hi i ti f of isotopes, in a large number of non-radioactive elements, and for his enunciation of
the whole-number rule
Aston Aston
Aston
Alfred Nier Alfred Nier
Caractersticas Caractersticas
Alta resoluo (~50.000)
Alta exatido (~ 10-20 ppm) Alta exatido ( 10 20 ppm)
Analizador discriminativo
Feixe contnuo
Acoplamento c/ Analisadores de alta E Acoplamento c/ Analisadores de alta E
c
Misso Viking Misso Viking
Espectrmetro de Massa Viking Espectrmetro de Massa - Viking
Primeiro Espectro de Marte ! Primeiro Espectro de Marte !
Espectro de Titan Espectro de Titan
Misso Phoenix (Maio/08) Misso Phoenix (Maio/08)
Design & Implementation: In concert with TEGA The M/S will measure Design & Implementation: In concert with TEGA, The M/S will measure
the ratios of the isotopes of C, N, O, H, Ne, Ar, Kr, and Xe. It will also
sample Martian atmosphere and support the MET experiment by measuring
humidity. The double focusing magnetic-sector mass spectrometer (MS)
emplo s a modified Matta ch Her og geometr offering simplicit of employs a modified Mattauch-Herzog geometry, offering simplicity of
design, stability, good mass resolution and mass rejection ratio, superior
abundance sensitivity, and minimal electromagnetic interference. Gases are
admitted from the ovens or from the atmosphere through a leak, or from a
t t th t ti ll ll th CO2 t i iti it gas concentrator that removes essentially all the CO2 to improve sensitivity
for lower abundance species by a factor of at least 10. The electron beam
ionizer is controlled by a microprocessor to produce two emission currents
(25A and 250A) and four electron energies (from 75eV to 20eV). This
d h d i b f f 10 d h l id if l l extends the dynamic range by a factor of 10 and helps identify molecular
constituents by varying their cracking patterns and charge states. Pumping
consists of a non-evaporable getter to maintain the analyzer section at <
1x10-7 Torr, and a mini sputter-ion pump, like that flown in the Pioneer p p p
Venus instrument, to remove argon. Electronics consist of low and high
voltage power supplies, an emission controller, preamplifiers, signal
conditioning and control circuits, and a microprocessor
Calutron Calutron
Calutrons
Main Calutron patents:
U.S. Patent 2709222 Methods of and apparatus for separating materials (Ernest O. Lawrence) pp p g ( )
U.S. Patent 2719924 Magnetic shims (Robert Oppenheimer and Stanley Frankel)
U.S. Patent 2847576 Calutron system (Ernest O. Lawrence)
Razo Isotpica Razo Isotpica
IRMS IRMS
Razo Isotpica Razo Isotpica
Razo Isotpica p
IRMS IRMS
Razo Isotpica Razo Isotpica
IRMS IRMS
IRMS IRMS
Quadrupolo Quadrupolo
Quatro plos acoplados diagonalmente
Idealmente hiperblicos Idealmente hiperblicos
Substitui-se por circulares
C Voltagem RF e DC
Quadrupolo Quadrupolo
D
D / d = 1.148
d
D
D / d 1.148
p/ Quad. circulares
Voltagens DC e RF Voltagens DC e RF
Voltagens DC: opostas p/ cada par
Voltagens RF: Defasadas em 180
0
p/ cada par
Quadruplos Quadruplos
Diagrama de Estabilidade de
Mathieu
Quadrupolo Quadrupolo
Quadrupolo DC/RF constante
Quadrupolo DC/RF Massa Quadrupolo DC/RF Massa
= Resoluo Unitria !
Descrio Qualitativa
+ 1900
500
0
DC = 500 V
900
RF = 1400 Vpp
- 900
0
+ 900
- 500
- 1900
O quadrupolo O quadrupolo
Quadrupolo sintonizado para
Gerador DC/RF
m/z 200 e on de m/z 200
Freqncia=880kHz Freqncia = 880 kHz
comprimento = 20 cm
potencial de acelerao = 10 V p
tempo de permanncia
aproximado = 64 s
O quadrupolo O quadrupolo
Quadrupolo sintonizado para
Gerador DC/RF
m/z 200 e on de m/z 200
Freqncia=880kHz Freqncia = 880 kHz
comprimento = 20 cm
