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Organizado por:
LC-MS
ICP-MS GC-MS
Mass Spec/tacular
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Isidro Masana Agilent Technologies Especialista Productos LC/MS Divisin Biociencia y Anlisis Qumico
Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
PROGRAMA:
1.- Breve Introduccin a la Metabolmica. 2.- Requisitos Analticos e Instrumentacin Requerida 3.- Fases de un Estudio Metabolmico por MS. 4.- Introduccin al Software Requerido en un Estudio Metabolmico por MS 5.- Ejemplos de Resultados.
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Qu es la Metabolmica?
Metabolmica es el estudio sistemtico de las pequeas molculas orgnicas (metabolitos) presentes en un sistema biolgico Utiliza el anlisis estadstico multivariante para correlacionar:
- variaciones en la concentracin de metabolitos. - con distintas propiedades de 2 o ms grupos de muestras comparadas (organismo, rgano, tejido, clula, fluido,).
Cuales son las diferencias en su composicin qumica que se correlacionan con las diferencias observadas?
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Las 4 Piedras Angulares de una Clula Viva Soluciones Agilent en Hardware y Software
2.-Transcriptoma
- Gene Expression Arrays: SplicingArrays - GeneSpring GX Resolver
1.- Genoma
RNA DNA
- aCGH Arrays ChIP on Chip Arrays - GS Genotyping CGH Analytics ChIP Analytics
Protenas
3.- Proteoma
Tcnica anlisis:
CH2OH
Metabolitos
Metabolmica comparte: Instrumentacin LC/MS con Protemica Bioinformtica GeneSpring con Prot. & Genmica
4.- Metaboloma
Tcnica anlisis:
- Mejorar las propiedades funcionales de alimentos - Evaluar el impacto de la nutricin en los procesos biolgicos y patolgicos.
-
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- Se deber estudiar el impacto de estos factores en el perfil del genoma, proteoma y metaboloma del organismo.
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Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
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Amplio rango de Pesos moleculares entre 50 y 1600 Da Elevado nmero de metabolitos a estudiar:
Mamferos ~ 2.500 a 15.000 Plantas ~ 50.000 a 200.000
Peso Molecular
10,000 LC/MS-
LC/MS API-Electrospray
APPI
El acoplamiento Cromatografa / Espectrometra de Masas (LC/MS y GC/MS) es la tcnica que ofrece mejores prestaciones para estudios metabolmicos (componentes minoritarios y
mayoritarios).
1.000
LC/MS-APCI
GC/MS
muy polar Las mismas herramientas (hardw. & soft) y estrategias aplican a anlisis comparativos de muestras en todo tipo de industria
Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
no polar
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LC/MS
TOF LC/MS
QqQ LC/MS
Metalo-metabolitos
GC/MS
HPLC-Chip
Quads LC/MS
Q-TOF LC/MS
Todo tipo de metabolitos
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HPLC
(LC)
PC
para Control del instrumento y Procesado de la Informacin Cromatogramas & Espectros
GC
CE
D
Detector de Iones
HPLC, GC o CE: separar los diferentes componentes de la muestra para que estos lleguen al detector a distinto tiempo. MS: ionizar* los compuestos procedentes del HPLC, GC o CE y determinar su masa (m/z: masa/carga).
*Para poder ser detectadas las molculas necesitan ser ionizadas.
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Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
TOF
4 1
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Espectros LC/MS, CE/MS (Ionizacin a Presin Atmosfrica API ) versus GC/MS (Ionizacin por Impacto Electrnico - EI)
Intensidad
5.4e5 5.0e5 4.5e5 4.0e5 3.5e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 1.5e5 1.0e5
Clenbuterol
[M+H]+=277.0874
279.084
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290
m/z (masa/carga)
Abundance 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 86 OH
#103730: Clenbuterol
Cl
HN H2N CH3 CH3
Cl
H3C
276
Clenbuterol
PM = 276 Da
Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
m/z-->
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100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
+ +
MS/MS del in aislado (m1) en Q1
QTOF
1.9e5 1.8e5 1.7e5 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4
Filtro Masa n 1
132.0624 168.0385
Celda Colisin
Filtro Masa n 2
Cl
OH
203.0076 205.0046
Clenbuterol
HN H2N Cl H3C
CH3 CH3
0Cl
149.0898
133.0675 140.0202
1Cl
170.0359
2Cl
[M+H]+=277 (Clenbuterol
0.0
totalmente fragmentado) 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290
Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
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3.- Fases de un Estudio Metabolmico para Descubrimiento de Nuevos Biomarcadores por MS e Instrumentacin Requerida
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2 Fase (opcional): Identificacin de los metabolitos de inters (Qu metabolito es? slo necesario saber si hay que
interpretar las rutas metablicas).
