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Universit de Perpignan Via Domitia Anne 2011

Laboratoire de Chimie des Biomolcules et de lEnvironnement (LCBE) EA 4215


Laboratoire Gnome et Dveloppement des Plantes (LGDP) UMR 5096

Ecole Doctorale Energie et Environement (ED305)

N dordre


THSE


Prsente devant lUniversit de Perpignan Via Domitia pour lobtention du grade de Docteur
de lUniversit


Discipline : Biologie


Par

Christophe CALVAYRAC



DGRADATION BIOLOGIQUE DE LA SULCOTRIONE
DANS UN SOL AGRICOLE : RECHERCHE DUNE
VENTUELLE BIODGRADATION ACCLRE ET
CARACTRISATION DE SOUCHES BACTRIENNES
POTENTIELLEMENT DGRADANTES



Soutenue publiquement le 20 septembre 2011


Composition du jury :

F. MARTIN-LAURENT Directeur de Recherches INRA, Dijon Rapporteur
H. FENET Matre de Confrences, Universit Montpellier 1 Rapporteur
A. AMBLES Professeur, Universit de Poitiers Examinateur
R. ROUILLON Professeur, UPVD Examinateur
C. GUYOT Expert Environnement, BayerCropScience Examinateur
C. M. COSTE Professeur mrite, UPVD Examinateur
J. F. COOPER Professeur, UPVD Directeur de thse
O. PANAUD Professeur, UPVD Directeur de thse
Universit de Perpignan Via Domitia Anne 2011

Laboratoire de Chimie des Biomolcules et de lEnvironnement (LCBE) EA 4215
Laboratoire Gnome et Dveloppement des Plantes (LGDP) UMR 5096

Ecole Doctorale Energie et Environement (ED305)

N dordre


THSE


Prsente devant lUniversit de Perpignan Via Domitia pour lobtention du grade de Docteur
de lUniversit


Discipline : Biologie


Par

Christophe CALVAYRAC



DGRADATION BIOLOGIQUE DE LA SULCOTRIONE
DANS UN SOL AGRICOLE : RECHERCHE DUNE
VENTUELLE BIODGRADATION ACCLRE ET
CARACTRISATION DE SOUCHES BACTRIENNES
POTENTIELLEMENT DGRADANTES



Soutenue publiquement le 20 septembre 2011


Composition du jury :

F. MARTIN-LAURENT Directeur de Recherches INRA, Dijon Rapporteur
H. FENET Matre de Confrences, Universit Montpellier 1 Rapporteur
A. AMBLES Professeur, Universit de Poitiers Examinateur
R. ROUILLON Professeur, UPVD Examinateur
C. GUYOT Expert Environnement, BayerCropScience Examinateur
C. M. COSTE Professeur mrite, UPVD Examinateur
J. F. COOPER Professeur, UPVD Directeur de thse
O. PANAUD Professeur, UPVD Directeur de thse

Ab nou cor et ab nou talen,


Ab nou saber et ab nou sen,
Et ab nou bel captenemen,
Vuoill un bon vers commensar.

Raimbaut dAurenga, trobador.

Remerciements




Les travaux prsents dans ce manuscrit ont t effectus au sein du Laboratoire de Chimie
des Biomolcules et de lEnvironnement (LCBE) et du Laboratoire Gnome et
Dveloppement des Plantes (LGDP) de lUniversit de Perpignan Via Domitia (UPVD).

Au terme de ces nombreuses annes passes sous la direction des mes deux directeurs de
thse, quils veuillent bien trouver dans ce travail, un modeste tmoignage de mon profond
respect et de mon entire reconnaissance pour leur aide et leurs prcieux conseils.

Je voudrais remercier Mr Jean-Franois Cooper de mavoir accept au sein de son quipe et
de mavoir confi ce prsent travail. Malgr les grandes difficults et les nombreux obstacles
qui se sont prsents, il ma toujours prodigu encouragements et conseils et a su porter un
intrt constant mon travail. Jai beaucoup appris ses cots. Et bien au-del de laspect
purement scientifique. Son rudition, son rayonnement personnel ainsi que son humanit sont
pour beaucoup dans la russite de ce travail. Quil soit permis de lui exprimer mon
respectueux attachement ainsi que ma profonde admiration.

Je remercie galement Mr Olivier Panaud qui a accept de co-dirriger ce travail. Je lui suis
trs reconnaissant pour la qualit de son accueil au sein de son quipe, son soutien permanent
ainsi que pour la confiance quil su maccorder. Il a toujours manifest mon gard
gentillesse, marques de sympathie et une trs grande disponibilit. La qualit de son
encadrement scientifique ma permis de mener bien une grande partie de ce travail. Quil
veuille bien trouver ici lexpression de mes trs sincres remerciements.

Je tiens exprimer toute ma gratitude Mr Camille Michel Coste dont le prcieux concours
ma permis de raliser une partie de mon travail. Ses conseils aviss, sa grande disponibilit,
sa bonne humeur ainsi que les nombreuses discussions scientifiques que nous avons pu
changer ont t trs constructives et mont t trs profitables. Quil veuille bien trouver ici
la marque de ma sympathie et lexpression de mes trs sincres remerciements.

4



Je remercie vivement les membres du jury qui ont accept dvaluer ce travail. Leur prsence
signe lintrt quils ont port la ralisation de cette thse. Merci tout particulirement Mr
Fabrice Martin-Laurent et Mme Hlne Fenet davoir accept dtre les rapporteurs du
manuscrit, quils soient assurs de ma profonde reconnaissance et de mes sentiments
respectueux.

Jadresse galement un vif remerciement Mr Rgis Rouillon qui a accept de prsider ce
jury de thse. Quil soit permis de lui exprimer toute ma profonde reconnaissance.

Je remercie BayerCropScience pour le soutien financier accord tout au long de ce travail de
thse. Jadresse notamment mes vifs respects Mme Ilona Browjohn pour le rle
dinterlocutrice quelle a pu jouer et pour lintrt quelle a su porter cette tude. Je remercie
galement Mr Christian Guyot pour sa collaboration.

Je ne saurai oublier dans mes remerciements tous les membres des laboratoires qui mont
accompagn dans la ralisation de ce travail.

Je tiens exprimer ma profonde reconnaissance Mr Fabrice Martin-Laurent pour son
soutien indfectible, sa disponibilit et pour lexcellence de ses commentaires et de ses
remarques scientifiques toujours trs instructifs et formateurs. Merci Marion Devers-
Lamrani, Jrmie Beguet ainsi que tous les acteurs de lINRA de Dijon de lUMR
Microbiologie du Sol et de lEnvironnement, pour leur accueil, leur formation et le temps
quils ont su me consacrer lors de mes diffrents sjours.

Que tous mes collgues du LCBE, du LGDP, de lIUT de Perpignan, Dpartement Gnie
Biologique et plus gnralement de lUPVD, soient galement assurs de ma profonde
gratitude pour les nombreux conseils et les suggestions quils mont prodigus. Merci pour les
sourires, les discussions, les coups de mains, les encouragements, votre bonne humeur et
votre implication dans la ralisation de cette thse. Ce travail est aussi le vtre.



5

Merci Alexia pour son implication dans cette tude ainsi que pour le srieux de son travail.
Merci Julie pour sa bonne humeur et sa prsence.
Merci galement Susan qui ma soutenu dans les moments difficiles et qui a toujours cru en
moi.

Enfin, je souhaiterai remercier ma famille qui ma accompagn et encourag durant ce long
travail. Merci mes parents, Audrey, ma sur. Merci Philippe et Gigi, qui par leur
soutien et leur prsence, mont permis darriver au bout.

Je ddie cette thse ma fille Nina et ma grand-mre Marie-Louise.


6
Sommaire

REMERCIEMENTS 3
SOMMAIRE 6
TABLEDESILLUSTRATIONS 9
INTRODUCTION 18
PREMIEREPARTIE:REVUEBIBLIOGRAPHIQUE 22
Chapitre1Soletdiversitmicrobienne 23
1Contexte 23
2Composantemicrobiennedusol 24
3Diversitmicrobiennedusol 26
Chapitre2Mthodologiesnonmolculairesappliquesltudedessouchesbactriennes
telluriques 27
1Mthodescultivablestraditionnelles 27
2Mthodescultivablesinnovantes 29
Chapitre3Mthodologiesmolculairesappliquesltudedessouchesbactriennestelluriques
31
1AnalysedesprofilsderestrictiondesADNr16Samplifis(ARDRA) 31
2AmplificationPCRdessquencesrptitives(REPPCR) 33
3SquenagedesADNr16SetAnalysephylogntique 35
Chapitre4Dgradationbiologiquedesproduitsphytosanitairesdanslessols 41
1Dgradationbiologiqueetrcalcitrancemolculaire 41
2Inductionsenzymatiquesetadaptionsmicrobiennes 42
3Aspectscintiquesdeladgradationbiologique:Mtabolismedirectetcomtabolisme. 45
4Casparticulierdedgradationbiologique:labiodgradationacclre(BDA)despesticides 47
DEUXIEMEPARTIE:PRESENTATIONGENERALEDELETUDE 51
Chapitre1Lafamilledesherbicidestrictones 52
1Contextehistorique 52
2Lasubstanceactive 54
3Modedactiondelasubstanceactive 56
4Approchestoxicologiqueetcotoxicologique 60
5Comportementdanslesdiffrentscompartimentsdelenvironnement 61
Chapitre2Matricedtude:lesoldePerpignan 67
1Situationgographiquedelaparcelle 67
2ParamtresdaphiquesdusoldePerpignan 68
3Historiquecultural 69
4Stratgiedchantillonnage 69
5Dispositifexprimental:lesmicrocosmes 70
TROISIEMEPARTIE:METHODOLOGIESDETRAVAIL 73

7
Chapitre1Mthodologiedelanalysechimique 74
1Analysedeschantillonsdesols 74
2Analysedeschantillonsdemilieuxdeculture 77
Chapitre2Mthodologiedelanalysebiologique 87
1Cadredeltude:organisationdestravaux 87
2Approchecultivable:essaidisolementdesouchesbactriennesdgradantlasulcotrione 87
3Approchemolculaire:caractrisationdesisolatsbactriensdgradantlasulcotrionevsisolatsnon
dgradants 99
QUATRIEMEPARTIE:RESULTATSETDISCUSSION 119
Chapitre1ConfirmationdupouvoirbiodgradantdusoldePerpignanetrecherchedune
ventuellebiodgradationacclre(BDA) 120
1RactivitbiologiquedusoldePerpignan 120
2Rechercheduneventuellebiodgradationacclre(BDA) 124
3Conclusion 127
Chapitre2Isolementdesouchesbactriennespotentiellementdgradantesdelasulcotrione 129
1Recherchedesouchessulcotrionersistantes 129
2Isolementdesouchesbactriennesmtabolisantlasulcotrione 130
3Etudedupotentieldedgradationdesisolatsdgradants:suivideladissipationdelasulcotrione
danslemilieudeculture(MS) 134
4Recherchedemtabolitesdelasulcotrionedanslemilieudeculture(MS) 137
Chapitre3Caractrisationphylogntiquedesisolats1OPet1TRANS 142
1VrificationdelaqualitdelADNmatrice 142
2AnalysedupolymorphismedesquencedesADNr16Samplifis(ARDRA)desisolats 142
3Analysedesisolatsbactriensparamplificationdessquencesrptitives(REPPCR) 144
4SquenagedelADNr16Sdesisolats1OPet1TRANS 145
5Conclusion 154
Chapitre4Caractrisationfonctionnelledesisolats1OPet1TRANS 159
1Prambule 159
2DtectiondesgnesXylEcodantlenzymecatchol2,3dioxygnase 160
3DtectiondesgnesC12Ocodantlenzymecatchol1,2dioxygnase 164
4SquenagedesampliconsXylE 165
5SquenagedesampliconsC12O 165
CONCLUSIONGENERALEETPERSPECTIVES 167
REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUES 173
VALORISATIONDESTRAVAUXDERECHERCHE 207
Publicationn1(SOUSPRESSE) 208
Publicationn2 233
Communicationscientifique 241
TABLEDESANNEXES 252
ANNEXE1 253

8
ANNEXE2 260
ANNEXE3 262
TABLEDESMATIERES 263


9














Table des illustrations

10

Liste des figures


Figure I-1-1 : Principales caractristiques du sol en tant que microhabitat (Nannipieri et al.,
2003).

Figure I-2-1 : Rpartition des diffrents phyla (%) reprsents dans la banque Australian
Collection of Microorganisms , aprs entre en collection des isolats bactriens (Hugenholtz,
2002).

Figure I-3-1 : (a) Agrandissement dun ribosome chez une bactrie. (b) Modlisation
tridimentionnelle du ribosome 70S compos de la grande sous-unit 50S (ARNr 5S + ARNr
23S + 31 protines) et la petite sous-unit 30S (ARNr 16S + 21 protines). (c) Exemple de
repliement dans lespace de lARNr 16S provenant de la petite sous-unit 30S du ribosome
(Stern et al., 1988b). (d) Exemple de la structure secondaire de lARNr 16S de Vibrio.
parahaemolyticus X56580 prsentant la structure secondaire des 4 principales squences
provenant de diffrents isolats de Vibrio parahaemolyticus (Harth et al., 2007).

Figure I-3-2 : Principe de la REP-PCR.

Figure I-4-1 : Principaux mcanismes molculaires intervenant dans le transfert gntique
horizontal (HGT), daprs Zaneveld et al. (2008).

Figure I-4-2 : Modlisation conceptuelle de ladaptation des communauts bactriennes la
biodgradation acclre (BDA) de latrazine. Dispersion (flches rouges) des gnes atz et trz
par conjugaison plasmidique et diversification (flches vertes) du support des gnes atz par
transposition, daprs Devers et al. (2008).

Figure II-1-1 : Formule dveloppe de la leptospermone (C
15
H
22
O
4
).

Figure II-1-2 : Structure de la 2-[2,4-benzoyl disubstitu]-1,3 cyclohexanedione.


11
Figure II-1-3 : Formes tautomriques dominantes de benzoyl-cyclohexane-1,3-dione en
solution aqueuse (X = Cl pour la sulcotrione, X = NO
2
pour la msotrione.

Figure II-1-4 : Comportement dune benzoylcyclohexane-1,3-dione caractre acide faible
en solution aqueuse.

Figure II-1-5 : Voie mtabolique de biosynthse des tocophrols et des plastoquinones
partir du 4-Hydroxyphnylpyruvate chez la plante : site dinhibition de lenzyme 4-
phnylhydroxypyruvate dioxygnase par un herbicide trictonique (sulcotrione).

Figure II-1-6 : Formules dveloppes des principaux produits de dgradation de la
sulcotrione issus des voies A et B dcrites dans la littrature.

Figure II-1-7 : Principaux photoproduits de la sulcotrione (chaabane et al, 2007).
(A) : (2-hydroxy-4-mthylsulfonyl)-1,3-cyclohexanedione, (B) : Acide 5,7-dicto-7-(2-
chloro-4-mthylsulfonylphnyl) heptanoque, (C) : Acide 5,7-dicto-(2-hydroxy-4-
mthylsulfonyl) heptanoque, (D) : 1,3-cyclohexanedione, (E) : Acide 2-chloro-4-
mthylsulfonylbenzoque, (F) : Acide 2-hydroxy-4-mthylsulfonyl benzoque.

Figure II-1-8 : Variation de Ln K
obs
en fonction de 1/T pour la dgradation de la sulcotrione
dans le sol de Belgique dans la gamme de tempratures 25, 40 et 60C.

Figure II-2-1 : Plan de la parcelle exprimentale (IUT de Perpignan, UPVD).

Figure II-2-2 : Parcelle exprimentale (avant traitement phytosanitaire) situe sur le site de
lIUT de Perpignan, Universit de Perpignan Via Domitia (Pyrnes Orientales).

Figure II-2-3 : Synoptique du calendrier de traitements et de prlvements des essais en
microcosmes.

Figure II-2-4 : Prparation et mise en place des microcosmes.

Figure III-1-1 : Appareillage CLHP/UV Shimadzu utilis pour les analyses de la sulcotrione
partir de la matrice sol.

12

Figure III-1-2 : Chromatogramme CLHP/UV de la sulcotrione et de ses principaux
mtabolites (CHD et CMBA).

Figure III-1-3 : (a) Spectre de masse (CLHP/SM-ESI) de la 1,3-cyclohexane dione (CHD) en
mode positif. (b) Chromatogrammes du standard analytique (10 mg.L
-1
) par dtection barrette
de diodes et (c) dtection SM par extraction du fragment m/z 113 en mode positif.

Figure III-1-4: (a) Spectre de masse de lacide 2-chloro-4 methylsulfonyl benzoque
(CMBA) (standard analytique 20 mg.L
-1
) obtenu en CPG/SM (mode positif, SM, impact
lectronique). (b) Chromatogramme montrant la prsence du CMBA (fragments m/z, 217, 248
et 250) dans le milieu de culture (MS) supplment en sulcotrione de la souche 1OP aprs 27
jours dincubation.

Figure III-1-5: Droite dtalonnage de lester mthylique provenant du CMBA obtenu aprs
drivation et analyse en CPG/SM.

Figure III-1-6: Droite dtalonnage de la sulcotrione surajoute dans le milieu de culture MS,
aprs extraction et analyses CLHP/UV.

Figure III-1-7: Principe de la raction de drivation de lacide 2-chloro-4 methylsulfonyl
benzoque (CMBA), en prsence dun excs de trimthylsilyldiazomthane (TMSCHN
2
)

et de
mthanol conduisant la formation de lester mthylique correspondant.

Figure III-2-1 : Exemples dappareillages et de matriels utiliss en culture Pasteurienne lors
de ltude. IUT de Perpignan, Dpartement Gnie Biologique (UPVD).

Figure III-2-2 : Protocole disolement de souches bactriennes telluriques sulcotrione-
rsistantes.

Figure III-2-3 : Cultures rptes des isolats sulcotrione-rsistants avec pression de slection
de lherbicide.



13
Figure III-2-4 : Protocole de slection de souches bactriennes sulcotrione-dgradantes aprs
cinq cycles de cultures rptes.

Figure III-2-5 : Spectrophotomtre Nanodrop (ThermoFisherScientific) utilis pour la
quantification des chantillons dADN gnomique issus des isolats bactriens.

Figure III-2-6 : (a) Imageur de gel autonome (systme UGenius, SynGene), (b) Systme
compact dlectrophorse, (c) Thermocycleurs PTC 200 Gradient Cycler (Bio-Rad et MJ
Research), disponibles au LGDP (UPVD).

Figure III-2-7 : Carte du vecteur de clonage utilis lors de ltape de ligation des produits
PCR, dlimitant la positionde linsert dintrt (insert cloned) situ entre les deux promoteurs
T7 et SP6 ncessaire la transcription (plasmide pGEM

-T Easy Vector Ligation kit,


Promega, Madison, USA).

Figure III-2-8 : Croissance des colonies aprs talement de 20 L (gauche) et de 80 L
(droite) de cellules comptentes Escherichia coli DH5

ayant intgr le vecteur de clonage


pGEM

-T easy sur milieu LB + ampicilline (20 g.mL


-1
).

Figure III-2-9 : Squenceur Applied Biosystems Hitachi 3130xl Genetic Analyzers.

Figure III-2-10 : Voies de clivage du noyau aromatique du catchol (voies ortho et mta)
catalyses par les catchol dioxygnases.

Figure IV-1-1 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione dans les microcosmes de sol (4S) vs
(St4S) aprs traitements successifs.

Figure IV-1-2 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione dans les microcosmes de sol (C) vs
(StC) aprs traitements successifs.

Figure IV-2-1 : Colonies isoles sur milieu minimum (MS) supplment en sulcotrione
comme seule source de carbone et/ou dnergie aprs croissance 24C lobscurit.


14
Figure IV-2-2 : Suivi de la croissance des souches 1OP vs 1TRANS dans le milieu de culture
(MS) supplment en sulcotrione par mesure de labsorbance 600 nm.

Figure IV-2-3 : Suivi de la croissance des souches 1OP vs 1TRANS dans le milieu de culture
(MS) non supplment en sulcotrione par mesure de labsorbance 600 nm.

Figure IV-2-4 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione en fonction du temps dans le milieu
de culture (MS) supplment et ensemenc par les souches 1OP ou 1TRANS. Le contrle est
un milieu (MS) supplment non ensemenc.

Figure IV-2-5 : Suivi de laccumulation de lacide 2-chloro-4 methylsulfonyl benzoque
(CMBA) et de la dissipation de la sulcotrione en fonction du temps dans le milieu de culture
(MS) supplment et ensemenc par la souche 1OP.

Figure IV-3-1 : Empreintes ARDRA des isolats 1OP et 1TRANS gnres aprs digestion
des ADNr 16S par Alu I et migration sur gel dagarose (1%). La taille des fragments est
indique en paires de bases (pb).

Figure IV-3-2 : Empreintes ARDRA des isolats 1OP et 1TRANS gnres aprs digestion
des ADNr 16S par Hae III et migration sur gel dagarose (1%). La taille des fragments est
indique en paires de bases (pb).

Figure IV-3-3 : Profils REP PCR des isolats 1OP et 1TRANS.
Puits 1, 2, 5 et 6: REP PCR ralise avec 1 ng.L
-1
dADN

matrice. Puits 3, 4, 7 et 8: REP
PCR ralise avec 2 ng.L
-1
dADN matrice.

Figure IV-3-4 : Migration sur gel dagarose (1%) des ADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS
aprs amplification PCR laide des amorces universelles 27f et 1492r.

Figure IV-3-5 : Mise en culture des colonies recombinantes (colonies blanches T7-SP6-PCR
positives) pour la prparation de lADN plasmidique (MiniPreps) destin au squenage,
partir des banques de clones dADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS (milieu glos LB +
Ampicilline).


15
Figure IV-3-6 (a) : Migration sur gel dagarose (1% ) des amplicons aprs amplification PCR
partir des colonies blanches issues de la banque dADNr 16S de la souche 1OP.

Figure IV-3-6 (b) : Migration sur gel dagarose (1% ) des amplicons aprs amplification PCR
partir des colonies blanches issues de la banque dADNr 16S de la souche 1TRANS.

Figure IV-3-7 : Alignement des squences consensus des ADNr 16S des isolats 1OP et
1TRANS. BIODE : souche 1OP ; N-BIO : souche 1TRANS.

Figure IV-3-8 : Analyse phylogntique des ADNr 16S des isolats Pseudomonas sp.
1TRANS (NBD) et Pseudomonas sp. 1OP (BD). Les numros daccession GenBank des
squences dADNr16S utilises pour lanalyse sont indiqus entre parenthse dans la lgende.

Figure IV-4-1 : Migration des produits PCR sur gel dagarose (1,2%) aprs amplification de
lADN gnomique des deux isolats 1OP et 1TRANS laide des amorces XylEaf et XylEar.
Contrle 1 : ADN gnomique E. coli DH5 ; contrle 2 : ADN plasmidique pCambia 3300.
La taille des fragments est indique en paires de bases (pb).

Figure IV-4-2 : Migration des produits PCR sur gel dagarose (1,2%) aprs amplification de
lADN gnomique des deux isolats 1OP et 1TRANS laide des amorces C12Of et C12Or.
La taille des fragments est indique en paires de bases (pb).

Figure IV-4-3 : Alignement multiple des squences provenant des fragments dADN (taille
approximative 500 pb) obtenus lors du ciblage du gne C12O chez les isolats 1OP et
1TRANS laide du logiciel ClustalX V. 2.0.10 (Thompson et al., 1997).

16
Liste des tableaux


Tableau II-1-1 : Activit herbicide (DC
50
: Dose moyenne ncessaire pour le contrle

de 50
% de 7 espces diffrentes de dicotyldones) des composs 2-[2,4-benzoyl disubstitus]-1,3
cyclohexanedione (daprs Lee et al.,1998).

Tableau II-1-2 : Sensibilit des adventices la sulcotrione pour un traitement en post-leve
450 g.ha
-1
. TS = trs sensible, S = sensible, MS = moyennement sensible, MR =
moyennement rsistante, R = rsistante (daprs Compagnon et Beraud, 1992).

Tableau II-1-3 : Toxicit et cotoxicit de la sulcotrione non formule (The Pesticide
Manual, 2007).

Tableau II-2-1 : Proprits pdologiques et physico-chimiques du sol de la parcelle de
lInstitut Universitaire de Technologie (IUT) de Perpignan, dtermines par les protocoles
standardiss (Laboratoire dAnalyses Agricoles de Perpignan et LCBE UPVD).

Tableau III-1-1: Performances de la mthodologie danalyse de la sulcotrione dans le sol.

Tableau III-1-2 : Origine, rfrences et puret des standards analytiques utiliss lors de
lanalyse chimique.

Tableau III-1-3 : Calibration de lanalyse sulcotrione + mtabolites sur milieu de culture
avec lappareillage CLHP Jasco).

Tableau III-2-1: Prparation du milieu de culture minimum (MS).

Tableau III-2-2: Composition du milieu de culture TS (pH 7,3 0,2) pour 1 litre deau
purifie.

Tableau III-2-3: Composition du tampon Knapp (pH 6,6) pour 1 litre deau purifie.


17
Tableau III-2-4 : Prparation, composition et conditions de conservation du tampon Giescher
5X ncessaire la raction de REP-PCR.

Tableau III-2-5 : Prparation et composition du milieu Luria Bertani (LB) ncessaire la
slection des cellules bactriennes transformes par le plasmide pGEM

-T easy.

Tableau III-2-6 : Caractristiques des amorces utilises pour la dtection des gnes codant la
catchol 2,3-dioxygnase (C23O) et la catchol 1,2-dioxygnase (C12O) par amplification
PCR.

Tableau III-2-7 : Quantit dADN (en ng) ncessaire par raction de squenage pour les
fragments PCR. Etalonnage du squenceur Applied Biosystems Hitachi 3130xl Genetic
Analyzers.

Tableau IV-1-1 : Constantes cintiques (k), temps de demi-vie (t
1/2
) et coefficients de
dtermination (R
2
) relatifs la cintique de dgradation de la sulcotrione en conditions de
microcosmes pour le sol de Perpignan.

Tableau IV-1-2 : Paramtres cintiques relatifs aux diffrents traitements successifs effectus
pour les sols (4S), (St4S), (C) et (StC).

Tableau IV-2-1 : Evolution des concentrations en substance active et mtabolites dans le
milieu de culture (MS) supplment en sulcotrione et ensemenc par lisolat bactrien 1OP
(ND : non dtect).

Tableau IV-3-1 : Quantification et valuation de la qualit de lADN gnomique des isolats
bactriens 1OP et 1TRANS.

Tableau IV-3-2 : Quantification et valuation de la qualit des ADNr 16S des isolats
bactriens 1OP et 1TRANS obtenus aprs amplification PCR et purification.

18











Introduction









Introduction



19
La prsence de rsidus de composs xnobiotiques dans les principaux compartiments
de lenvironnement est avre depuis plusieurs dcennies. Les diverses activits anthropiques
(dveloppement urbain, pollutions industrielles, agriculture, pandage des boues de stations
dpuration, ) exercent des pressions environnementales variables, que les institutions
nationales et/ou supranationales sefforcent didentifier et de limiter (plan national Ecophyto
2018, lgislation Europenne REACH,).
Lagriculture intensive conventionnelle participe de manire notable la dgradation de la
qualit des eaux de surface et souterraines, du sol et de latmosphre, conscutivement
lutilisation dintrants agricoles tels que les engrais, le lisier et les produits
phytopharmaceutiques. Dans son bulletin dat de juin 2010 (Lenvironnement en France :
leau), le Service de lObservation et des Statistiques du Commissariat Gnral au
Dveloppement Durable (ex IFEN) a publi des donnes relatives ltat des cours deau en
2007 : 82 % des stations slectionnes prsentaient une concentration en pesticides totaux <
0,5 g.L
-1
en moyenne annuelle, les teneurs suprieures (18 %) affectant les cours deau des
rgions pratiquant une agriculture intensive (Midi-Pyrnes, bassin parisien, valle du Rhne,
nord de la France). Les eaux souterraines apparaissent sensiblement moins contamines.
Le rle du sol, zone majoritaire de charge en produits phytopharmaceutiques (PPP), est
videmment essentiel dans leur transfert vers les diffrents compartiments aquatiques
terrestres. Dans cette matrice, le comportement de ces composs est fortement conditionn par
plusieurs processus :

- La volatilisation, principalement en surface ;
- Ladsorption-dsorption, contrlant la distribution et la mobilit des molcules
pesticides ;
- La dgradation chimique, essentiellement hydrolyse, photolyse et oxydo-
rduction ;
- La dgradation biologique ;
- Les phnomnes de transport (diffusion molculaire, convection, transport de
composs dissous ou en phase particulaire, ).

