Prcticas de LABORATORI O

OBJETIVOS GENERALES
Que el alumno conozca: Las principales propiedades de las protenas y que se familiarice con los procesos generales de extraccin, identificacin y cuantificacin de las mismas. Que las enzimas constituyen una clase especial de protenas, que requieren condiciones ptimas de accin, que catalizan reacciones qumicas especficas y que para su funcionamiento resulta esencial mantener la conformacin nativa.

I. PROTENAS
OBJETIVOS ESPECFICOS Discutir la importancia de la eleccin del mtodo de obtencin de una muestra.

Comprender los fundamentos de las tcnicas que permiten detectar la presencia o ausencia de protenas en muestras biolgicas. Discutir el significado de los trminos falso positivo y falso negativo aplicados a una reaccin de caracterizacin. Conocer el significado y la importancia de la expresin sensibilidad del mtodo y discutir las condiciones en que determinado mtodo se puede aplicar. Realizar ensayos de caracterizacin cualitativos de protenas en diferentes muestras biolgicas. Realizar la determinacin de la cantidad de protenas presentes en una muestra por mtodos colorimtricos: ensayo de caracterizacin cuantitativo. Construir una curva de calibracin para protenas.

1. Extraccin y valoracin de las protenas presentes en frutos Para obtener un determinado componente a partir de un material biolgico deben realizarse distintas operaciones, tales como extraccin, aislamiento y purificacin. La necesidad de efectuar una o ms de estas operaciones depender del material de partida y de los objetivos perseguidos. Por ejemplo, si se desea determinar el

contenido de glucosa en orina, no es necesario realizar ninguna operacin previa (salvo las indicadas por el mtodo elegido), ya que este monosacrido se encuentra disuelto en la orina. En cambio, si se desea determinar la concentracin de glucgeno en clulas hepticas de cobayo, necesariamente se deber: a) separar y disgregar el tejido heptico del animal y b) liberar el glucgeno de las clulas, esto es, realizar las operaciones necesarias para extraer el glucgeno heptico. Asimismo, dependiendo del mtodo de determinacin a emplear, ser necesario realizar una o varias etapas de separacin o aislamiento del glucgeno: separarlo de otros componentes celulares que puedan interferir con las determinaciones. Por ltimo, si el objetivo es analizar la estructura del glucgeno, ser necesario purificarlo. En el presente trabajo prctico se realizar una extraccin de las protenas solubles en medio acuoso que se encuentran presentes en frutos. Luego de la extraccin, las protenas sern separadas de impurezas tales como azcares y pigmentos por tratamiento con acetona, que produce la precipitacin de las protenas, las que luego sern redisueltas y posteriormente cuantificadas por el mtodo de Bradford. 2. Reaccin del biuret Fundamento de la reaccin Consiste en tratar una protena o pptido con Cu ++ en medio alcalino, producindose una coloracin violcea por formacin de un complejo de coordinacin entre el Cu++ y los pares electrnicos libres de los nitrgenos de los grupos imino de la unin peptdica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptdicas para que tenga lugar la reaccin. Retomando lo visto anteriormente en el trabajo experimental del mdulo 2 (ver algunas consideraciones), cuando se caracteriza un grupo o familia de sustancias (por ejemplo, caracterizacin cuali o cuantitativa de protenas en una muestra problema) o identifica una sustancia en particular (por ejemplo comprobar la presencia de ovoalbmina en clara de huevo) se debe tener muy en cuenta el objetivo que se persigue. En funcin de este objetivo se seleccionar el mtodo ms indicado. La reaccin del biuret no es una reaccin especfica para protenas. Eso hace que un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los resultados falsos positivos. Un resultado negativo de la reaccin del biuret sobre una muestra problema no necesariamente indica la ausencia de protenas, ya que puede ocurrir a) que no existan protenas o pptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret positivas), b) que existan una o ms sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reaccin (lo que dara lugar a un resultado falso negativo). Esto puede descartarse (o evitarse) si conozco de antemano la composicin aproximada de la muestra. Por ejemplo, si deseo determinar el contenido de pptidos generados por una reaccin de hidrlisis cida, los H+ del medio

interferirn con la reaccin del biuret, ya que sta necesita de un medio alcalino para la formacin del complejo con Cu++. En este caso la interferencia puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar el ensayo (en caso contrario obtendra un falso negativo como resultado) y c) Que existan pptidos, pero a una concentracin inferior al lmite de sensibilidad del mtodo. Todo mtodo permite determinar la presencia de un compuesto slo si la concentracin del mismo es superior a cierto valor. Existen mtodos mucho mas sensibles que el biuret (ver mas abajo).