potencial de acelerao = 10 V p
tempo de permanncia
aproximado = 64 s
O quadrupolo q p
Gerador DC/RF
ro ro
ro ro
YZ
ro ro
XZ
ro ro
XZ
m/z 204 m/z 196
Quadrupolo sintonizado para m/z 200
Fatores Importantes Fatores Importantes
Resoluo ~ nmero de ciclos RF
Comprimento p
Velocidade
Frequncia Frequncia
Paralelismo muito importante !
Quadrupolo: Caractersticas Quadrupolo: Caractersticas
Simples
Baixa resoluo (1 Da) Baixa resoluo (1 Da)
Varredura discriminatria
Espectrometria de Massas
Sequencial
E d i d t i d Emprego de mais de um estgio de
anlise de m/z
Estgios distribudos no espao (triplos
quads) ou no tempo (ion traps) q ) p ( p )
Conjunto de experimentos
Designados por MS/MS (MS
2
) Designados por MS/MS (MS
2
),
MS/MS/MS (MS
3
), ..
Funo de estabelecer um nova dimenso
de massas
MS/MS MS/MS
Experimentos:
Varredura (MS) ( )
SIM (MS)
SRM / MRM (MS/MS) SRM / MRM (MS/MS)
Varredura de ons Produtos (MS/MS)
Varredura de ons Precursores (MS/MS)
Varredura de Perda Neutra (MS/MS) ( )
Dissociao Induzida por Coliso
(CID)
Fatores que afetam a fragmentao: Fatores que afetam a fragmentao:
-Espcie gasosa ( massa
2
)
-Presso Presso
-on (molcula e carga)
-Energia de Coliso
Monitoramento Seletivo de Reaes
Tipos de
Varredura de ons Produtos
Tipos de
Experimentos
Varredura de ons Produtos
MS/MS
Varredura de ons Precursores
Varredura de Perda Neutra
Espectrometria de Massas Espectrometria de Massas
Sequencial q
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det
M
1
M
2
Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det
M
1
M
2
Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det
M
1
M
2
Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det
M
1
M
2
Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det
M
1
M
2
Det Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. Fonte Q1 q2 Q3 q4 Q5 Det. Det
MS/MS ou MS MS/MS ou MS
22
tipo Varredura de tipo Varredura de
P d t P d t ons Produtos ons Produtos
100
2.81e3
149.08
84.99
181.12
%
99.03
195.13
301.24
209.13
223.11
415 33 31 23
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
m/z 0
249.16 437.31
415.33 317.23
453.31
100
35
544.93
% 544.84
545.41
m/z 0
156.16
536.37 496.94
447.31 197.18
425.31
363.98
345.16
315.21
545.96
547.44
548.52
631.55
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
100
158
169.18
156.14
%
70 07
129 15
544.99
243.19
503.43 311.29
547.47
892.68
547 55 631 52
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
m/z 0
70.07
129.15
300.27
446.87
356.32
373.30
547.55 631.52
548.41
778.63
650.53
737.61 779.69
893.81
933.88
991.86
MS/MS MS/MS
Interpretao Interpretao Interpretao Interpretao
MS/MS: on Precursor
Fonte Q1 q2 Q3
Q1 Varredura Q1 Varredura
Q3 Fixo
Fonte Q1 q2 Q3
Fonte Q1 q2 Q3 Fonte Q1 q2 Q3
Ligao Cruzada
(Cross Linking) (Cross-Linking)
HN
C
O
NH
C
O
HN
C
O
NH
C
O
a
b
b
H
2
N CH C
O
GCREVT NH CH C O GCREVT C O
m/z 1040 5 m/z 1012 5
H
2
N CH C
O
CH
NH
a
a
m/z 1040.5
b
8
m/z 1012.5
a
8
/b
7
C
O
C
O
C
O
C
O
HN
C
N
C
HN
C
N
C
NH
2
H
m/z 1012.5
GCREVT C O H
2
N CH C
O
m/z 995.5
a
8
-17/b
7
GCREVT C O H
2
N CH C
O
- GCREVT
O
O
HN
C
N
C
N
O
O
N
O
O
NH
2
H
2
N CH C O
m/z 350.2
a
8
-17/b
7
/y
11
m/z 222.1
m/z 239
Figura 9 Fluxograma Figura 9 - Fluxograma
m/z 222.1494
or 239 1759
No
No DSS MS/MS Spectra
or 239.1759
Yes
m/z 305.2229
No
Dead-end XL
Yes
m/z 147.1134
and 175.1195
No
Inter/Intra XL
Yes
Inter XL
Hemoglobina (TIC) Hemoglobina (TIC)
PIS m/z 222
Mioglobina c/
S /
Cross-Linking
PIS m/z 239
PIS / 305 PIS m/z 305
Efeito da Energia de Coliso
Energias de Coliso para
m/z 222
772PC
449PC
519PC
515PC
60
80
100
n
s
i
t
y