Les herbicides de la famille chimique des trictones, mis sur le march dans les annes 90, ont
t homologus dans certains itinraires techniques agricoles, notamment en masiculture,
Introduction



20
bnficiant du retrait de substances actives comme latrazine. Ces molcules de nouvelle
gnration (msotrione et sulcotrione), employes doses infrieures celles de latrazine
(150 - 450 g.Ha
-1
vs 1200 g.Ha
-1
) ont t qualifies de composs prsentant des risques
minimes pour lenvironnement (Mitchell et al., 2001). Cependant, afin de limiter les risques
de pollution future du milieu naturel et de la ressource en eau, diverses tudes ont t
entreprises afin dtablir le profil comportemental de cette famille chimique. Un premier
travail t prcdemment men au Laboratoire de Chimie des Biomolcules et de
lEnvironnement (LCBE) et a conduit, en collaboration avec BayerCropScience (BCS), la
soutenance de thse de H. Chaabane (2005). Cet auteur a tudi le comportement de la
sulcotrione dans diffrents sols agricoles (Belgique, Martinique, Landes et Perpignan) par une
approche phnomnologique classique . A propos de la rtention, quel que soit le type de
sol, la capacit dadsorption sest avre modre pour la substance active ainsi que pour un
de ses produits de dgradation principaux (acide 2-chloro-4-msyl benzoque, CMBA) et leur
dsorption relativement aise. La 1,3-cyclohexanedione (CHD), autre produit de dgradation,
est apparu plus fortement adsorbe sur les composantes du sol. Le transfert de ces composs a
t estim modr dans lhorizon 0-10 cm. Dans le cas de la dgradation abiotique, ltude de
lhydrolyse, en conditions naturelles puis en conditions de laboratoire, selon diffrentes
modalits (pH, temprature, prsence du cation Fe
++
,) a permis de qualifier la sulcotrione
de compos stable. La photolyse, tudie dans diverses eaux (eau de laboratoire, eau de mer et
eau de rivire) a montr une vitesse de dgradation suprieure celle observe pour
lhydrolyse. La dgradation biologique, gnralement associe une dgradation abiotique,
est apparu prpondrante notamment dans le sol de Perpignan.

Le sol de Perpignan, prsentant donc une ractivit biologique notable et ayant reu
antrieurement des traitements rpts par la sulcotrione lors des travaux de H. Chaabane, a
constitu un outil prcieux pour essayer de provoquer puis de caractriser une ventuelle
biodgradation acclre (BDA) en conditions contrles, conscutivement une possible
adaptation de la microflore tellurique par acquisition de gnes codant les enzymes
cataboliques responsables de la dgradation.

Par ailleurs, nous avons souhait utiliser la ractivit avre de ce sol de Perpignan afin den
isoler des microorganismes dgradants spcifiques, capables dutiliser la sulcotrione comme
Introduction



21
seule source de carbone et /ou dnergie. La culture de ces microorganismes au laboratoire, et
le souhait de les caractriser de la manire la plus formelle possible, nous ont amen
proposer une stratgie exprimentale comprenant plusieurs tapes successives :

- slection de milieux adapts la culture, au laboratoire, de souches telluriques,
gnralement rputes comme difficilement cultivables sur milieux synthtiques ;
- slection des souches dintrt ;
- valuation de leur potentiel biodgradant ;
- caractrisations phylogntique et fonctionnelle des isolats retenus.

Lensemble de ces donnes sera discut, avec pour objectif la perspective dune valorisation
biotechnologique possible des isolats prsentant le plus fort potentiel de dgradation.
En outre, ce travail devrait sinscrire dans une thmatique de recherche plus fondamentale
visant apprhender certains mcanismes volutifs conduisant ladaptation des
microorganismes en rponse aux changements de leur environnement.



22











Premire partie: Revue bibliographique
Premire partie Chapitre 1 : Sol et diversit microbienne



23

Chapitre1Soletdiversitmicrobienne

1- Contexte

Tous les pesticides pandus sur les surfaces agricoles ou plus gnralement sur tout
type de sol, sont plus ou moins rapidement dgrads. La dgradation peut ainsi sappuyer sur
des mcanismes biochimiques consistant essentiellement en des ractions dhydrolyse,
doxydation, de rduction et de dshalognation (Van der Meer et al., 1992 ; Castillo et
Tortensson, 2007). Ce processus est qualifi de dgradation biologique, catalyse par les
microorganismes telluriques plus ou moins spcifiques, en arobiose ou anarobiose, avec
formation de mtabolites. Ce mcanisme est dans la majorit des cas quantitativement plus
important que la dgradation chimique des composs xnobiotiques (exception faite de
composs trs rcalcitrants, comme les polychlorobiphnyles).

Nous prsenterons ici les principales composantes de ce processus avant de nous attarder sur
un cas particulier de dgradation biologique, qualifi de biodgradation acclre (BDA).
Cependant, dans un premier temps, il nous a sembl ncessaire de considrer le sol comme
une matrice prsentant ses propres spcificits, et dont le rle sera prpondrant dans les
processus de biodgradation des produits phytosanitaires.

La phnomnologie des pesticides dans le sol fait intervenir de nombreux facteurs parmi
lesquels figurent la nature chimique de la substance, la formulation applique, mais galement
la nature du sol, sa texture, ses proprits physico-chimiques, sa capacit de rtention, la
diversit des communauts microbiennes prsentes,

Notre travail sest donc limit dcrire ltude de la biodgradation de lherbicide
sulcotrione ; nous avons donc souhait prsenter, dans cette partie bibliographique : (i) le sol
en tant que microhabitat, source de diversit microbienne, (ii) les mthodologies retenues
pour caractriser les microorganismes et leur action et, (iii) le rle de cette microflore
tellurique largement implique dans la dgradation des produits phytosanitaires.
Premire partie Chapitre 1 : Sol et diversit microbienne



24

2- Composante microbienne du sol

Le sol est un micro-habitat pourvu dimportantes proprits distinctives (cf figure I-1-
1) qui en font une matrice originale (Kuster et Hattori, 1973). En premier lieu, la population
microbienne y est trs diversifie. En prenant la taille du gnome d'Escherichia coli comme
unit de rfrence, Torsvik et al. (1996) ont estim la prsence d'environ 6000 gnomes
bactriens diffrents par gramme de sol. A titre dexemple, la biomasse microbienne dans un
sol de prairie tempre s'lve environ 1 2 t.Ha
-1
de biomasse bactrienne et 2 5 t.Ha
-1

de biomasse fongique (Killham, 1994).
Le sol est un systme structur, htrogne et discontinu, gnralement pauvre en
lments nutritifs. Les sources de carbone et d'nergie disponibles pour les microorganismes
vivants sont relativement plus faibles que les concentrations optimales en lments nutritifs
obtenues au laboratoire pour assurer la croissance microbienne sur milieux synthtiques
(Stotzky, 1961). Les caractristiques chimiques, physiques et biologiques de ces micro-
habitats diffrent galement dans le temps et l'espace. La taille des habitats dpend
principalement de la nature des organismes qui sy trouvent : quelques m pour les bactries,
moins de 100 m pour les champignons et entre 100 m et 2 mm pour les acariens et
collemboles et, enfin, entre 2 et 20 mm pour les isopodes (Coleman et Crossley, 1996). De
plus, mme si l'espace disponible est vaste dans le sol, l'espace biologique, occup par les
microorganismes vivants, reprsente une faible proportion, gnralement infrieure 5% de
l'espace total disponible (Ingham et Horton, 1987). Une autre particularit du sol est la
prsence de zones d'activits biologiques accrues : les agrgats de sols, prsentant des
proprits physico-chimiques diffrentes selon leur origine (Sexstone et al., 1985) et riches en
particules organiques (Parkin, 1987 ; Petersen et al., 1996) et la rhizosphre (Lynch, 1994 ;
Morgan et al., 2005) sont les principaux reprsentants de ces zones biologiquement actives.
De plus, de nombreux facteurs environnementaux contrlent cette vie microbienne : les
sources de carbone et d'nergie, les substances minrales prsentes, les facteurs de croissance,
l'eau disponible ainsi que sa composition ionique, la temprature et la pression, loxygnation,
le pH, les potentiels d'oxydo-rduction sont autant de paramtres cologiques influenant la
croissance des populations microbiennes telluriques. Enfin, la nature des surfaces et les
interactions spatiales entre les micro-organismes jouent galement un rle fondamental. Selon
Hattori (1973), prs de 80 90% des micro-organismes telluriques se trouvent sur des
Premire partie Chapitre 1 : Sol et diversit microbienne



25
surfaces solides. Huang et al. (1998) et Chen et al. (2006) ont montr que certaines cellules
bactriennes produisent des polysaccharides extracellulaires interagissant avec les particules
d'argile et que ces complexes argilo-polysaccharides peuvent persister mme aprs la mort
des microorganismes. Ainsi, la majorit de la microflore vit libre ou attache des surfaces, et
se rpartit dans les films liquidiens entourant les particules solides et lintrieur d'agrgats
(Stotzky, 1961).
La phase solide du sol adsorbe d'importantes molcules biologiques comme les
protines et les acides nucliques. De cette faon, certaines enzymes extracellulaires
adsorbes par les minraux argileux ou piges par les molcules dacides humiques peuvent
maintenir leur activit biologique, et sont protgs contre la protolyse, la dnaturation
thermique et les effets du pH (Nannipieri et al., 2003). Les acides nucliques adsorbs ou
ventuellement lis des molcules dacides humiques ou des particules d'argile et de sable
sont protgs contre la dgradation par les nuclases, rendant donc possible les processus de
transfert gntique horizontal (HGT) rencontrs au sein des populations microbiennes
telluriques, facteur important de la diversit gntique des populations microbiennes
telluriques (Lorenz et al., 1991 et 1994 ; Trevors et al., 1996 ; Paget et al., 1992;
Pietramellara et al., 2002).

Figure I-1-1 : Principales caractristiques du sol en tant que microhabitat (daprs


Nannipieri et al., 2003).
Premire partie Chapitre 1 : Sol et diversit microbienne



26
3- Diversit microbienne du sol


La diversit microbienne est un terme gnral qui comprend la diversit gntique, (cest--
dire la rpartition des donnes gntiques au sein des espces microbiennes), la diversit des
espces (bactries et de champignons dans les communauts microbiennes) et la diversit
cologique correspondant la variation de la structure des communauts, la complexit des
interactions et le nombre de niveaux trophiques. La diversit microbienne peut tre mesure
par le nombre despces diffrentes (richness) ainsi que leur abondance relative (evenness)
dans la microflore du sol (Kennedy et Smith, 1998). En ce qui concerne la diversit
bactrienne, il est gnralement admis quelle est comprise entre 5 x 10
3
et 5 x 10
4
espces par
gramme de sol pour des abondances pouvant varier de 10
8
10
11
cellules par gramme de sol
(Kennedy et Papendick, 1995 ; Torsvik et al., 2002 ; Curtis et al., 2002 ; Roesch et al., 2007).

Accder cette diversit du sol peut globalement se rsumer lutilisation de deux
approches : (i) les techniques non molculaires, reprsentes par les mthodes traditionnelles
de microbiologie pasteurienne, faisant appel aux approches cultivables par lutilisation de
divers milieux synthtiques utiliss en fonction des objectifs dfinis (milieux slectifs ou non
et/ou diffrentiels) ou par des comptages in situ des chantillons laide de marqueurs
spcifiques ; (ii) les techniques molculaires faisant appel la biologie molculaire et/ou aux
mthodes biochimiques.
Premire partie Chapitre 2 : Mthodologies non molculaires appliques ltude
des souches bactriennes telluriques



27
Chapitre2Mthodologiesnonmolculairesappliques
ltudedessouchesbactriennestelluriques

Dans cette partie bibliographique, nous nous limiterons dcrire brivement le principe des
mthodologies retenues au cours de notre travail de thse.

1- Mthodes cultivables traditionnelles

La possibilit de cultiver des souches bactriennes telluriques au laboratoire est


fondamentale car elle contribue mieux apprhender leurs proprits et leurs capacits
fonctionnelles. Historiquement, les techniques cultivables appliques la microbiologie du
sol ont connu un essor important la fin du 19
ime
sicle avec les travaux de Winogradsky
(caractrisation des microorganismes responsables de la nitrification dans le sol ; Van Elsas et
al., 2007) et de Beijerinck (obtention de cultures pures de Thiobacillus denitrificans par
enrichissements successifs). Les techniques par enrichissements slectifs, fondes sur
lutilisation de nutriments cibles et/ou dinhibiteurs spcifiques, ont permis de mettre en
vidence un nombre important et croissant de groupes spcifiques de microorganismes du sol.

Lunique procdure dnumration des souches microbiennes vivantes prsentes dans
leur habitat naturel a t pendant trs longtemps la technique du nombre le plus probable ou
Most-Probable-Number (Bakken, 1997; Johnsen et al., 2001). La dcouverte de nouveaux
groupes taxonomiques ou fonctionnels na t possible que par la slection de souches
microbiennes partir de milieux gloss spcifiques et la diversit cultivable tudie par
isolement de ces colonies, compltes par une identification par typage molculaire
(Vandamme et al., 1996). Certains auteurs ont galement valu la diversit des micro-
organismes cultivables en suivant la chronologie dapparition des diffrentes colonies
identifies sur le milieu glos choisi (Ishikuri et Hattori, 1985). Nanmoins, tudier la
diversit microbienne du sol par ce type de mthodologie prsente des limites, non seulement
Premire partie Chapitre 2 : Mthodologies non molculaires appliques ltude
des souches bactriennes telluriques



28
parce que le nombre de micro-organismes cultivables sur milieux synthtiques est limit, mais
aussi parce que les procdures disolement sont trs souvent extrmement laborieuses. De
plus, ces techniques prsentent une estimation biaise de la diversit microbienne du sol.
Hugenholtz et al. (1998) et Hugenholtz (2002) rapportent que les microorganismes facilement
isols reprsentent 0,1 1% de la totalit des espces microbiennes du sol. A titre dexemple,
pour un mme chantillon de sol, le comptage in situ par microscopie pifluorescence
permet de multiplier dun facteur 100 1000 les rsultats de dnombrements obtenus par les
techniques cultivables conventionnelles (Johnsen et al., 2001). Ce phnomne appel Great
Plate Count Anomaly par Staley et Konopla (1985), a largement t dcrit par de nombreux
microbiologistes du sol. En outre, ces microorganismes cultivables, bien que prsentant une
diversit de genres et despces, appartiennent trs majoritairement aux quatre phyla
suivants (the big four) : Proteobacteries, Firmicutes, Actinobacteries et Bacteroidetes
(Hugenholtz, 2002). A titre dexemple, la figure I-2-1, illustre ce biais cultivable (place
dominante des big four ) dcrit dans la banque Australian Collection of
Microorganisms .

Figure I-2-1 : Rpartition des diffrents phyla (%) reprsents dans la banque Australian
Collection of Microorganisms , aprs entre en collection des isolats bactriens (Hugenholtz,
2002).
Premire partie Chapitre 2 : Mthodologies non molculaires appliques ltude
des souches bactriennes telluriques



29
Ces donnes sexpliquent essentiellement par l'interdpendance trophique des
diffrents organismes prsents dans un cosystme spcifique et l'incapacit de crer, en
culture pure, les conditions environnementales rencontres par les micro-organismes du sol.
Ainsi, seules certaines espces microbiennes sont cultivables et uniquement sous certaines
conditions physiologiques (Bakken, 1997; Muyzer et Smalla, 1998; Heuer et al., 2001). De
nombreux auteurs ont en effet dmontr que le choix du milieu de culture affecte
sensiblement les colonies formes (Srheim et al., 1989; Johnsen et Nielsen, 1999). Daprs
Bakken (1997), les cellules bactriennes de petites dimensions (ultramicrobactries) ne sont
pas cultivables sur milieu glos car incapables de former des colonies en prsence dagar. En
considrant que les cellules de grandes dimensions occupent environ 80 % du volume total
dans lequel est confine la totalit des bactries telluriques, il a mis lhypothse que seules
ces dernires prsentent une importance cologique majeure dans le sol.
Ce type de mthodologie demeure une approche fondamentale en cologie microbienne, mais
prsente finalement des limites importantes daccs la diversit microbienne.


2- Mthodes cultivables innovantes

Lapproche cultivable demeure une technique incontournable lorsque lon souhaite
isoler et cultiver des souches microbiennes telluriques dintrt. De nouvelles mthodologies
alternatives sont aujourdhui disponibles et laissent entrevoir des perspectives intressantes
pour lavenir. Globalement, ces technologies suivent trois stratgies distinctes mais
complmentaires (Keller et Zengler, 2004): (i) une amlioration des techniques cultivables
conventionnelles par optimisation des milieux synthtiques, (ii) une stimulation de la
croissance microbienne in situ par utilisation directe de lchantillon environnemental comme
milieu de culture appropri, supplment ou non avec de faibles concentrations en nutriments
et, (iii) un dveloppement de protocoles de cultures haut-dbit accompagnes de systme
haute rsolution de dtection de la croissance microbienne.
Ainsi, en jouant de faon synergique sur les divers paramtres contrlant les tapes du
protocole disolement (sonication des particules de sol, faible concentration en nutriments,
pH, substitution de lagar par de la gomme gellane, longue dure dincubation et observation
minutieuse des colonies en dveloppement sur la glose), Janssen et al. (2002) ont pu isoler
Premire partie Chapitre 2 : Mthodologies non molculaires appliques ltude
des souches bactriennes telluriques



30
pour la premire fois de nouvelles souches bactriennes rparties dans diffrentes divisions
(Acidobacteria, Actinobacteria, Proteobacteria et Verrucomicrobia) et jusqualors dcrites
seulement par des mthodes non cultivables.
Lutilisation de faibles concentrations de nutriments dans les milieux denrichissement peut se
rvler efficace pour isoler des souches faible vitesse de croissance, gnralement perdues
dans des milieux conventionnels au profit de celles dveloppement rapide (Connon et
Giovannoni, 2002). Le dveloppement de certaines colonies sur milieux synthtiques peut
tre excessivement lent et demander des semaines, voire des mois avant dtre observables
lil nu (Harris et Paul, 1994 ; Davis et al., 2005 et 2011).
Daprs des tudes relativement rcentes (Janssen et al., 2002 ; Joseph et al., 2003 ; Sangwan
et al., 2005 ; Stevenson et al., 2004 ; Zengler, et al., 2002 ; Kaeberlein et al., 2002 ; Ferrari et
al., 2005 ; Davis et al., 2005, 2011 ; Sait et al., 2002 et 2006 ;Vartoukian et al., 2010), la mise
au point de nouveaux milieux de culture et le dveloppement de techniques cultivables
innovantes permettent denvisager de nouvelles perspectives disolement et dentre en
collection de souches microbiennes telluriques non cultivables sur milieux conventionnels.
Selon certains auteurs comme Nichols (2007) ou Ellis et al. (2003), il est donc ncessaire de
nuancer quelque peu le paradigme qui consistait considrer la majorit des espces
microbiennes prsentes dans le sol comme tant non cultivables.

Premire partie Chapitre 3 : Mthodologies molculaires appliques ltude des


souches bactriennes telluriques



31
Chapitre3Mthodologiesmolculairesappliques
ltudedessouchesbactriennestelluriques

Les techniques molculaires impliquent gnralement l'extraction des acides


nucliques (ADN ou ARN) issus des populations microbiennes de faon directe ou indirecte
partir du sol. Elles sont indpendantes des mthodes cultivables et ont un pouvoir de
rsolution variable qui peut gnralement tre ajust en fonction des objectifs, de lanalyse
des grands groupes taxonomiques jusqu la mise en vidence despces au sein
dchantillons de sols. Nous nous limiterons dcrire les techniques utilises dans le cadre de
notre tude.

1- Analyse des profils de restriction des ADNr 16S amplifis


(ARDRA)

Les travaux de Carl Woese (1987) ont vritablement rvolutionn lapproche


taxonomique en microbiologie. Ils ont dmontr que les squences dADN ribosomaux
(ADNr) prsentes sous forme doprons chez tous les microorganismes (leur nombre variant
environ de 1 15 copies par gnome bactrien (Rainey et al., 1996) taient des marqueurs
volutifs relativement robustes, semblables des chronomtres , trs utiles pour dchiffrer
la phylognie et lvolution des populations microbiennes au cours du temps (Woese, 1987).
Les ribosomes (cf figure I-3-1) sont forms de deux sous-units (une grande sous-unit 50S et
une petite sous-unit 30S) comportant chacune des protines ribosomales (31 et 21 protines
respectivement) assembles sur une matrice d'acides ribonucliques (ARNr). Les ARN
ribosomiques (petite sous unit = ARNr 16S, grande sous-unit = ARNr 23S) se sont imposs
comme rfrence de taxonomie molculaire car ils runissent l'ensemble des qualits requises.
En premier lieu, ils sont un lment cl de la synthse protique, fonction trs conserve car
indispensable la vie de la cellule. Ensuite, ils ont une structure particulire faite d'une
succession de domaines dont les vitesses d'volution sont trs variables, de relativement
leve presque nulle et chacun de ces domaines a son importance pour l'identification
molculaire des micro-organismes. Certaines parties sont identiques chez toutes les bactries
et donc utilisables comme sites de complmentarit pour des amorces universelles de
Premire partie Chapitre 3 : Mthodologies molculaires appliques ltude des
souches bactriennes telluriques



32
squences ou d'amplification (PCR). La comparaison des domaines conservs permet de
retracer les liens de parent qui unissent des bactries loignes, tandis que les domaines
vitesse d'volution plus rapide permettent l'tude des relations phylogntiques d'espces plus
proches. D'autres parties de squences sont propres un groupe et permettent ainsi
l'identification de squences dites signatures caractristiques d'ordres taxonomiques diffrents
(espce, genre, famille ou royaume). A titre dexemple, Heuer et al. (1999) ont indiqu que 14
rgions diffrentes de l'ADNr 16S (A, B, C, D, E, F, V1V3 et V5V9) ont pu tre utilises
pour gnrer des empreintes des communauts bactriennes.

















Figure I-3-1 : (a) Agrandissement dun ribosome chez une bactrie. (b) Modlisation
tridimentionnelle du ribosome 70S compos de la grande sous-unit 50S (ARNr 5S + ARNr
23S + 31 protines) et la petite sous-unit 30S (ARNr 16S + 21 protines). (c) Exemple de
repliement dans lespace de lARNr 16S provenant de la petite sous-unit 30S du ribosome
(Stern et al., 1988b). (d) Structure secondaire de lARNr 16S de Vibrio. parahaemolyticus
X56580 prsentant les quatre principales squences provenant de diffrents isolats de Vibrio
parahaemolyticus (Harth et al., 2007).

Premire partie Chapitre 3 : Mthodologies molculaires appliques ltude des
souches bactriennes telluriques



33
LARDRA consiste, aprs amplification par PCR dune partie de la squence du gne de
lADNr 16S, analyser, aprs digestion enzymatique, les profils de restriction obtenus entre
diffrents chantillons dADNr 16S. Cette mthodologie est, dune faon gnrale et quel que
soit le gne auquel elle est applique, appele analyse du polymorphisme de longueur des
fragments de restriction ou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). En revanche,
lorsquelle est applique des ADN ribosomaux (ADNr), on parle plutt danalyse de
restriction dADN ribosomaux amplifis ou dARDRA. Cette technique a t reconnue
comme tant un outil danalyse phylogntique fiable et a donc t largement utilise dans de
nombreuses tudes taxonomiques sur divers microorganismes cultivables ou non cultivables,
issus de diffrents chantillons environnementaux (Vaneechoutte et al., 1992, 1993;
Martinez-Murcia et al., 1995). Les travaux de Moyer et al. (1994) ont dmontr que
lutilisation de 2 endonuclases reconnaissant des sites de restriction 4 nuclotides
permettait de discriminer la majeure partie des ADNr 16S prsents au sein dun mlange
complexe, en rvlant le polymorphisme de squence de lopron ribosomique bactrien
(Massol-Deya et al., 1995). Il est communment admis que lARDRA permet de diffrencier
des chantillons jusquau niveau du genre bactrien (Martin-Laurent et al., 2001). Toutefois,
il est faut tre trs prudent dans l'interprtation de la composition des communauts
microbiennes car la mthode d'extraction des ADN peut influencer les rsultats obtenus
(Martin-Laurent et al., 2001).

2- Amplification PCR des squences rptitives (REP-PCR)

Lamplification des squences rptitives (REP-PCR), permet lamplification, par la


raction de polymrisation en chaine (PCR), de fragments dADN de tailles diffrentes
(amplicons) constitutifs de squences extragniques (non codantes) rptitives et
palindromiques prsentes dans de nombreux gnomes microbiens. Les squences REP,
comprises lintrieur de squences non traduites des oprons bactriens, ont t dcrites
comme tant vraisemblablement des lments gntiques rgulateurs potentiels, (Townsend et
al., 1997) intervenant notamment dans leur capacit former des structures stables en boucles
lors du processus de transcription. Ds 1984, les premires squences REP ont t mises en
vidence chez Escherichia coli et Salmonella typhimurium par Stern et al. (1984). Ces
Premire partie Chapitre 3 : Mthodologies molculaires appliques ltude des
souches bactriennes telluriques



34
lments palindromiques, constitus de squences consensus conserves (environ 38 paires de
bases), pouvant former une structure stable sous forme de boucle avec une rgion centrale
variable denviron 5 paires de bases, sont largement prsents dans les gnomes de la plupart
des genres bactriens. Les squences REP ont donc t utilises comme amorces pour
l'amplification par PCR de rgions de l'ADN gnomique bactrien (de Bruijn, 1992). Ainsi,
lors de la raction, les amorces utilises se fixent sur plusieurs squences dADN rparties
dans tout le gnome des microorganismes. Plusieurs fragments amplifis, hautement
spcifiques et de diffrentes longueurs sont donc ainsi facilement obtenus et spars par
lectrophorse sur gel dagarose. Le principe de cette technique est prsent figure I-3-2.
En cologie microbienne molculaire, la prsence des lments REP dans la grande majorit
des gnomes des Eubactries prsente une approche dinvestigation molculaire relativement
utile dans la caractrisation dchantillons environnementaux. Cette mthodologie de travail
permet (i) de rendre compte de la variabilit de l'ensemble du gnome bactrien (Versalovic et
al., 1991), (ii) d'analyser les gnomes ou de diffrencier des souches bactriennes appartenant
des groupes phylogntiquement trs proches pouvant aller jusquau niveau de lespce,
(iii) de rendre compte de la dispersion des squences REP caractristiques de chaque souche
bactrienne (Menna et al., 2009) et, enfin, (iiii) de raliser une analyse de la diversit
gnotypique plus fine que par la technique de l ARDRA. (Frey et al., 1996).

