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IDENTIFICATION ET VALUATION DE LEFFET PROBIOTIQUE DES BACTRIES LACTIQUES ISOLES DANS DES FROMAGES CAPRINS TRADITIONNELS
H. Dib, E. Hajj Semaan, R. Mrad, J. Ayoub, L. Choueiry, H. Moussa et G. Bitar Facult dAgronomie, Universit Libanaise, Dekwaneh, Liban ehajj@ul.edu.lb (Received 7 September 2010 - Accepted 7 June 2011) RSUM Dans le but didentifier la flore lactique des fromages caprins fabriqus de faon traditionnelle et de rechercher un effet probiotique, une analyse chimique et microbiologique de sept produits collects de diffrentes rgions libanaises a t ralise : Laban (L), Labneh Ambarise (LA), Labneh Serdalli (LS), Jebneh Darfieh (JD), Keshek (K), Shanklish (Sh) et Labneh Darfiyeh (LD). Le pH et lacidit ont t mesurs ; lisolation des bactries lactiques a t faite sur gloses slectives MRS et M17 ; les colonies isoles ont t identifies par les caractristiques morphologiques, coloration Gram, catalase et oxydase, production dammonium partir du glucose, croissance dans un bouillon MRS 10 et 45C, tolrance aux sels (2, 4 et 6.5% de NaCl), production de CO2 partir du glucose, ainsi que la fermentation des substrats carbons (API 50CHL et API 20Strep). Leffet probiotique a t valu par linhibition des bactries pathognes (Salmonella, Staphylococcus aureus et E. coli), la survie diffrents pH (1, 2, 3 et 7.2) et le temps ncessaire pour lacidification du lait entier et crm. Les chantillons de Labneh Ambarise et Labneh Darfiyeh avaient un pH moyen de 40.5 et une acidit moyenne de 2%0.1 (p/p), alors que le pH moyen et lacidit titrable du fromage Darfiyeh taient respectivement 5.22 et 0.62. Aucune prsence de bactries lactiques ne fut dtecte dans les chantillons de Labneh Ambarise et de Labneh Darfiyeh, prservs dans lhuile dolive. Dans les autres chantillons, vingt cinq souches ont t isoles et identifies ; neuf appartiennent aux Lactobacillus plantarum (L2, Sh2, K2, K3, K4, K5, LS1, LS3 et LS4) ; trois Lactobacillus paracasei spp. paracasei (Sh3, LS2 et LS5) ; cinq Leuconostoc mesenteroides spp. dextranicum 2 (JD1, JD2, JD3, JD4 et JD5); quatre colonies ont t souponnes tre Lactobacillus casei (L1, Sh4, K1 et K6); les quatre restantes seraient des levures (L3, L4, L5, L6). Les souches identifies ont t capables de produire des substances antimicrobiennes avec un maximum dinhibition de 20 mm contre Salmonella (K1, Sh4, LS1 et JD1), 21 et 19 mm contre Escherichia coli et Staphylococcus aureus respectivement (L2). pH = 3, la survie des colonies allait de 50% 93% pour Sh3, K2, LS2, LS5, JD1 et JD3. La croissance de ces bactries tait inhibe aux pH 1 et 2 (sauf pour JD1 et JD3). Le temps d'acidification du lait inocul par ces bactries tait suprieur 10 h en moyenne dpassant le temps d'acidification requis par les ferments lactiques du yaourt (5 h). Le Jebneh Darfieh, par la prsence de Leuconostoc mesenteroides, montre les caractristiques les plus intressantes pour sa tolrance au stress dacidit et son activit antimicrobienne maximale contre la salmonelle ; il pourrait tre utilis en tant que