(
%
)
449PC
60
80
100
n
s
i
t
y

(
%
)
515PC
20
40
R
e
l
a
t
i
v
e

2
2
2

I
n
t
e
n
20
40
R
e
l
a
t
i
v
e

2
2
2

I
n
t
e
n
Intra 2+
Intra 3+
10 20 30 40 50 60 70
0
CE (eV)
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
CE (eV)
613PC
Intra 2+
Intra 3+
60
80
100
s
i
t
y

(
%
)
820PC
60
80
100
e
n
s
i
t
y

(
%
)
20
40
60
R
e
l
a
t
i
v
e

2
2
2

I
n
t
e
n
s
20
40
R
e
l
a
t
i
v
e

2
2
2

I
n
t
e
525PC
619PC
547PC
409PC
Inter 2+
I t 3+
10 20 30 40 50 60
0
CE (eV)
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
0
CE (eV)
Inter 2+
Inter 3+
MS/MS: Perda Neutra
Fonte Q1 q2 Q3
Q1 Varredura Q1 Varredura
Q3 Q1 x Da
Fonte Q1 q2 Q3
Fonte Q1 q2 Q3 Fonte Q1 q2 Q3
Ion Trap 3D Ion Trap 3D
+
Ion Trap 3D Ion Trap 3D
Armadilha inica desenvolvida por Wolfgang
Paul (Nobel de Fsica de 1989)
Ion trap Ion trap
Diagrama de estabilidade Diagrama de estabilidade
Aprisionamento RF Aprisionamento RF
Aprisionamento RF Aprisionamento RF
Ion Trap Ion Trap
Consiste de um eletrodo em forma de
Anel e dois eletrodos tampa p
Conectados uma voltagem RF/AC
F t i l il t d Forma um potencial oscilante de
aprisionamento
Segue a equao de Mathieu
Sequencia de Eventos (MS) Sequencia de Eventos (MS)
Aprisionamento
Resfriamento Resfriamento
Varredura
Deteco (por instabilidade de rbita)
Sequncias no Tempo !!!
Aprisionamento Aprisionamento
Lentes na entrada do Ion trap permitem a
entrada de ons no trapp
Aps um certo tempo, muda-se a
voltagem da lente bloqueando a entrada voltagem da lente bloqueando a entrada
Cuidado tem de ser tomado para no
acumular muitos ons
Razo espao/carga critica !! (repulso Razo espao/carga critica !! (repulso
dos ons)
Gs de Resfriamento Gs de Resfriamento
ons tem uma distribuio de velocidade
inicial ao entrar no IT
O ion trap preenchido com He (1 mTorr)
lid H b i i d ons colidem com He a baixas energias de
coliso e so cinticamente resfriados
ons so acumulados no centro do trap,
diminuindo a disperso diminuindo a disperso
Varredura Varredura
Aps o resfriamento, faz-se uma rampa da
voltagem RF g
Ions deixam de ter trajetrias estveis e
so ejetados para fora do trap so ejetados para fora do trap
Detector captura (parte) desses ons
ejetados
Eficincia de Apriosionamento Eficincia de Apriosionamento
Eficincia de Dissociao Eficincia de Dissociao
Efeito na Resoluo Efeito na Resoluo
Velocidade de Varredura vs
Resoluo
Velocidade de Varredura vs
Resoluo
Velocidade de Varredura vs
Resoluo
Chemical Shift Chemical Shift
Interaes entre os ons causam desvio
de rbita dentro do trapp
Provoca um erro de massa em alguns
casos casos
Chemical Shift Chemical Shift
N b il b N-butil-benzeno
Chemical
Shift
Fonte Fonte
Fonte de ons deve ficar afastada do trap
Possibilidade de reaes on molcula Possibilidade de reaes on molcula
(CI)
U i d f Usa-se um guia de ons para fazer a
transferncia de ons
Espectrometria de Massas
Sequencial no Tempo (IT)
Eventos de anlise de m/z, dissociao e
anlise de m/z ocorrem no IT