Figure I-3-2 : Principe de la REP-PCR



Premire partie Chapitre 3 : Mthodologies molculaires appliques ltude des
souches bactriennes telluriques



35
3- Squenage des ADNr 16S et Analyse phylogntique

3-1- Principe gnral

La systmatique peut tre dfinie comme une nomenclature hirarchise des


organismes vivants, li la thorie de lvolution, et dont lobjectif principal est dassurer une
classification des espces sappuyant sur les relations phylogntiques (Harayama et Kasai,
2006). Lespce constitue lunit taxonomique fondamentale. Wayne et al. (1987) ont propos
une dfinition de lespce microbienne sappuyant sur les proprits de dnaturation et de
renaturation de lADN gnomique. Ainsi, les valeurs dhybridation ADN-ADN entre deux
souches suprieures ou gales 70 %, accompagnes de valeurs de Tm infrieures ou gales
5C, constituent des bornes raisonnables et acceptables de dfinition de lespce
microbienne. Nanmoins, certains auteurs ont pu mettre en vidence que cette mthodologie
prsentait certains biais (Stackebrandt et Goebel, 1994 ; Vandamme et al., 1996). En outre,
Rossello-Mora et Amann (2001) ont montr que pour dcrire de nouvelles espces
microbiennes, une approche polyphasique intgrant des donnes la fois gnotypiques et
phnotypiques savrait ncessaire. Les spcialistes de la systmatique bactrienne nont donc
pas encore totalement trouv de consensus satisfaisant pour dfinir sensu stricto le terme
despce (Cohan, 2002). En effet, donner une dfinition de lespce bactrienne applicable
tous les microorganismes semble difficile, aucun critre de classification phylogntique
ntant suffisamment discriminant, stable et universel (Stackebrandt, 2003).
Malgr les biais inhrents chaque mthode, ltude de lhybridation ADN-ADN associe
lanalyse des squences dADNr 16S constitue une mthodologie trs largement admise par
les microbiologistes pour discerner les souches microbiennes troitement apparentes.
Historiquement, le dbut des phylognies molculaires bases sur lanalyse compare
de squences remonte aux annes 60, avec les travaux de Zucklerkandl et Pauling (1965) et
Fitch et Margoliash (1967) sur les squences protiques de cytochrome c et de globines.
Dans le cadre de notre tude, lanalyse phylogntique sest appuye sur le squenage des
ADNr 16S (Woese et al., 1990). Cette procdure sest droule en plusieurs tapes
conscutives : (i) amplification des squences dADNr 16S (environ 1500 paires de bases)
partir damorces universelles de la division Bacteria, (ii) squenage, (iii) dition et
alignement des squences obtenues par comparaison avec des squences de rfrences
Premire partie Chapitre 3 : Mthodologies molculaires appliques ltude des
souches bactriennes telluriques



36
prsentes dans les bases de donnes internationales, (iiii) estimation des distances volutives
entre les squences concernes par application de modles volutifs et enfin, (iiiii)
construction dun arbre phylogntique partir des distances values prcdemment par
lapplication dun algorithme associ une analyse statistique afin de tester la robustesse de
larbre retenu.
Il nous a sembl opportun, dans cette partie bibliographique, de rappeler le principe gnral
des mthodologies de laprs-squenage ncessaires lexploitation des donnes
gnomiques.

3-2- Mthode dalignement

Pour construire un arbre partir de squences nuclotidiques, il faut tout d'abord diter
ces squences afin den liminer le dbut et de la fin (baisse de qualit, donc de confiance),
didentifier et dliminer les pics parasites ( gomtrie irrgulire) et les fragments du
vecteur de clonage. Il sagit galement de corriger les ambiguts dues des superpositions de
pics insuffisamment discrimins par le programme et assurer manuellement une correction
des erreurs.
Lalignement consiste faire correspondre les positions dans la squence ayant une origine
commune avec les autres squences disponibles. Cette tape permet de mettre en regard des
nuclotides homologues prsents dans les squences dADNr 16S. Le travail dalignement est
particulirement dlicat raliser, et, mme sil existe des logiciels adapts, les alignements
ncessitent dtre trs souvent rajusts manuellement. Deux nuclotides pourront tre
homologues et informatifs pour deux espces proches alors quils ne le seront pas pour deux
espces lointaines. En outre, les phnomnes dhomoplasie (similarit ne drivant pas dun
caractre ancestral) compliquent lanalyse des squences dans les zones hypervariables. Les
homoplasies sont conscutives des vnements de type rversion (changement dans une
squence annul par un second changement G CG), paralllisme (changements parallles
dans deux squences conduisant des nuclotides identiques) ou convergence (squences
ancestrales diffrentes qui voluent vers des squences identiques).
En fonction des squences analyser, il convient donc de dterminer quelles sont les
positions informatives et de dlimiter les zones rellement comparables. Pour valuer la
confiance que lon peut avoir dans un alignement, il est possible de sassurer que les
Premire partie Chapitre 3 : Mthodologies molculaires appliques ltude des
souches bactriennes telluriques



37
squences signatures dun groupe phylogntique sont bien en regard les unes des autres.
Lanalyse des structures secondaires savre, galement, trs souvent ncessaire.

3-3- Reconstruction des arbres phylogntiques

La phylognie molculaire a pour objectif de retrouver les liens de parent entre des
squences de nuclotides. Ces relations de parent sont gnralement reprsentes sous forme
darbre, compos de branches et de nuds, les branches connectant les nuds eux-mmes
dfinis comme des points au niveau desquels deux branches ou plus divergent. Les branches
et les nuds peuvent tre internes ou externes. Dans le cas dun arbre de gnes, un nud
interne correspond la squence ancestrale hypothtique avant le ou les vnements de
duplications qui ont donn naissance aux squences actuelles. Les nuds terminaux
(galement dnomms Operational Taxonomic Units ou OTU) correspondent aux
squences partir desquelles larbre a t construit. Les branches dfinissent les relations de
parent entre les diffrents nuds. Un nud interne et lensemble des OTU qui en drivent
forment un groupe monophyltique ou clade. Un groupe incluant un nud interne et une
partie seulement des OTU qui en drivent est appel groupe paraphyltique. Enfin, un groupe
rassemblant des OTU nayant pas de nud interne qui leur est spcifique est appel groupe
polyphyltique.
Larbre phylogntique peut tre enracin ou pas. La racine constitue lanctre commun de
toutes les OTU reprsentes dans larbre. La direction entre la racine et les diffrentes OTU
reprsente le temps volutif. Dans un arbre non enracin, seules les relations entre les
diffrentes OTU sont reprsentes.

Il existe diffrentes mthodes pour calculer des arbres phylogntiques partir dalignements
multiples de squences. Ces mthodes sont gnralement regroupes en trois catgories : (i)
les mthodes de distance, (ii) les mthodes de maximum de parcimonie et (iii) les mthodes
probabilistes.

Les mthodes de distance sont les plus simples et les plus rapides mettre en oeuvre. Elles
sont bases sur lutilisation dune matrice o sont consignes les distances calcules pour
toutes les combinaisons deux par deux des squences analyses. Des algorithmes de calculs
Premire partie Chapitre 3 : Mthodologies molculaires appliques ltude des
souches bactriennes telluriques



38
sont ensuite utiliss pour dduire, partir de la matrice de distance, les relations
phylogntiques des OTU. Dans la mthode de distance, la longueur des branches sera
proportionnelle la distance. A ct de la mthode UPGMA Unweighted Pair Group
Method with Arithmetic mean (Sneath et Sokal , 1973) et de la mthode de Fitch-
Margoliash (1967), nous avons utilis la mthode de Neighbor-Joining (Saitou et Nei, 1987).
Cette mthodologie consiste regrouper les squences les plus similaires entre elles (cest--
dire ayant une distance faible), ce regroupement se faisant par tapes, avec comme contrainte
principale de minimiser la longueur totale de larbre. Cette mthode donnera toujours un seul
arbre pour une matrice de distance donne.

Le principe des mthodes de maximum de parcimonie est bas sur lidentification, parmi
tous les arbres phylogntiques possibles, de celui qui demande le plus petit nombre de
modifications volutives ( pas volutifs ) pour expliquer les diffrences observes entre les
squences ou OTU qui sont tudies. La longueur des branches des arbres obtenus sera
proportionnelle au nombre de modifications volutives requises pour passer dun nud
lautre.
Les principales diffrences avec la mthode de distance sont : (i) la totalit des sites de la
squence nest pas utilis mais seuls les sites dits informatifs (cest--dire ceux qui vont
tendre favoriser un ou plusieurs arbres par rapport aux autres) sont pris en compte, (ii)
plusieurs arbres phylogntiques sont possibles avec cette mthode de reconstruction.
Si la construction de larbre est effectue dans le cadre dune analyse cladistique, seront
considrs comme informatifs uniquement les sites o plusieurs OTU partagent un tat
driv. En pratique, ds quil y a plusieurs OTU et un nombre de sites importants, la
construction ncessite un quipement informatique performant car le nombre darbres
possible augmente de manire exponentielle avec le nombre dOTU. Il arrive donc trs
souvent quil soit impossible destimer tous les arbres. La solution alternative est
gnralement dutiliser des approches heuristiques qui ne vont explorer quune partie des
arbres possibles : il sagit gnralement de partir dun arbre choisi alatoirement et de le
modifier tout aussi alatoirement. Le nombre de pas volutif est chaque fois calcul pour
chaque arbre obtenu. Lanalyse se perptue tant que lon obtient des arbres plus parcimonieux
que les prcdents.
Premire partie Chapitre 3 : Mthodologies molculaires appliques ltude des
souches bactriennes telluriques



39
La mthode de maximum de parcimonie permet ainsi dobtenir plusieurs arbres
quiparcimonieux possibles, ne diffrant gnralement les uns des autres que par quelques
nuds. La construction dun arbre consensus savre donc ncessaire.

Parmi les mthodes probabilistes, la mthode de maximum de vraisemblance ou
Maximum of Likelihood (Felsentein, 1973) est gnralement la plus utilise. Elle sappuie
sur lutilisation de modles dvolution, cest--dire un ensemble dhypothses traduisant les
processus dvolution possibles des squences concernes. Par exemple, le principe est de
proposer des algorithmes donnant les probabilits de changement dun nuclotide vers un
autre, diffrentes pour les transitions (substitution dun nuclotide comportant une purine par
un autre nuclotide comportant galement une purine ou substitution dun nuclotide
comportant une pyrimidine par un autre nuclotide comportant galement une pyrimidine) et
les transversions (susbtitution dun nuclotide comportant une purine par un nuclotide
comportant une pyrimidine ou inversement). Cette modlisation va estimer la probabilit de
raliser lalignement de squences en fonction de diffrentes hypothses. Cette probabilit est
appele la vraisemblance. La mthode de maximum de vraisemblance va donc consister
retenir, parmi un ensemble darbres possibles, celui dans lequel la vraisemblance est
maximale. Larbre retenu dans ce cas, est considr comme la reprsentation phylogntique
la plus plausible, tant donn le modle dvolution utilis. La limitation principale des
mthodes probabilistes est le temps de calcul ncessaire trouver larbre maximisant la
vraisemblance. En outre, cette mthodologie implique galement dutiliser le modle
dvolution le plus proche de la ralit.

3-4- Estimation de la robustesse des arbres

Toutes les mthodes danalyse phylogntique possdent des avantages et des


inconvnients car aucune nincorpore vritablement tous les aspects des mcanismes
biologiques de lvolution des squences. Ainsi, aucune mthode probabiliste disponible nest
donc susceptible de fournir un arbre phylogntique vrai . Gnralement, seules les
branches des arbres retrouves par les trois mthodes (Neighbor-Joining, maximum de
parcimonie et maximum de vraisemblance) sont susceptibles de sapprocher de la ralit
(Huelsenbeck et Hillis, 1993).
Premire partie Chapitre 3 : Mthodologies molculaires appliques ltude des
souches bactriennes telluriques



40
Nanmoins, dautres mthodes dvaluation sont possibles. Cest le cas de lanalyse en
boostrap (Felsenstein, 1985 ; Felsenstein et Kishino, 1993). Cest la mthode la plus souvent
utilise pour tester la fiabilit des branches internes de larbre. Elle consiste effectuer un
tirage alatoire des sites au hasard avec remise.
Cette opration est effectue entre 100 (pour les arbres de maximum de parcimonie ou de
maximum de vraisemblance) et 1000 fois (arbres de distances) et un arbre est propos pour
chaque chantillonnage. Les diffrentes topologies darbres sont ensuite compares et
compiles en un arbre consensus, prsentant un pourcentage de robustesse attribu chacun
des nuds de larbre en fonction du nombre de fois o celui-ci a t retrouv cette position.
En pratique, seules les branches dfinies par une valeur suprieure 90 % sont considres
comme fiables.
Cest cette mthode que nous avons retenue dans notre travail de caractrisation des souches
dintrt.
Premire partie Chapitre 4 : Dgradation biologique des produits phytosanitaires
dans les sols



41
Chapitre4Dgradationbiologiquedesproduits
phytosanitairesdanslessols

1- Dgradation biologique et rcalcitrance molculaire

Les microorganismes assurent une fonction essentielle du sol grce leur grande
diversit (Topp, 2003). Cette diversit des communauts microbiennes telluriques jouerait un
rle important dans la dgradation des pesticides (Entry et Emmingham, 1995 ; Voos et
Groffman, 1997). Cependant, dautres auteurs ont galement observ une forte corrlation
entre la quantit de biomasse dun sol ou lactivit microbienne et la dgradation des
pesticides (Anderson, 1984 ; Walker et Welch, 1989 ; Wardle et Parkinson, 1991 ; Flint et
Witt, 1997; Walker et al., 2001 ; de Lipthay et al., 2007). Une des conditions fondamentales
la dgradation biologique est la prsence daccepteurs dlectrons. Dans les systmes
arobies, laccepteur final dlectrons est loxygne molculaire (Castillo et Tortensson,
2007) alors quen conditions anarobies, les accepteurs dlectrons inorganiques sont trs
majoritairement le NO
3
-
, SO
4
2-
, S, CO
2
ou Fe
3+
. Les premires tapes de la dgradation
provoquent les transformations de la structure molculaire du pesticide avec lapparition de
mtabolites pouvant, dans certains cas, tre plus toxiques que la molcule mre. La
minralisation de la substance active, avec la transformation du carbone organique en CO
2
est
le processus ultime. Il ny a pas de relation univoque entre la stabilit chimique dune
molcule et sa stabilit biologique.
Les ractions de transformation ou de dgradation des pesticides par les populations
microbiennes telluriques sont essentiellement des ractions doxydation, de rduction et
dhydrolyse. Les ractions doxydation sont majoritairement reprsentes par les mcanismes
dhydroxylation, dalkylation, poxydation et sulfoxydation. Ces systmes ractionnels sont
gnralement catalyss par les familles denzymes suivantes : les mono et di-oxygnases, les
laccases et les peroxydases. Les microorganismes ont la possibilit de dgrader les polluants
aromatiques par ortho ou mta clivage. La position des substituants a galement un impact
important sur la biodgradation de la molcule (Baker et Woods, 1977, Baker et Mayfield,
1980). Outre la rcalcitrance propre la molcule, les processus de dgradation biologique
Premire partie Chapitre 4 : Dgradation biologique des produits phytosanitaires
dans les sols



42
dpendent galement de nombreux facteurs physiques, chimiques et physiologiques dont le
degr dimportance varie selon lenvironnement (Alexander, 1994).

Cependant, les polluants prsentant une structure chimique lectroniquement stable ou ayant
de nombreux substituants halogns sont gnralement les plus difficiles dgrader (Sims et
al., 1986 ; Goulding et al., 1988 ; Scheneurt et al., 1993). Dans ce cas, la stratgie
communment retenue par la microflore peut consister en lintroduction de groupes polaires
qui ont pour effet daccrotre le caractre hydrophile et de faciliter ainsi leur dgradation
ultrieure.

2- Inductions enzymatiques et adaptions microbiennes

La biodgradation dun pesticide dans le sol suppose que les microorganismes


prsents soient capables de mobiliser des fonctions catalytiques appropries. La spcificit
enzymatique, parfois troite, est rarement absolue (Soulas, 1990). Ainsi, la biodgradation
dun grand nombre de composs chimiques de synthse est trs souvent accomplie par des
voies mtaboliques prexistantes qui permettent aux microorganismes dutiliser des substrats
naturels. Cette prdisposition enzymatique reposerait sur la similitude de certains composs
naturels dorigine vgtale avec certaines molcules phytosanitaires, appeles molcules
analogues (Alexander, 1994). Lattaque du xnobiotique a donc un caractre fortuit
(Knackmus, 1981 ; Slater, 1984) et peut soprer jusqu un stade avanc qui peut aller
jusqu la minralisation complte (Schmidt et al., 1987). En outre, certains auteurs (Parales
et al., 2002 ; Pandey et Jain, 2002) prcisent que linduction enzymatique saccompagnerait
dune aptitude chimiotactique des microorganismes. Pour autant, cette analogie structurale
nest pas la seule explication possible du phnomne de biodgradation et le cas des acides
phnoxyactiques en constitue un contre-exemple (Soulas, 1990). De plus, parler
vritablement dadaptation microbienne vis--vis dun xnobiotique donn prsuppose la
mise en place dvnements gntiques affectant des rgulations ou des activits
enzymatiques (Soulas, 1990). Ainsi, certains auteurs ont mis en vidence que lexpression des
gnes codant pour la catalyse de ces molcules est troitement lie la concentration du
pesticide (Alexander, 1985 ; Fomsgaard et Kristenssen, 1999 ; de Lipthay et al., 2007). Dans
le cas de sols nayant jamais t exposs un xnobiotique ou dans des horizons profonds
Premire partie Chapitre 4 : Dgradation biologique des produits phytosanitaires
dans les sols



43
(Fomsgaard et Kristenssen, 1999), il est ncessaire davoir une certaine concentration afin que
le xnobiotique soit accept en tant que substrat pour microflore.
Il existe galement des systmes enzymatiques spcialiss traduisant lexistence dadaptations
gntiques organises en structures simples ou polycistroniques (oprons) et codant pour des
enzymes spcifiques au sein dune voie de biodgradation responsable dun mtabolisme
direct (Dick et Quinn, 1995 ; Mandelbaum et al.,1995 ; Sorensen et al., 2001). La slection de
telles adaptations est guide par le rsultat du bilan entre le cot de la synthse denzymes
spcialises et le gain nergtique procur par la dgradation du xnobiotique, sans oublier
pour autant lavantage slectif procur par ce rarrangement en rponse aux pressions
environnementales subies par les communauts microbiennes (Garcia-Gonzales et al., 2003 ;
Rhine et al., 2003 ; Sims, 2006). Citons dans ce cas lexemple de la dgradation de lacide
2,4-dichloro-phnoxyactique ou 2,4-D (Streber et al., 1987), de latrazine (de Souza et al.,
1996), des ures substitues (Turnbull et al., 2001 ; El Seba et al., 2004 ; Hussain et al.,
2009) comme des illustrations de ce phnomne adaptatif.

Globalement, trois mcanismes fondamentaux peuvent dcrire de faon satisfaisante
ce mcanisme adaptatif des populations microbiennes : (i) soit une mutation des gnes
rgulateurs contrlant la transcription des gnes structuraux pouvant amener une production
continue denzymes correspondantes un niveau lev, (ii) soit une amplification des gnes
structuraux aboutissant lexistence, dans le gnome microbien, de plusieurs copies dun
mme gne ou dun ensemble de gnes responsables, par effet additifs, des concentrations
enzymatiques suffisantes pour que la transformation dune molcule de xnobiotique
devienne possible, (iii) soit lapparition de mutations ponctuelles des gnes structuraux
prcde dune amplification du ou des gnes correspondants, lorigine de la production de
protines enzymatiques dotes de fonctions catalytiques nouvelles ou amliores (Soulas,
1990). Lvolution indpendante des diffrentes copies du gne peut ainsi permettre le
maintien de la fonction mtabolique ancienne et la mise en place puis la spcialisation
progressive de fonctions mtaboliques nouvelles.

Ds lors quune fonction nouvelle est apparue, sa dispersion au sein dune population
microbienne emprunte classiquement les voies de reproduction sexue (appariement
Premire partie Chapitre 4 : Dgradation biologique des produits phytosanitaires
dans les sols



44
chromosomique et recombinaison) et parasexue (transformation, transduction gnralise et
conjugaison). Ainsi, ces mcanismes adaptatifs sappuieraient sur lexistence dlments
gntiques mobiles prsents au sein des communauts microbiennes. Ces structures
gntiques, reprsentes par les plasmides, les transposons, les intgrons, les ilots gnomiques
ainsi que par les bactriophages, sont galement collectivement reconnues comme des
vecteurs responsables du transfert gntique horizontal (HGT), jouant un rle fondamental
dans la dgradation des pesticides. Ces groupes de gnes, forte mobilit, sont dfinis comme
tant des lments relativement flexibles pouvant sintgrer avec plus ou moins de facilit
dans les gnomes des bactries htes (Funchain et al., 2001 ; Frost et al., 2005).
Trois mcanismes molculaires principaux contrlent ce transfert gntique horizontal
(HGT) dans le sol : la transformation, la transduction et le mcanisme de conjugaison. La
transformation est un processus physiologique dabsorption dun fragment dADN extra-
cellulaire (plasmide ou partie du chromosome bactrien) lintrieur de cellules dites
comptentes, qui requiert ou non la prsence de squences spcifiques (squences
dabsorption) dans le fragment dADN transfr pour quil soit retrouv dans le cytoplasme
de la cellule hte (Lorenz et Wackernagel, 1994 ; Trevors, 1996 ; Thomas et Nielsen, 2005).
Le mcanisme de transduction est un processus dans lequel un fragment dADN pris au
hasard dans le gnome dune bactrie et provenant soit dune cellule hte pralablement
infecte par un bactriophage (transduction gnralise), soit dune squence dADN dun
hte flanque de deux squences dinsertion ayant pralablement intgr de lADN de
bactriophage excis (transduction spcialise), se retrouve encapsid pour constituer de
nouvelles particules phagiques (Ochman et al., 2000 ; Ochman, 2005). De nombreuses tudes
ont rcemment suggr que les frquences de transduction dans le sol sont largement sous-
estimes et que de nombreuses populations de bactriophages se trouvent dans cette matrice.
(Ashelford et al., 2000). Enfin, la conjugaison bactrienne, processus de transfert gntique
qui semble tre largement majoritaire dans le sol (Burrus et Waldor, 2004), est un mcanisme
contact-dpendant o le transfert dun fragment dADN se fait dune cellule donneuse vers
une cellule hte pour la majorit des genres bactriens (Davison, 1999). Enfin, la prsence de
squences spcifiques codant pour le contrle de leur transfert, lors des mcanismes de
conjugaison ou de transduction, confrent aux lments gntiques mobiles une frquence de
transfert plus leve et une stabilit suprieure dans les gnomes des cellules htes,
Premire partie Chapitre 4 : Dgradation biologique des produits phytosanitaires
dans les sols



45
comparativement aux fragments dADN reus par le mcanisme de transformation (Burrus et
Waldor, 2004). La figure I-4-1 prsente les principaux mcanismes molculaires impliqus
dans le transfert gntique horizontal (HGT).



















Figure I-4-1 : Principaux mcanismes molculaires intervenant dans le transfert gntique
horizontal (HGT), daprs Zaneveld et al. (2008)


3- Aspects cintiques de la dgradation biologique : Mtabolisme
direct et co-mtabolisme.

Les microorganismes responsables de la dgradation dun pesticide sont gnralement


regroups en deux catgories : ceux qui disposent de lintgralit des enzymes pour
transformer le substrat (acide 2,4,5-trichlorophnoxyactique, par exemple) par les voies du
mtabolisme central (Kilbane et al., 1983), et ceux dont lquipement enzymatique est
incomplet pour mener terme la dgradation de la molcule (Baker et Woods, 1977 ;
Horvath, 1972 ; Dalton et al., 1982 ; Anderson, 2002).
Premire partie Chapitre 4 : Dgradation biologique des produits phytosanitaires
dans les sols



46
Dans le premier cas, on parle de mtabolisme direct. Le compos organique est utilis
par les microorganismes comme source de carbone et dnergie des fins de croissance. Le
stade ultime correspond une minralisation du compos organique (acide 2,4-
dichlorophnoxyactique, atrazine, isoproturon, organophosphors) se traduisant
gnralement par lapparition de CO
2
, dH
2
O et/ou de sels inorganiques. Dans la plupart des
cas, ce processus de dgradation nentrane pas laccumulation de mtabolites. La courbe de
dgradation est caractrise par une priode de latence suivie dune phase exponentielle
dacclration (Soulas, 1990 ; Radosevitch et al., 1995 ; El Seba, 2004 ; ). La vitesse de
minralisation du produit phytosanitaire augmente avec la rptition de son application. La
cintique de dgradation est sous la dpendance de diffrents paramtres : (i) les facteurs
climatiques, (ii) la taille initiale de la microflore dgradante, (iii) la dose de pesticide
applique, (iiii) la frquence et le nombre des apports du produit phytosanitaire. Ainsi, ce
processus de dgradation va tendre vers la slection et le dveloppement progressif dune
communaut microbienne tellurique dgradante susceptible dentraner une biodgradation
acclre (BDA).

Dans le second cas, la transformation partielle de la substance active ne permet pas de
rcuprer lnergie ncessaire la croissance des souches microbiennes. On parle alors de co-
mtabolisme. La dgradation ultime de la molcule ncessite la prsence dun consortium
microbien compos par des populations spcialises chacune dans une tape mtabolique bien
spcifique (Daughton et Hsieh, 1977 ; Soulas, 1990). Cette complmentarit mtabolique des
voies de dgradation entre les diffrents microorganismes du consortium pourrait sexpliquer
par lutilisation en cascade des mtabolites produits lors des tapes de dgradation successives
(Soulas, 1990 ; de Souza et al. 1998 ; Pelz et al., 1999 ; Smith et al., 2003a, 2003b).
Cependant, ces mcanismes restent bien souvent partiels et entranent une accumulation de
produits de dgradation qui peuvent tre leur tour transforms ou stabiliss en rsidus lis
(Horvath, 1972). Dans certains cas, les mtabolites produits peuvent tre plus toxiques et plus
mobiles que le produit phytosanitaire dont ils sont issus (Somasundaram et Coats, 1990). Les
microorganismes participant ce type de dgradation biologique ont ncessairement besoin
doxyder dautres sources de carbone pour se dvelopper. La matire organique, prsente sous
diffrentes formes dans les sols, est souvent utilise comme co-substrat (Houot et al., 1998).
Premire partie Chapitre 4 : Dgradation biologique des produits phytosanitaires
dans les sols



47
De plus, les microorganismes dots denzymes large spectre dactivit (champignons par
exemple) sont souvent impliqus dans ce type de processus mtabolique.
Diffrentes hypothses peuvent tre avances pour expliquer la dgradation dite co-
mtabolique : (i) soit les micro-organismes ne possdent pas toutes les enzymes ncessaires
lensemble des tapes mtaboliques, (ii) soit les enzymes prsentes sont peu efficaces vis--
vis du substrat, (iii) soit un mtabolite prsente une toxicit particulire et son accumulation
nuit au fonctionnement mtabolique et ventuellement la viabilit de la cellule microbienne
(Janke et Fritsche, 1985). Dans ce cas, la courbe de dgradation sapparente une
transformation chimique catalyse sans point dinflexion. Ainsi, labsence de croissance des
populations responsables de la dgradation, jointe leur faible taille, fait du co-mtabolisme
une voie lente de dgradation dont la vitesse naugmente pas au cours du temps (Soulas,
1990). Il sagit l dune caractristique cintique essentielle des transformations co-
mtaboliques. La plupart des produits phytosanitaires sont dgrads par voie ce type de voie
co-mtabolique.

4- Cas particulier de dgradation biologique : la biodgradation
acclre (BDA) des pesticides

4-1- Contexte et dfinition

La biodgradation acclre (BDA) des pesticides correspond la diminution de la


persistance et, quelques fois, de lefficacit agronomique dun produit phytosanitaire,
conscutivement des applications rptes dans une parcelle agricole (Suett, 1987 ; Suett et
Jukes, 1988 ; Suett et al., 1993 ; Arbeli et al., 2007). Daprs Rouchaud et al., (1996, 1997 et
2000) ce phnomne est une des consquences majeures de la structure et de lvolution des
populations microbiennes impliques dans la dgradation des pesticides. Le produit
phytosanitaire est dans ce cas utilis comme source de nutriments et/ou dnergie par un
nombre restreint de microorganismes adapts conduisant la slection progressive de
populations microbiennes telluriques. Audus (1949) fut le premier auteur parfaitement
dcrire ce phnomne en travaillant sur la dgradation du 2,4-D. En effet, il mit en vidence
la corrlation existant entre les effets de la rptition des traitements et la vitesse de
dgradation de ce pesticide. Ces travaux ont t confirms par de nombreuses tudes sur
Premire partie Chapitre 4 : Dgradation biologique des produits phytosanitaires
dans les sols



48
dautres familles phytosanitaires : carbamates (Felsot et al., 1981 ; Racke et Coats, 1988a),
organophosphors (Racke et Coats, 1988b ; Chung et Ou, 1996), s-triazines (Barriuso et
Houot, 1996 ; Puissemier et al., 1997 ; Radosevich et al. ; 1995 ; Mandelbaum et al., 1995 ;
Yassir et al., 1999 ; Topp et al., 2000) et ures substitues notamment (Walker et Welch,
1991 ; Cox et al., 1996 ; Sorensen et al., 2001 ; El Seba et al., 2004 ; Sorensen et Aamand,
2003 ; Sorensen et al., 2003). Ces donnes ont suggr la ncessit de prendre en compte le
risque potentiel dadaptation des sols face aux traitements rpts de pesticides. En effet, dun
point de vue agronomique, la BDA est un facteur limitant lefficacit des produits
phytosanitaires puisquils sont rapidement dgrads par la microflore tellurique. En revanche,
la mise en place dune BDA au sein dun parcelle agricole impacte positivement
lenvironnement, puisque ce phnomne adaptatif peut limiter la persistance et le transfert des
produits phytosanitaires du sol vers les autres compartiments.