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probiotique naturel. Les isolats des chantillons de Laban, Shanklish, Keshek et Labneh Serdalli (L. plantarum et L. paracasei principalement) taient sensibles au pH=2, avec une activit antimicrobienne importante contre les bactries pathognes; leur encapsulation peut les protger contre les conditions acides. Des tudes supplmentaires sont ncessaires pour dterminer lidentit exacte de certaines bactries et la nature des scrtions responsables de leffet probiotique. Mots-cls: caprins, fromages traditionnels, bactries lactiques, probiotiques ABSTRACT In order to identify lactic acid bacteria (LAB) associated with traditional goat cheeses and to assess their probiotic effect, chemical and microbiological analysis were carried out on seven products collected from different Lebanese regions: Laban (L), Labneh Ambarise(LA), Labneh Serdalli (LS), Jebneh Darfieh (JD), Keshek (K), Shanklish (Sh) and Labneh Darfiyeh (LD). These samples were analysed for their pH and acidity. The isolation of lactic acid bacteria was achieved using two selective media, namely MRS and M17 agar. Isolated strains were identified according to morphology, Gram staining, catalase and oxydase, ammonia production from arginine, carbon dioxide production from glucose, growth in MRS broth at 10C and 45C, salt tolerance (2, 4 and 6.5% of NaCl), sugar fermentation with API (Analytical Profile Index) system methods (50CHL and 20Strep). The probiotic potential of isolates to inhibit pathogenic bacteria (Salmonella, Staphylococcus aureus and E. coli), their survival at different pH (1, 2, 3 and 7.2), the time needed to reach acidification end point in full and skimmed milk were assessed. Labneh Ambarise and Labneh Darfiyeh had an average pH of 40.5 and a titratable acidity of 2%0.1 (w/w), while the average pH and titrable acidity of Darfiyeh cheese were 5.22 and 0.62 respectively. The presence of LAB in one year old samples preserved in olive oil could not be detected. Twenty five strains were isolated and identified from different samples, where nine of them belong to Lactobacillus plantarum (L2, Sh2, K2, K3, K4, K5, LS1, LS3 and LS4), three are Lactobacillus paracasei spp. paracasei (Sh3, LS2 and LS5) and five are Leuconostoc mesenteroides spp. dextranicum 2 (JD1, JD2, JD3, JD4 and JD5); four colonies are suspected to be Lactobacillus casei (L1, Sh4, K1 and K6) and four others are probably yeasts (L3, L4, L5 and L6). Identified strains showed a capacity to produce antimicrobial substances with maximum inhibition diameters of 20 mm against Salmonella (K1, Sh4, LS1 and JD1), 21 mm and 19 mm for L2 against Escherichia coli and Staphylococcus aureus, respectively. The microorganisms survival rate in simulated gastric juice (SGJ) varied between 50% and 93% at pH 3 (Sh3, K2, LS2, LS5, JD1 and JD3). Their growth was inhibited at pH 1 (0.05% to 0.08%); only JD1 and JD3 showed more then 50% of viability at pH 2. The time needed for milk acidification had an average of more than 10 h exceeding the time required by yogurt starter cultures (5 h). The Jebneh Darfieh sample, rich in Leuconostoc mesenteroides, showed the most interesting characteristics of cell viability at pH 2 (50% for JD1 and JD2) and a maximum of 20 mm of inhibition against Salmonella. It could be used as a natural source of probiotic. The isolates of the samples Laban, Shanklish, Keshek and Labneh Serdalli (L. plantarum and L. paracasei mainly) were more sensitive to high acidity (pH=2), but showed good antimicrobial activity against pathogens. Microencapsulation is probably required to protect them from harsh conditions. Further tests are needed to determine the exact identity of some strains and the nature of secreted substances responsible of the probiotic effects. Keywords: goat, artisanal cheese, lactic acid bacteria, probiotics

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INTRODUCTION Les probiotiques sont des micro-organismes qui, en quantit suffisante, exercent un effet positif sur la sant (Corthier, 2006). Ils ont un rle important dans l'amlioration de la digestion et du transit intestinal, le maintien de l'quilibre de la flore intestinale et de l'quilibre acido-basique au niveau du clon. Les bactries lactiques forment actuellement un groupe dorganismes utiliss pour l'enrichissement de certains yaourts et laits (Klaenhammer et al., 2007). Cette utilisation est due aux effets nutritionnels et thrapeutiques de ces bactries car elles enrichissent le milieu o elles se trouvent en vitamines (B et K), acides amins, composs organiques (acides lactique et actique), enzymes (lactase) et bactriocines responsables de l'inhibition des bactries pathognes (Soomro et al., 2002). Les bactries les plus frquemment utilises comme probiotiques sont des Lactobacillus et des Bifidobacterium (Khan & Ansari, 2007). Les lactobacilles ont t incorpors dans des laits ferments (Heller, 2001 ; Oliveira et al., 2001), des fromages (Gomes & Malcata, 1998 ; Nayra et al., 2002) et des glaces (Christiansen et al., 1996). Par ailleurs, toute souche bactrienne isole, productrice de probiotiques, devrait rsister des conditions trs varies telles l'exposition aux enzymes digestives des cavits buccale et gastrique, au pH acide de l'estomac, la teneur rduite de l'O2 dans l'intestin, une temprature pas toujours optimale... En effet, les laits ferments contiennent des bifides et des lactobacilles (Lactobacillus casei ou Lactobacillus acidofilus) qui transitent avec laliment, mais plus de 95% meurent en chemin. Les plus fortes mortalits sont observes dans lestomac qui est un milieu trs acide, au dbut de lintestin grle dont les cellules produisent des dfensines, et dans le gros intestin sous laction de la microflore autochtone. De plus, pour qu'elles soient efficaces, ces bactries doivent tre administres vivantes et en nombre trs important, avec 106 dunits formant colonies (ufc) par gramme du produit jusqu' la date d'expiration (Charteris et al., 1998). Le Liban est un pays riche en produits caprins traditionnels (Jebneh Darfieh, Labnet el jarra, Shanklish, Keshek, Labneh Darfiyeh, Chnini, Ambarise) non valoriss jusqu' prsent. Aprs lanalyse de leur valeur hyginique (Chedid, 2007), cette tude vise isoler et identifier les bactries lactiques. La rsistance des souches isoles diffrentes conditions de temprature, de salinit, dacidit ainsi que leurs effets en prsence de souches pathognes sont galement tudis afin de prouver une potentielle activit probiotique, ce qui amnerait leur utilisation l'chelle industrielle. MATRIEL ET MTHODES Echantillonnage Des chantillons de produits fromagers caprins traditionnels sont prlevs chez les leveurs dans des milieux ruraux et transports 4 C dans des flacons striles pour l'analyse microbiologique. La distribution rgionale et le nom des chantillons collects sont prsents dans le Tableau 1. Analyses chimiques Le pH (Hanna pH meter) et lacidit titrable (A.O.A.C., 1995 ; Chammas, 2006) ont t mesurs.