3. Reaccin de Bradford Fundamento de la reaccin El mtodo involucra la unin de un colorante, el Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) a las protenas. La solucin del colorante libre es de color rojizo (mxima absorcin a 465 nm) y cambia al azul (mxima absorcin a 595 nm). La unin es un proceso rpido (aproximadamente 2 minutos) y el complejo colorante-protena se mantiene estable hasta una hora despus de producido. Como en esta reaccin el CBB se une especficamente a las protenas, es un buen mtodo de caracterizacin (aunque no de identificacin). La reaccin se prefiere a otras por su sensibilidad (mayor que la del biuret), lo que significa que, para una misma muestra, puede obtenerse un resultado positivo con el reactivo de Bradford pero negativo con el reactivo del biuret. Dado que an los materiales biolgicos ms sencillos poseen una composicin qumica compleja, siempre se debe de tener en cuenta la posibilidad de interferencias(positivas o negativas). Tambien se debe tener en cuenta que no siempre son las mismas sustancias las que interfieren en los distintos mtodos. En el caso de extractos vegetales es comn encontrar sustancias como los fenoles que por lo general producen interferencias en muchos de los mtodos de caracterizacin de protenas. La reaccin de Bradford es de eleccin en estos casos pues los mencionados compuestos no producen interferencia. Confeccin de la curva de calibracin Una vez que se ha detectado la presencia de un componente es importante conocer la cantidad del mismo presente en la muestra y en consecuencia se debe hallar una manera de cuantificarlos. Para llevar a cabo el anlisis cuantitativo es necesario efectuar una curva de calibracin. Para la confeccin de dicha curva se utilizan diluciones de una protena pura de concentracin conocida ( protena patrn; en nuestro caso utilizaremos albmina bovina). Sobre cada dilucin se lleva a cabo la reaccin de Bradford y la curva de calibracin se obtiene graficando los datos de absorbancia [2] correspondientes a cada una de las diluciones versus la concentracin de protena de las mismas. El rango de deteccin de protenas para el mtodo es de 0,1 a 1 mg/ml, dentro del cual la relacin absorbancia-concentracin se mantienelineal. 4. Ensayos de estabilidad de protenas en dispersin acuosa

Las protenas se mantienen dispersas gracias a interacciones con las molculas de solvente y de solutos presentes. Su estabilidad, al igual que sucede con otras macromolculas que forman dispersiones coloidales, se fundamenta en dos factores: hidratacin y carga elctrica, que actan contraponindose a la influencia de la gravedad que tiende a producir la sedimentacin de las partculas dispersas. En el seminario de trabajos prcticos se discutir en detalle de qu forma distintos agentes (pH, agentes deshidratantes, solventes orgnicos, etc) influyen sobre la estabilidad de las protenas. 5. Electroforesis Fundamento Si se aplica un campo elctrico a una solucin que contiene una molcula con carga neta (+ o -), sta migrar a una velocidad que depende del valor de su carga, su tamao y su forma. Esta tcnica, denominada electroforesis, se utiliza para separar mezclas de molculas cargadas (protenas, cidos nucleicos), ya sea sobre un soporte (papel, cellogel) o dentro de un gel (agarosa, almidn o poliacrilamida). La movilidad electrofortica es la relacin de la velocidad de la molcula (v) y el potencial elctrico (E). Tambin es igual a la carga neta de la molcula (Z) dividida por el coeficiente friccional (f), que es la resistencia que el gel opone al movimiento de la partcula.