4-2- Mcanismes responsables de la biodgradation acclre

Lorigine du mcanisme est lie lactivit de la biomasse microbienne du sol


(Chapman et Harris, 1990). Le schma gnral est toujours identique : la premire application
dun produit phytosanitaire dans une parcelle agricole se traduit par une dgradation de la
substance active aprs une priode plus ou moins longue selon la nature du produit, appele
priode de latence. Cette premire phase correspond linduction enzymatique pouvant
sexpliquer par une adaptation physiologique et/ou gntique des populations microbiennes
concernes. Au cours dune deuxime phase, la dgradation de la substance active se traduit
trs souvent par une dcroissance exponentielle de la concentration rsiduelle. Cette phase
nest rellement mesurable qu la seule condition davoir une densit cellulaire suffisante. Si
lapplication du mme produit est successivement rpte un grand nombre de fois, la
prsence dune trs forte densit de souches microbiennes adaptes entraine une diminution,
voire une suppression de la phase de latence. Dans ce cas, au sein de ces sols dits adapts ,
80 % du produit phytosanitaire appliqu peut ainsi tre rapidement biodgrad en moins de 15
jours (Devers, 2008). Ce potentiel dgradant dun sol adapt la substance active peut se
maintenir sur des priodes allant de quelques semaines plusieurs annes aprs larrt total
des traitements (Roeth, 1986 ; Walker et Welch, 1991 ; Parekh et al., 1992 ; Anderson et
Premire partie Chapitre 4 : Dgradation biologique des produits phytosanitaires
dans les sols



49
Lafuerza, 1992 ; Suett et al., 1993 ; Smelt et al., 1996 ; Morel-Chevillet, 1998). La disparition
de cette capacit catabolique peut rsulter de la perte du caractre gntique en labsence de
pression de slection suffisante au sein des communauts microbiennes telluriques.
Certains auteurs (Fournier et al., 1998) prcisent que le dveloppement dune BDA
puis sa propagation dans la parcelle agricole est gnralement graduel dans le temps et dans
lespace, et ncessite la mise en oeuvre de diffrents mcanismes de dispersion (travaux
agricoles, ruissellement, phnomnes mtorologiques).
Le transfert gntique horizontal (HGT) prsent au sein des communauts microbiennes (cf
paragraphe I-4-2) joue un rle fondamental dans le dveloppement du phnomne de BDA.
Cet change de matriel gntique peut en effet soprer : (i) via la conjugaison bactrienne
par change de plasmides conjugatifs (molcules dADN circulaires, double brins, extra-
chromosomiques, autorplicables et transfrables dans certains cas), (ii) ; via la transposition
par lintermdiaire dlments transposables (petites units dADN mobiles intgres au
chromosome bactrien pouvant sexciser et se repositionner ailleurs dans le gnome) ; (iii) via
la transformation bactrienne dADN extra-chromosomique. Dans le cas des BDA, les
transferts gntiques sont pour la plupart pilots par les deux premiers mcanismes.
Le modle conceptuel de ladaptation des communauts bactriennes la biodgradation
acclre (BDA) de latrazine propos par Devers (2008) et Devers et al. (2004, 2005, 2007a,
2007b et 2008) est une illustration de ces mcanismes gntiques adaptatifs (cf figure I-4-2).
Ces auteurs ont pu montrer la grande plasticit de ces phnomnes, pouvant sappuyer
partiellement sur un mcanisme dj cit : la conjugaison plasmidique comme acteur principal
de la dispersion des gnes atz et trz. Il faut associer ce processus lintervention probable des
transposons via leurs squences dinsertion IS 1071 qui jouent un rle important dans la
diversification du support (la localisation gnomique des gnes atz et tr peut tre
chromosomique et/ou plasmidique) et dans leur duplication par recombinaison homologue.
Ces transferts et rarrangements gntiques concourent, in fine, (i) augmenter le potentiel de
dispersion des gnes cataboliques de latrazine par augmentation du spectre dhte au sein des
gnomes bactriens, (ii) optimiser la voie de dgradation du pesticide par duplication en
tandem de certains gnes codant pour des enzymes clefs des voies cataboliques.

Premire partie Chapitre 4 : Dgradation biologique des produits phytosanitaires


dans les sols



50

Figure I-4-2 : Modlisation conceptuelle de ladaptation des communauts bactriennes la


biodgradation acclre (BDA) de latrazine. Dispersion (flches rouges) des gnes atz et trz
par conjugaison plasmidique et diversification (flches vertes) du support des gnes atz par
transposition, daprs Devers (2008).

Dans certains cas, le processus de BDA ne se limite pas un seul pesticide en particulier ; au
contraire, cest une mcanisme dou dune importante plasticit puisquil peut concerner des
produits phytosanitaires prsentant des structures chimiques apparentes (Audus, 1951 ;
Soulas, 1985 ; Roeth et al., 1989 ; Singh et al., 2005) mais galement des substances actives
appartenant des familles totalement diffrentes (Morel-Chevillet et al., 1996 ; Morel-
Chevillet, 1998 ; Warton et al., 2003). De plus, la BDA est un mcanisme microbien adaptatif
qui nest pas seulement circonscrit aux produits phytosanitaires, mais, semble tre gnralis
lensemble des molcules organiques polluantes massivement rpandues dans
lenvironnement (Erickson et Mondello, 1993 ; Field et al., 1995).






51











Deuxime partie: Prsentation gnrale de
ltude
Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

52

Chapitre1Lafamilledesherbicidestrictones



1- Contexte historique

La prsence de composs -trictoniques dorigine naturelle a t dcrite par Hellyer


(1968) dans des huiles volatiles de certaines plantes australiennes appartenant la famille des
Myrtaces. Une activit herbicide naturelle a t ensuite envisage par des chercheurs de la
firme agro-pharmaceutique Zeneca Ag Products, conscutivement lobservation de
labsence de certaines espces dadventices autour darbustes connus sous le nom de Rince-
bouteilles ou Bottle-brush (Callistemon citrinus stapf). Diffrentes analyses ont permis
dattribuer lactivit herbicide la prsence dun compos ttractonique, la leptospermone,
substance alllopathique (figure II-1-1) efficace sur de nombreuses adventices mais non
phytotoxique sur le mas.

Figure II-1-1 : Formule dveloppe de la leptospermone (C


15
H
22
O
4
).

Ces rsultats ont t la base du dveloppement des herbicides de la famille des trictones.
Michaely et Kratz (1986) ont synthtis des drivs substitus de la 2-benzoyl-1,3-
cyclohexanedione manifestant une activit herbicide plus intressante. Les relations structure-
activit ont t dcrites par Lee et al. (1998) et ont mis en vidence le caractre obligatoire de
la prsence dun substituant en position ortho sur le noyau aromatique pour obtenir une action
herbicide. Par ailleurs, cette activit est renforce par la prsence de substituants lectro-
Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

53
attracteurs en position 2,4 (cf figure II-1-2 et tableau II-1-1). A partir de ces tudes, deux
molcules ont ainsi connu un dveloppement commercial, notamment en masiculture : la
sulcotrione et la msotrione.

Figure II-1-2 : Structure de la 2-[2,4-benzoyl disubstitue]-1,3 cyclohexanedione.
























Tableau II-1-1 : Activit herbicide (DC
50
: Dose moyenne ncessaire pour le contrle

de 50
% de 7 espces diffrentes de dicotyldones) des composs 2-[2,4-benzoyl disubstitus]-1,3
cyclohexanedione (daprs Lee et al.,1998).


Compos Substituant A
position ortho
Substituant Q
position para
DC
50
(g.ha
-1
) Log DC
50

3 Cl OCH
3
5100 3,71
4 Cl CH
3
2800 3,45
5 Cl H 830 2,92
6 Cl F 1600 3,2
7 Cl Cl 180 2,26
9 Cl SO
2
CH
3
72 1,86
10 NO
2
H 810 2,91
11 NO
2
Cl 42 1,62
12 NO
2
CF
3
14 1,16
13 NO
2
SO
2
CH
3
13 1,12
Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

54
2- La substance active

2-1- Fiche didentit

Nom commun : Sulcotrione
CAS-n : 99105-77-8
Famille chimique : Benzoyl-cyclohexane-1,3-diones ou trictones.

Formule brute : C
14
H
13
ClO
5
S
Formule dveloppe :








Noms chimiques :
IUPAC : 2-(2-chloro-4-msylbenzoyl)cyclohexane-1,3-dione
CAS : 1,3-cyclohexanedione, 2-[2-chloro(4-mthylsulfonyl) benzoyl]

Nom de code (R&D) : ICIA0051 ; SC-0051 (The Pesticide Manual, 2006)

Activit biologique : herbicide systmique, absorb prfrentiellement par les feuilles ;
contrle des adventices dicotyldones et certaines gramines annuelles ; homologu en France
sur mas, lin, ray-grass, sorgho, mas doux (Index phytosanitaire, ACTA, 2011). Utilisation
dcrite galement sur canne sucre (Pesticide Manual, 2006)

2-2- Proprits physico-chimiques




Poids molculaire : 328,7 g.mol-1
Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

55
Point de fusion : 139 C
pKa : 2,8 0,2 (acide faible)
Etat physique : solide blanc brun, amorphe.
Tension de vapeur : 5,4 10
-6
Pa = 4,18 10
-8
mm Hg (molcule peu volatile)
Masse volumique : 1,15 g.mL-1 20C.
Solubilit dans leau : 165 mg.L
-1
25C (solubilit intermdiaire ).
Solubilit dans les solvants organiques :









2-3- Les formes tautomriques de la sulcotrione

La tautomrisation cto-nolique des composs de la famille des benzoyl-
cyclohexane-1,3-dione a t tudie par divers auteurs (Rouchaud et al., 1996 ; Lin et al.,
2000 ; Huang et al., 2002 ; Wu et al., 2002). Un calcul thorique a permis de dterminer
lexistence de trente deux tautomres. Nanmoins, deux conformations sont considres
comme dominantes en solution aqueuse (Huang et al., 2002) : il sagit de la forme
exocyclique et de la forme endocyclique, ce dernier le tautomre apparaissant comme le plus
stable (cf figure II-1-3).







Figure II-1-3 : Formes tautomriques dominantes de la benzoyl-cyclohexane-1,3-dione en
solution aqueuse (X = Cl pour la sulcotrione, X = NO
2
pour la msotrione).
Solvant Solubilit (g.L
-1
)
Actone 40
Chlorobenzne 10
Ethanol < 6
Xylne < 6
Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

56
En outre, le caractre acide faible de la sulcotrione (et de la msotrione), conditionnant la
forme molculaire ou dissocie suivant le pH du milieu, est prsent dans la figure II-1-4
(Dyson et al., 2002).


Figure II-1-4 : Comportement acide faible en solution aqueuse dune
benzoylcyclohexane-1,3-dione.

3- Mode daction de la substance active




La sulcotrione est un herbicide slectif du mas dont la slectivit est fonde sur la
mtabolisation par la plante cultive (Pallet et al., 2001). Cet herbicide est gnralement
utilis en post-leve des adventices au stade 4-6 feuilles, mais peut tre aussi utilis en pr-
mergence et en pr-semis. La substance active peut tre absorbe par la voie foliaire (Wilson
et Foy, 1992 ; Reddy et Bhowmik, 1991 ; Lee et al., 1998 ; Townson et al., 1999) mais
galement par la voie racinaire puisquelle a montr une certaine activit rsiduelle dans le sol
(Compagnon et Beraud, 1992 ; Cools et al., 1997). Cet herbicide est transport par le phlome
dans le cas dune application foliaire et par le xylme dans le cas dune application sur sol nu
(Index Phytosanitaire, ACTA, 2011).
Chez les plantes sensibles, les symptmes externes se manifestent surtout par le blanchiment
des feuilles (Mayonado et al., 1989 ; Reddy et Bhowmik, 1991 ; Schultz et al., 1993 ; Lee et
al., 1998 ; Index Phytosanitaire, ACTA, 2011) qui saccompagne rapidement dune ncrose
puis de la mort des plantes. Nanmoins, dautres zones autres que le systme foliaire vont
galement prsenter signes de perturbations physiologiques importantes. Par exemple, lorsque
Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

57
la sulcotrione est applique en pr-leve, lherbicide agit sur les graines traites. Ces dernires
peuvent germer mais les plantules blanchies ne tardent pas mourir (Townson et al., 1999).
Lee et al. (1998) ont pu mettre en vidence que les tissus mristmatiques les plus rcents
prsentent des symptmes de chlorose plus rapidement que les tissus plus gs de ladventice.
Mayonado et al. (1989) ont remarqu que lapplication de sulcotrione entraine gnralement
une diminution de la concentration en carotnodes et favorise laccumulation de pigments
incolores ou phytones, suite la dpltion du taux de plastoquinones. Pour Tsegaye et al.
(2002) puis Falk et al. (2003), une telle diminution accompagne de la baisse des alpha-
tocophrols entraine ncessairement une perturbation majeure de lappareil photosynthtique
chez la plante. Chez le mas, lenzyme 4-hydroxyphnylpyruvate dioxygnase a t isole,
extraite et purifie par Barta et Bger (1996). Cest une enzyme Fe
2+
-dpendante, de nature
non hminique, qui convertit le 4-hydroxyphnylpyruvate en homogentisate, prcurseur cl
dans la synthse des tocophrols et des quinones. La protine enzymatique catalyse une
dcarboxylation, une substitution et une oxydation du cycle du compos aromatique. Cette
enzyme appartient la famille des oxygnases acides alpha-ctoniques dpendantes
(Brownlee et al., 2004 ; Moran, 2005). Ltude a notamment montr que l'enzyme avait un
pH optimum de 7,3, une masse molculaire apparente de 43 kDa et tait semblable celle de
l'enzyme correspondante trouve dans le foie des mammifres. Les cintiques ralises lors de
ces travaux ont dmontr que les herbicides de la famille des trictones taient de puissants
inhibiteurs comptitifs de lenzyme 4-p HPPD, notamment pour des valeurs de Ki voisines de
5 nM pour la 2-(2-nitro-4-chlorobenzoyl)-5-(2-methoxyethyl) cyclohexane-1,3-dione and et
voisine de 15 nM pour la 2-(2-chloro-4-methanesulfonylbenzoyl)-cyclohexane-1,3-dione. Les
tudes qui ont suivi sont venues confirmer les premiers rsultats des travaux de Barta et Bger
(Secor, 1994 ; Lee et al., 1998 ; Townson et al., 1999 ; Tsegaye et al., 2002 ; Matringe et al.,
2005, Dayan et al., 2007 ; Dayan et al., 2009 ; Beaudegnies et al., 2009). Les molcules de la
famille des trictones interagissent en tant quinhibiteur comptitif au niveau du site
catalytique de lenzyme par prsence du groupement 1,3-cyclohexane-dione, analogue de
la partie alpha-ctonique du substrat de lenzyme 4-phnylhydroxypyruvate (cf figure II-1-5).
La synthse de lhomogentisate tant bloque, les plastoquinones absentes nassurent plus
leur rle de co-facteur de lenzyme phytone dsaturase, la synthse des carotnodes est donc
stoppe (Kim et al., 2002 ; Artetxe et al., 2006). La sulcotrione classe F2 selon la liste des
Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

58
cibles biochimiques des herbicides bloque donc indirectement cette enzyme. In fine, les
carotnodes ne jouent plus leur rle protecteur dans la neutralisation de la chlorophylle
ltat triplet et de loxygne singulet, et par voie de consquence, les plantes prsentent
progressivement un blanchiment des tissus.

Figure II-1-5 : Voie mtabolique de biosynthse des tocophrols et des plastoquinones


partir du 4-hydroxyphnylpyruvate chez la plante : site dinhibition de lenzyme 4-
phnylhydroxypyruvate dioxygnase par un herbicide trictonique (sulcotrione).


Paralllement, chez les mammifres, les effets biologiques des trictones ont t mis
en vidence, notamment chez le rat, partir des effets cibls du 2-(2-nitro-4-
trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) sur la chaine de biosynthse des
alpha-tocophrols (Lindstedt et al., 1992 ; Ellis et al., 1995 ; Pronicka et al., 1996).
Laccumulation de la tyrosine et du 4-phenylhydroxypyruvate, notamment dans le plasma des
rats, a permis de montrer que le NTBC tait galement un puissant perturbateur du
catabolisme de la tyrosine en agissant, comme chez les plantes, en tant quinhibiteur de
Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

59
lenzyme 4-hydroxyphnylpyruvate dioxygnase (EC 1.13.11.27). Les travaux de Wu et al.
(2011) ont galement confirm le rle dinhibiteur comptitif de la sulcotrione vis--vis de
lenzyme 4-pHPPD et ont mis en vidence certains troubles physiologiques associs une
ingestion chronique de sulcotrione chez les rats.

La sulcotrione est utilise en masiculture depuis linterdiction de latrazine en 2003.
Elle est autorise la vente en France depuis fvrier 1993 et commercialise notamment sous
le nom de Mikado

ds 1994 par Syngenta puis, depuis 2001 par Bayer CropScience. Ce


produit est une suspension concentre 300 g.L
-1
de sulcotrione.
Les doses dapplication recommandes sont de lordre de 300 450 g.Ha
-1
(Index
phytosanitaire, ACTA 2011 ; Mamy et Barriuso, 2005). La sulcotrione est utilise pour le
dsherbage en France, seule ou en association avec dautres herbicides (bromoxynil,
isoxaflutole, actochlore, msotrione ou nicosulfuron) afin daugmenter lefficacit du
traitement tout en diminuant les doses dapplication (Chaabane, 2005). Elle prsente un large
spectre daction et couvre donc une trs large gamme dadventices. Laction de la sulcotrione
sur certaines adventices monocotyldones et dicotyldones annuelles (famille des Poaces)
frquemment rencontres en masiculture (cf tableau II-1-2) a t tudie.

Degr de sensibilit Dicotyldones Monocotyldones (famille des Poaces)


TS S
Chenopodium album
Solanum nigrum
Polygonum persicaria
Stellaria media
Digitaria sanguinalis
Echinochloa crus galli
Panicum miliaceum

MS MR
Amaranthus sp.
Mercurialis annua

Panicum dichotomiflorum

R
Calystegia sepium
Equisetum sp.
Setaria sp.
Cynodon dactylon
Tableau II-1-2 : Sensibilit des adventices la sulcotrione pour un traitement en post-leve
450 g.Ha
-1
. TS = trs sensible, S = sensible, MS = moyennement sensible, MR =
moyennement rsistante, R = rsistante (daprs Compagnon et Beraud, 1992).
Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

60
4- Approches toxicologique et cotoxicologique

4-1- Vis--vis des mammifres


La sulcotrione est rapidement limine par voie urinaire, le mtabolite majeur tant la
4-hydroxysulcotrione. La DL
50
orale chez le rat est estime suprieure 5000 mg.kg
-1
. Peu
absorb travers la peau et peu irritant au niveau des yeux chez le lapin. Les cochons dinde
ont cependant montr une forte sensibilit au niveau de lpiderme. Chez le rat, la CL
50
par
inhalation est > 1,6 mg.L
-1
.
La dose sans effet chez le rat a t estime 0,5 mg.kg
-1
P.C par jour. La DJA a t value
0,005 mg.kg
-1
PC.jour
-1
. Aucun effet tratogne na t not chez les rats et les lapins. In vivo,
la sulcotrione na pas montr de proprits gnotoxiques.


4-2- Ecotoxicologie

Les donnes relatives lcotoxicologie de la sulcotrione sont reportes dans le


tableau II-1-3.

Espce Test DL
50
ou CL
50

Oiseaux Toxicit aige par voie orale > 1350 mg.kg
-1

Poissons (truite-arc-en-ciel) Toxicit aige par voie dermale > 4000 mg.kg
-1

Abeilles Toxicit aige par contact
Toxicit aige par voie orale
> 200 g/abeille
> 50 g/abeille
Daphnie Toxicit aige aprs 48 heures
dexposition
> 100 mg.L
-1

Algues et plantes aquatiques Test de croissance CEB
b50
= 3,5 mg.L
-1

Tableau II-1-3 : Toxicit et cotoxicit de la sulcotrione non formule (Pesticide Manual,
2006).

Des donnes plus exhaustives relatives limpact de la sulcotrione sur les organismes vivants,
extraites de la base de donnes Agritox, sont prsentes dans lannexe I
(http://www.dive.afssa.fr/agritox/php/sa.php?sa=1101).
Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

61
5- Comportement dans les diffrents compartiments de
lenvironnement

5-1- Dans la matrice air


Trs peu de donnes sont disponibles en ce qui concerne le comportement de la
substance active dans la matrice air. Nanmoins, la valeur de la pression de vapeur de la
sulcotrione (5,4 Pa 25 C) classe cet herbicide dans la famille des composs trs peu
volatils.

5-2- Dans la matrice eau

Lhydrolyse de la sulcotrione a t largement dcrite par Chaabane (2005). Les


donnes bibliographiques concernant cet herbicide faisaient tat de deux voies de dgradation
hydrolytique (voies A et B) quelle a pu effectivement mettre en vidence. Linfluence de
plusieurs paramtres a t tudie (pH, temprature, dure, prsence de Fe
++
,). Le rle du
pH de la solution aqueuse sest avr dterminant.
Un test prliminaire a t men, selon les recommandations de la directive de lOECD (2002),
50 C et sous conditions de pH fortement acide ou alcalin. Malgr la stabilit de la
substance active dans ces conditions relativement extrmes, Chaabane a propos un schma
ractionnel dhydrolyse contrl par le pH. A pH alcalin, la voie A (considre comme
classique) a t prdominante, contrairement aux pH acides o la voie B a t dcrite.
A pH neutre ou alcalin, la voie A, largement dcrite dans la littrature (Rouchaud et al., 1996,
1998a, 1998b) est caractrise par lapparition de deux produits de dgradation principaux,
lacide 2-chloro-4-mthylsulfonylbenzoque (CMBA) ne prsentant pas dactivit herbicide
(Rouchaud et al.,1998a ; Cherrier et al., 2004) et la 1,3-cyclohexanedione (CHD). Pour des
valeurs de pH < 7, la dtection intermdiaire du driv dacide heptanoque indique
lintervention dune deuxime voie (voie B), au pralable dcrite uniquement dans certains
sols (Rouchaud et al., 1996), avec cependant, pour rsultat final, la prsence du mme
CMBA.
La figure II-1-6 dcrit ces deux voies de dgradation.

Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

62























Figure II-1-6 : Formules dveloppes des principaux produits de dgradation de la
sulcotrione, issus des voies A et B dcrites dans la littrature.


En milieu aqueux 25C, la sulcotrione sest montre chimiquement trs stable. Le temps de
demi-vie a t estim entre 200 et 400 jours selon le pH (Chaabane, 2005).
La substance active semble se dgrader plus rapidement en prsence du cation Fe
++
, dont le
rle de catalyseur mtallique doit tre confirm.
Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

63
La photolyse a galement t tudie au pralable au laboratoire (Chaabane, 2005 ;
Chaabane et al., 2007). La vitesse de cette photolyse a t nettement suprieure celle de
lhydrolyse, avec formation de photoproduits majoritairement comparables, laissant supposer
une hydrolyse photoassiste de la sulcotrione. Un schma ractionnel gnral a t propos (cf
figure II-1-7). La photolyse des photoproduits des herbicides trictoniques (sulcotrione et
msotrione) fait actuellement lobjet dune nouvelle tude au LCBE.














Figure II-1-7 : Principaux photoproduits de la sulcotrione (Chaabane et al., 2007).
(A) : (2-hydroxy-4-mthylsulfonyl)-1,3-cyclohexanedione, (B) : Acide 5,7-dicto-7-(2-
chloro-4-mthylsulfonylphnyl) heptanoque, (C) : Acide 5,7-dicto-(2-hydroxy-4-
mthylsulfonyl) heptanoque, (D) : 1,3-cyclohexanedione, (E) : Acide 2-chloro-4-
mthylsulfonylbenzoque, (F) : Acide 2-hydroxy-4-mthylsulfonyl benzoque.

Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

64
5-3- Dans la matrice sol

5-3-1- Rtention et transfert de la sulcotrione et de ses produits de dgradation


Le processus de rtention a t largement dcrit par Chaabane (2005) et Chaabane et
al. (2008), selon les directives de lOCDE (2002) prconisant la mthode Batch
equilibrium . Les rsultats exprimentaux ont montr une bonne concordance avec le modle
mathmatique de Freundlich, et notamment, une diminution des sites dadsorption avec
laugmentation de la concentration de lherbicide dans la phase liquide.
La sulcotrione et son mtabolite majeur (CMBA) montrent des capacits dadsorption
modres ainsi quune dsorption relativement aise partir des sols tudis lors de ces
travaux, choisis pour leur reprsentativit culturale (Perpignan, Landes, Belgique,
Martinique). La teneur en matire organique, le pH et la teneur en argiles du sol jouent un rle
prpondrant dans ce cas. Ainsi, la persistance de la sulcotrione augmente avec la diminution
du pH mais aussi avec le contenu en matire organique (Rouchaud et al., 1998a, 1998b).
Dautres produits de dgradation (CHD, acide phnylheptanoque) sont apparus plus
fortement adsorbs.
Le transfert de la sulcotrione (en plein champ et sur colonne de sol reconstitu) est
modr dans le profil de sol 0-10 cm et fortement influenc par sa rtention et sa dgradation
dans le sol ainsi que par les conditions climatiques avant et aprs traitement.

5-3-2- Dgradation de la sulcotrione

Les travaux de Chaabane (2005) ont montr la prdominance de la voie de dgradation


biologique dans les sols tudis, avec une cintique de dgradation pouvant tre gnralement
dcrite par une loi de premier ordre. Les temps de demi-vie observs en conditions de plein
champ sont comprises entre 16 et 122 jours (Rouchaud et al., 1996, 1998a et 1998b). Au
laboratoire, elles sont trs variables, de 1 60 jours (Baer et Calvet, 1999 ; Cherrier et al.,
2004 ; Chaabane, 2005 ; Mamy et al., 2005 ; Chaabane et al., 2007 ; Doublet et al., 2009) et
sont sous linfluence de plusieurs paramtres :

Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

65
La nature du sol : en accord avec les travaux de Cherrier et al. (2004), le temps de demi-vie
de la sulcotrione diminue avec laugmentation de la teneur en matire organique du sol. Par
contre, la vitesse de dgradation semble peu influence par la texture du sol (Rouchaud et al.,
1996).

Le taux dhumidit relative : la vitesse de dgradation augmente proportionnellement la
teneur en eau (dans la limite 25-70 %), quel que soit le type de sol tudi. Cette activation a
t galement dcrite par Baer et Calvet (1999).

La temprature : Les exprimentations ont t menes par Chaabane (2005) diverses
tempratures (25, 40 et 60 C). La figure II-1-8 prsente les rsultats obtenus sur le sol de
Belgique ; la non-linarit de la courbe montre que le mcanisme de dgradation de la
sulcotrione dans le sol varie en fonction de la temprature. Ces travaux ont permis deux
hypothses : i) la sulcotrione se dgrade majoritairement par voie biologique, lactivit
microbienne diminuant au-del de 30 C (1) ; ii) temprature plus leve (50-60C), la
dgradation est contrle par la prsence de bactries themophiles (2).











Figure II-1-8 : Variation de Ln K
obs
en fonction de 1/T pour la dgradation de la sulcotrione
dans le sol de Belgique dans la gamme de tempratures 25, 40 et 60C.

Deuxime partie Chapitre 1 : La famille des herbicides trictones

66
La strilisation du sol : la dgradation est apparue trs faible aprs strilisation du sol
lautoclave (cet autoclavage pouvant cependant modifier sensiblement la modification de la
structure du sol, Cantier et al., 1986 ; Barrre et al., 1988).

La substance active sous forme de standard analytique ou formule (Mikado

) : La
formulation joue un rle au niveau de la vitesse de dgradation, nettement plus rapide avec le
produit formul.