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TABLEAU 1 Distribution Rgionale et Nom des Echantillons Collects Bqaa de lOuest Aakkar (Aydamoun) Laban (L) Shanklish (Sh) Keshek (K) Nord (Bcharre) Sud (Rmeich) Mont Liban (Chouf)

Rgions

Echantillons

Labneh Ambarise (LA)

Jebneh Darfieh (JD)

Labneh Darfieh (LD)

Labneh Serdalli (LS)

Analyses microbiologiques Les chantillons collects ont t conservs au maximum 24h 4 C avant dtre analyss. Ils ont t dilus (10-3 10-6) puis ensemencs sur milieux de culture gloss slectifs. Les lactobacilles ont t dnombrs sur milieu MRS (Scharlau SA Barcelona, Spain) mis incuber 37 C pendant 72 h en anarobiose (gnrateurs de CO2, Bio Mrieux SA, France). Le dnombrement des streptocoques a t ralis sur milieu M17 mis incuber 37C pendant 48 h en arobiose (Oxoid, 2007). Chaque chantillon a t ensemenc sur trois botes de chacun des milieux. Aprs une description morphologique, des tests biochimiques ont t raliss pour ltude des caractristiques physiologiques des bactries lactiques. Les bactries Gram positive et catalase ngative ont t identifies par les tests suivants : oxydase (Health Protection Agency, 2010), production de CO2 partir du glucose, croissance en milieu hypersal (2, 4, 6.5, 8 et 10%), croissance 10 et 45 C, et fermentation des sucres avec les galeries API (API 50 CHL, Bio Mrieux, France) pour lidentification des Lactobacillus sp. et Leuconostoc sp., et API 20 Strep pour lidentification des Lactococcus sp., Streprococcus sp. et Pediococcus sp. (API 20 Strep, Bio Mrieux, France). Evaluation de leffet probiotique Trois paramtres ont t tests pour lvaluation de lactivit probiotique des colonies isoles sur les deux milieux MRS et M17. Lactivit antimicrobienne des bactries isoles a t teste sur la croissance de Salmonella spp., Staphylococcus aureus et Escherichia coli obtenues de lInstitut de la Recherche Agronomique Libanais (IRAL-Fanar). Le diamtre de la zone dinhibition a t calcul par la mthode de diffusion sur glose (Yang, 2000). La survie des bactries dans un milieu simulant le jus gastrique (pH = 1, 2, 3) a t estime par la mthode de Gibson et al. (2005) en comparaison avec un tmoin (pH=7.2).