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Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
8.0e6
7.0e6 6.0e6 5.0e6 4.0e6 3.0e6 2.0e6 1.0e6 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time, min 20 22 24 26 28 30 Intensity, cps
OH
#103730: Clenbuterol 86 9000
Cl CH3 CH3
8000
HN H2N H3C
M+1
+TOF MS: 5.672 to 5.833 min from lowhigh03.wiff Agilent
7000
Cl
6000
5000
4000
277.087
279.084
1.0e5
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290
m/z (masa/carga)
Abundancia
Tiempo d retenci e n
sa Ma
/z) (m
Tecnologa QUAD/TRAP
TOF /Q-TOF
Muy Elevada Selectividad Cuantitativa para la extraccin de informacin especfica de cada metabolito/compuesto con mtodos de adquisicin genricos (modo barrido).
Masa Exacta independiente de la concentracin del analito. Buena Sensibilidad en modo barrido (mtodos genricos MS-SCAN).
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Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
Fase Comparacin Perfiles: Selectividad Cuantitativa de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta.
Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina IC: 277.1 m/z - Ventana Extracin 1 Da Clenbuterol S/N = 14
+/- 30ppm
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Robustez Masa Exacta Agilent QTOF & TOF: m/z independiente de la concentracin
Fipronil peak from 7.37 7.46 minutes. Instrument was run in 4 GHz mode for optimum resolution, mass accuracy and sensitivity
0.4ppm
Disponer de masa exacta robusta es clave para la especificidad y selectividad en la comparacin de resultados por LC/MS
1.8ppm
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La INDEPENDENCIA de la masa exacta con respecto a la concentracin facilita la comparacin entre compuestos con gran diferencia de concentracin entre las distintas poblaciones.
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Validacin Metabolitos
Peak Finding
Normalizacin de Datos
Soft. Deconvolucin
Interpretacin Resultados
Soft. Identificacin Metabolitos y ayuda interpretacin resultados
Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
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Deconvolucin 3-D con AMDIS (GC/MS) y Mass Hunter Molecular Feature Extractor(LC/MS)
En muestras complejas 1 pico (TIC) suele estar formado por varios compuestos no resueltos y algunos del propio fondo
Componente 1
[M+Na]+
Componente 2
[M+H]+
[2M+H]+
Componente 3
[M+H]+
1. Determinar las masas (m/z) de todos los compuestos ionizados. 2. Determinar las reas de los cromatogramas especficos de cada compuesto (ECCs: Extracted Compound Chromatograms suma de las
respuestas de los iones caractersticos de cada compuesto).
3. Comparar las reas normalizadas especficas de cada compuesto entre todas TIC las muestras.
ECCs 0La identificacin para comparar el mismo metabolito se realiza por igualdad de - Tiempo de Retencin normalizados
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Ejemplo Listado de Compuestos Detectados por el Algoritmo Mass Hunter Molecular Feature Extractor
+ 20 compuestos en 1 minuto
Las estadsticas se efectuarn comparando intensidades de seal especficas de compuestos con igual -Tiempo de retencin
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50
10
1 2 3 4 5 6 7 x10 7
1 Fase: Extraccin Informacin Metabolitos por Deconvolucin del 3D (tr, m/z, Intensidad)
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Ejemplo 1: Estudio Metabolomico Infeccin Bacteriana en Arroz: Influencia lneas de Arroz y cepas Bacteriales
Bacteria salvaje
PX099
TP309 TP309-Xa21
PXo99 6 (A)
Blanco control tratado Blanco control SIN tratar
6 (C) 6 6 6 (D)
TP309: Arroz salvaje susceptible de ser atacado por la bacteria PXO99 salvaje TP309-Xa21 arroz transgnico resistente a la bacteria salvaje PXO99, pero NO a la modificada (A) (B) (C) (D) genticamente: PXO99 (RaxST-). PXO99: bacteria salvaje que dispone del gen raxST que codifica una protena tipo sulfotransferasa capaz de generar el pptido AvrXa21. PXO99 RaxST- : bacteria modificada genticamente para eliminar el gen raxST que permite generar el pptido AvrXa21. Pptido AvrXa21 (producido a partir del gen raxST) y que genera una respuesta inmune en el arroz modificado genticamente (TP309-Xa21)
6 6 NA(B)
PXo99
RaxST-
TP309 TP309-Xa21