Ces rsultats, obtenus au LCBE lissue dun premier travail de doctorat et mettant en
exergue la prdominance de la voie de dgradation biologique, nous ont conduit mettre
lhypothse dune ventuelle biodgradation acclre (conscutive des traitements rpts)
et mettre en vidence le rle majeur dune flore microbienne dgradante spcifique,
lorigine de cette mtabolisation. Dans ce but, le sol de la parcelle de lIUT de Perpignan,
prcdemment utilis dans le cadre des travaux de Chaabane, a fait lobjet dune nouvelle
campagne dchantillonnage (cf paragraphe II-2-4 et II-2-5)
.
Deuxime partie Chapitre 2 : Matrice dtude : le sol de Perpignan



67

Chapitre2Matricedtude:lesoldePerpignan

1- Situation gographique de la parcelle

La parcelle choisie pour cette tude a t mise notre disposition par lInstitut
Universitaire de Technologie (IUT) de Perpignan, dpartement Gnie Biologique, Universit
de Perpignan Via Domitia (UPVD). Ses coordonnes gographiques sexagsimales ont t
dtermines : 42 40' 55" N, 2 53' 49" E. Cette parcelle agricole (figure II-2-1), prsume
homogne, dune surface globale voisine de 1500 m, a t pralablement subdivise en cinq
zones convenablement matrialises, dont deux (S1) et (S2), dune surface quivalente (200
m environ) ont t et exclusivement rserves ce travail sur la sulcotrione. Des zones
tampons ont t dlimites, afin disoler chaque unit de traitement et de limiter, dans la
mesure du possible, les phnomnes de contamination (drive, ruissellement, ). Une zone
contrle (C) a galement t rserve (environ 300 m).

Figure II-2-1 : Plan de la parcelle exprimentale (IUT de Perpignan, UPVD).


Deuxime partie Chapitre 2 : Matrice dtude : le sol de Perpignan



68
2- Paramtres daphiques du sol de Perpignan

Les analyses pdologiques et physico-chimiques du sol ont t effectues par le
Laboratoire dAnalyses Agricoles de Perpignan, selon des protocoles standardiss; lhumidit
relative des chantillons a t dtermine au Laboratoire de Chimie des Biomolcules et de
lEnvironnement (LCBE-UPVD), suivant la mthode publie par Mathieu et Pieltain (2003),
base sur le calcul de la perte de poids aprs schage de lchantillon ltuve 100C
pendant 24 h. Les rsultats sont prsents dans le tableau II-2-1.

Figure II-2-2 : Parcelle exprimentale (avant traitement phytosanitaire) situe sur le site de
lIUT de Perpignan, Universit de Perpignan Via Domitia (Pyrnes Orientales).

Deuxime partie Chapitre 2 : Matrice dtude : le sol de Perpignan





69
Sable

(%)
Limon

(%)
Argile

(%)
Humidit
Relative
(%)
Carbone
Orga.
(%)
Azote
Orga.
(g kg
-1
)
Matire
Orga.
(%)
C/N CEC

(meq 100 g
-1
)
pH
25.6 60.5 13.9 24 0,9 0,98 1,55 9,64 15,5 8,1

Tableau II-2-1 : Proprits pdologiques et physico-chimiques du sol de la parcelle de
lInstitut Universitaire de Technologie (IUT) de Perpignan, dtermines par les protocoles
standardiss (Laboratoire dAnalyses Agricoles de Perpignan et LCBE UPVD).

Selon la classification FAO, le sol de lIUT est rang parmi les sols limono-sablo-argileux
dans le triangle des textures.

3- Historique cultural

La parcelle, mise notre disposition lIUT, avait servi de systme cultural en


agriculture biologique avant dtre laisse en friche agricole jusquen 2005. A compter de
cette date, les zones (S1) et (S2) ont reu 4 traitements successifs la dose agronomique
recommande de 300 g de sulcotrione.Ha
-1
par pulvrisation manuelle dune prparation
base de Mikado

, suspension concentre titrant 300 g.L


-1
de substance active
(BayerCropScience).
Ces traitements phytosanitaires ont t effectus selon le calendrier suivant : traitement 1 :
21 avril 2006 ; traitement 2 : 22 mai 2006 : traitement 3 : 22 juin 2006 ; traitement 4 : 21
juillet 2006.
Paralllement, dans le contexte de notre premire tude sur ces herbicides trictones ralise
dans le cadre dun stage de Master (O. Moutugou Mouanda), les zones (M1) et (M2) ont t
traites, de manire comparable, laide dune prparation base de Callisto

, formulation
renfermant 100g.L
-1
de msotrione, substance active voisine de la sulcotrione ne diffrant que
par la nature du substituant en position 2 sur le noyau benznique (substituant NO
2
au lieu de
Cl). Par la suite, aucun autre traitement phytosanitaire na t appliqu sur la parcelle.


4- Stratgie dchantillonnage

Les zones de prlvement (S1) et (S2), prsumes homognes, ont t divises de


manire alatoire, en units dchantillonnage, chaque unit faisant lobjet dun prlvement
Deuxime partie Chapitre 2 : Matrice dtude : le sol de Perpignan



70
lmentaire, effectu laide dune tarire dans une couche de profondeur dtermine (0-8
cm). Les prlvements lmentaires (environ 200g de sol/prlvement), ont t runis et
homogniss pour constituer un chantillon global (4S) qui a t tamis ( 2 mm) puis rduit
par quartages successifs (Mathieu et Pieltain, 2003) avant conservation au laboratoire (+ 4C
ou - 20C). Cet chantillon (4S) correspond donc un sol ayant reu 4 traitements successifs
par la sulcotrione dose agronomique. Paralllement, la zone contrle a t
chantillonne dans les mmes conditions pour constituer le sol (C).


5- Dispositif exprimental : les microcosmes

La mise en place de systmes exprimentaux permet dapprhender le comportement
des produits phytosanitaires dans le sol, et, plus particulirement, laction des communauts
microbiennes du sol sur leur persistance. Ces dispositifs, appels microcosmes ou
msocosmes en fonction de leur taille, de leur complexit ou de leur localisation, constituent
en ce sens des modles relativement pertinents en cologie microbienne, reconstituant des
fractions dcosystmes en conditions contrles de laboratoire.

Les microcosmes ont t prpars partir des chantillons de sols natifs (4S) et (C),
ainsi que des sols striles (St4S) et (StC), obtenus par autoclavage (2 cycles 121C pendant
20 minutes avec 1 jour de repos entre chaque autoclavage) dune fraction des sols (4S) et (C).
Un calendrier de prlvement a t pralablement tabli (Figure II-2-3), prvoyant 1, 2, 3 ou 4
traitements successifs par la sulcotrione. Chaque date de prlvement prvue a ncessit la
prparation initiale de 2 microcosmes (tude en duplicat) selon le protocole opratoire
suivant : 10,0 g de sol sont placs dans des boites de Ptri striles (diamtre interne 55 mm) et
surajouts par 0,6 mL dune solution aqueuse de sulcotrione pralablement strilise par
filtration (membrane filter Minisart

0,20m) et de concentration 22 mg.L


-1
, ajout
correspondant environ 1,2 g de sulcotrione par g de sol. Ces microcosmes ont t ensuite
pess individuellement avant dtre placs lobscurit, afin de limiter la photodgradation de
lherbicide, et en chambre thermostate (24,0 0,2C).
Deuxime partie Chapitre 2 : Matrice dtude : le sol de Perpignan



71
Tout au long de lexprimentation (Figure II-2-4), des peses rgulires nous ont permis de
conserver des teneurs en humidit relativement constantes, par ajout contrl deau strile
sous hotte flux laminaire.

Chacun des 4 sols (4S), (C), (St4S) et (StC) a ncessit la prparation de 40
microcosmes. Le premier traitement (TT
1
) par la sulcotrione a concern la totalit de la
population des microcosmes. Des prlvements ont t effectus (en duplicat) au cours du
premier mois, respectivement aux jours TT
1
-D
0
, TT
1
-D
2
, TT
1
-D
7
, TT
1
-D
15
et TT
1
-D
30
. Un
deuxime traitement a alors t rajout sur lensemble des microcosmes restants (en
conservant les mmes conditions de temprature et dhumidit) et a t suivi de prlvements
selon la mme priodicit : TT
2
-D
0
, TT
2
-D
2
, TT
2
-D
7
, TT
2
-D
15
et TT
2
-D
30
. Un troisime, puis
un quatrime traitement ont t conduits de la mme manire avec les prlvements
correspondants (TT
3
-D
0
, TT
3
-D
2
, TT
3
-D
7
, TT
3
-D
15
, TT
3
-D
30
et TT
4
-D
0
, TT
4
-D
2
, TT
4
-D
7
, TT
4
-
D
15
, TT
4
-D
30
).
La teneur en sulcotrione extractible a t dtermine pour chacun des 160 microcosmes.



Figure II-2-3 : Synoptique du calendrier de traitements et de prlvements des essais en
microcosmes.
Deuxime partie Chapitre 2 : Matrice dtude : le sol de Perpignan



72

Figure II-2-4 : Prparation et mise en place des microcosmes

73











Troisime partie: Mthodologies de travail


Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique



74
Chapitre1Mthodologiedelanalysechimique

La dgradation de la sulcotrione a t suivie successivement sur le sol de Perpignan


puis dans le milieu de culture slectionn (cf III-2-2-2-1-2). Sur cette dernire matrice, outre
le comportement de la substance active, nous avons recherch lapparition concomitante des
mtabolites principaux, identifis au cours dune tude prcdente (Chaabane, 2005).
Ce programme analytique a t ralis au Laboratoire de Chimie de lEnvironnement et des
Biomolcules (LCBE), en fonction de la disponibilit des moyens analytiques et notamment
de lacquisition tardive pour notre travail des couplages CLHP/SM et CPG/SM.

1- Analyse des chantillons de sols



1-1-Ractifs et Matriels

1-1-1-Standard analytique

Sulcotrione, rfrence Pestanal

46318, puret 98,8 %, origine Fluka analytical, France.


Solutions mres , prpares 200 mg.L
-1
dans le mthanol de qualit CLHP ; solutions
filles 0,1 ; 0,2 ; 0,5 ; 1 et 2 mg.L
-1
.

1-1-2- Autres ractifs

a) Mthanol et actonitrile, qualit CLHP, origine Carlo Erba.
b) Dichloromthane, pour analyse de pesticides, origine Riedel De Han GmbH.
c) Acide chlorhydrique 38%, origine Prolabo, France.
d) Eau CLHP.
e) Acide trifluoroactique (TFA), origine Sigma-Aldrich (Rf. T6508 25mL), France.
f) Cartouches SPE SupelClean ENVI-Chrom, copolymre styrne/divinylbenzne, 500mg,
6 mL, origine Supelco, France.

1-1-3- Matriel classique de laboratoire

Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique





75
Agitateurs mcaniques pales, vaporateurs rotatifs, chambre dextraction sous pression
rduite, ampoules dcanter

1-1-4- Appareillage chromatographique et conditions danalyses

Le chromatographe liquide haute performance dtection Ultra-Violet (CLHP/UV) utilis


tait une chaine Shimadzu quipe de deux pompes LC10ADvp, une colonne ODS
Hypersil C18 (250 mm x 4,5mm d.i., 5 m), une boucle dinjection de 20 L et un dtecteur
SPD-10Avp UV-Visible programm = 265 nm, avec logiciel dacquisition AZUR version
4.5 (figure III-1-1).
La phase mobile consistait en un mlange (A) : Actonitrile et (B) : eau CLHP + 0,3% TFA,
dlivr, avec un dbit de 1 mL/min, selon le gradient dlution suivant : 0 min : 30 % (A) 70
% (B), voluant jusqu 50% (A) et 50 % (B) 8 min et maintenu pendant 10 min.
Ltalonnage de cet appareillage a t effectu par injections, en triplicat, de solutions talons
mthanoliques de sulcotrione (gamme de concentration 0,1 -2 mg.L
-1
). Lquation de la droite
de rgression a t dtermine y = 45,0 ( 1,0) x + 2,9 ( 1,3) avec r = 0,997 ( 0,003), ce
qui a permis destimer une limite de dtection voisine de 0,020 mg.L
-1
.

Figure III-1-1 : Appareillage CLHP/UV Shimadzu utilis pour les analyses de la sulcotrione
partir de la matrice sol.

Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique





76
1-2- Protocole opratoire

1-2-1- Prparation des chantillons

Lextraction de la sulcotrione partir des chantillons de sols a t ralise partir
dune mthode adapte par Chaabane (2005) ; Trois tapes dextraction et de purifications
successives ont t menes afin doptimiser lextraction de la sulcotrione tout en limitant la
co-extraction de substances interfrentes.

-Extraction par solvant : les chantillons de sol (10 g) ont t mis en suspension dans 60 mL
dun mlange binaire actonitrile/solution aqueuse dHCL 0,1M (90/10, v/v), puis agits
pendant 30 minutes laide dun agitateur mcanique tige verticale muni dune pale
dagitation. La solution est ensuite filtre sur fritt et papier filtre Whatmann GF/A. Le sol
partiellement extrait a t remis en suspension dans 30 mL du mme mlange binaire, puis re-
agit pendant 15 minutes et filtr dans les mmes conditions. Les filtrats ont t runis et
vapors sous vide (vaporateur rotatif 30C), afin dliminer lactonitrile. La phase
aqueuse acide (Ext 1) a t ensuite purifie.

-Purification par partage liquide/liquide : La solution aqueuse a t extraite deux reprises
par un volume gal de dichloromthane (DCM) dans une ampoule dcanter. Les phases
organiques ont t runies et vapores juste sec. Le rsidu a t repris par 1 mL de
mthanol qualit CLHP puis noy dans 20 mL de solution aqueuse dHCl 0,1 M (Ext2).

-Purification complmentaire sur phase solide : Une nouvelle tape de purification a t
ncessaire. Elle consistait en lextraction, laide dun dispositif adapt (chambre
dextraction sous pression rduite) de lextrait Ext2 sur cartouche EnviChromP

,
pralablement conditionne successivement par 2 mL dun mlange eau distille/mthanol
(50/50, v/v) et 2 mL deau distille. Aprs passage de lextrait Ext2 et schage de la
cartouche, la sulcotrione (ainsi que ses mtabolites, bien que non recherchs dans cette tude
uniquement sol ) ont t lues par 5 mL de mthanol qualit CLHP (Ext3).

1-2-2- Analyse chromatographique
(cf III-1-1-4)
Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique



77
1-3- Performances de la mthode danalyse et validation

Aprs extraction des substances dintrt, purification de lextrait et analyse


chromatographique, les performances de la mthodologie ont t values (tableau III-1-1),
notamment en termes de rptabilit, de limites de dtection (l.d.), de quantification (l.q.) et,
dans ce cas, de pourcentage de rcupration des analytes. Deux niveaux de fortification (0,1 et
2 g de sulcotrione.g
-1
de sol) ont t tests en triplicat.

Ajout de 0,1 g de sulcotrione
par g de sol (triplicat)

Ajout de 2 g de sulcotrione
par g

de sol (triplicat)
Limite de
dtection
(l .d.
g.g
-1
de sol)
Limite de
quantification
(l.q.g.g
-1
de
sol)
%
recouvrement
Coefficient de
variation
%
recouvrement
Coefficient de
variation
0,02 0,05 84 % 21 % 92 % 10 %
Tableau III-1-1: Performances de la mthodologie danalyse de la sulcotrione dans le sol.

Aprs ajouts de sulcotrione, certes suprieurs la limite de quantification, les rsultats
prsents (coefficient de variation et taux de recouvrement) paraissent acceptables, ainsi que
lincertitude au voisinage de cette limite de quantification (0,05 g.g
-1
).
Les teneurs obtenues lors de ltude de dgradation de lherbicide (cf IV-1-1) intgrent ces
donnes (limite de quantification et taux de recouvrement).

2- Analyse des chantillons de milieux de culture



2-1-Ractifs et matriels

2-1-1- Standards analytiques



Analytes Origine Rfrence Puret
Sulcotrione Fluka analytical, France Pestanal

46318 98,8 %
Acide 2-chloro-4 methylsulfonyl
benzoque (CMBA)
Acros Organics, France 425010010 95,0 %
1,3-cyclohexane dione (CHD) Fluka analytical, France 29059 97,0 %
Tableau III-1-2 : Rfrences et purets des standards analytiques utiliss lors de lanalyse
chimique des milieux de culture.

Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique



78
Pour mener bien notre travail, trois solutions mres mthanoliques de sulcotrione (200
mg.L
-1
), de CMBA (200 mg.L
-1
) et de CHD (500 mg.L
-1
) ont t ralises partir des
standards analytiques prsents dans le tableau III-1-2. Les solutions filles ont t
prparares 0,1 ; 0,2 ; 0,5 ; 1 et 2 mg.L
-1
.
Lacide 5,7-dicto-7-(2-chloro-4-mthylsulfonylphnyl) heptanoque a t synthtis au
LCBE (Chaabane, 2005). Une solution mthanolique (1 mg.L
-1
) a t utilise (t
r
= 9,95 min)
comme contrle de prsence au cours de la dgradation de la sulcotrione dans le milieu de
culture.

2-1-2- Autres ractifs

a) Mthanol et actonitrile, qualit CLHP, origine Carlo Erba.


b) Dichloromthane, pour analyse de pesticides, origine Riedel De Han GmbH.
c) Acide chlorhydrique 38%, origine Prolabo, France.
d) Eau CLHP.
e) Acide trifluoroactique (TFA), origine Sigma-Aldrich (Rf. T6508 25mL), France.
6 mL, origine Supelco, France.
f) Trimethylsilyldiazomthane 2M, solution dans dithylether, origine Sigma-Aldrich, France
(rf.527254-100mL).

2-1-3- Matriels classiques de laboratoire



Centrifugeuses de laboratoire, vaporateurs sous flux dazote, ampoules dcanter

2-1-4- Spectrophotomtre UV/visible

La croissance de la biomasse microbienne a t suivie par la mesure de labsorbance =
600 nm partir daliquotes des milieux de cultures ensemences. Lappareil utilis a t un
spectrophotomtre monofaisceau quip dun monochromateur rseau holographique et
dun dtecteur au silicium (Secoman, Anthelie Advanced, France).

2-1-5- Appareillages chromatographiques et conditions danalyses

Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique





79
2-1-5-1- CLHP/UV

Les extraits ont t analyss laide dune chaine JASCO quipe de deux pompes (Jasco
880PU Intelligent HPLC pump), une colonne ODS Hypersil C18 (250 mm x 4,5mm d.i., 5
m), une boucle dinjection de 20 L et un dtecteur Jasco-875-UV programm = 265
nm, avec logiciel dacquisition Borwin 1.50
La phase mobile consistait en un mlange (A) : Actonitrile et (B) : eau CLHP + 0,3% TFA,
dlivr, avec un dbit de 1 mL/min, selon le gradient dlution suivant : 0 min : 30 % (A) 70
% (B) jusqu 4 min, voluant jusqu 60% (A) et 40 % (B) 7 min et maintenu pendant 15
min.
Un chromatogramme obtenu avec un mlange de solutions talons est prsent figure III-
1-2. Ce chromatogramme correspond linjection dun extrait obtenu partir dun chantillon
de milieu de culture surajout avant extraction, par un mlange des trois solutions talons
(sulcotrione, CMBA et CHD). Pour ces trois composs, la gamme de concentration a t de 2
30 mg.L
-1
. Les quations correspondantes sont prsentes dans le tableau III-1-3.

Figure III-1-2 : Chromatogramme CLHP/UV de la sulcotrione et de ses principaux


mtabolites (CHD et CMBA).
Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique



80

Tableau III-1-3 : Calibration de lanalyse sulcotrione et mtabolites sur milieu de culture


avec lappareillage CLHP Jasco.

2-1-5-2- CLHP/SM

Les analyses relatives la prsence de 1,3-cyclohexanedione (CHD) par CLHP/SM


ont t effectues laide dun appareillage LCQ-Fleet (Thermo Fisher Scientific), disponible
au LCBE depuis septembre 2010, quip dune source dionisation Electrospray (ESI) et
dun analyseur ion-trap 3D. Lanalyse de la CHD a t effectue, entre les m/z 60 et 300,
en modes full scan positif (4 kV) et ngatif (3,5 kV). Les conditions
chromatographiques taient: HPLC Accela Thermo Fisher, avec pompe Accela 600, passeur
automatique dchantillons (Accela autosampler) et dtecteur barrettes de diodes (Accela
PDA detector) ; colonne phnomenex Gemini C6-phnyl (150 mm x 3,0 mm ; 5m) ; phase
mobile : mlange (A) : acide formique 0,1 % dans actonitrile et (B) : acide formique 0,1 %
dans eau CLHP, dlivr, avec un dbit de 0,4 mL/min, selon le gradient dlution suivant : 0
min : 10 % (A) 90 % (B) jusqu 2 min, voluant jusqu 90% (A) et 10 % (B) 20 minutes.
Le temps de rtention, pour la 1,3 cyclohexanedione (CHD), a t de 4,51 minutes (PDA).
Lion m/z 113, en mode positif, a t retenu pour confirmer ou infirmer la prsence de la 1,3
CHD dans les extraits (figure III-1-3). Dans ces conditions - non encore optimises- la limite
de quantification a t estime environ 0,5 mg.L
-1
.

Analyte
(mthode
chromatographique)
Temps de
rtention
(minutes)
Gamme de
concentrations
(mg.L
-1
)
Droite de rgression
Valeurs moyennes (cart-type)

Sulcotrione


11,08

2 - 30
y = 65504 (1420) x -19214
( 10045)
r = 0,997 ( 0,002)

CMBA


5,15

2 - 30
y = 14537 ( 840) x - 7247
( 810)
r = 0,999 ( 0,001)

CHD


4,54

2 - 30
y = 61323 ( 3101) x - 34162
( 19205)
r = 0,995 ( 0,003)
Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique



81

Figure III-1-3 : (a) Spectre de masse (CLHP/SM-ESI) de la 1,3-cyclohexanedione (CHD) en
mode positif. (b) Chromatogrammes du standard analytique (10 mg.L
-1
) par dtection barrette
de diodes et (c) dtection SM par extraction du fragment m/z 113 en mode positif.

2-1-5-3- CPG/SM

Lappareillage CPG/SM (Thermo Fisher Scientific) a t galement disponible au


LCBE partir de septembre 2010. Il nous a notamment permis de confirmer qualitativement
et quantitativement la prsence dacide 2-chloro-4 methylsulfonyl benzoque (CMBA) aprs
drivation (cf paragraphe III-1-3-2-3-3). Le systme consiste en un CPG Focus GC coupl
un dtecteur de spectromtrie de masse DSQ2 (Thermo Fisher Scientific) fonctionnant
(impact lectronique 70eV), en mode full scan (m/z 100 350) avec extraction, partir du
scan , des fragments m/z 217, 248 et 250, caractristiques du CMBA mthyl (figure III-1-
5). Les conditions chromatographiques taient les suivantes : injection en mode split ,
temprature de la ligne de transfert 300C, colonne G-SQC GC (5 %
phnylmthylpolysiloxane, 15m x 0,25 mm, 0,25 m), avec un gradient de temprature :
temprature initiale 80 C (1 min), augmentation de 10/min jusqu 260C, maintenue
Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique



82
pendant 15 minutes ; gaz vecteur Hlium 6.0 (1 mL.min
-1
). Dans ces conditions opratoires, le
temps de rtention du CMBA-mthyl a t de 14,81 minutes.
Ltalonnage de lappareillage a t ralis partir de solutions mthanoliques
talons mthyles, de concentrations comprises entre 0,5 et 20 mg.L
-1
, en mode full
scan , et extraction de lion m/z 217 (figure III-1-4). La droite de rgression correspondante
est prsente sur la figure III-1-5. La limite de quantification a t value 0,20 mg.L
-1
. Une
optimisation de cette application chromatographique est en cours (injection splitless ; mode
dacquisition SIM : fragments m/z 250, 248, 217 et 155).



Figure III-1-4: (a) Spectre de masse du driv mthyle de lacide 2-chloro-4 methylsulfonyl
benzoque (CMBA), (standard analytique 20 mg.L
-1
) obtenu en CPG/SM (mode positif, SM,
impact lectronique). (b) Chromatogramme montrant la prsence du CMBA mthyl
(fragments m/z, 217, 248 et 250) dans le milieu de culture (MS) supplment en sulcotrione
de la souche 1OP aprs 27 jours dincubation.

Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique





83

Figure III-1-5: Droite dtalonnage de lester mthylique provenant du CMBA obtenu aprs
drivation et analyse en CPG/SM

2-2- Protocole opratoire

2-2-1- Pparation des chantillons



Lextraction des composs dintrt partir des chantillons de milieux de culture a
t mise au point au laboratoire, aprs une tape pralable de centrifugation. Des chantillons
de milieu de culture vierge ont t surajoutes par des quantits connues et croissantes (2-30
mg.L
-1
) de substances doser (cohorte chimique sulcotrione + CMBA + CHD). Une aliquote
(1 mL) de milieu de culture a t prleve et centrifuge pendant 15 minutes 4000 rpm
temprature ambiante. Le surnageant a t ensuite rcupr et acidifi par 0,3 mL dHCl (0,16
M), puis amen un volume de 2,5 mL par apport deau milliQ. La solution est alors extraite
deux fois avec 2,5 mL de dichloromthane (DCM). Lextrait DCM est vapor juste sec
sous flux dazote et le rsidu repris par 1,0 mL de mthanol de qualit CLHP (Ext
MC
) avant
analyse chromatographique.

Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique





84
2-2-2- Analyse chromatographique

Initialement les extraits milieux de culture ont t analyss par CLHP/UV. Les
rsultats obtenus ont pu tre ensuite confirms, pour la CHD, par CLHP/SM et pour le
CMBA, par CPG/SM aprs mthylation.

2-3- Performances de la mthode danalyse et validation

Des chantillons non ensemencs du milieu de culture (MS) ont t supplments par
des quantits connues et croissantes (2-30 mg.L-
1
) de substances doser (cohorte chimique
sulcotrione + CMBA + CHD), afin de dterminer les performances de la mthode danalyse.
La mthode valide a t ensuite applique aux chantillons des essais de biodgradation,
obtenus aprs ensemencement par des souches susceptibles de dgrader la sulcotrione ajoute
au milieu de culture (MS).

2-3-1- CLHP/UV

La droite de rgression linaire de la mthode complte, obtenue aprs analyse en
triplicat des chantillons tmoins surajouts, est prsente figure III-1-6.

Figure III-1-6: Droite dtalonnage de la sulcotrione surajoute concentrations croissantes


dans le milieu de culture (MS), aprs extraction et analyses CLHP/UV.



Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique



85
Lquation correspondante a t dtermine : y = 47154 ( 1650) x 13276 ( 11974)
avec r voisin de 0,9967 ( 0,0003). La limite de quantification a t estime 0,5 mg.L
-1
. Le
coefficient de dtermination suprieur 0,996 et le coefficient de variation sur la pente de la
droite infrieur 4% nous permettent de considrer ce protocole analytique comme tout fait
acceptable et utilisable pour ltude de biodgradation de la sulcotrione dans ce milieu de
culture. Les chantillons provenant de ltude de dgradation ont t ensuite quantifis par
rapport cet talonnage.

Paralllement, une tude comparable a t mene partir dchantillons de milieu minimum
MS, surajouts par les mtabolites principaux (CMBA et CHD). Les quations
correspondantes ont t dtermines :
Pour le CMBA
y = 10537 ( 1210) x -4224 ( 2009) avec r = 0,9973 ( 0 ,0010)
Limite de quantification : 1mg.L
-1
.
Pour la 1,3-CHD
y = 34500 ( 3121) x -7240 ( 5421) avec r = 0,9960 ( 0,0006)
Limite de quantification : 1mg.L
-1
.

Cette mthode sest avre applicable au driv acide heptanoque , initialement rajout
la concentration de 2 mg.L
-1
(t
r
= 9,95 min).

2-3-2- CLHP/SM

Les chantillons de milieux de culture obtenus lors de ltude de biodgradation de la


sulcotrione et, de manire concomitante, de lapparition ventuelle de mtabolites, ont t
conservs par conglation du fait de la non-disponibilit du couplage CLHP/SM au moment
de lexprimentation. Ds la mise en service de cet appareillage (octobre 2010), nous avons
souhait confirmer labsence de rsidus de CHD (du moins au-del de la limite de
quantification) par infusion et par couplage avec la chromatographie liquide.