En la frmula puede verse que a mayor carga elctrica, mayor ser la movilidad de la molcula. Un parmetro importante a considerar en la electroforesis de aminocidos y protenas es su punto isolelctrico (pI), ya que conociendo el pI y el pH del medio, conoceremos la carga de la molcula. Cuando el pH es mayor que el pI la molcula tendr carga negativa; por el contrario, si el pH es menor que el pI la carga de la molcula ser positiva. De esta manera, de acuerdo al pH del buffer de electroforesis utilizado, la muestra se sembrar en uno u otro polo: si la molcula tiene carga negativa se sembrar cerca del polo negativo (ctodo), con lo que migrar hacia el polo positivo (nodo) y viceversa.

II. ENZIMAS
OBJETIVOS ESPECFICOS Detectar la presencia o ausencia de actividad enzimtica en saliva (actividad amiloltica) y en jugo de anan (actividad proteoltica). Determinar el valor de la actividad enzimtica variando algunos parmetros que la afectan (pH, temperatura). Si en un extracto biolgico se desea establecer la presencia de una determinada protena con actividad biolgica, tal como una enzima, no basta con determinar la existencia de

dicha protena, sino que se requiere un ensayo que pruebe que la misma es biolgicamente funcional. Cuando la actividad biolgica es especfica (como ocurre en el caso de las enzimas) resulta innecesaria la etapa de purificacin, ya que la actividad biolgica ser evidenciable an en presencia de otras protenas, aunque ser necesaria la eliminacin de cualquier sustancia que interfiera con su actividad. Para medir la actividad enzimtica slo se requiere un mtodo analtico sencillo que determine la desaparicin del sustrato o la aparicin de los productos de reaccin.

S
Sustrato

Enzima

P
Productos

Para medir la influencia del pH, de la temperatura, de la concentracin de enzima, etc. sobre la velocidad de la reaccin, debe realizarse dicha reaccin variando el factor en estudio y dejando constantes todos los dems. 1. Degradacin de almidn por accin de amilasa salival Fundamento El mtodo se basa en la hidrlisis del almidn (sustrato), en condiciones de pH y temperatura fisiolgicos, por accin de una amilasa presente en la saliva. Los productos de reaccin son polisacridos de menor peso molecular hasta llegar a disacridos (maltosa), no evidenciables con el reactivo de Lugol (pero s con Fehling). 2. Determinacin de la actividad proteoltica de las enzimas presentes en el jugo de anan Fundamento: El mtodo se basa en la hidrlisis de la casena (sustrato) por accin de enzimas proteolticas (proteasas) en condiciones de pH y temperatura adecuados, obtenindose como producto de reaccin pptidos de menor peso molecular, que no precipitan por el agregado de cido tricloroactico y que pueden evidenciarse por medio de la reaccin del biuret. Medida de la actividad proteoltica

proteasas

CASENA

pptidos pequeos

La reaccin se detiene por inactivacin de la enzima proteoltica con cido tricloroactico al 5% (TCA 5%). Es necesario realizar blancos de reaccin (tiempo cero de la reaccin) y para ello la enzima es inactivada con TCA 5% antes de la adicin del sustrato. La concentracin de pptidos solubles en TCA formados luego de la reaccin enzimtica es directamente proporcional a la cantidad de casena hidrolizada y por lo tanto es un medida directa de los productos de la reaccin proteoltica. Estos pptidos sern cuantificados por la reaccin del biuret. Si deseamos conocer el tipo y nmero de pptidos formados se debe realizar un anlisis por electroforesis. Al detener la reaccin con TCA (ms aun si se defecta a tiempos cortos) observaremos la presencia de un precipitado que corresponde a la casena que no ha sidohidrolizada por la enzima. Este precipitado puede redisolverse con hidrxido de sodio al 10% y determinarse la concentracin de protenas por el mtodo de Bradford, lo que proporcionar una medida indirecta de la actividad enzimtica.