Eventos ocorrem no tempo
i li d / i i t nico analizador m/z, vrios experimentos
Dissociao realizada com He ssoc ao ea ada co e
Nova fonte de RF excita os ons
a ialmente pro ocando o a mento da axialmente, provocando o aumento da
energia interna Dissociao
Diagrama Diagrama
m/z = 10
m/z = 50
m/z = 100
Diagrama Diagrama
MS
MS/MS
Tempo das Etapas de anlise
de m/z no LIT
Low Mass Cut Off (LMCO) Low Mass Cut-Off (LMCO)
Nas condies de CID, os valores de
ons de massa baixa no so estveis ons de massa baixa no so estveis
nessas condies
1/3 d ons com massa < 1/3 do precursor so
ejetados
LMCO LMCO
Precursor
MS
n
MS
n
Experimentos de MS sequancial com
n > 2 so possveis sem custo p
Basta repetir os ciclos de seleo,
resfriamento dissociao e varredura resfriamento, dissociao e varredura
Limitado pela sensibilidade (somente 1
acumulao !)
Aplicaes c/ n=3 demonstrado c/ n=12 Aplicaes c/ n=3, demonstrado c/ n=12
Ion Trap Linear (LIT)
Outra forma de Trap Outra forma de Trap
Consiste em um arranjo quadrupolar com
lentes de entrada sada lentes de entrada sada
Vrias melhorias em relao ao 3D:
Maior capacidade
Menor LMCO
Menor (ausncia ?) de chemical shifts
Dois tipos extrao: Dois tipos extrao:
Radial (Thermo)
Axial (Applied Biosystems) Axial (Applied Biosystems)
LIT LIT
LIT LIT
Instrumentos Instrumentos
Applied
Q q LIT
Instrumentos Instrumentos
Thermo
LTQ
IT de dupla cela (HP e LP) IT de dupla cela (HP e LP)
Time of Flight (TOF) Time-of-Flight (TOF)
Princpio mais simples dos analizadores
Ions so acelerados por uma voltagem Ions so acelerados por uma voltagem
constante
A l id d d d d d As velocidades dos ons dependem da
razo m/z
Mede-se o tempo que o on leva para
percorrer uma certa distncia percorrer uma certa distncia
Tof Tof
Fli ht T b I S
m K T =
F I
+
Flight Tube Ion Source
l
i
g
o
n
+
2
0
g
h
t
S
o
u
k
V
T
u
b
r
c
e
V
K T
e
m K T =
Tof (Linear) Tof (Linear)
Analisador Pulsado (no contnuo) Analisador Pulsado (no-contnuo)
Grande sensibilidade (No faz varredura,
Vantagem de Fellgett)
Sem limite terico de massa Sem limite terico de massa
Baixo Custo
Baixa resoluo (100-400) devido
disperses disperses
Disperses em TOF Disperses em TOF
Disperso espacial: ons esto em
posies diferentes em relao placa de p p
acelerao
+
+
Disperses em TOF Disperses em TOF
Disperso Temporal: ons so formados
em tempos diferentes p
Formado depois
+
Formado antes
+
Disperses em TOF Disperses em TOF
Disperso Temporal: ons so formados
em tempos diferentes p
Formado depois
+
Formado antes
+
Disperses em TOF Disperses em TOF
Disperso Cintica: ons com velocidades
diferentes
+
+
Disperses Disperses
Causam baixa resoluo
Podem ser compensados: Podem ser compensados:
Extrao pulsada c/ gradiente
E t t d Extrao atrasada
Refletor
Extrao Atrasada c/ Gradiente
(DE)
+
Ions de mesma massa,
mas diferentes posies
0 V
Detector
+
+
+
0 V
Detector
+
+
+
+20 kV
+18 kV
+
+
20 kV
+18 kV
0 V
+
+
0 V
+
+
Extrao Atrasada Extrao Atrasada
Massa Otimiz = 5730
0
n