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Le test dacidification du lait a t tudi de la manire suivante: 200 ml de lait entier ou crm ont t inoculs avec la bactrie tester et mis incuber 37 C ; le pH a t mesur toutes les 30 min (Moreton, 1998) jusqu' atteindre le point final dacidification de pH=4.6 (Sodini et al., 2002). Deux probiotiques commerciaux lyophiliss et base de bactries lactiques ont t analyss en parallle aux bactries isoles dans les fromages traditionnels pour le comptage, lidentification et la recherche de leur effet probiotique. Ce sont (i) l'Infloran (Laboratorio Farmaceutico SIT Specialita Igienico Terapeutiche Srl, Italy) contenant principalement Lactobacillus acidophilus (au moins 109 ufc/g dans une capsule) et (ii) lAntibiophilus (Laboratoires Lyocentre, France) contenant Lactobacillus casei varit rhamnosus (au moins 8x108 ufc/g dans une capsule). RSULTATS ET DISCUSSION Acidit des chantillons collects Le Tableau 2 prsente le pH et lacidit titrable des chantillons analyss. On note lacidit la plus leve pour le Keshek (4.3). Elle est due probablement son mode de prparation partir de Laban acide ; cette valeur est comparable celle observe par Oner et al. (2004) sur un fromage turc caprin traditionnel. La plus faible valeur a t note pour le Jebneh Darfieh (0.62). TABLEAU 2 Paramtres Chimiques des Echantillons Analyss chantillons Labneh Ambarise Labneh Darfiyeh Labneh Serdalli Jebneh Darfiyeh Laban Shanklish Keshek Symbole LA LD LS JD L Sh K pH 3.55 4.26 3.67 5.22 4.30 4.94 Acidit titrable (%, p/p) 2.90 1.04 2.80 0.62 1.30 1.10 4.30

Bactries lactiques dans les produits caprins traditionnels Le Tableau 3 montre le nombre total de bactries poussant sur les deux milieux MRS et M17. Le Jebneh Darfieh est le plus riche en bactries lactiques poussant sur les deux milieux de culture avec un total de 7.5 x 108 CFU/mL; ce nombre est comparable celui isol dans le fromage Tulum (Oner et al., 2004). Pour le Labneh Ambarise (LA), labsence de bactries poussant sur les deux milieux (MRS et M17) serait probablement d au mode de conservation des chantillons dans

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lhuile dolive et/ou au salage important lors de la priode de maturation. Ceci serait responsable de linhibition de la croissance bactrienne lactique (Keceli et al., 2007). Le Laban et le Shanklish montrent un nombre comparable de bactries (1.8-2 x 107 CFU/ml) probablement cause dune acidit similaire responsable de la rduction de leur nombre (1.3 et 1.1 respectivement). Le nombre de bactries poussant sur MRS tant suprieur celui poussant sur M17, surtout pour le Keshek (3.4x107 contre 1.7x104), montre une prdominance de lactobacilles par rapport aux streptocoques. TABLEAU 3 Nombre Logarithmique Total des Bactries Poussant sur Glose MRS et M17 (Valeurs Log10) MRS (CFU/ml) Labneh Ambarise Labneh Darfiyeh Labneh Serdalli Jebneh Darfiyeh Laban Shanklish Keshek 7.00 6.81 8.60 7.18 8.29 7.53 M17 (CFU/ml) 7.00 5.43 8.54 6.52 5.98 4.23 Total (CFU/ml) 7.30 6.83 8.88 7.26 7.30 7.53

Les souches bactriennes isoles sur les milieux de culture ont t identifies par des tests biochimiques dont les rsultats sont prsents dans le Tableau 4. Vingt six colonies isoles sur MRS et M17 sont Gram positives, oxydases et catalases ngatives lexception de quelques souches montrant une catalase positive (Tableau 4). Ces dernires pourraient ne pas tre des bactries lactiques ou montreraient une fausse catalase par la prsence dune enzyme peroxydase. Les coques sont isoles dans le Laban et le Jebneh Darfieh ; dans les autres produits, des lactobacilles ont t exclusivement identifies. Parmi les lactobacilles identifis, les Thermobacterium ont t exclus car aucune bactrie na pouss 45C. De plus, et comme les colonies isoles sont toutes homofermentaires, les Betabacterium ont galement t exclus (Robinson, 2002). Les bactries appartenaient donc aux Streptobacterium (Singh & Sharma, 2009). En ce qui concerne les coques, les Entrocoques sont exclus car ces dernires poussent 45C (Todar, 2008) ; les Pdiocoques sont galement exclus, ce genre tant capable de produire de lammonium partir de larginine. Par la suite, les bactries isoles taient des Leuconostoc, Streptococcus ou des Lactococcus.

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TABLEAU 4 Caractristiques Morphologiques et Physiologiques des Colonies Isoles du Laban (L), du Shanklish (Sh), Keshek (K), Labneh Serdalli (LS) et du Jebneh Darfieh (JD) Bactrie isoles P R O D U I T L a b a n Sh an k li sh Tests Gram /cell Croissance (oC) Arginine 2 + + + + + + + + Ferment.. Oxydase Catalase 10 45 NaCl (%) 4 + + + + + + + + 6.5 + + + + + + + +

L1 L2 L3 L4 L5 L6 Sh1 Sh2 Sh3 Sh4

+/Btonnet +/Btonnet +/Coque +/Coque +/Coque +/Coque +/ Btonnet +/ Btonnet +/ Btonnet +/ Btonnet