2 tipos arroz (TP) Los replicados de muestras de la poblacin son importantes LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/muestra (ESI+: 1500 -: 400)
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Deconvolucin de Cromatogramas LC/MS de Arroz mediante Agilent Molecular Feature Extractor (MFE)
MFE deconvoluciona cromatogramas para localizar los tiempos de retencin / masa /abundancia de todos los compuestos ionizados. Evala isotpos, aductos y coeluciones. Parmetros utilizados:
Mx. carga iones = 1 Umbral Deteccin en altura (o S/N)
Iones Positivos: 1000 Iones Negativos: 500
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7-INF 2 3-INF 5
6-RES 2
3-INF 7-INF
6-RES
1 2 3-INF
+info: Nota de Aplicacin Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN Pgina 36
Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
GeneSpring MS: ANOVA de 1-va con Datos de Arroz Filtrados mediante Tukey Post-hoc Test: modo Iones Positivos 7 Condiciones Biolgicas Comparadas
----Arroz Transgnico
Bact. Salvaje
------ -----
Arroz Salvaje
------
Arroz Trangnico
Resisten.
Arroces
Bact. Salvaje
Resisten.
Bact. Salvaje
Infeccin
Arroz Salvaje
Arroces
Bact. Salvaje
Infeccin
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+ inf. en nota aplicacin: Maximizing Metabolite Extraction for Comprehensive Metabolomics Studies of Erythrocytes p/n: 5989-7407EN Pgina 40
Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
LC/MS-QTOF & QqQ: Changes in phopholipase expression in the CNS of SIVinfected macaques.
Gary Siuzdak & others. The Journal of Clinical Investigation http://www.jci.org Volume 118 Number 7 July 2008
CE/MS-TOF: Ophthalmic Acid as an Oxidative Stress Biomarker Indicating Hepatic Glutathione Consumption Tomoyoshi Soga & others. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 24, pp. 1676816776, June 16, 2006
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Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
Fenilcetonuria (PKU): se controla con la relacin de PHE / Tyr, donde Tirosina es el producto natural del metabolismo de la fenilalanina. Niveles elevados de Phe en relacin con Tyr indica problemas en la conversin natural de este metabolito. PKU es una enfermedad que se puede tratar (slo por el control de la dieta) y es importante tratarla lo antes posible, ya que puede conducir a dao cerebral y retraso mental.
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Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
Conclusiones
- La Espectrometra de Masas acoplada a cromatografa proporciona una excelente herramienta para el descubrimiento de nuevos biomarcadores. - En LC/MS la disponibilidad de una masa exacta robusta e independiente de la concentracin del analito es clave para el xito del estudio. - Se requiere del uso de potentes herramientas de software para: - Extraer la informacin cuantitativa especfica de cada compuesto ionizado. - Automatizar la cuantificacin relativa y comparacin de miles de compuestos mediante un potente software de anlisis estadstico multivariante que ofrezca anlisis de componentes principales (PCA). - Todas estas herramientas son aplicables a todo tipo de empresas que requieran estudios comparativos.
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Metabolomics Brochure Agilent Metabolomics Laboratory: The breadth of tools you need for successful metabolomics research - 5989-5472EN Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice - 5989-6234EN Agilent Software for Metabolomics: Software tools for each step in metabolomics data analysis - 5989-6172EN Biological sample preparation for successful metabolomic analysis - 5989-6326EN Considerations for Choosing GC/MS or LC/MS for Metabolomics - 5989-6327EN Selection Guide Choosing Instrument Systems for Metabolomics Analyses - 5989-6328EN Webcasts An Introduction to Metabolomics Analysis using Mass Spectrometry - Steve Fischer, Agilent Technologies Novel Mass-Based Approaches to Global Metabolomics - Gary Suizdak, Scripps Institute, CA More coming. Offers GeneSpring MS Trial CD Plus Tutorial Data
Application Note
Product Note
Tech Note
www.metabolomics-lab.com
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40m
Preguntas?
Mass Spec/tacular
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Metabolmica y comparacin de muestras 07/07/2009
MS-QTOF MS-QqQ
1200-RRLC
MS-TOF MS-Q
MS-TRAP