Troisime partie Chapitre 1 : Mthodologie de lanalyse chimique





86
2-3-4- CPG/SM

En chromatographie gazeuse, lanalyse du CMBA, driv de lacide benzoque, nest


possible quaprs une raction de mthylation approprie. Mashimoto et al. (1981) ont dcrit
un protocole de mthylation particulirement adapt au dosage des acides carboxyliques. Ces
auteurs indiquent que le trimthylsilyldiazomthane (TMSCHN
2
) ragit rapidement,
temprature ambiante, en prsence de mthanol et avec de bons rendements, sur des acides
carboxyliques pour donner des esters mthyliques (Figure III-1-7). Le TMSCHN
2
constitue
donc une alternative intressante au diazomthane pour lanalyse de ces acides par
chromatographie gazeuse.
25 L de solution de TMSCHN
2
2,0 M dans lther dithylique et 0,5 mL de mthanol de
qualit CLHP sont ajouts 0,5 mL dextrait de milieu de culture (Ext
MC
). Lensemble est
ensuite agit temprature ambiante pendant 2 heures.
Lestrification se produit rapidement et quantitativement en prsence dun excs
de TMSCHN
2
, la raction pouvant tre suivie par la disparition progressive de la couleur
jaune. Lextrait mthyl est alors analys par CPG/SM dans les conditions dcrites
prcdemment. Le rendement de la mthode, aprs ajout dune quantit connue de CMBA
une aliquote du milieu de culture (MS), extraction et mthylation, a t estim 70%
(comparativement une solution talon mthanolique mthyle de concentration connue).
Cette mthode nous a permis, malgr la disponibilit tardive de lappareillage, de confirmer la
prsence et les teneurs de CMBA dans les extraits de milieux de culture aprs biodgradation.

Figure III-1-7: Principe de la raction de drivation de lacide 2-chloro-4 methylsulfonyl


benzoque (CMBA), en prsence dun excs de trimthylsilyldiazomthane (TMSCHN
2
)

et de
mthanol conduisant la formation de lester mthylique correspondant.

Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

87
Chapitre2Mthodologiedelanalysebiologique

1- Cadre de ltude : organisation des travaux

Au cours de notre tude, les analyses microbiologiques se sont droules en trois


tapes successives.
En premier lieu, il a t ncessaire de dvelopper une approche cultivable originale et
efficace, en optimisant les conditions de cultures sur milieu synthtique (intgration de leffet
matrice de lcosystme sol sur les conditions de cultures au laboratoire, source de carbone,
source dazote, richesse nutritive et oxygnation), afin de favoriser, autant que possible,
lisolement et la slection de souches bactriennes telluriques capables de pousser sur un
milieu synthtique, en prsence de sulcotrione.
Dans une deuxime tape, les isolats bactriens ont t tests, sparment, sur leurs
capacits potentielles utiliser la sulcotrione avec plus ou moins defficacit, comme seule
source de carbone et dnergie laide dessais de biodgradation en cultures liquides.
La troisime tape a consist identifier les isolats bactriens dintrt par une
mthodologie de travail sappuyant sur une approche phylogntique et fonctionnelle.
Lobjectif tait dans un premier temps de pouvoir caractriser les souches dgradantes en
comparaison de souches non dgradantes prises comme contrles, puis dans un deuxime
temps, didentifier formellement les isolats par un squenage de leur ADN ribosomal 16S
(ADNr 16S), complt par une caractrisation fonctionnelle.

2- Approche cultivable : essai disolement de souches bactriennes
dgradant la sulcotrione

2-1- Principe et stratgie de travail

Au cours de cette tude, trois types de milieux de culture ont t ncessaires pour
dvelopper une approche cultivable efficace afin dessayer de saffranchir, du moins en partie,
des effets du phnomne du Great Plate Count Anomaly (Staley et Konopka, 1985), bien
connu des microbiologistes du sol. En effet, une grande difficult dans ltude de la flore
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

88
microbienne du sol rside dans lisolement et la culture de souches microbiennes sur des
milieux de culture synthtiques conventionnels.
En premier lieu, afin de pouvoir isoler avec succs des souches bactriennes
telluriques, nous avons donc labor un milieu synthtique le plus voisin possible de leur
microhabitat dorigine, en incorporant lchantillon environnemental sol au milieu de
culture appropri. Lobjectif tait double : (i) russir cultiver des souches au laboratoire
issues dun chantillon de sol et (ii) slectionner des isolats bactriens capables de se
dvelopper en prsence dune forte concentration dherbicide.
Un milieu complexe appel (NS) ( nutrient source ) a donc t prpar directement partir
dun chantillon composite de sol provenant de la parcelle de lIUT de Perpignan (sol C) et
supplment en sulcotrione (30 mg.L
-1
). Lensemble sol + herbicide peut tre considr
comme la source nutritive de la microflore tellurique. En outre, le sol, prsent en proportion
importante dans le milieu de culture (40 grammes), a galement servi de matrice de support
aux colonies, permettant ainsi de saffranchir en partie des effets dltres de lagar sur la
croissance de certaines souches telluriques (Janssen et al., 2002). Cette technique cultivable a
t adapte des travaux de Ferreira et al. (2009) qui ont tudi les effets de trois insecticides
(aldicarb, chlorpyrifos et deltamthrine) et trois fongicides (tbuconazole, mtalaxyl et
mancozebe) sur les communauts bactriennes cultivables de sols agricoles brsiliens.

Dans un deuxime temps, un milieu slectif minimum (minral) dans lequel
lherbicide tait la seule source de carbone et/ou dnergie (sulcotrione 30 mg.L
-1
) a t
utilis, selon une adaptation des travaux de Rousseaux et al. (2001). Ce milieu (MS) a permis
de raliser des cultures liquides rptes, avec forte pression de slection de lherbicide, sur
les souches bactriennes prcdemment isoles et purifies. Lobjectif tait dinduire une
adaptation gntique des microorganismes prsents dans le milieu au cours des cultures,
conduisant ainsi lapparition progressive dune population apte utiliser lherbicide comme
seule source de carbone et/ou dnergie. Par la suite, ce milieu minral nous a galement servi
mener nos essais de dgradation en cultures liquides partir des isolats provenant des
cultures rptes, avec pression de slection de lherbicide. Enfin, lajout dagar dans le
milieu (MS) a galement t ncessaire afin de tester la capacit de croissance des souches
isoles sur milieu glos en prsence de lherbicide.

Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

89
Un milieu riche non diffrentiel - trypto casine de soja (Triptic soy broth ou TS mdium)
supplment en sulcotrione et contenant de lagar, a t utilis pour raliser les isolements sur
milieux gloss ncessaires lobtention de souches pures partir de nos isolats. Ce bouillon
de soja tryptique est un milieu liquide polyvalent prconis dans des procdures
denrichissement et de culture de microorganismes arobies non exigeants ou modrment
exigeants. Les produits issus de la digestion enzymatique de casine et de semoule de soja,
prsents dans ce milieu de culture, apportent les aminoacides et les composs azots
complexes ncessaires la croissance de ces microorganismes. Le glucose constitue une
source dnergie, le chlorure de sodium assure lquilibre osmotique et le phosphate
bipotassique (K
2
HPO
4
) permet de contrler le pH.
Ce mme milieu (TS) a galement t utilis sans ajout dagar, afin dobtenir par la
technique de culture en croissance discontinue ou en lot ( batch cultures), une
concentration suffisante de biomasse microbienne en phase exponentielle de croissance. Cette
croissance a t suivie de faon rgulire par la mesure de labsorbance = 600 nm partir
daliquotes de cultures liquides, avant dentreprendre les essais de biodgradation aprs une
tape de lavage laide de tampon Knapp.

2-2- Milieux de culture et matriels utiliss

2-2-1- Prparation des milieux de culture

2-2-1-1- Milieu complexe sol ou nutrient soil medium (NS)

- ractifs

Sol (C) de la zone de contrle C de la parcelle exprimentale de lIUT de Perpignan
Agar technique en poudre AEB175006, AES Laboratoire, France
Solution de NaOH 0,16 M
Cycloheximide, minimum 94 %, rfrence C7698-5g, Sigma Aldrich, France
Solution aqueuse de cycloheximide 1g.L
-1
, strilise sur filtres striles Acrodisc


Sulcotrione, 98,8 %, Pestanal

46318, Fluka analytical, France


Solution aqueuse de sulcotrione 100 mg.L
-1
, strilise sur filtres striles Acrodisc


Filtres striles Acrodisc

32, Supor

0,2 m, GelmanSciences
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

90
Seringues striles usage unique Injekt (20 mL), rfrence 4606205V, Braun,
Germany.

- prparation
Le sol (C), prlev sur la parcelle de lIUT a t tamis (tamis 2 mm) et sch trois
jours ltuve 65C. Le milieu (NS) est prpar partir de 400 g de ce sol sec, 20 g dagar
dans environ 350 mL deau distille; le pH est mesur et ventuellement amen 8 (pH de la
solution de sol, cf tableau II-2-1) avec la solution de NaOH. Le mlange est autoclav 1,5
heures 120C. Aprs ajout de 50 mL de solution aqueuse de cycloheximide (50 mg) et de
300 mL de solution aqueuse de sulcotrione (30mg), le volume est ajust 1000 mL avec de
leau distille strile.
Le mlange est homognis et, avant prise en masse de lagar, coul dans des boites de Ptri
striles (diamtre interne 8,6 cm).

2-2-1-2- Milieu minimum (MS)

La prparation de ce milieu de culture slectif ncessite le mlange de plusieurs solutions
prparer extemporanment (cf tableau III-2-1). Dans un premier temps, les solutions (A),
(B) et (C) et leau distille (qsp 800 mL) sont mlanges et autoclaves 1h30 120C. Les
solutions de vitamines et de sulcotrione sont ensuite rajoutes par filtration strilisante. Le
milieu de culture (MS) liquide (en absence dagar) a t ensuite utilis dans des erlenmeyers
baffls (500 mL), cotonns et pralablement striliss. Aprs prparation, ce milieu doit tre
conserv + 4C et utilis rapidement.
Dans certains cas, 15 g dagar ont pu tre rajouts, avant autoclavage, de manire obtenir un
milieu glos, utilisable lors de certains tests de biodgradation sur boite de Ptri.
Le pH doit galement tre mesur et ventuellement amen 8.







Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

91

Solutions
prparer

Elments
constitutifs

Concentration de la
solution prparer
(g.L
-1
)
Volume de
cette
solution qsp
1000 mL de
milieu de
culture (mL)

Concentration de
llment dans le
milieu de culture
(mg.L
-1
)
K
2
HPO
4
100 16 1600
KH
2
PO
4
100 4 400
MgSO
4
, 7H
2
O 40 5 200
NaCl 10 10 100
CaCl
2
20 1 20
Solution (A) :
Elments
minraux
FeSO
4
, 7H
2
O 5 1 5

2
1,8
0,2
0,8
0,25
Solution (B) :
Mlange
doligo-
lments

H
3
BO
3

MnSO
4
, H
2
O
ZnSO
4

CuSO
4

Na
2
MoO
4
, 2H
2
O
Co(NO
3
)
2


2
1,80
0,20
0,80
0,25
traces



1
traces
Solution (C) :
Source dazote

(NH
4
)
2
SO
4


175

20

3,5
Eau purifie H
2
O - qsp 800mL -

0,1
Solution (D) :
Mlange de
vitamines

Thiamine
Biotine

0,10
0,04

1
0,04
Solution de
sulcotrione

H
2
O

0,150

200

30
Agar (cas dun
milieu solide)

-

-

15 g

-
Tableau III-2-1: Prparation du milieu de culture minimum (MS), pH 8.
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

92
2-2-1-3- Milieu complexe trypto - casine de soja ou Triptic soy (TS)

Le produit commercial (Bouillon Trypcase Soja, rfrence 51019) nous a t fourni par
BioMrieux, France. Sa composition est prsente dans le tableau III-2-2.

Elment Quantit (g)
Digestion pancratique de casine bovine 17,0 g
Digestion peptidique de semoule de soja 3,0 g
NaCl 5,0 g
K
2
HPO
4
2,5 g
C
6
H
12
O
6
(dextrose) 2,5 g
Tableau III-2-2: Composition du milieu de culture TS (pH 7,3 0,2) pour 1 litre deau
purifie.

Ce milieu, a t prpar, selon les recommandations du fabricant, par lajout de 30 grammes
de prparation (forme pulvrulente) dans un litre deau purifie. La suspension homognise,
a t ensuite chauffe jusqu dissolution complte rpartie, selon lusage envisag, dans des
erlenmeyers ou dans des tubes (20 x 200 mm), cotonns et autoclavs 15 minutes 120C.
Dans certains cas, des milieux gloss ont t prpars par ajout de 15 g.L
-1
dagar par litre de
milieu (TS), afin de purifier nos souches bactriennes par striages successifs sur boites de
Ptri lors de la procdure disolement.
Afin dliminer toute trace rsiduelle de bouillon TS aprs ltape de production de biomasse,
lutilisation dune solution de rinage (Tampon Knapp) a t ncessaire avant dentreprendre
les essais de biodgradation dans le milieu de culture (MS). La composition de ce tampon est
donne dans le tableau III-2-3.

Elment Quantit (g)
K
2
HPO
4
1
KH
2
PO
4
1
MgSO
4
, 7 H
2
O 0,04
FeCl
3
0,004
Tableau III-2-3: Composition du tampon Knapp (pH 6,6) pour 1 litre deau purifie.

Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

93
2-2-2- Matriels utiliss dans le cadre de lapproche cultivable

Lensemble des essais disolement et de culture des souches bactriennes telluriques


ont t mens dans les locaux de lIUT de Perpignan, au sein du Dpartement de Gnie
Biologique. Nous avons pu disposer dun environnement de travail bien adapt aux
techniques cultivables (figure III-2-1).

Figure III-2-1 : Exemples dappareillages et de matriels utiliss en culture Pasteurienne lors
de ltude. IUT de Perpignan, Dpartement Gnie Biologique (UPVD).

2-3- Protocole opratoire

2-3-1- Isolement de souches bactriennes sulcotrione rsistantes

Plusieurs chantillons contenant 10 grammes de sol (4S) provenant de la surface (4S)


ayant t traite par la sulcotrione (cf paragraphe II-2-4) ont t placs dans des erlenmeyers
striles de 500 mL en prsence de 90 mL deau physiologique (0,9 % NaCl) puis agits 200
rpm pendant 30 minutes afin de constituer une suspension de sol homogne. Une aliquote de
cetet suspension (500 L) a t ensuite tale sur milieu glos (NS) contenant 30 mg.L
-1
de
sulcotrione. Paralllement, 1 mL de cette suspension de sol a t additionne 9 mL deau
physiologique strile. Aprs homognisation au vortex, une srie de dilutions dcimales a t
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

94
ralise (jusqu 10
-4
) et tale sur le milieu (NS). Deux boites ont t ralises pour chaque
dilution. Les boites de Ptri ont t ensuite places 28C pendant 7 jours lobscurit et
observes rgulirement. Deux contrles constitus daliquotes de 500 L de suspension de
sol ont t tals sur glose (NS) sans sulcotrione et galement incubs dans les mmes
conditions. Les colonies observes sur glose (NS) supplmente en sulcotrione ont t
identifies comme des souches bactriennes capables de pousser en supportant la prsence de
lherbicide concentration relativement forte dans le milieu de culture (30 mg.L
-1
). Aprs
observation et reprage de colonies bien distinctes sur la glose, les isolats ont t purifis.
Brivement, chaque colonie a t prleve laide dune anse de platine strile, puis
ensemence dans 100 mL de milieu liquide (TS) supplment en sulcotrione (30 mg.L
-1
)
pendant 24 heures sous agitation (200 rpm, 30C). Plusieurs repiquages et talements
successifs sur glose (TS) contenant de la sulcotrione (30 mg.L
-1
) ont t ncessaires afin
dobtenir des souches pures.
Cette premire tape disolement est schmatise dans la figure III-2-2.















Figure III-2-2 : Protocole disolement de souches bactriennes telluriques sulcotrione-
rsistantes.

10 g de SOL (4S) +!
90 mL H
2
Oavec !
0,9 % NaCl!
Agitation 30
minutes!
Aliquotes 500 L!
Dilutions en srie!
Etalement au
rteau des
dilutions !
Milieu (NS) +
sulcotrione!
Milieu (NS)
sulcotrione!
Croissance 28C!
lobscurit!
Colonies sulcotrione-
rsistantes!
(TS) + sulcotrione!
Colonies ensemences dans!
bouillon (TS) + sulcotrione!
24 heures sous
agitation 30C!
Repiquages
successifs!
Contrle!
1! 2!
3!
4!
5!
6!
Isolement par stries
dpuisement!
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

95
2-3-2- Isolement de souches bactriennes dgradant la sulcotrione


2-3-2-1- Cultures liquides rptes des isolats bactriens avec pression de slection
de lherbicide


Chaque isolat sulcotrione-rsistant, caractris par sa capacit pousser en prsence
dune forte concentration dherbicide sur milieu (MS), a t mis en culture dans un milieu
liquide (MS) supplment en sulcotrione (30 mg.L
-1
). Brivement, chaque isolat a t
ensemenc dans 100 mL de milieu (MS) supplment en herbicide dans des erlenmeyers
bafls (500 mL) et incub 28C sous agitation (150 rpm) pendant 20 jours. Au bout de 20
jours de culture, une aliquote de 10 mL a t transfre dans un nouvel erlenmeyer strile
(500 mL) contenant 90 mL de milieu (MS) supplment en herbicide et incub nouveau
dans les mmes conditions. Cinq cycles de cultures rpts (C1C5) avec pression de
slection de lherbicide ont t ainsi conduits (cultures en triplicat) afin de provoquer une
adaptation physiologique des isolats aux conditions de culture. Au bout des cinq cycles, la
capacit de chaque isolat pousser sur milieu glos (MS) supplment en sulcotrione (30
mg.L
-1
) a t teste par talement daliquotes de culture (10
0
10
-3
) et striage sur glose
partir des dilutions dcimales (duplicats par boite). Les milieux gloss ont t incubs 5 jours
environ lobscurit 28C. Paralllement, des fins dentre en collection, 20 mL de
bouillon (TS) supplment en sulcotrione (30 mg.L
-1
) ont t ensemencs par une aliquote de
1 mL de chaque souche pure issue du cycle 5 et incubs 12 heures sous agitation 28C. La
culture a t ensuite centrifuge 10 minutes 4000 rpm 4C, le surnageant jet et le culot
bactrien resuspendu dans une solution strile de milieu (TS) contenant 25 % de glycrol puis
congel dans lazote liquide et conserv - 80C.
La figure III-2-3 rsume cette tape.







Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

96

















Figure III-2-3 : Cultures rptes des isolats sulcotrione-rsistants avec pression de slection
de lherbicide.


2-3-2-2- Estimation de la capacit de dgradation des isolats bactriens vis--vis de
la sulcotrione

La technique de batch galement dnomme culture en discontinu ou en lot a t


utilise afin dobtenir une biomasse microbienne concentre en phase exponentielle de
croissance, nous permettant de suivre, dans de bonnes conditions opratoires, la dissipation de
lherbicide dans le milieu de culture (cf figure III-2-4). Une aliquote de 1 mL de chaque isolat
provenant de C5

a t ensemence dans 49 mL de bouillon (TS) supplment en sulcotrione
(30 mg.L
-1
). Les cellules ont t rcoltes par centrifugation (15 minutes, 4000 rpm, 4C)
pendant la phase exponentielle de croissance, aprs 15 heures de culture 30C sous agitation
(150 rpm). Le surnageant a t jet, le culot bactrien lav deux fois avec 20 mL de tampon
Knapp afin dliminer toute trace de milieu (TS) rsiduel. Le culot a t immdiatement
resuspendu dans un milieu minimum (MS) supplment en sulcotrione comme unique source
PHASE DADAPTATION = 5 cycles de culture (C1 C5)"
1 cycle = 20 jours sous agitation 28C"
Milieu (MS) + sulcotrione" Milieu (MS) + sulcotrione (90 mL)"
C1" C5" C"
Milieu (MS) + sulcotrione"
Transfert de 10 mL de
culture au bout de 20
jours dans milieu neuf"
Transfert de 10 mL"
Ensemencement "
lanse"
ENTREE EN COLLECTION"
-80C"
Aliquote 1 mL"
Bouillon (TS) + sulcotrione "
12 heures de
culture"
Milieu (MS) + sulcotrione"
Etalement au
rteau"
ESSAIS DE BIODEGRADATION "
Mesure de la capacit de dgradation
des isolats bactriens vis--vis de la
sulcotrione en cultures liquides"
1"
2"
3"
4"
Milieu (MS) + sulcotrione"
Stries sur boite"
Isolat puri"
(TS) + sulcotrione"
Dilutions en srie"
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

97
de carbone et/ou dnergie afin dobtenir une absorbance voisine de 0,3 ( = 600 nm) dans le
milieu de culture. Les chantillons ont t ainsi cultivs 30C sous agitation (200 rpm) et
lobscurit afin de limiter la photodgradation de la sulcotrione. Une aliquote de 1 mL de
chaque culture a t rgulirement prleve selon un calendrier pr-tabli (0, 6, 15 et 27
jours), la mesure de labsorbance ( = 600 nm) a t effectue et les chantillons ont t
extraits puis analyss par chromatographie (cf paragraphe III-2-2) afin dtablir les cintiques
de dgradation de lherbicide et dapparition des mtabolites principaux dans le milieu de
culture. Un milieu de culture (MS) supplment en sulcotrione (30 mg.L
-1
) non ensemenc et
un milieu (MS) ensemenc non supplment en sulcotrione ont servi de contrles (triplicats)
au cours de nos essais.


















Figure III-2-4 : Protocole de slection de souches bactriennes sulcotrione-dgradantes aprs
cinq cycles de cultures rptes.

Milieu (MS) + sulcotrione!


Bouillon (TS) + sulcotrione!
15 heures sous
agitation 30C!
Aliquote de 1 mL !
de culture!
Culture C5!
Milieu (MS) + sulcotrione!
BATCH CULTURES!
Centrifugation de la culture !
Lavage du culot avec
TAMPON KNAPP pH 6,6!
Absorbance
voisine de 0,3 !
( = 600 nm).!
Croissance 28C!
lobscurit avec
agitation !
Milieu (MS)! Milieu (MS) !
non ensemenc!
Contrles!
RESUSPENSION DU CULOT BACTERIEN!
DANS: !
Suivi de!
labsorbance!
Cintiques de
dgradation de!
la sulcotrione et
dapparition de
mtabolites
ventuels!
1! 2!
3!
4!
5!
Aliquote 1 mL!
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

98
2-3-3- Caractrisation morphologique et biochimique des isolats dgradants

Lobservation macroscopique des isolats a t ralise partir des cultures sur milieux
gloss (MS) et (TS) afin dobtenir des informations sur laspect des colonies, cest--dire sur
leur taille, leur couleur, leur forme (contour) leur coupe (de profil), leur consistance
(crmeuse, filante ou muqueuse), laspect de la surface (lisse ou rugueuse) et lopacit
(opaque, translucide ou transparente).
Lobservation microscopique des isolats sest appuye sur la ralisation dtats frais et de
colorations de Gram. Ces observations ont t effectues partir des cultures liquides (MS),
supplmentes en sulcotrione lors des essais de biodgradation, mais galement partir des
colonies isoles et purifies ayant pouss sur milieu glos (MS) supplment avec
lherbicide. Nous avons ainsi pu acqurir des informations sur la taille et la mobilit des
isolats dgradants.
Brivement, pour la ralisation de ltat frais, une deux gouttes de suspension cellulaire (
partir des colonies sur glose) ou de milieu de culture ont t plac au centre dune lame de
verre (Marienfeld, Germany) laide dune pipette Pasteur strile puis recouvertes dune
lamelle de verre (ESCO, USA). Le lutage a t effectu laide de paraffine. Lobservation
des isolats a t ralise sur fond clair au microscope optique avec lobjectif X40 (Leica
CME, Leica Microsystems, France) puis avec lobjectif X100 aprs ajout dune goutte dhuile
dimmersion (ractifs RAL, France) sur la lamelle.

Afin de caractriser la morphologie de la paroi de nos isolats dgradants (Gram+ ou Gram-),
des frottis ont t prpars par dpt dune goutte de culture sur lame (Marienfeld, Germany),
tals sur 1cm
2
environ avec lanse de platine strilise puis schs. La prparation a t fixe
par ajout dune goutte dthanol puis flambe au bec bunsen. La coloration primaire a t
effectue par trempage des lames 45 secondes dans le violet de gentiane phnique (Ractifs
RAL, France) puis rinage leau distille. Lajout du mordant a t ralis par trempage des
prparations 45 secondes dans le lugol. Les lames ont t rapidement laves avec le mlange
alcool thylique - actone (4/1, v/v) puis rinces leau distille lors de la dcoloration. La
coloration secondaire a t ralise par trempage pendant 45 secondes dans la safranine des
chantillons, qui sont ensuite rincs leau distille et dlicatement tamponns avec du papier
filtre. Lobservation au microscope a t ralise comme prcdemment dcrit pour les tats
frais.
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

99
Lobservation dun critre biochimique a t ralise par lutilisation de tests catalase, trs
simples mettre en place sur le plan pratique, afin de mettre en vidence la possible
accumulation de proxyde dhydrogne (H
2
O
2
) chez nos isolats dans le cas dun mtabolisme
arobie. Aprs avoir dpos une goutte dH
2
O
2
sur une lame de verre, nous avons prlev une
colonie laide dune pipette Pasteur boule. Lensemble a t dlicatement mlang. Dans le
cas dune raction positive, le dgagement gazeux est immdiat (bulles doxygne). Il traduit
la prsence de lenzyme qui catalyse la raction suivante : 2 H
2
O
2
O
2
+ 2 H
2
O.

3- Approche molculaire : caractrisation des isolats bactriens
dgradant la sulcotrione vs isolats non dgradants

3-1- Principe et stratgie de travail

LADN total bactrien a t extrait partir des souches cultives en milieu liquide
(MS) supplment en sulcotrione (30 mg.L
-1
), afin de lutiliser comme matrice pour les
diffrentes amplifications gniques envisages lors de ltude. Cette approche molculaire a
consist caractriser les souches bactriennes isoles dun point de vue phylogntique et
fonctionnel.

3-2- Protocole opratoire

La totalit des travaux de biologie molculaire sur les souches telluriques prcdemment
isoles a t effectue dans les locaux du Laboratoire Gnome et Dveloppement des Plantes
(LGDP) de lUniversit de Perpignan Via Domitia (UPVD).

3-2-1- Extraction et purification de lADN gnomique

LADN gnomique des isolats bactriens dintrts a directement t extrait lors de nos
essais de biodgradation, partir dune aliquote de 100 L de milieu de culture minimum
(MS) aprs 27 jours dincubation (absorbance voisine de 0,7 = 600 nm). Cette
mthodologie dextraction avait dj t dcrite et utilise avec succs par Chneby et al.
(2004) au cours de leur tude sur la diversit des bactries dnitrifiantes et leur activit
rductrice de lazote au sein de la zone rhizosphrique du mas.
Lchantillon, prlev dans un tube Eppendorf strile de 1,5 mL, a t centrifug 13 000 g
pendant 10 minutes +4C puis le culot a t lav deux fois laide deau ultra-pure strilise
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

100
et resuspendu dans 100 L dune solution strile de Tris-Cl (5mM, pH 8,3). Les cellules
bactriennes ont ensuite t incubes avec 6,5 L dune solution de protinase K (1 mg.mL
-1
)
pendant deux heures au bain-marie (+55C). Afin de favoriser la lyse cellulaire et dinactiver
la protinase K, lchantillon a t plac, successivement, + 80C pendant 10 minutes puis
immdiatement incub 15 minutes dans la glace. Cette opration a t effectue trois
reprises. La solution a t centrifuge pendant 10 minutes (13 000 g, +4C) et le surnageant a
t purifi par le kit GENECLEAN

Turbo Kit (MP Biomedicals, Europe) selon la procdure
prconise par le fournisseur. Brivement, aprs mesure du volume du surnageant
prcdemment obtenu, les diffrents chantillons ont t placs dans des tubes striles (1,5
mL) et 85 L de GENECLEAN

Turbo Gnomic Salt Solution ont t ajouts. Lensemble a
lgrement t vortex puis transfr (volume < 600 L) sur une colonne de purification
(GENECLEAN

Turbo

Cartdrige) et centrifug 5 secondes 14000 g temprature ambiante.
Aprs ajout de 500 L de GENECLEAN

Turbo Wash Solution, les colonnes ont t
centrifuges une premire fois, 5 secondes 14000 g (temprature ambiante), puis une
deuxime fois 4 minutes 14000 g. Les chantillons ont t incubs 5 minutes temprature
ambiante aprs ajout de 30 L de GENECLEAN

Turbo Elution Solution. Les colonnes ont
t lues par centrifugation 1 minute 13000 g (temprature ambiante). Les chantillons ont
t stocks -20C pour analyses ultrieures.