PROTOCOLO DE LAS EXPERIENCIAS

I. PROTENAS
1. REACCIN DEL BIURET Reactivos y muestras: Dispersiones de diferentes protenas Dispersin de una protena conocida (control positivo) Agua destilada o solucin en la que est disuelta la protena (Control negativo) Hidrxido de sodio al 10% Sulfato de cobre al 10% Protocolo de la Reaccin del Biuret Colocar en un tubo de ensayo: Solucin a investigar Hidrxido de sodio 10% 0,5 ml al 0,5 ml

Sulfato de cobre al 1% mezclar por agitacin

1 gota

Ensayo cualitativo de protenas Tomar 4 tubos de ensayo Rotularlos como se indica en la segunda columna de la siguiente tabla

Empleando el protocolo correspondiente, realizar la reaccin del biuret con cada una de las soluciones indicadas en la tercera columna de la misma tabla Tipo de Ensayo Control (Blanco) Control Positivo Muestra 1 Muestra 1 Rotular Solucin investigar Negativo B Agua destilada P G H a

Casena al 0,1% Gelatina comercial al 1% Clara de huevo al 10%

Interpretar los resultados. 2. REACCIN DE BRADFORD Reactivos y muestras: u Dispersiones de diferentes protenas Dispersin de una protena conocida (control positivo) Agua destilada o solucin en la que est disuelta la protena (Control negativo) Reactivo de Bradford Protocolo de la reaccin de Bradford Colocar en un tubo de ensayo: Solucin a investigar Reactivo de Bradford 0,05 ml 2,50 ml

mezclar por agitacin y dejar en reposo 5 min

Nota: la medida de la solucin a investigar se realizar con pipeta automtica o en su defecto con pipetas de 0,1 ml 2.1. Ensayo cualitativo de protenas Tomar 4 tubos de ensayo Rotularlos como se indica en la segunda columna de la tabla

Empleando el protocolo correspondiente, realizar la reaccin del biuret con cada una de las soluciones indicadas en la tercera columna Nmero de ensayo Rotular Solucin a investigar Control Negativo B Agua destilada (Blanco) Control Positivo P Casena al 0,1% Muestra 1 G Gelatina comercial al 1% Muestra 2 C Clara de huevo al 10% Interpretar los resultados. 2.2. Ensayo cuantitativo 2.2.1. Confeccin de la curva de calibracin para el mtodo de Bradford Se utilizarn diferentes diluciones de albmina bovina (protena patrn) para lo cual se partir de una solucin que contiene 1mg/ml. Sobre dichas soluciones se lleva a cabo la reaccin de Bradford como se indic anteriormente. Deber realizarse un ensayo en blanco. El rango de deteccin de protenas por este mtodo es de 0,1 a 1 mg/ml. La curva de calibracin se obtendr graficando los datos de absorbancia correspondientes a cada una de las distintas soluciones leda a 595 nm (A 595) en funcin de la concentracin de la protena patrn. Preparacin de las diluciones de albmina Rotular B 100 250 500 750 1000 Albmina mg/ml ---0,1 ml 0,25 ml 0,5 ml 0,75 ml 1,0 ml 1 Agua destilada 1,0 ml 0,9 ml 0,75 ml 0,5 ml 0,25 ml ---Agregar en cada tubo las sustancias indicadas en las columnas de la derecha y mezclar

Determinacin de la absorbancia para cada dilucin de albmina Rotular un tubo para cada muestra y uno para el blanco

Realizar la reaccin de Bradford como se indic en el correspondiente protocolo Determinacin de la A595 a las diferentes diluciones de albmina

Confeccin de la curva de calibracin En computadora o sobre papel milimetrado graficar A595 vs. concentracin. 2.2.2. Extraccin y cuantificacin de las protenas presentes en los frutos de anan 1) Obtener por prensado el jugo de una rodaja de anan de 2 cm de espesor 2) Medir el volumen obtenido 3) Precipitar las protenas contenidas en 2,5 ml de jugo por la adicin de 7,5 ml de acetona fra. Atencin: la acetona ser agregada gota a gota y la mezcla jugo-acetona ser mantenida en un bao de hielo para evitar la desnaturalizacin proteica. 4) Centrifugar y eliminar el sobrenadante. 5) Redisolver el precipitado obtenido en 2,5 ml de buffer fosfatos 0,1M de pH 7,5 y realizar la reaccin de Bradford como indica el protocolo 6) Determinar el contenido de protenas por ml de jugo empleando la curva de calibracin realizada anteriormente 3. ENSAYOS DE ESTABILIDAD DE PROTENAS EN DISPERSIN ACUOSA 3.1. Efecto del pH En un tubo de ensayo colocar 1 ml de dispersin de casena de leche al 1% Agregar cido actico al 10% gota a gota hasta obtener un precipitado

Al observar la formacin de precipitado comenzar a agregar hidrxido de sodio al 10% hasta lograr la redisolucin del precipitado Interpretar los resultados obtenidos.