1
4
0
0
0
5
8
0
0
Massa Otimiz 5730
Massa Otimiz = 5730
e
s
o
l
u
t
i
o
n

3
8
0
0
R
e
s
o
l
u
t
i
o
n
R
e
s
o
l
u
t
i
o
n

5
R
e
Massa Otimiz = 2400
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Massa Otimiz = 2400
R
e
s
o
l
u
t
i
o
n

1
R
e
s
o
l
u
t
i
o
n

1
4
0
R
e
s
o
l
u
t
i
o
n

1
0
0
R R
Refletor Refletor
Flight Tube
Reflector
Detector
Ion Source
+
Reflector (Ion Mirror)
Refletor Refletor
Simultaneous Arrival
t th D t t
Faster ion
t k
Reflector
Detector
at the Detector takes
longer path
Detector
Slower ion
takes
shorter path
Ions of same
b t diff t
shorter path
2-Stage Electrostatic Mirror
mass but different
velocities
Tof DE Reflectron Tof DE Reflectron
Alta resoluo (10000-20000)
Alta exatido (~ 3-10 ppm) Alta exatido ( 3 10 ppm)
Limite de massa (at 8000 a 10000)
Menor sensibilidade
TOF TOF
Alta resoluo
Alta exatido Alta exatido
Anlise no-discriminatria
Alta sensibilidade p/ espectros
Anlise pulsada Anlise pulsada
Corrente Pulsada x Contnua Corrente Pulsada x Contnua
Perfeito acoplamento c/ MALDI
Para ESI / APCI / EI necessrio Para ESI / APCI / EI necessrio
transformar o feixe contnuo em pulsado
E t t l Extrao ortogonal
TOF c/ Feixe contnuo TOF c/ Feixe contnuo
Ci l d Ciclo de
trabalho
Define
Sensibilidade
MS/MS com TOF MS/MS com TOF
Requer um segundo analisador p/ seleo
de ons
Tof
Quadrupolo Quadrupolo
IT
timo p/ varredura de on produto
No possvel outros experimentos de No possvel outros experimentos de
MS/MS
*
Tof com MS/MS Tof com MS/MS
Analisadores de seleo:
Quadrupolo (Q-Tof) Q p (Q )
Tof (Tof-Tof)
IT (IT Tof) IT (IT-Tof)
Q Tof (V) Q-Tof (V)
Q Tof (W) Q-Tof (W)
Tof Tof Tof-Tof
IT Tof IT-Tof
Tof MS/MS Tof MS/MS
Quadrupolo melhor resoluo /
transmisso
Trabalha com baixas Ec
Tof opera em altas Ec (MALDI) Tof opera em altas Ec (MALDI)
IT (?) ( )
Orbitrap
Baseado no Trap de Kingdon
(1923) ( )
Aperfeioado pela geometria
por Knight (1981) por Knight (1981)
Tranformado em
Espectrmetro por Makarov Espectrmetro por Makarov
(1999)
Orbitrap Orbitrap
Orbitrap Orbitrap
{ } ) / l ( 2 / ) (
2 2 2
R R
k
U { } ) / ln( 2 /
2
) , (
2 2 2
m m
R r R r z z r U + =
r
z

Orbitrap Orbitrap
Movimento dos ons no Orbitrap Movimento dos ons no Orbitrap
z m
k
/
= e
w = Freq. Oscilao
k = Const. do Instrum.
m/z = O que ns queremos! q q
A.A. Makarov, Anal. Chem. 2000, 72: 1156-1162.
A.A. Makarov et al., Anal. Chem. 2006, 78: 2113-2120.
Ions de Diferentes m/z no Orbitrap Ions de Diferentes m/z no Orbitrap
Grande Grande
capacidade de
t armazenamento
Transformada de
Fourier -> m/z
Orbitrap
LIT Orbitrap LIT-Orbitrap
Orbitrap: Operao Orbitrap: Operao
Orbitrap Eventos Orbitrap - Eventos
Orbitrap Nmeros Orbitrap - Nmeros
Resoluo > 60,000 em m/z 400 a 1 seg , g
Resoluo Max. > 100,000 (FWHM)
Exatido < 5 ppm externa Exatido < 5 ppm externa
Exatido < 2 ppm calibrao interna
Faixa de Massa 50 2,000; 200 4,000
Velocidade 4 espectros p/ segundo Velocidade 4 espectros p/ segundo
(1 high-resolution
scan in the orbitrap + 3 MS/MS scans in the scan in the orbitrap + 3 MS/MS scans in the
LTQ)
Resolving Power vs Cycle Time Resolving Power vs Cycle Time
785.8419
R=5901 786 3435
20
40
60
80
100
R=5901 786.3435
R=5900
786.8447
R=5900
787.3463
R=6000
787.8453
R=5800
785.5934
R=6200
RP 7500
0.2 s
40
60
80
100
e

A
b
u
n
d
a
n
c
e
0
R 6200
785.8421
R=23801
786.3434
R=23900
786.8446
R=24000
787.3457
787 8471 785 5992
RP 30000
0.5 s
60
80
100
0
20
R
e
l
a
t
i
v
e
8 3 5
R=24100
787.8471
R=15600
785.5992
R=24300
785.8419
R=48101
786.3435
R=47700
786 8446
0 9
RP 60000
80
100
0
20
40
60
786.8446
R=48200
787.3458
R=47500
787.8477
R=42000
785.5994
R=47100
785.8413
R=94801
786.3428
R=95200
0.9 s
RP 100000
785.0 785.2 785.4 785.6 785.8 786.0 786.2 786.4 786.6 786.8 787.0 787.2 787.4 787.6 787.8 788.0 788.2
0
20
40
60
80
786.8442
R=93600
787.3458
R=98000
785.5989
R=95800
787.8477
R=89200
1.6 s
RP 100000
m/z
Exemplos Exemplos
100
1696.10560
60
70
80
90
100
d
a
n
c
e
1696.20570
1696.30552
1696.40580
1695.80587
Mi l bi 10
30
40
50
60
R
e
l
a
t
i
v
e