+ + + + + + + -

+ + + + + + + + +

Ho(1) Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho

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Suite : K1 K2 K3 K4 K5 K6 LS1 LS2 LS3 LS4 LS5 +/ Btonnet +/ Btonnet +/ Btonnet +/ Btonnet +/ Btonnet +/ Btonnet +/ Btonnet +/ Btonnet +/ Btonnet +/ Btonnet +/ Btonnet +/Coque +/Coque +/Coque +/Coque +/Coque + + + + + + + + + + + + + + + + Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho Ho He(2) He He He He + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

K e s h e k Se r da l l i Jeb neh

JD1 JD2 JD3 Dar JD4 fieh JD5 1: homofermentaire 2: htrofermentaire

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Aprs les tests biochimiques, le mtabolisme des sucres carbons des systmes API (50CHL et 20Strep) a permis didentifier, pour chaque produit analys, les bactries lactiques isoles (Tableau 5). Ainsi, trois lactobacilles (plantarum, casei et paracasei) et une Leuconostoc mesenteroides spp. dextranicum 2 ont t identifis. A noter que plusieurs colonies, isoles dans le Laban (L3, L4, L5 et L6), seraient des levures et non des LAB, et la colonie Sh1 na pas t identifie. TABLEAU 5 Bactries Lactiques Identifies dans les chantillons Caprins Analyss Echantillons Laban Shanklish Keshek Labneh Serdalli Jebneh Darfiyeh Lactobacillus plantarum L2 (98.9%)* Sh2 (98.9%)* K2, K3, K4, K5 (99.5%)* LS1 (88.7%)* LS3, LS4 (98.9%)* Bactries lactiques isoles Lactobacillus Leuconostoc paracasei mesenteroides Sh3 (98.9%)* LS2, LS5 (99.5%)* Lactobacillus casei (suspected) L1 Sh4 K1, K6 -

JD1, JD2, JD3 (99.7%)* JD4, JD5 (90%)* * : Degr de confiance accord lidentification selon le programme API. Evaluation de leffet probiotique des bactries lactiques isoles

La dose minimale de colonies dans un probiotique doit tre entre 6 et 7 log10 ufc/g de produit lors de sa vente. La culture des produits Infloran et Antibiophilus sur MRS agar (en anarobiose 37 C et pendant 72 h) montre un nombre suprieur mme aux valeurs indiques sur le produit commercialis (10.22 et 9.37 log10 ufc/g respectivement). Caractristiques de deux probiotiques commerciaux Les caractristiques des deux probiotiques commerciaux (Infloran et Antibiophilus) obtenues aprs culture sur milieu MRS, isolation et identification par des tests biochimiques et le mtabolisme des sucres (systme API), ont confirm que les colonies sont bien L. acidophilus et L. rhamnosus (Tableau 6). Leffet probiotique de ces bactries a t valu dans diffrentes conditions de croissance. Les rsultats prsents dans le Tableau 6 seront utiliss titre de comparaison. Une des caractristiques intressantes des bactries lactiques est leur capacit de ralentir et dinhiber lactivit et la croissance des bactries pathognes par la production de facteurs inhibiteurs (Yateem et al., 2008). Leffet inhibiteur des colonies isoles a t test sur la croissance de Salmonella, Escherichia coli et Staphylococcus aureus (Figure 1). Les colonies isoles dans le Jebneh Darfieh ont t testes sur la croissance de Salmonella seulement (Figure 1).

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TABLEAU 6 Caractristiques de 2 Probiotiques Commerciaux et leur valuation dans Diffrentes Conditions de Croissance
Croissance Type de fermentation Rductase Thermorsistance Tolrance au sel (% NaCl) Survie dans le Jus Gastrique pH = 2 Simul (%) Diamtre dinhibition (mm) Staph.aureus Gram Catalase Oxydase Production dammonium Production de CO2

T E S T B A C T E R I E

Aptitude dacidification
(3)

15 C

45 C

60 C, 90 min

65 C, 30 min

6.5

pH = 1

pH = 3

Salmonella

E. coli

lait entier

lait demi-crm

L. acidophilus L. rhamnosus
(1)

+ +

(2)

+ +

Ho(1)

AcR(2) AcR

+ +

+ +

+ +

+ +

0 18

80 41

97 97

11 8

2 1

3 1

10 8

10 8

Ho

: homofermentaire

: acide avec coagulation rduction du Litmus (3) : temps (h) pour atteindre le pH de 4.6

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Evaluation de lactivit antimicrobienne des colonies isoles (a)

Salmonella E.coli Staphylococcus aureus

(b)
Salmonella E.coli Staphylococcus aureus

25

Diametre d'inhibition (mm)

Diametre d'inhibition (mm)

20 15 10 5 0

20 15 10 5 0
L. pl an ta ru m L. pa ra ca se i (S h3 ) L. ca se i( Sh 4) (S h2 )

(L 2)

i( L1

(L 5 as t Ye

) as t

ru m

ca se

as t

Ye

as t

L.