3.2. Efecto de agentes deshidratantes En un tubo de centrfuga colocar 1 ml de dispersin de gelatina al 1%

Agregar gota a gota solucin saturada de sulfato de amonio hasta que no se observe ms formacin de precipitado Interpretar los resultados obtenidos.

3.3. Efecto de solventes orgnicos

En un tubo de ensayo colocar 1 ml de dispersin de casena de leche al 1% Agregar acetona fra gota a gota y agitando Observar el fenmeno de precipitacin Interpretar los resultados obtenidos.

4. ELECTROFORESIS DE PROTENAS SRICAS SOBRE TIRAS DE CELLOGEL Equipamiento Cuba electrofortica Fuente de poder Reactivos: Buffer de corrida: Veronal - veronal sdico, pH 8,6. Colorante: Amidoschwarz 10B. Decolorante: cido actico al 5%. Deshidratante: metanol puro. Transparentizante: metanol/cido actico/glicerol. Tcnica: 1. Sumergir en el buffer las tiras durante diez minutos y luego secarlas entre papeles de filtro 2. Colocar el buffer en la cuba electrofortica 3. Extender las tiras sobre el puente de la cuba, con la superficie permeable hacia arriba 4. Sembrar la muestra a un centmetro del borde 5. Conectar la fuente de poder de tal modo que el polo negativo quede en el lado de la siembra y correr durante 75 minutos 6. Desconectar la fuente de poder 7. Secar las tiras y sumergirlas en la solucin colorante durante cinco minutos 8. Sumergir tres o cuatro veces en solucin decolorante 9. Sumergir las tiras en el deshidratante durante treinta minutos

10.

Pasarlas a la solucin transparentizante durante un minuto

11. Colocarlas sobre una placa de vidrio adhirindolas bien y dejar en estufa durante unos minutos 12. Observar las bandas e interpretar los resultados.

II. ENZIMAS
1. DEGRADACIN DE ALMIDN POR ACCIN DE LA AMILASA SALIVAL 1.1. Preparacin de la solucin stock de enzima Colocar gotas de saliva diludas en 0,5 ml de agua destilada. 1.2. Ensayo cualitativo. Deteccin de la atividad amilsica Agregar 0.5 ml de la solucin stock de amilasa salival a un tubo Lugol positivo (solucin de almidn ms Lugol, color violceo) A otro tubo Lugol positivo agregar 0,5ml de agua destilada

Luego de unos minutos, el tubo con saliva comenzar a cambiar de color por desaparicin del complejo almidn-yodo Anotar el cambio de color e interpretar los resultados.

2. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLTICA EN JUGO DE ANAN

2.1. Preparacin del stock de enzima. Se utilizar el extracto proteico (precipitado acetnico redisuelto) del jugo de anan obtenido anteriormente. 2.2. Medida de la actividad proteoltica Protocolo para la determinacin de la actividad proteoltica Colocar los tubos para los ensayos y el blanco, debidamente rotulados, en un bao a 37 oC Agregar los reactivos indicados en la tabla, en el orden indicado Reactivo Ensayo

Blanco

Muestra 0,1ml 0,1ml TCA al 5% 2 ml Casena al 1% 1 ml 1 ml Incubar a 37 oC durante el tiempo indicado TCA al 5% 2 ml Centrifugar los tubos a 3.000 rpm durante 10 Tomar 1,5 ml del sobrenadante y alcalinazarlo por agregado de 0,5 ml de OHNa 1M Agregar una gota de SO4Cu Comparar los resultados

2.2.1. Efecto del pH Segn el protocolo indicado arriba se determinar la actividad enzimtica empleando como sustrato soluciones de casena al 1% disuelta en soluciones de diferente valor de pH (2; 7 y 11) Rotular cuatro tubos de la siguiente manera: B (para el blanco), 2 (para la solucin de casena de pH 2), 7 (para la solucin de casena de pH 7) y 11 (para la solucin de casena de pH 11) Agregar los reactivos segn se indica en la tabla del protocolo Cortar la reaccin enzimtica a los cinco minutos por agregado de TCA 5% Continuar el desarrollo del protocolo Interpretar los resultados obtenidos