3-2-2- Quantification et contrle de la qualit de lADN gnomique

LADN gnomique des isolats bactriens prcdemment extrait et purifi t quantifi


par spectrophotomtrie = 260 nm laide du Nanodrop

2000 (ThermoFisherScientific)
disponible au laboratoire (cf figure III-2-5). Sa qualit a t vrifie par le calcul des ratio
A260/A280 et A260/A230 ainsi que par une sparation lectrophortique sur gel dagarose
1% (agarose molecular biology grade, Eurogentec France) aprs coloration par une solution
de GelRed

3X (Nucleic Acid Gel Stain, Biotum). Le gel a t rvl sous UV. Les
photographies ont t enregistres sur limageur de gel autonome (systme UGenius,
SynGene).
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

101











Figure III-2-5 : Spectrophotomtre Nanodrop (ThermoFisherScientific) utilis pour la
quantification des chantillons dADN gnomique issus des isolats bactriens.


3-2-3- Caractrisation phylogntique des isolats bactriens

3-2-3-1- Analyse des profils de restriction des ADNr 16S (ARDRA)

En vue dune premire approche globale de caractrisation taxonomique de nos


diffrents isolats bactriens, nous avons donc choisi dutiliser cette mthode de travail. Nous
avons amplifi une portion de lADNr 16S de chacun de nos isolats en utilisant les amorces
universelles 27f (5-AGA GTT TGA TCH TGG CTG CTC AG-3) et 1492r (5-TAC GGH
TAC CTT GTT ACG ACT T-3) (Gurtler et Stanisich, 1996). La raction damplification a
t ralise dans un volume final de 25 L, contenant 2,5 L de tampon 5X GoTaq
Polymrase (Promega, USA), 200 M de chaque dNTP (Promega, USA), 1 M de chaque
amorce, 2,5 U de GoTaq DNA polymrase (Promega, USA) et 25 ng dADN matrice. La
raction de PCR a t ralise laide dun thermocycleur PTC 200 Gradient Cycler (MJ
Research, Waltham) avec le programme damplification suivant : 1 cycle de 4 minutes
94C ; 34 cycles de 1 minute 94C, 1 minute 55C, 2 minutes 72C et un cycle final de
15 minutes 72C. Afin de vrifier la qualit de la raction damplification, 3 L de produits
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

102
PCR ont t spars par lectrophorse sur gel dagarose 1 % (Molecular Biology Grade
agarose, Eurogentec, Europe), plac 100 V pendant 20 minutes dans une solution de TBE
1X. Le marqueur de taille molculaire 1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen) a t utilis. Le gel
a t ensuite color par une solution de GelRed (Nucleic Acid Gel Stain, Biotum) et rvl
sous UV. Les photographies ont t enregistres sur limageur de gel autonome (systme
UGenius, SynGene). Une photographie des appareillages utiliss est prsente figure III-2-6.
Les produits PCR ont t finalement purifis par le kit GENECLEAN

Turbo Kit (MP
Biomedicals, Europe) selon la procdure prcdemment dcrite. Le polymorphisme de
longueur de lADNr 16S a t rvl aprs digestion des produits PCR laide des enzymes
de restriction Alu I et Hae III (New England Biolabs

). Deux mlanges ractionnels dun


volume final de 20 L ont t prpars, composs par 2 L de tampon ractionnel 10X (New
England, Biolabs

) spcifique de lenzyme de restriction utilise, 1 U denzyme, 12 L


dH
2
O milliQ strile et 5 L de produits PCR. Un troisime mlange ractionnel dun volume
final de 20 L, contenant les deux enzymes de restriction prcdentes Alu I et Hae III a
galement t prpar avec 2 L de tampon ractionnel 10X (New England, Biolabs

), 0,5
L de chaque enzyme, 12 L dH
2
O milliQ strile et 5 L de produits PCR. Les trois
mlanges ractionnels ont ensuite t incubs 37C pendant 12 heures. Les fragments de
restriction obtenus aprs digestion enzymatique ont t spars par lectrophorse sur un gel
dagarose haute rsolution 2 % (MetaPhor

,

Gentaur), plac 80 V pendant 3,5 heures dans
du tampon TBE 1X. Le marqueur de taille molculaire 1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen) a
t utilis. Aprs coloration par une solution de GelRed

3X (Nucleic Acid Gel Stain,


Biotum) le gel a t rvl sous UV. Les photographies ont t enregistres sur limageur de
gel autonome (systme UGenius, SynGene). Les profils de bandes caractristiques ainsi
obtenus ont t compars entre eux afin dessayer de distinguer, dun point de vue
taxonomique, les diffrentes souches bactriennes dintrt isoles lors de lapproche
cultivable.
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

103


















Figure III-2-6 : (a) Imageur de gel autonome (systme UGenius, SynGene), (b) Systme
compact dlectrophorse, (c) Thermocycleurs PTC 200 Gradient Cycler (Bio-Rad et MJ
Research), disponibles au LGDP (UPVD).

3-2-3-2- Analyse des isolats bactriens par REP-PCR

Dans le cadre de notre tude phylogntique, cette technique sest avre ncessaire afin
de pouvoir, dans la mesure du possible, diffrencier les profils gnotypiques des souches
bactriennes prcdemment isoles, comparant les diffrents profils REP-PCR obtenus pour
les isolats dgradants ou non dgradants. Cette stratgie de travail avait galement pour but de
confirmer ou dinfirmer les premiers rsultats comparatifs dj obtenus par la technique de
lARDRA.
La raction REP-PCR a t conduite en utilisant le couple damorce REP1R-I (5-III ICG
ICG ICA TCI GGC-3) et REP2-1 (5-ICG ICT TAT CIG GCC TAC-3) prsentant des
inosines inclues dans la squence oligonuclotidique. Ce couple damorces, utilis par
Versalovic et al. (1991) lors de ltude de la rpartition des squences REP chez les
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

104
Eubactries, sest avr trs efficace pour obtenir des empreintes gnomiques trs distinctes
chez Echerichia coli (souche W310), en comparaison dautres couples de squences
oligonuclotidiques galement tests. Leur utilisation dans ltude du transfert gntique
horizontal des gnes cataboliques de latrazine chez Agrobacterium tumefaciens, par Devers
et al. (2005), a galement confirm leur capacit donner de bons rsultats.
La raction damplification a t ralise dans un volume final de 25 L contenant 5 L de
tampon 5X Giescher (cf composition tableau III-2-4), 0,16 mg.mL
-1
de serum dalbumine
bovine (BSA, New England Biolabs

), 1,25 mM de chaque dNTP (Promega, USA), 0,1 L.


mL
-1
de dimethyl sulfoxide (Sigma Aldrich, France), 2 M de de chaque amorce (REP1R-I et
REP2-1), 1 U de GoTaq DNA polymerase (Promega, USA) et 25 ng dADN matrice. La
raction de PCR a t ralise laide dun thermocycleur PTC 200 Gradient Cycler (MJ
Research, Waltham) avec le programme damplification suivant : 1 cycle de 6 minutes
95C ; 30 cycles de 1 minute 94C, 1 minute 40C, 4 minutes 65C et un cycle final de
16 minutes 65C. Les amplicons obtenus ont t spars par lectrophorse sur un gel
dagarose 1 % plac 100 V pendant 20 minutes dans du tampon TBE 1X. Le marqueur de
taille molculaire 1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen) a t utilis. Aprs coloration par une
solution de GelRed

3X (Nucleic Acid Gel Stain, Biotum), le gel a t rvl sous UV. Les
photographies ont t enregistres sur limageur de gel autonome (systme UGenius,
SynGene). Des duplicats indpendants des diffrents chantillons dADN extraits partir des
isolats bactriens ont t utiliss afin de sassurer de la rptabilit de la mthode.

Solution de tampon Giescher 5X (mlange aprs auto-clavage
des solutions stock suivantes)
Concentration finale (mM)
16,6 mL dune solution de (NH
4
)
2
SO
4
1M 83
67,7 mL dune solution de Tris-HCl 1M pH 8,8 335
1,3 mL dune solution de MgCl
2
1M 6,5
1,3 mL dune solution dEDTA 0,5 mM 0,0335
2,08 mL dune solution commerciale de C
2
H
6
OS 14, 4 M 150
H
2
O milliQ qsp 200 mL
Rpartir la solution de tampon Giescher 5X dans des tubes Eppendorf striles (1,5 mL).
Stockage -20C pendant plusieurs mois.
Tableau III-2-4 : Prparation, composition et stockage du tampon Giescher 5X.
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

105

3-2-3-3- Squenage des ADNr 16S

Nous avons ensuite entrepris de squencer certains des isolats bactriens issus du sol de
Perpignan partir des ADNr 16S disponibles aprs tape prliminaire damplification par
PCR laide des amorces universelles 27f (5-AGA GTT TGA TCH TGG CTG CTC AG-3)
et 1492r (5-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3). Afin de vrifier la qualit de la
raction damplification, 3 L de produits PCR ont t spars par lectrophorse sur gel
dagarose 1 % (Molecular Biology Grade agarose, Eurogentec, Europe), et placs sous 100
V pendant 20 minutes dans une solution de TBE 1X. Le marqueur de taille molculaire 1Kb
Plus DNA Lader (Invitrogen) a t utilis. Le gel a t ensuite color par une solution de
GelRed (Nucleic Acid Gel Stain, Biotum) et rvl sous UV. Les photographies ont t
enregistres sur limageur de gel autonome (systme UGenius, SynGene). Les produits PCR
ont t purifis par le kit GENECLEAN

Turbo Kit (MP Biomedicals, Europe) et quantifis
au spectrophotomtre selon les procdures dj dcrites.


3-2-3-3-1- Ligation des produits PCR de lADNr 16S dans un vecteur de clonage

Les produit PCR de lADNr 16S gnrs partir de chaque isolat bactrien dintrt
ont t rabouts au plasmide pGEM

-T easy (cf figure III-2-7). La raction de ligation a


consist mlanger 1 L de vecteur pGEM

-T Easy (50 ng. L


-1
) avec 5 L de tampon 2X
(Rapid Ligation buffer, T4DNA Ligase) pour lenzyme, 1 L de T4 DNA ligase (3 U. L
-1
)
ainsi que 3 L de produits PCR. Le mlange a t incub pendant une nuit 4C.

Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

106


















Figure III-2-7 : Carte du vecteur de clonage utilis lors de ltape de ligation des produits
PCR, dlimitant la position de linsert dintrt (insert cloned) situ entre les deux promoteurs
T7 et SP6 ncessaire la transcription (plasmide pGEM

-T Easy Vector Ligation kit,


Promega, Madison, USA).


3-2-3-3-2- Transformation des cellules comptentes avec le vecteur de clonage

Les plasmides obtenus lors de ltape prcdente sont introduits par transformation
laide dun choc thermique dans des cellules bactriennes ultra-comptentes Escherichia coli
DH5

(Invitrogen) selon le protocole suivant : Des aliquotes de 100 L de cellules
comptentes pralablement conserves -80C et places dans des tubes Eppendorf (1,5 mL)
ont t incubes 10 minutes dans la glace puis 10 L de produit de ligation ont t rajouts et
lensemble a alors t plac 30 minutes dans la glace. Le mlange a t ensuite laiss 45
secondes au bain-marie 42C puis replac nouveau 2 minutes dans la glace. Enfin, 900 L
de milieu Luria Bertani (LB) ont t rajouts (cf tableau III-2-5) et les cellules transformes
ont t cultives 37C sous agitation (150 rpm) pendant 1 heure. Des aliquotes de 80 et 20
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

107
L de chaque culture ont alors t respectivement tales sur du milieu LB glos contenant
de lampicilline (20 g. mL
-1
), du X-Gal (40 g. mL
-
) et de lIPTG (32 g.mL
-1
). Les boites
ont finalement t places une nuit ltuve 37C.
Le plasmide pGEM

-T easy porte le gne de rsistance lampicilline et va donc servir de


crible de slection pour les cellules bactriennes qui ont t transformes, cest dire qui ont
intgr le plasmide. De plus, ce vecteur porte galement un gne codant pour lenzyme
galactosidase lintrieur duquel se situe le site de clonage (compris entre les deux
promoteurs SP6 et T7), o peut venir se positionner linsert dintrt. La prsence ou
labsence de linsert dintrt dans cette zone permet ou non de slectionner les bactries
recombinantes en imposant un crible de slection supplmentaire. En effet, le raboutage dun
produit PCR au site de clonage cause dans ce cas la disruption du gne codant pour lenzyme
galactosidase, entrainant ncessairement la perte de capacit de la souche recombinante
dgrader le X-Gal et conduisant la coloration bleue de la colonie. In fine, les colonies
bactriennes se dveloppant sur milieu LB contenant de lampicilline ont donc bien intgr le
plasmide pGEM

-T easy, et parmi ces colonies, seules celles qui apparaissent blanches


possdent un plasmide recombinant (cf figure III-2-8). Pour chaque isolat bactrien, 20
colonies blanches ont t slectionnes partir des boites gloses de milieu LB +
Ampicilline, places dans 100 L deau ultra-pure pralablement filtre (filtres striles
Acrodisc

32, Supor

0,2 m, GelmanSciences) et galement repiques sur boite LB +


ampicilline en vue de leur conservation (12 heures 37C puis places 4C).











Tableau III-2-5 : Prparation et composition du milieu Luria Bertani (LB) ncessaire la
slection des cellules bactriennes transformes par le plasmide pGEM

-T easy.
Elment Quantit (g)
Bacto-tryptone (1 %) 10
Extrait de levure (0,5 %) 5
NaCl (0,5 %) 5
Agar (1,5%) si milieu glos 16
H
2
O purifie qsp 1 litre
Aprs autoclave, ajouter pour 1 litre ampicilline (20 g.mL
-1
final) 400 L
Ajouter extemporanment (par boite, environ 20 mL) :
IPTG (32 g.mL
-1
final)
X-Gal (32 g.mL
-1
final)

3,5
40 L
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

108


Figure III-2-8 : Croissance des colonies aprs talement de 20 L (gauche) et de 80 L
(droite) de cellules comptentes Escherichia coli DH5

ayant intgr le vecteur de clonage


pGEM

-T easy sur milieu LB + ampicilline (20 g.mL


-1
).


3-2-3-3-3- Test PCR sur colonies des clones recombinants

Ce test a consist confirmer par PCR, que les colonies blanches slectionnes lors de
ltape prcdente, prsentent bien le plasmide pGEM

-T easy contenant linsert dintrt


(ADNr 16S des isolats bactriens) et viter de slectionner des faux positifs avant
ltape de squenage des clones recombinants.
Une amplification PCR a donc t ralise partir des colonies blanches slectionnes en
utilisant des amorces situes de part de dautre du site dinsertion et composes par les
squences des deux promoteurs SP6 et T7 du plasmide. Le mlange ractionnel a t effectu
dans un volume total de 25 L et compos par 2,5 L de tampon 5X GoTaq Polymrase
(Promega, USA), 200 M de dNTP, 0,5 M de chaque amorce (SP6 et T7), 2,5 U de GoTaq
DNA polymerase (Promega, USA) et 2,5 L de suspension bactrienne. La raction a t
ralise dans un thermocycleur PTC 200 Gradient Cycler (MJ Research, Waltham) avec le
programme damplification suivant: 3 minutes 94C ; suivi de 30 cycles de 30 secondes
94C, 45 secondes 55C, 2 minutes 72C, et enfin un cycle dlongation de 5 minutes
72C. Les amplicons obtenus ont t spars et rvls comme dcrit prcdemment.
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

109
Les colonies blanches slectionnes ayant donn, aprs migration lectrophortique, des
fragments de taille suprieure 3000 paires de bases (taille du plasmide pGEM

-T easy de
3015 pb) ont finalement t retenues et slectionnes comme tant des clones recombinant
prsentant le plasmide avec linsert dintrt.
En vue de la prparation ultrieure des chantillons pour la raction de squenage, les
colonies correspondantes ont t ensemences partir de 6 mL de milieu liquide LB
complment en ampicilline (20 g. mL
-1
) pendant une nuit 37C.


3-2-3-3-4- Prparation de lADN plasmidique (MiniPrep)

Une extraction de lADN plasmidique des clones recombinants ayant pouss pendant
une nuit 37C sur milieu LB complment dampicilline (colonies blanches positives aprs
la raction de PCR avec les amorces T7 et SP6) a t ralise laide du kit commercial
Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega, USA). Les cultures
ensemences ont t places dans des tubes Falcon striles (10 mL) numrots et centrifuges
en salle de culture P2 3000 rpm pendant 10 minutes 4C. Le surnageant obtenu a t
limin et le culot repris par 250 L de solution de resuspension (E1) fournie par le kit. 250
L de solution de lyse (E2) ont t rajouts et les tubes ont t mlangs par inversion (4
fois), puis 10 L de solution de protase alkaline (E3) ont t rajouts et les chantillons ont
t homogniss et laisss 5 minutes temprature ambiante. 350 L de solution de
neutralisation (E4) ont t finalement t rajouts, les chantillons homogniss (inversion 4
fois) et centrifugs 13 000 rpm pendant 10 minutes temprature ambiante. La totalit du
surnageant de chaque chantillon a t dpose sur spin colonne (Kit) et centrifug 13 000
rpm pendant 1 minute temprature ambiante. Les colonnes ont t laves deux fois (solution
E5, ajout de 750 L puis de 250 L) et centrifuges nouveau 13 000 rpm pendant 2
minutes. Les colonnes ont finalement t lues par ajout de 50 L dH2O ultra-pure
(solution E6) et centrifugation 13000 rpm pendant 1 minute. LADN plasmidique ainsi
obtenu a t quantifi et sa qualit a t vrifie comme prcdemment dcrit.

3-2-3-3-5- Raction de squenage

Les amplifiats de PCR SP6/T7, issus de la prparation plasmidique prcdente, ont t utiliss
pour raliser les ractions de squenage. Cela consiste raliser llongation de linsert clon
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

110
par une PCR linaire laide dune seule des deux amorces SP6 ou T7, en prsence dun
mlange des 4 di-dsoxy nuclotides triphosphates (ddNTPs) marqus par un colorant
spcifique chaque base. Dans le cadre de notre tude, chaque amplifiat provenant des
diffrents clones recombinants slectionns a t systmatiquement amplifi en utilisant les
deux amorces sparment, en utilisant soit SP6, soit T7 dans le mlange ractionnel. Les
chantillons ont t prpars dans un volume final de 10 L compos de 1 L dune des
amorces SP6 ou T7 (concentration initiale des amorces 10 pmole. L
-1
), et dun volume de
produit PCR de faon obtenir 100 ng dADN dans le mlange ractionnel complt par
ajout deau ultra-pure (qsp 10 L). Les chantillons ont t placs dans un thermocycleur
PTC 200 Gradient Cycler (MJ Research, Waltham) afin dtre dshydrats par chauffage
80C pendant 30 minutes puis repris par 20 L de solution de ddNTPs BigDye Terminator
v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystem, Fostercity, USA). Le programme
damplification suivant a t conduit : 5 minutes 92C puis 35 cycles de 30 secondes
92C, 20 secondes 50C (diminution de 1C.seconde-1) et 4 minutes 60C (augmentation
de 1C.seconde-1). La raction damplification a t arrte par lajout de 75 L dune
solution darrt (2 mL dactate de sodium 3 M pH 4,5 + 48 mL dthanol 95, qsp 50 mL).
Les chantillons ont t agits au vortex et centrifugs 3250 rpm pendant 40 minutes 4C.
Le surnageant a t limin et le culot dADN dlicatement sch (centrifugation 3250 rpm
pendant 30 secondes 4C puis gouttage). Le culot a t lav deux fois avec 70 L dthanol
70 % pralablement plac -20C puis lensemble est centrifug 3250 rpm pendant 15
minutes 4C. Le surnageant a t limin et le culot a t sch sur la paillasse puis remis en
suspension dans 20 L dH
2
O ultra-pure. Les chantillons ont t chargs dans une plaque 96
puits et analyss par un squenceur 16 capillaires de type Applied Biosystems Hitachi
3130xl Genetic Analyzers (cf figure III-2-9). Les donnes brutes gnres par le squenceur
ont t traites laide du logiciel Data Collection Software (V 3.0, Applied Biosystems,
USA) qui permet de gnrer un spectre de squenage et daboutir la dtermination de la
squence nuclotidique de la matrice ADN tudie.

Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

111
















Figure III-2-9 : Squenceur Applied Biosystems Hitachi 3130xl Genetic Analyzers.

3-2-3-3-6- Traitement et analyse des squences



Les squences nuclotidiques dADNr 16S obtenues ont t dites par le logiciel
4PEAKS V1.7 (http://www.mekentosj.com/science/4peaks). Linversion des squences
complmentaires a t ralise laide du logiciel Reverse Complement
(http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html). Des squences consensus ont t ensuite
gnres grce au logiciel SeqManNGen

(DNASTAR, USA) partir de nos donnes et


compares aux squences dADNr 16S connues et disponibles dans la banque GenBank
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) par le programme BlastN (Altschul et al., 1990).
Lalignement multiple des squences consensus dADNr 16S des clones et des squences
slectionnes dans GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) a t ralis avec le
logiciel ClustalX (http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/; Thompson et al., 1997). La
matrice de similitude gnre a t traite par le logiciel NJPlot (ftp:://pbil.univ-
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

112
lyon1.fr/pub/mol_phylogeny/njplot; Perrire et Gouy, 1996) afin de reconstruire larbre
phylogntique correspondant par la mthode du Neighbor-Joining (Saitou et Nei, 1987)
assigne de la correction de Jukes et Cantor (1969). Une analyse par boostrap (Felsentein,
1985 ; Felsentein et Kishino, 1993) a t mene pour tester la robustesse de notre arbre.


3-2-4- Caractrisation fonctionnelle des isolats bactriens :

3-2-4-1- Contexte

Nous avons voulu complter lidentification phylogntique de nos isolats par la
dtection de deux familles de gnes impliqus dans la dgradation de xnobiotiques
aromatiques par action de mtalloenzymes dioxygnases bactriennes. Limportance du
carrefour mtabolique que semble constituer la voie des catchols ou protocatchuates laisse
penser que les populations bactriennes ont progressivement dvelopp des enzymes capables
de reconnatre des gammes tendues de substrat, afin de pouvoir transformer des composs
aromatiques de familles diffrentes en mtabolites de nature catcholique (Dagley, 1986 ;
Vaillancourt et al., 2006 ; Zeyaullah et al., 2009 ; Lillis et al., 2010).

Les dioxygnases catalysent deux ractions fondamentales: en premier lieu,
lhydroxylation du compos aromatique, puis dans une deuxime tape, louverture du noyau
(Williams and Sayers, 1994 ; Hatta et al., 2003 ; Costas et al., 2004 ; Prathibba et Sumathi,
2007). Ces enzymes sont classes selon le mode douverture du noyau aromatique quelles
catalysent : lintradiol dioxygnase ou catchol 1,2-dioxygnase (C12O) lorsque le clivage se
fait en position ortho (clivage entre les carbones porteurs des groupements hydroxyles) ou
lextradiol dioxygnase ou catchol 2,3-dioxygnase (C23O) pour clivage en position mta
(clivage entre les deux carbones adjacents au diol). Ces deux types denzymes constituent
deux familles distinctes et diffrent notamment par la valence de latome de fer situ au site
actif : les intradiol dioxygnases prsentent un fer ferrique alors que les extradiol
dioxygnases possdent un fer ferreux (Harayama et Rekik, 1989). La figure III-2-10
reprsente le mcanisme gnral de ces deux types denzymes.



Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

113






Figure III-2-10 : Voies de clivage du noyau aromatique du catchol (voies ortho et mta)
catalyses par les catchol dioxygnases.

La premire dioxygnase de ce type avoir t squence est la catchol 2,3-
dioxygnase, code par le gne xylE sur le plasmide TOL (Nakai et al., 1983). Cette enzyme
catalyse loxydation du catchol en acide 2-hydroxymuconique semialdhyde. Les gnes XylE
sont constitus denviron 923 pb correspondantes la totalit du cadre de lecture ouvert du
gne de la catchol-2,3-dioxygnase qui est trs largement rpandue dans le monde microbien
et se trouve implique dans des mtabolismes varis (Eltis et Bolin, 1996).
Ces gnes sont potentiellement dexcellentes cibles molculaires pour caractriser et typer la
microflore du sol implique dans la dgradation des composs xnobiotiques aromatiques
(Wikstrm et al., 1996). Ils sont gnralement ports par un plasmide catabolique conjugatif,
le plasmide TOL pWW0 denviron 117 kb (Nakai et al., 1983), organiss en opron et se
localisent lintrieur dlments transposables (Assinder et Williams, 1990). Nous avons
recherch leur prsence chez nos isolats.

Nous avons galement recherch la prsence des gnes codant lenzyme catchol-1,2-
dioxygnase (C12O) dans nos isolats. Mme si la nature chimique de la sulcotrione semble
certainement incompatible avec un mcanisme de type ortho clivage, il tait tout de mme
important davoir une vision fonctionnelle largie de nos isolats vis--vis de ces deux
enzymes clefs du mtabolisme bactrien. Les gnes C12O sont composs denviron 920 pb et
codent lenzyme catchol-1,2-dioxygnase (C12O) qui intervient galement dans des
mtabolismes impliquant des composs aromatiques varis (Strachan et al., 1998 ; Giedraityte
et Kalediene 2009).



114
3-2-4-2- Dtection par PCR des gnes XylE codant lenzyme catchol 2,3-
dioxygnase

Nous avons appliqu la procdure dcrite par Jussila et al. (2007). Ces auteurs ont dvelopp
une mthode de dtection gne-spcifique du plasmide TOL par amplification PCR denviron
731 pb des gnes XylE (cf tableau III-2-6) partir des amorces consensus XylEaf (5-TCG
AGT TGC TGG GCC TGA TCG-3) et XylEar (5- CCC GCA GAA CAC TTC GTT GCG-
3). La raction damplification a t ralise dans un volume final de 25 L, contenant 2,5
L de tampon 5X GoTaq Polymrase (Promega, USA), 200 M de chaque dNTP (Promega,
USA), 1 M de chaque amorce, 2,5 U de GoTaq DNA polymrase (Promega, USA) et 25 ng
dADN matrice. Les amplifications ont t ralises partir dADN gnomique de nos isolats.
Les deux contrles utiliss ont t de lADN gnomique dEscherichia coli souche DH5
[gnotype F
-
80lacZM15 (lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(r
k
-
, m
k
+
)
phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1
-
] obtenu aprs culture de 100 L de suspension
bactrienne sur milieu LB (12 heures 37C) et extraction-purification laide du kit
Wizard

Genomic DNA Purification kit (Promega, USA) ainsi que le plasmide pCambia
3300 (taille 9kb, Flag-HA /3300 : CTZ, cration juin 2010, source LGDP, Equipe Nouveaux
Systmes Transcriptionnels chez Arabidopsis thaliana). La raction de PCR a t ralise
laide dun thermocycleur PTC 200 Gradient Cycler (MJ Research, Waltham) avec le
programme damplification suivant : 1 cycle de 10 minutes 94C ; 30 cycles de 30 secondes
94C, 1 minute 70C, 1 minute 72C et un cycle final de 3 minutes 72C. 8 L de
produit PCR ont t dposs sur gel dagarose 1,2 % (Molecular Biology Grade agarose,
Eurogentec, Europe) et spars par lectrophorse 80 V pendant 35 minutes dans une
solution de TBE 1X. Le marqueur de taille molculaire 1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen) a
t utilis. Le gel a t ensuite color par une solution de GelRed (Nucleic Acid Gel Stain,
Biotum) et rvl comme dcrit prcdemment. Les bandes obtenues ont t excises sous
UV et purifies par le kit GENECLEAN

Turbo Kit (MP Biomedicals, Europe) selon la
procdure prcdemment dcrite. 3 L de chaque chantillon dADN ont t quantifis sur
gel dagarose 1 % (Molecular Biology Grade agarose, Eurogentec, Europe) avec 1, 2 et 5 L
de solution de marqueur de taille molculaire 1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen). Les
chantillons ont galement t doss par spectrophotomtrie = 260 nm laide du
Nanodrop

2000 (ThermoFisherScientific) et leur qualit a t value (rapports A 260/280 et
A 260/230). Les chantillons ont t conservs -20C pour analyses ultrieures.