L.

pl a

nt a

Colonies dans Laban

Ye

Ye

(L 4

(L 6

(L 3

Colonies dans Shanklish

(c)
Salmonella
20

(d)
E.coli Staphylococcus aureus
Salmonella E.coli Staphylococcus aureus

20 Diametre d'inhibition (mm) 15 10 5 0

pa ) ra ca se i( L pl S2 an ) ta ru m L. (L pl S 3) an ta ru m L. (L S pa 4) ra ca se i( LS 5) m pl an ta L. ru (L S1 L.

Diametre d'inhibition (mm )

15 10 5 0
) 2) 3) 4) K1 5) (K (K (K (K i( i( ca L. se K6 )

ru m

ru m

ru m an ta pl L. pl

ca

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an ta

pl

L.

L.

pl

L.

an ta

L.

ru m

se

Colonies dans Keshek

Colonies dans Labneh Serdalli

(e)
Salmonella

20 15

Diametre d'inhibition (mm)

10 5 0
) ) ) ) D1 D3 D4 D2 (J (J es es es es (J es (J (J D5 )

id

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Lc

Lc

Lc

Lc

Colonies dans Jebneh Darfiyeh

Figure 1. Diamtres des zones dinhibition des bactries pathognes par des colonies isoles dans le Laban (a), Shanklish (b), Keshek (c), Labneh Serdalli (d) et Jebneh Darfiyeh (e). La croissance de la salmonelle a t inhibe avec une zone dinhibition de 20 mm de diamtre par Sh4 and K1 (Lactobacillus casei), LS1 (Lactobacillus plantarum) et JD1 (Leuconostoc mesenteroides spp. dextranicum 2). Bien que L2 (Lactobacillus plantarum), L4

Lc

.m

es

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es

es

en

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ro

id

L.

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(levure), K3 (Lactobacillus plantarum) et K4 (Lactobacillus plantarum) ont montr la plus faible activit dinhibition contre Salmonella (14 mm), leur activit reste toutefois suprieure celle des probiotiques lactiques commerciaux comme L. acidophilus et L. rhamnosus qui ont montr un diamtre dinhibition de 11 et de 8 mm respectivement (Ayoub, 2008). Par ailleurs, la zone dinhibition de E. coli a t la plus large (21 mm) avec L2 et LS4 (L. plantarum) et la plus rduite (12 mm) avec LS5 (L. paracasei), activit toutefois suprieure celle des probiotiques lactiques commerciaux L. acidophilus et L. rhamnosus (2.5 et 1.5 mm respectivement (Ayoub, 2008)). En ce qui concerne Staphylococcus aureus, L2 (Lactobacillus plantarum) a montr une activit inhibitrice de 19 mm; un minimum de 13 mm a t mesur pour L1, K1 (Lactobacillus casei), et Sh2 (Lactobacillus plantarum); cette activit est bien suprieure celle de L. acidophilus (2 mm) et L. rhamnosus (1 mm) (Ayoub, 2008). Lactivit inhibitrice de la mme bactrie tait diffrente selon le produit dans lequel elle a t isole. Ainsi, il existe deux ou plusieurs sous espces de la mme bactrie dans le mme produit. En effet et titre dexemple, dans le Keshek, quatre types de Lactobacillus plantarum ont t isols et montrent une activit inhibitrice diffrente vis--vis des bactries pathognes. De plus, la mme bactrie Lactobacillus plantarum a montr une activit inhibitrice maximale contre Staphylococcus aureus lorsquelle a t isole dans le Laban (L2) et minimale lorsquisole dans le Shanklish (Sh2). Taux de survie des colonies isoles dans diffrents pH Une des caractristiques importantes dune bactrie lactique effet probiotique est sa capacit de survivre dans des conditions difficiles dacidit simulant celles du jus gastrique ; ce dernier pouvant varier entre pH 1 aprs un jene et pH 4.5 la suite dun repas (Maragkoudakis et al., 2006). La figure 2 montre les taux de survie des bactries isoles dans des liquides de diffrents pH: 1, 2, 3 et 7.2. pH 7.2, utilis comme une solution tampon pour les lactobacilles (Maragkoudakis et al., 2006) les colonies ont montr un maximum de viabilit (100%) lexception de K4 (Lactobacillus plantarum) et Sh4 (Lactobacillus casei) qui nont survcu aucun pH. Ce rsultat peut tre expliqu par la faiblesse de ces colonies ou bien par le besoin dun pH diffrent pour leur survie. Aucune colonie na pu supporter le pH trs acide (pH=1); lacidit aurait exerc un stress important sur les colonies empchant toute croissance (Gibson et al., 2005). Lactobacillus acidophilus et rhamnosus vendus comme probiotiques sur le march local montrent aussi une viabilit rduite pH=1 (0.25% et 18% respectivement (Ayoub, 2008)). pH 2, alors que le taux de viabilit ne dpasse pas 8% chez la majorit des colonies isoles, il a t de 50% pour celles isoles du Jebneh Darfiyeh (JD1 et JD3). Cette valeur a t de 80% et de 41% respectivement pour Lactobacillus acidophilus et rhamnosus. L5 et L6 sont souponnes tre des levures avec une viabilit importante (60% et 82% respectivement) pH 2; Kuhle et al. (2005) ont identifi une levure probiotique Saccharomyces boulardii tolrant un pH de 2.2.