2.2.2. Efecto del tiempo Segn el protocolo indicado arriba se determinar la actividad enzimtica empleando como sustrato solucin de casena al 1% a pH 7, cortando la reaccin a diferentes tiempos (2, 5 y 10 minutos). Rotular cuatro tubos: de la siguiente manera: B (para el blanco),y 2, 5 y 10 para los ensayos a los diferentes tiempos Agregar los reactivos segn se indica en la tabla Cortar la reaccin enzimtica del tubo 2 a los dos minutos Cortar la reaccin enzimtica del tubo 5 a los cinco minutos Cortar la reaccin enzimtica del tubo 10 a los diez minutos Continuar el protocolo

IMPORTANTE: Es imprescindible que todo el material de vidrio utilizado se encuentre perfectamente limpio. El lavado se realiza con detergente. Debe enjuagarse repetidas veces con agua de la canilla para que no queden restos de detergente (interfiere en el mtodo de Bradford). Finalmente enjuague con agua destilada.

CUESTIONARIO DEL TRABAJO EXPERIMENTAL

1) En tres dispersiones acuosas A, B y C, de composicin desconocida, se realizaron diversos ensayos con los siguientes resultados: Reaccin Biuret Lugol Fehling Precipitacin con (NH4)2SO4 Muestra A + + + Muestra B + Muestra C + -

En base a los resultados del cuadro, qu compuesto/s podrn hallarse en cada una de las muestras? 2) Qu reacciones de caracterizacin realizara para verificar la naturaleza proteica de la gelatina? Cul es el fundamento de esta reaccin de caracterizacin? Indicar reactivos y visualizacin de la reaccin. 3) Una protena con estructura helicoidal, da positiva la reaccin de Lugol?.

4) Si realiza la reaccin del biuret sobre una solucin del aminocido alanina, obtendr resultado (+) (-)? 5) Puedo utilizar el mtodo de biuret para identificar albmina bovina en una mezcla de protenas? Fundamente su respuesta. 6) En qu caso el resultado de la reaccin de biuret puede generar un falso negativo? 7) Se realiza la reaccin de Bradford en una muestra problema y los resultados son los siguientes: agua destilada: (-) muestra: (-) solucin de casena al 1%: (+) Explique los resultados obtenidos 8) Qu operaciones debera efectuar si se desea cuantificar el contenido de protenas en el jugo de anan? 9) Explique el efecto del (NH4)2SO4 sobre las protenas. 10) Cul es el fundamento de la tcnica de electroforesis?. De qu factores depende la migracin diferencial de las molculas? A qu tipo de compuestos puede aplicarse esta metodologa? 11) Disee las condiciones de una experiencia electrofortica que le permita separar tres protenas (A, B y C), cuyos pesos moleculares son del mismo orden pero cuyos puntos isoelctricos tienen los siguientes valores: 8.3, 5.1 y 7.2, respectivamente. Fundamente su respuesta. 12) En qu direccin migrarn las siguientes protenas puestas en un campo elctrico al pH indicado ? a) Seroalbmina a pH = 5 (p I=4,9; PM = 68.500) (pI=9,5 PM=23.240)

b- Quimotripsingeno a pH = 5, pH= 9 y pH=11

13) Cul es la razn para utilizar un reactivo de caracterizacin de hidratos de carbono (Lugol) en la determinacin de la actividad de la amilasa salival, que es una protena? 14) Por qu en los ensayos en blanco de actividad proteoltica agrega cido tricloroactico antes de agregar el sustrato? 15) En la determinacin de la actividad proteoltica del jugo de anan usted determin la existencia de pptidos que han sido producidos por la hidrlisis enzimtica de la

caseina a travs de la reaccin del biuret. Es esta una medida directa o indirecta de la actividad? De qu otro modo podra realizarla? 16) Qu informacin aporta el conocer el valor de la actividad enzimtica a diferentes valores de pH? 17) Cul es el objeto de realizar la medida de la actividad enzimtica a diferentes tiempos?

http://payala.mayo.uson.mx/Programa/Trabajo%20Experimental.htm