A
b
u
n
d
1696.50579
1695.60576
1696.70597
Mioglobina +10
90
100
10
20
1696.70597
1696.80571
1697.00309
1696.10651
1696.20677
1695.90599
50
60
70
80
90
1695.90599
1696.30703
1695.80572
1696.40729
1695.70545 1696.50755
20
30
40
50
1696.50755
1696.60780
1695.60518
1696.70805
1696.80830
1695.5 1696.0 1696.5 1697.0
m/z
10 1697.00881
Ultra Alta resoluo Ultra-Alta resoluo
Ressonncia Ciclotrnica de Ions Ressonncia Ciclotrnica de Ions
FTMS
Espectrometria de Massas com Ressonncia Ciclotrnica de ons (ICR) e
Transformada de Fourier
Comosarow & Marshal 1974
Espectrmetro de massas FT ICR ( 9 4 Tesla ) Espectrmetro de massas FT-ICR ( 9.4 Tesla )
FTMS
Espectrometria de Massas com Ressonncia Ciclotrnica de ons (ICR) e
Transformada de Fourier
Comosarow & Marshal 1974
FT-MS
- Uma cela cbica posicionada no centro de um ma supercondutor (~ 3-7 Tesla).
Os ons formados dentro da cela (ou ali injetados) se movem em uma trajetria
circular perpendicular ao eixo do campo magntico, de frequncia angular
(frequncia de ressonncia ciclotrnica) w proporcional ao campo magntico B e as (frequncia de ressonncia ciclotrnica) w
c
proporcional ao campo magntico B e as
suas m/z's:
w
c
= zeB/m
- Para evitar que ons escapem da cela, uma baixa voltagem dc aplicada aos
eletrodos de aprisionamento gerando um campo eltrico E perpendicular ao campo
magntico B.
- Uma voltagem rf aplicada aos eletrodos transmissores (laterais). Varre-se ento
rapidamente a frequncia da voltagem rf (pulso) mantendo-se B constante. Quando a
frequncia de rf (w
rf
) se iguala a frequncia angular de oscilao de algum on: w
c
,
este absorve energia com aumento de velocidade e do raio de sua orbita mas sem este absorve energia com aumento de velocidade e do raio de sua orbita mas sem
alterar a frequncia de sua oscilao. Aps poucas rotaes, os ons que absorveram
energia estaro se movendo sincronizadamente. Esta oscilao ciclotrnica sentida
pelos eletrodos receptores (superior e inferior), produzindo uma corrente com
frequncia iqual a w
c
. Rpida variao de w
rf
pode ser realizada, sendo o espectro de
massas obtido pela aplicao de FT.
- Princpio bsico: Aprisionamento de ons em uma campo magntico/eltrico,
seguido da medida de suas frequncias de ressonncia ciclotrnica.
FTMS FTMS
Detector
plate
Trapping
plate
Detection on
frequency spectrum
Magnetic
fi ld B
Excitation
plate
frequency spectrum
field, B
Excitation on, one frequency (RF)
excites one m/z
FTMS FTMS
Princpios de operaco do ICR (FTMS) c p os de ope c o do C ( S)
Partculas carregadas iro apresentar ummovimento circular
i f i i l i emumcampo magntico comuma frequncia ciclotrnica
relacionadaaoseuvalor dem/z !
FF = = zz ((vv x x BB))
F = massa . acelerao
r
F
=
mv
2
r
zvB
=
mv
2
r m
e
c =
v
=
zB
2t 2tm
v
c =
e
c =
zB
z 2tv
c
m
=
B
Illustration of how the image current is obtained. As the ion(s) in a circular orbit approach
the top plate, electrons are attracted to this plate from ground. Then as the ion(s) circulate
towards the bottom plate the electrons travel back down to the bottom plate This motion of towards the bottom plate, the electrons travel back down to the bottom plate. This motion of
electrons moving back and forth between the two plates produces a detectable current.
Caractersticas principais FT-MS
- Altssima resoluo (funo de B como em RMN) que diminue
com o aumento de m/z.
- Anlise no-discriminatria (e no destrutiva). Alta
sensibilidade. 10-100 ons precisam normalmente oscilar para
serem sentidos pelos eletrodos receptores.
- Alto custo (supercondutores), difcil manuteno.
- MS
n
. Operao semelhante aos ion-traps.
- Trabalham sob altssimo vcuo (< 10
-8