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pH 3, les isolats de Jebneh Darfiyeh JD1 et JD3 (Leuconostoc mesenteroides spp. dextranicum2) montrent une viabilit allant jusqu' 93% ; il en est de mme pour le Labneh Serdalli (91% pour Lactobacillus paracasei spp. paracasei (LS2 and LS5) ; le taux de survie de Lactobacillus plantarum (LS1, LS3 et LS4) na pas dpass 23%. Dans lchantillon de Laban, les levures montrent une viabilit allant de 47% 91%, une viabilit infrieure pour L1 (Lactobacillus casei) et L2 (Lactobacillus plantarum) : 69 et 22% respectivement. Le Shanklish et le Keshek montrent une large variabilit des taux de survie des colonies (de 15% 62%); ceci serait d la diffrence entre les sous espces. (a)
pH 1 100 pH 2 pH 3 pH 7.2

(b)
pH 1
100

pH 2

pH 3

pH 7.2

Taux de survie (%)

Taux de survie (% )

80 60 40 20 0

80 60 40 20 0
2) 3) (S h Sh i( i( L. ca
pH 3

L. ca se L. pl i( an L1 ta ) ru m (L 2 Ye ) as t( L3 Ye ) as t( L4 Ye ) as t( L5 Ye ) as t( L6 )

um

ta r

an

pl

Colonies dans Laban

L.

Colonies dans Shanklish

(c)
pH 1 pH 2 pH 3 pH 7.2

(d)
pH 1 pH 2 pH 7.2

100

100

Taux de survie (% )

80 60 40 20 0
) ) 2) 3) 4) K1 5) (K (K (K (K K6 i( ru m ru m se se i(

Taux de survie (%)

80 60 40 20 0
ar ) ac as ei L. (L pl S2 an ) ta ru m L. ( LS pl an 3) ta ru m L. (L pa S4 ra ) ca se i( LS 5) (L S1

ru

ru

ca

ta

ta

ta

ta

ca

pl an ta

an

an

an

pl

pl

pl

pl

an

L.

L.

L.

L.

Colonies dans Keshek

L.

(e)
pH 1 pH 2 pH 3 pH 7.2
100

Taux de survie (%)

80 60 40 20 0

Lc. mesenteroides (JD1)

Lc. mesenteroides (JD3)

Colonies dans Jebneh Darfiyeh

Figure 2. Taux de survie, diffrents pH (1, 2, 3 et 7.2), des colonies lactiques isoles dans le Laban (a), Shanklish (b), Keshek (c), Labneh Serdalli (d) et Jebneh Darfiyeh (e).

L. p

L.

L.

ru

Colonies dans Labneh Serdalli

L.

pa

ra

ca

se

se

Sh 4

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Temps dacidification du lait par les bactries isoles Les Lactobacilles peuvent survivre pH 4.6, pH commun plusieurs produits ferments (Maragkoudakis et al, 2006). Le Tableau 7 prsente le temps ncessaire pour 13 colonies isoles pour atteindre le pH dacidification dans du lait entier ou crm. Le lait joue le rle de transporteur des probiotiques qui peuvent tre utiliss avec les ferments lactiques. Le pH du lait a t de 6.6 et 6.5 pour les laits entier et crm respectivement. Comme le montre le Tableau 7, en prsence de K2, K4 et L2 (Lactobacillus plantarum) ainsi que K6 (Lactobacillus casei) le pH dacidification est presquatteint aprs 10 h et demie dinoculation dans le lait entier (4.62, 4.63, 4.62 et 4.63 respectivement). Les Lactobacillus acidophilus ont acidifi le milieu aprs 10 h dinoculation. De plus, les milieux contenant LS1 (L. plantarum) et LS2 (L. paracasei) ont atteint le point final dacidification (pH 4.6) aprs 8h40min dinoculation dans le lait entier, valeur comparable celle observe avec L. rhamnosus o le pH de 4.6 est atteint aprs une dure de 8 h. A signaler que linoculation dans le lait crm na permis aucune colonie des chantillons de Laban et de Keshek dacidifier le milieu au point final dacidification, de pH 4.6, mme 10 h et demie aprs inoculation. TABLEAU 7 pH des Laits Entier (E) et crm () avant (T0) et des Heures aprs Inoculation par les Colonies Isoles du Laban (L), Keshek (K) et Labneh Serdalli (LS) Temps Colonies L1 L2 L4 L5 L6 K1 K2 K3 K4 K5 K6 LS1 LS2 E 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 6.6 T0 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 E 4.83 4.74 4.91 4.89 4.90 5.10 4.77 4.82 4.77 4.78 4.75 4.56 4.56 T+9h 4.97 5.09 4.96 4.99 5.06 5.19 5.04 4.98 4.96 4.97 5.03 4.78 4.79 E 4.78 4.65 4.86 4.80 4.83 4.95 4.70 4.75 4.68 4.71 4.65 T+10h 4.90 5.02 4.89 4.92 4.99 5.14 4.96 4.91 4.87 4.91 4.96 4.71 4.73 E 4.73 4.62 4.80 4.76 4.78 4.89 4.62 4.70 4.63 4.67 4.63 T+10h30min 4.88 4.99 4.85 4.89 4.97 5.09 4.90 4.88 4.83 4.87 4.89 4.66 4.65

E: Lait entier; : crm

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CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES La flore lactique identifie dans les chantillons caprins traditionnels est variable et prometteuse du fait de sa tolrance une forte acidit et de la possibilit dinhiber ou de modrer la croissance de bactries pathognes. Ces produits peuvent porter le nom de fromages probiotiques naturels sans aucune modification pour ceux contenant des bactries tolrantes lacidit stomacale (JD1 et JD3) ou, pour celles moins tolrantes (Sh3, K1, K2, LS2, LS5, JD1 et JD3). Elles pourraient tre protges et encapsules pour rsister aux conditions acides. Des tudes supplmentaires seraient ncessaires afin didentifier les sous espces des bactries isoles (PCR), de dterminer la nature des substances antimicrobiennes labores et de les purifier afin de les utiliser au niveau industriel avec ou sans protection. REMERCIEMENTS Ce travail a t financ par le Conseil National de la Recherche Scientifique Libanais. RFRENCES A.O.A.C. 1995. Official methods of analysis. AOAC, Arlington, Virginia. Ayoub, J. 2008. Carry-through potential evaluation of commercial probiotics in various growth conditions. Academic dissertation, Department of Food Sciences and Technology, Faculty of Agriculture, Lebanese University. Chammas, G. 2006. Caractrisation et utilisation des souches de bactries lactiques locales dans le dveloppement de produits laitiers ferments au Liban. Thse doctorat, INAPG, 222. Charteris, W.P., Kelly, P.M., Morelli, L. and Collins, J.K. 1998. Development and application of in vitro methodology to determine the transit tolerance of potentially probiotics Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract. Journal of Applied Microbiology, 84: 759-768. Chedid, M. 2007. Qualits physicochimique et microbiologique de produits laitiers caprins traditionnels libanais. Mmoire de fin d'tudes, Universit Libanaise, Facult d'Agronomie. Christiansen, P.S., Edelsten, D., Kristiansen, J.R. and Nielsen, E.W. 1996. Some properties of ice cream containing Bifidobacterium bifidum and Lactobacillus acidophilus. Milchwissenschaft, 51: 502-504. Corthier, G. 2006. Probiotics and Health. Inra press service. www.international.inra.fr/press/probiotics. Gibson, G.R., Rouzaud, G., Brostaff, J. and Rayment, R. 2005. Final technical report for FSA project Ref G01022. An evaluation of probiotic effects in the human gut: microbial aspects, p. 8-12. Gomes, A.M.P. and Xavier Malcata, F. 1998. Development of probiotic cheese manufactured from goat milk: response surface analysis via technological manipulation. J. Dairy Sci., 81: 1992-1507. Health Protection Agency 2010. Oxidase test. National Standard Method, BSOPTP 26, Issue 2.1, http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_sops.asp. Heller, K.J. 2001. Probiotic bacteria in fermented foods: product characteristics and starter organisms. American Journal of Clinical Nutrition, 73: 374S-379S.

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