Torr) enquanto a
quantidade de ons aprisionados na cela pequena ("charge-
spacing").
- Muito utilizados em estudos de reaes on-molcula (estudos
cinticos) e em anlise de altssima resoluo-preciso.
Instrumentos Hbridos Instrumentos Hbridos
Instrumentos Hbridos Instrumentos Hbridos
Instrumentos Hbridos Instrumentos Hbridos
The APEX-Q platform combines a Q-q- "front-end"
and a high field FTMS magnet (9.4 or 12 Tesla) for the
ultimate resolution proteomics mass spectrometer.
QqFT-MS
Instrumentos Hbridos Instrumentos Hbridos
Petrolemica Petrolemica
Petrolemica Petrolemica
Petrolemica
http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/magnetacademy/fticr/page10.html
Grfico de Kendrick
Analisadores Analisadores
Analis Res Exat Varredura MS
n
Sens Monit Sens Varr Analis. Res Exat Varredura MS Sens Monit Sens Varr
B
50.000 10 Discr. - +++ +
Q
U it N Di 2 +++++ +
Q
Unit Nom Discr. 2 +++++ +
IT
Unit Nom Discr. +
Acumula
10 ++ +++
Acumula
o
TOF
40.000 2 No Discr. 2 ++ ++++
O
Orbit
rap
100.000 2 Disr+Acum
ulao
10 + ++++
rap
ICR
1.000.000 1 No Discr. - ++ ++++
Mtodos Alternativos de
Dissociao
CID o mtodo mais comum
Eficiente e simples p
Para ICR, CID no possvel
O C Outros mtodos para ICR
SORI
IRMPD
ECD ECD
SORI SORI
Irradiao sustentada prxima da
ressonncia
Pulso de gs injetado na clula de ICR
U RF ili ( b i d f d Um RF auxiliar (abaixo da freq. de
ressonncia do on) adicionado aos ons
A acelerao promove fragmentao
Somente fragmentao primria Somente fragmentao primria
observada
IRMPD IRMPD
Dissociao multifotnica no
infravermerlho
Laser de IV (CO
2
) usado para irradiar os
ons ons
Bombeamento vibracional leva
dissociao
Evento sincronizado com o ICR Evento sincronizado com o ICR
IRMPD IRMPD
Dissociao por Captura de
Eltrons (ECD)
Um feixe de eltrons direcionado para a cela
de ICR
Os eltrons so capturados pelos ons positivos
e ganham energia g g
Essa energia usada para dissociar os ons:
(M + 4H+) + e- (M + H + 3H+)** (M + 4H+) + e (M + H + 3H+)
(M + H + 3H+)** fragmentos
Funciona somente para ons multicarregados
SORI / IRMPD / ECD
Anlise Quantitativa Anlise Quantitativa
MS muito sensvel
MS muito verstil (qualquer analito) MS muito verstil (qualquer analito)
MS muito rpido
MS muito robusto
Feito atravs de monitoramento (Q!!!) Feito atravs de monitoramento (Q!!!)
GC-MS
LC-MS (?)
LC MS/MS (!!!!) LC-MS/MS (!!!!)
GC MS GC-MS
EI fornece fragmentos / Ion molecular
GC tem alta resoluo GC tem alta resoluo
Quantificao feita atravs de
it t d 1 i monitoramento de 1 ou mais ons
Maior a massa Maior seletividade a o a assa a o se et dade
Tempos razoavelmente longos
Necessidade de derivatizao em vrios
casos
LC MS LC-MS
APIs no fornecem fragmentos
Necessidade de monitorar MH
+
Necessidade de monitorar MH
HPLC menor resoluo que GC
No necessita de derivatizao
Grande nmero de interferentes Grande nmero de interferentes
Longos tempos de corrida
SRM SRM
Monitoramento do fragmento
Maior especificidade Maior especificidade
Menor tempo de anlise
Tratamento de amostra mnimo
Quase universal Quase universal
Mltiplos analitos (MRM)
SRM SRM
FK 506: imunosupressor FK-506: imunosupressor
Preparao da amostra (LC) Preparao da amostra (LC)
1. Wash all glassware in methanol x2 and tert-butyl methyl ether (TBME) x2. g y y ( )
2. Place 50L of internal standard (in methanol) into each screw-cap glass tube.
3. Add 200L Sirolimus calibrator (5x concentrated in methanol) or 200L
methanol for patient samples.
4 Add 1 0mL blank whole blood to calibrators or 1 0mL patient whole blood 4. Add 1.0mL blank whole blood to calibrators or 1.0mL patient whole blood.
5. Add 2.0mL 0.1M ammonium carbonate buffer.
6. Mix thoroughly.
7. Add 7.0mL TBME and extract for 15min.
8. Transfer upper layer to clean tube and re-extract lower layer with 7.0mL TBME.
9. Combine TBME extracts and evaporate to dryness.
10. Redissolve residue in 5.0mL ethanol and evaporate to dryness.
11 Redissolve residue in 1 0mL ethanol transfer to Eppendorf tube and evaporate to 11. Redissolve residue in 1.0mL ethanol, transfer to Eppendorf tube and evaporate to
dryness.
12. Redissolve residue in 100L 85% methanol.
13. Inject 80L (equivalent to 800L whole blood) and analyse using two 4.6mm x
250mm C18 columns connected in series (30min run time).
Anlise por HPLC p
Preparao da amostra (MS) Preparao da amostra (MS)
SIM SIM
Interefentes ! Interefentes !
SRM SRM
SRM SRM
SRM SRM
10 minutos de corrida !
Supresso Inica Supresso Inica
Supresso Inica p
Supresso Inica Supresso Inica
Temas Temas
Anlise quant. LC-MS/MS
SIMS
Mobilidade inica
ICP / MS
Dissociao meta-estvel
(MIKES / PSD)
A li d t
Metablitos
(Metaboloma)
P l Si tti Anlise de protenas
Dissociao de peptdeos
M d Ci i
Polmeros Sintticos
Petrleo (ICR)
F d Mtodo Cintico
Reaes on/Molcula
Fragmentao de ons
negativos (ESI)
S l l id d
Linked Scan
BIRD
Supramolecularidade
Detectores
Supramolecularidade Supramolecularidade
Espcies supramoleculares so formadas
por ligao no covalentes: p g
Interao dipolo/dipolo (Ind. & Perm.)
Foras eletrostticas Foras eletrostticas
Ligaes H
ESI permite a caracterizao desses
complexos p
Difcil de caracterizar por outras tcnicas
Dmeros ligados por H
+
Dmeros ligados por H
Pseudorotaxanos Pseudorotaxanos
Catenanos Catenanos
Catenanos Catenanos
m/ 367 [M 4PF ]
4+
m/z 367 = [M4PF
6
]
4+
Complexos Grade Complexos Grade
Complexos Grade Complexos Grade
Vrias cargas => vrios BF
4
-
Vrias cargas => vrios BF
4
associados
Complexos Grade Complexos Grade
Complexos Geomtricos p
Chem. Eur. J. 2002, 3538
Complexos Geomtricos Complexos Geomtricos
Complexos Geomtricos Complexos Geomtricos
RMN ? RMN ?
IRMPD ! IRMPD !
Nmeros Mgicos Nmeros Mgicos
Anal. Chem. 2001, 73, 3646-3655
Estrutura Homoquiral Estrutura Homoquiral
Homoquiralidade Homoquiralidade
Anlise quiral Anlise quiral
Enantimeros tem propriedades qumicas
idnticas em meios aquirais q
nica excesso: desvio da luz polarizada
P dif i ti Para diferenciar enantimeros,
necessrio a formao de
diasteroismeros
MS tem capacidade de diferenciar MS tem capacidade de diferenciar
diasteroismeros
Anlise quiral Anlise quiral
Dissociao de Diasteroismeros Dissociao de Diasteroismeros
Anlise quiral Anlise quiral
Anlise quiral
Anlise quiral
Quantificao
Anlise quiral Anlise quiral
Possvel atravs da formao de
diasteroismeros
Complexos diasteromricos formados em
ESI ESI
Espectro de ons fragmentos apresenta
diferentes intensidades de fragmentos
Quantificao feita pela intensidade Quantificao feita pela intensidade
relativa dos fragmentos.
Mobilidade Inica Mobilidade Inica
Consiste em medir o tempo de vo de um
on atravs de um tubo de gs g
Presso, temperatura e voltagem de
acelarao cuidadosamente controlados acelarao cuidadosamente controlados
O tempo de vo inversamente
proporcional sesso de choque
FAIMS
FAIMS FAIMS
Mobilidade Inica Mobilidade Inica
Mobilidade Inica Mobilidade Inica
Mobilidade Inica Mobilidade Inica
Fragmentos de Peptdeo
Conformao x Carga Conformao x Carga
Mobilidade Inica
Sacardeos Sacardeos
Estados Eletrnicos
Conformao Conformao
Conformao Conformao
MS / MS
MS / IMS / MS
Mobilidade Inica Mobilidade Inica
Permite uma nova dimenso na anlise
por MS p
Analisa m/z e sesso de choque
I li Inmeras aplicaes
Comercial a partir de 2006 Co e c a a pa t de 006

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