115



Amorce Direction
Long.
(nt)
Temp.
(C)
G + C
(%)
Position 5de la
squence
codante
Squence
Gne
amplifi
Taille du
fragment
attendu
(pb)
Rfrences

XylEaf

Foward

21

70,1

62

127
5- TCG AGT TGC TGG
GCC TGA TCG -3


XylEar


Reverse

21

70,3

62

857
5- CCC GCA GAA CAC
TTC GTT GCG-3
C23O 731
Jussila et al.
(2007)
Nakai et al.
(1983)


C12Of
Foward

20

-

65

-

5- GCC AAC GTC GAC
GTC TGG CA-3


C12Or Reverse 25 - 52 -
5- CGC CTT CAA AGT
TGA ATC TGC GTG
GT-3
C12O 282
Sei et al.
(1999)
Guzik et al.
(2011)

Tableau III-2-6 : Caractristiques des amorces utilises pour la dtection des gnes codant la catchol 2,3-dioxygnase (C23O) et la
catchol 1,2-dioxygnase (C12O) par amplification PCR.


Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

116

3-2-4-3- Dtection par PCR des gnes C12O codant lenzyme catchol 1,2-
dioxygnase

Nous avons appliqu la procdure dcrite par Sei et al. (1999) et reprise par Guzik et
al. (2011). Ces auteurs ont dessin des amorces spcifiques (cf tableau III-2-6) partir de 11
rgions fortement homologues des gnes C12O par alignement multiple des squences des
gnes C12O disponibles dans GenBank. Leur objectif tait de pouvoir amplifier une large
gamme de gnes codant les catchol 1,2-dioxygnases des genres bactriens suivants :
Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes et Arthrobacter. Les amorces C12Of (5-GCC
AAC GTC GAC GTC TGG CA-3) et C12Or (5- CGC CTT CAA AGT TGA TCT GCG
TGG T-3) amplifient environ 300 pb du gne C12O.
La raction damplification a t ralise dans un volume final de 25 L, contenant 2,5 L de
tampon 5X GoTaq Polymrase (Promega, USA), 200 M de chaque dNTP (Promega, USA),
1 M de chaque amorce, 2,5 U de GoTaq DNA polymrase (Promega, USA) et 25 ng dADN
matrice. Les amplifications ont t ralises partir dADN gnomique de nos isolats. Les
deux contrles utiliss ont t de lADN gnomique dEscherichia coli souche DH5 et le
plasmide pCambia 3300 dcrits prcdemment. La raction PCR a t ralise laide dun
thermocycleur PTC 200 Gradient Cycler (MJ Research, Waltham) avec le programme
damplification suivant : 1 cycle de 3 minutes 94C ; 10 cycles de 1 minute 94C, 30
secondes 61C, 30 secondes 72C, 15 cycles de 1 minute 94C, 30 secondes 59C, 30
secondes 72C, 15 cycles de 1 minute 94C, 30 secondes 57C, 30 secondes 72C et
un cycle final de 30 secondes 72C. 10 L de produit PCR ont t dposs sur gel dagarose
1% (Molecular Biology Grade agarose, Eurogentec, Europe) et spars par lectrophorse
80 V pendant 35 minutes dans une solution de TBE 1X. Le marqueur de taille molculaire
1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen) a t utilis. Le gel a t ensuite color par une solution de
GelRed (Nucleic Acid Gel Stain, Biotum) et rvl comme dcrit prcdemment. Les
bandes obtenues ont t excises sous UV et purifies par le kit GENECLEAN

Turbo Kit
(MP Biomedicals, Europe) selon la procdure prcdemment dcrite. 3 L de chaque
chantillon dADN ont t quantifis sur gel dagarose 1 % (Molecular Biology Grade
agarose, Eurogentec, Europe) avec 1, 2 et 5 L de solution de marqueur de taille molculaire
1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen). Les chantillons ont galement t doss par
spectrophotomtrie = 260 nm laide du Nanodrop

2000 (ThermoFisherScientific) et
Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

117
leur qualit a t value (rapports A 260/280 et A 260/230). Les chantillons ont t
conservs -20C pour analyses ultrieures.

3-2-4-4- Squenage des produits PCR

Les chantillons ont t prpars afin de squencer les fragments dADN dans les
deux sens (53 et 35). Ils ont t composs dun volume final de 8 L comprenant 1
L damorces XylEaf ou XylEar (squenage du gne XylE), soit 1 L de damorces C12Of
ou C12Or (squenage du gne C12O) de concentration de 10 pmol. L
-1
et dun volume
dADN matrice variable selon la taille des fragments considrs (cf tableau III-2-7). Le
volume final a t complt par ajout deau ultra-pure (qsp 8 L). La raction de squenage
sest droule dans les conditions dcrites prcdemment.


Taille des fragments dADN
(pb)
Quantit dADN par raction de squenage
(ng)
300 7 14
500 700 9 18
1000 16 32
2000 28 56
Tableau III-2-7 : Quantit dADN (en ng) ncessaire par raction de squenage pour les
fragments PCR. Etalonnage du squenceur Applied Biosystems Hitachi 3130xl Genetic
Analyzers.


3-2-4-5- Traitement et analyse des squences

Les squences nuclotidiques dADN obtenues ont t dites par le logiciel FinchTV
version 1.4 (http://www.geospiza.com/Products/finchtv.shtml). Lalignement multiple entre
les squences dites et les squences des gnes XylE et C12O disponibles dans GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) t ralis avec le logiciel ClustalX (http://www-
igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/; Thompson et al., 1997).


Troisime partie Chapitre 2 : Mthodologie de lanalyse biologique

118
3-2-5- Caractrisation physiologique des isolats

En complment de ltude molculaire des souches bactriennes isoles, leur aptitude
dgrader la sulcotrione a t value. Cette partie de notre travail a t dcrite
prcdemment.

119











Quatrime partie: Rsultats et discussion
Quatrime partie Chapitre 1 : Confirmation du pouvoir biodgradant du sol de
Perpignan et recherche dune ventuelle biodgradation acclre (BDA)

120
Chapitre1Confirmationdupouvoirbiodgradantdusolde
Perpignanetrechercheduneventuellebiodgradation
acclre(BDA)

1- Ractivit biologique du sol de Perpignan



Les travaux prcdemment raliss au L.C.B.E par Chaabane (2005) et Chaabane et
al. (2005, 2008) ont permis de mettre en vidence la dgradation des herbicides trictones (et
notamment la sulcotrione) dans les quatre sols tudis (Belgique, Martinique, Landes et
Perpignan). Outre une dgradation effective par voie abiotique (hydrolyse et photolyse), cet
auteur a montr le rle prpondrant de la dgradation biologique. Ces rsultats ainsi que la
disponibilit du sol de Perpignan et les traitements quil avait reus au pralable nous ont
amen dfinir de nouveaux objectifs de travail : (i) confirmer le pouvoir biodgradant de ce
sol de Perpignan; (ii) rechercher une ventuelle biodgradation acclre (BDA) de la
sulcotrione, en confrontant nos rsultats aux donnes bibliographiques relatives dautres
substances actives (atrazine, isoproturon, 2,4-D,); (iii) isoler puis caractriser des souches
bactriennes, prsentes dans le sol de Perpignan et impliques dans le processus de
dgradation biologique.

Lors des prcdents travaux de H. Chaabane, la microflore du sol de Perpignan avait
montr une capacit transformer la sulcotrione en deux mtabolites majeurs, la 1,3-
cyclohexanedione (CHD) et lacide 2-chloro-4-msylbenzoque (CMBA) par clivage entre la
partie CHD et le noyau benznique. Nous avons souhait confirmer cette potentialit
biodgradante en conditions contrles par lutilisation de microcosmes.
Deux types de sols issus de la parcelle ont permis de prparer les diffrents microcosmes : un
sol (4S), ayant dj subi quatre traitements au champ, deux ans plus tt et un sol contrle
(C) exempt de tout traitement pralable par la sulcotrione. Paralllement, des essais similaires
ont t mens sur ces sols (4S) et (C) pralablement striliss (St4S) et (StC) (cf paragraphe
II-2-4).


Quatrime partie Chapitre 1 : Confirmation du pouvoir biodgradant du sol de
Perpignan et recherche dune ventuelle biodgradation acclre (BDA)

121
Un premier traitement a t effectu sur lensemble des microcosmes (boites de Ptri
contenant 10 grammes de sol) par ajout de 0,6 mL de solution aqueuse de sulcotrione 22
mg.L
-1
, se rapprochant ainsi de la teneur prvisible dans le sol (en g.g
-1
de sol dans les
premiers centimtres) aprs application aux doses homologues lors des itinraires techniques
masicoles (300-450 g.Ha
-1
).

Les cintiques de dgradation ont t tablies pour les quatre sols tudis (4S), (C), (St4S) et
(StC) aprs 30 jours dincubation dans une chambre thermostate 24C ( 0,2). Les rsultats
sont prsents dans le tableau IV-1-1 et les figures IV-1-1, IV-1-2). La biodgradation de la
sulcotrione est donc confirme sur les sols (4S) et (C) conformment aux travaux prsents
par H. Chaabane (2005). Le sol de Perpignan prsente une cintique de dgradation qui peut
raisonnablement tre dcrite par une loi de premier-ordre avec un coefficient de dtermination
r voisin de 0,9 dans les deux cas:

Ln C = - kt + Ln C
0

Avec C : concentration de pesticide restante en g.g
-1
de sol,
C
0
:

concentration initiale de pesticide prsente dans le milieu en dbut dincubation en
g.g
-1
de sol,
k : constante de cintique de premier-ordre.

Le temps de demi-vie (t
1/2
), ou encore temps ncessaire pour quil y ait disparition de la
moiti de la quantit initiale de pesticide est calcul partir de la relation prcdente:

t
1/2
= Ln 2 / k






Quatrime partie Chapitre 1 : Confirmation du pouvoir biodgradant du sol de
Perpignan et recherche dune ventuelle biodgradation acclre (BDA)

122
















Tableau IV-1-1 : Constantes cintiques (k), temps de demi-vie (t
1/2
) et coefficients de
dtermination (r
2
) relatifs la cintique de dgradation de la sulcotrione en conditions de
microcosmes pour le sol de Perpignan.


Figure IV-1-1 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione dans les microcosmes de sol (4S) vs
(St4S) aprs un, deux, trois ou quatre traitements successifs.


k (jours
-1
)


t
1/2
(jours)

r
2


Sol (C)

Traitement 1 (T1
D0
)


0,083

8

0.894

Sol (4S)

Traitement 1 (T1
D0
)


0,088

8

0.872

Sol (StC)

Traitement 1 (T1
D0
)


0,0004

-

-

Sol (St4S)

Traitement 1 (T1
D0
)


0,0004

-

-
Quatrime partie Chapitre 1 : Confirmation du pouvoir biodgradant du sol de
Perpignan et recherche dune ventuelle biodgradation acclre (BDA)

123

Figure IV-1-2 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione dans les microcosmes de sol (C) vs
(StC) aprs un, deux, trois et quatre traitements successifs.


Aprs 30 jours dincubation, environ 90 % de la sulcotrione initiale a t dgrade aussi bien
pour le sol (4S) que pour le sol (C).
Les constantes de dgradation (k 0,085) ont t voisines pour les deux sols, permettant
destimer des temps de demi-vie voisins de 8-10 jours, sensiblement plus courts que ceux
prsents par H. Chaabane (2005 ; Chaabane et al., 2007), mais compris dans la fourchette
de quelques jours environ 60 jours, retrouve dans dautres donnes bibliographiques
(Rouchaud et al., 1996 ; 1998a, 1998b ; Cherrier et al., 2004 ; Mamy, 2005).
Aucune diffrence notable nest donc apparue entre les sols (4S) et (C), malgr leur historique
de traitement volontairement diffrent. Ce rsultat nautorise donc pas voquer, lissue de
cette premire tape, un possible effet mmoire sur le potentiel de dgradation du sol (4S),
li la rptition antrieure (36 mois auparavant) des traitements en plein champ,.
De plus, pour les deux sols, aucune phase de latence na t observe lors de la cintique de
disparition, lment permettant de suggrer lintervention dun processus de co-mtabolisme
dans la dgradation de la sulcotrione.

Quatrime partie Chapitre 1 : Confirmation du pouvoir biodgradant du sol de
Perpignan et recherche dune ventuelle biodgradation acclre (BDA)

124
Les rsultats relatifs ltude mene partir des sols striliss (St4S) et (StC) sont galement
prsents dans le tableau VI-1-1. La dgradation a t pratiquement ngligeable, aussi bien
pour le sol (St4S) que pour le sol (StC), dans les conditions de strilisation retenues.
Ces donnes confirment donc que la voie biologique est largement prpondrante dans le cas
de la sulcotrione dans le sol de Perpignan en accord avec les prcdents rsultats dcrits par
H. Chaabane.


2- Recherche dune ventuelle biodgradation acclre (BDA)

Conscutivement lutilisation rpte de produits phytosanitaires sur de longues
priodes, une baisse progressive de lefficacit de la substance active a t souvent dcrite
dans la littrature, gnralement associe une adaptation de la microflore tellurique
implique dans la dissipation du pesticide dans le sol. Mise en vidence par Audus partir des
annes 50 avec le 2,4 D (Audus, 1964), la BDA est sans consquence sur les produits
application foliaire. Certaines familles de pesticides apparaissent plus concernes que dautres
par ce phnomne. Cest notamment le cas des carbamates, quil sagisse dinsecticides
comme le carbofuran (Felsot et al., 1981), le bendicarb et la carbaryl (Racke et Coats, 1988a)
ou dherbicides comme le butylate et le vernolate (Gray et Joo, 1985). Une BDA a t
galement observe pour certains insecticides organophosphors comme lisofenphos, le
fonofos et le fnamiphos par exemple (Chung et Ou, 1996) et des fongicides comme
liprodione et la vinchlozoline (Walker et al., 1986). Gray et Joo (1985) ont galement montr
lapparition de ce mcanisme chez les amides (napropamide), les drivs amides (alachlore),
les benzamides (propizamide) et chez certains acides halogns comme le dalapon. Bien sr
dans les familles dherbicides comme les s-triazines, ce phnomne a t largementt mis en
vidence (Barriuso et Houot , 1996 ; Pussemier et al., 1997 ; Yassir et al., 1999). Dans le cas
des ures substitues, il intressant de voir que la BDA nest pas systmatique pour tous les
composs dune mme famille : ainsi lisoproturon, le linuron et le chlortoluron peuvent tre
sujets la BDA alors que le diuron prsente par exemple une BDA plus modre malgr
une nombre de traitements importants pendant plusieurs annes (Rouchaud et al., 2000).
Ainsi, limportance de la structure chimique du compos phytosanitaire semble jouer un rle
sur le dveloppement dune BDA au sein dune parcelle agricole. En outre, ces processus
Quatrime partie Chapitre 1 : Confirmation du pouvoir biodgradant du sol de
Perpignan et recherche dune ventuelle biodgradation acclre (BDA)

125
adaptatifs ont t gnralement dcrits pour des composs phytosanitaires, le plus souvent
herbicides, utiliss depuis plusieurs dcennies des doses dapplication suprieures celles
homologues pour la sulcotrione, notamment en masiculture.

Aussi, il nous a sembl intressant de rechercher lexistence dun tel phnomne de BDA
dans le cas de la sulcotrione, en raison (i) de son avenir agronomique au sein des
itinraires techniques en remplacement de latrazine, interdite au dbut des annes 2000, (ii)
de sa structure chimique prsentant un substituant halogn (gnralement dcrits comme des
composs chimiques plutt rcalcitrants), (iii) des doses dapplication relativement modres.

A lissue du premier traitement en microcosme, la probabilit dapparition dune BDA est
apparue relativement faible au vu des rsultats relatifs aux cintiques de dgradation,
comparables entre les sols (4S) et (C). En raison de la ractivit de ces sols, nous avons
cependant souhait poursuivre cette tude par des traitements supplmentaires au niveau des
mmes microcosmes. Un calendrier a t tabli (cf paragraphe II-2-5). Il prvoyait un
deuxime traitement 30 jours aprs le premier et des prlvements conscutifs au cours du
mois suivant. Deux traitements supplmentaires, espacs chacun de 30 jours et raliss dans
les mmes conditions, ont complt cette tude.
Les rsultats sont prsents dans le tableau IV-1-2 ainsi que dans les figures IV-1-1 et IV-1-2.

Lexamen de ces rsultats, obtenus aprs rptition des traitements suscite plusieurs
commentaires :
(i) Les rsultats des cintiques de dissipation de lherbicide ont t similaires sur les sols (4S)
et (C), ce qui confirme bien labsence deffet mmoire entre ces sols, diffrents au niveau de
lhistorique phytosanitaire, absence dj entrevue lors du premier traitement.
(ii) Lexamen statistique (moyenne cart-type) des valeurs de k obtenues lissue de chaque
pisode (traitement et prlvements au cours du mois dincubation) montre une valeur
moyenne voisine de 0,085 (avec un coefficient de variation acceptable, voisin de 20 %), tout
fait comparable celle obtenue aprs le premier traitement. Le temps de demi-vie (t
1/2
),

invariable,

reste au voisinage de 8-10 jours. La rptition des traitements naffecte donc pas la
vitesse de dgradation de la sulcotrione dans le sol de Perpignan : la vitesse naugmente pas
Quatrime partie Chapitre 1 : Confirmation du pouvoir biodgradant du sol de
Perpignan et recherche dune ventuelle biodgradation acclre (BDA)

126
au cours du temps, caractristique cintique essentielle du processus de dgradation par co-
mtabolisme. De plus, aprs le premier traitement, et quels que soient les traitements
successifs (T2, T3 et T4) et le type de sol considrs, les courbes de dissipation de lherbicide
ne font pas apparatre de temps de latence. Au contraire, la cintique sapparente plutt une
transformation chimique catalyse ne prsentant pas de point dinflexion, signature dune
dgradation biologique par co-mtabolisme.
(iii) Lexamen des courbes de dissipation ainsi que les coefficients de dtermination souvent
suprieurs 0,9 corroborent le caractre de cintique de premier-ordre, quel que soit le
nombre de traitements.


















Tableau IV-1-2 : Paramtres cintiques relatifs aux diffrents traitements successifs effectus
en microcosmes sur les sols (4S), (St4S), (C) et (StC).
k (jours
-1
) t
1/2
(jours) r
2


Traitement 1 (T1
D0
)

0,083

8

0,894
Traitement 2 (T2
D30
) 0,060 11,5 0,955
Sol(C) Traitement 3 (T3
D60
) 0,100 7 0,989
Traitement 4 (T4
D90
) 0,100 7 0,962

Moyenne


0,085 0,020

8 2,5

-

Traitement 1 (T1
D0
)

0,088

8

0,872
Traitement 2 (T2
D30
) 0,093 7 0,936
Sol (4S) Traitement 3 (T3
D60
) 0,068 10 0,955
Traitement 4 (T4
D90
) 0,089 8 0,828

Moyenne


0,084 0.012

8 2,0

-

Sol (StC)

Traitement 1 (T1
D0
)


0,0004

-

-

Sol (St4S)

Traitement 1 (T1
D0
)


0,0004

-

-
Quatrime partie Chapitre 1 : Confirmation du pouvoir biodgradant du sol de
Perpignan et recherche dune ventuelle biodgradation acclre (BDA)

127
3- Conclusion

Le sol de Perpignan prsente bien une ractivit biologique importante vis--vis de la


sulcotrione, et ces rsultats confirment le rle majeur des communauts microbiennes dans la
dgradation de la substance active. Cette ractivit se caractrise, dans ce cas, par un potentiel
de dgradation notable puisque 50 % de la substance active est dgrade aprs seulement 7
jours dincubation en microcosmes. Les profils cintiques observs traduisent une
prpondrance du processus de co-mtabolisme dans la dgradation de cet herbicide dans le
sol. Lenchanement de quatre cycles de traitement successifs, de 30 jours chacun, na pas t
lorigine de rponses diffrentes des communauts microbiennes, et cela, autant pour les
microcosmes de sol (4S) et que ceux de sol (C), opposs pourtant, par des historiques de
traitement volontairement diffrents. La diminution de la demi-vie de la molcule active,
vnement signature de la mise en place du phnomne de biodgradation acclre (Topp et
al. 2003) na donc pas t observe. Ladaptation de la microflore tellurique na, priori, pas
t suffisamment importante pour gnrer une biodgradation acclre (BDA) en conditions
contrles (microcosmes).
Ces rsultats peuvent tre expliqus par un nombre de traitement peut-tre insuffisant. Cette
conclusion va dans le sens de F. Martin-Laurent (communication personnelle), la
biodgradation acclre dun produit phytosanitaire ne pouvant tre valablement mise en
vidence qu partir de traitements stalant sur des dures beaucoup plus longues (plusieurs
dcennies ?).
Dautre part, comparativement aux doses gnralement utilises pour les pesticides ayant
gnr des processus de biodgradation acclre, la dose dapplication de la sulcotrione
(300-450 g.Ha
-1
en masiculture) apparat sensiblement infrieure, ce qui pourrait limiter ou
retarder lapparition des phnomnes dadaptation biologique. Cette problmatique avait dj
t aborde par El Seba (2004), qui rapportait que la majorit des BDA avaient t observes
pour des produits phytopharmaceutiques dont les doses utilises taient gnralement gales
ou suprieures 1000 g.Ha
-1
. Il stait notamment interrog sur les effets imputs
lutilisation de ces composs sur la flore microbienne tellurique: (i) Des doses infrieures
1000 g.Ha
-1
sont-elles susceptibles de gnrer une pression environnementale suffisante sur
les communauts microbiennes pour provoquer des phnomnes adaptatifs ? (ii) La quantit
de carbone disponible issue du pesticide est-elle, dans ce cas, suffisante pour gnrer des
Quatrime partie Chapitre 1 : Confirmation du pouvoir biodgradant du sol de
Perpignan et recherche dune ventuelle biodgradation acclre (BDA)

128
effectifs microbiens en nombre important afin dobserver une BDA lchelle dune parcelle
agricole ?

Au dbut de cette tude, nous avions fait lhypothse que le sol de Perpignan pourrait
ventuellement prsenter une aptitude naturelle la BDA de la sulcotrione, facilement
observable dans des conditions de microcosmes, en rponse des cycles de traitements
rpts traduisant une stimulation de la biomasse dgradante en taille et/ou en activit. Cela
na pas t le cas. Nanmoins, le potentiel de dgradation de ce sol a t confirm et laisse
entrevoir tout de mme, la possibilit dy trouver des microorganismes dots de capacits
gntiques dgrader ce pesticide. Au regard de ces rsultats et conscient des difficults
exprimentales inhrentes la culture des microorganismes telluriques sur milieux
synthtiques, nous avons toutefois tent disoler partir du sol (4S) des souches bactriennes
susceptibles de biodgrader lherbicide sulcotrione.

Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

129
Chapitre2Isolementdesouchesbactriennes
potentiellementdgradantesdelasulcotrione

1- Recherche de souches sulcotrione-rsistantes



La premire tape de notre travail a consist dvelopper une mthode de culture
utilisant les chantillons environnementaux de sol (4S) et (C) sous forme de suspensions dans
du srum physiologique, avant talement, diverses dilutions (10
0
10
-4
) sur le milieu (NS),
constitu de sol (C) strilis, dagar et supplment en sulcotrione (30 mg.L
-1
) et
cycloheximide (cf figure III-2-2). Sur ce milieu, synthtique mais se rapprochant du micro-
habitat initial des souches telluriques, nous avons pu faire certaines observations :

- seule la dilution 10
0
(direct) a permis une croissance exploitable de micro-organismes aprs
sept jours dincubation lobscurit;
- dans ces conditions, de nombreuses colonies bactriennes ont pouss, sans contamination
fongique ; divers morphotypes ont t observs ;
- un morphotype dominant a t retenu, caractris par des colonies blanches de petite taille et
de consistance visqueuse ; ces isolats ont montr une morphologie comparable, formant des
colonies lisses , plus ou moins opaques, convexes, de forme circulaires et de diamtre
voisin de 2,5 mm.
- prsence dun nombre de colonies plus lev pour le contrle [milieu (MS) non supplment
en sulcotrione] que pour les gloses supplmentes avec lherbicide ;
- huit colonies bactriennes ont t isoles aprs purification par talements successifs sur
milieu glos partir de ce morphotype ;
- la croissance de ces colonies est possible malgr par la prsence de sulcotrione des teneurs
importantes dans le milieu de culture (30 mg.L
-1
) ;
Cette mthode hybride , a permis de cultiver, partir dun chantillon environnemental de
sol (milieu complexe naturel), des souches bactriennes difficilement cultivables sur milieux
synthtiques conventionnels, avec un temps dincubation relativement court et en labsence de
toute contamination myclienne. Elle est directement adapte des travaux de Ferreira et al.
(2009) ; son originalit rside dans lutilisation simultane de sol initial strilis et de glose,
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

130
des concentrations respectives optimises, limitant ainsi les effets potentiellement dltres
de lagar sur certaines colonies bactriennes et se rapprochant des conditions naturelles
propres aux communauts microbiennes du sol (4S). Ainsi, en jouant de faon synergique sur
divers paramtres contrlant les tapes du protocole disolement, comme lavaient dj dcrit
Zengler et al. (2002), il semblerait que les conditions physiologiques de culture dveloppes
dans notre approche soient favorables la croissance despces bactriennes du sol. Ces
rsultats vont dans le sens des travaux dj dvelopps par Janssen et al. (2002), qui ont pu
isoler du sol de nouvelles souches bactriennes dcrites jusqualors comme non cultivables et
caractrisables uniquement que par des techniques molculaires.

La comparaison du nombre de colonies obtenues partir des gloses additionnes dherbicide
et celles obtenues partir du contrle (sans sulcotrione) rvle que lajout dherbicide dans le
milieu de culture a un impact sur la croissance des colonies cultivables. Malgr ce stress
environnemental , une croissance des colonies, issue du morphotype dominant est tout de
mme observe, ce qui nous autorise qualifier ces isolats de souches rsistantes la
sulcotrione.

Lobtention de ces huit souches nous a fourni le support favorable la poursuite de notre
travail.


2- Isolement de souches bactriennes mtabolisant la sulcotrione

Chacune de ces huit colonies rsistantes, pralablement isole et purifie, a t
cultive sur milieu liquide (MS) supplment en sulcotrione comme seule source de carbone
et/ou dnergie. Cinq cycles de culture successifs de 20 jours ont t mens de faon exercer
une importante pression de slection sur la population microbienne issue de chaque isolat et
induire des mcanismes gntiques adaptatifs (cf figure III-2-3). A lissue de ces cinq cycles,
nous avons souhait valuer la capacit des isolats utiliser la sulcotrione comme source de
carbone : la croissance de la biomasse microbienne a donc t suivie par mthode
spectrophotomtrique ( 600 nm) et la dissipation de lherbicide par mthodes
chromatographiques.
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

131

A ce stade, quelle quait t la souche tudie, laugmentation de la biomasse a t trs limite
(faible vitesse de croissance), la dgradation de la substance active na t que peu
significative, le pourcentage de dgradation (calcul par rapport la teneur initiale)
nexcdant pas 10 4 % pour la souche la plus active. A la lumire de ces premiers rsultats,
il est possible de considrer que le nombre de cycles de cultures avec pression de slection de
lherbicide, volontairement limit cinq pour des raisons pratiques, ait t insuffisant.

Afin de mieux caractriser visuellement la croissance des colonies, nous avons ensuite
ensemenc des aliquotes des milieux de culture prcdents sur milieu glos (MS)
supplment en sulcotrione, au niveau duquel la croissance est gnralement plus nette.
Chacune des huit souches a plus ou moins pouss sur ce milieu solide (dilutions dcimales
10
0
et 10
-1
aprs talement au rteau et striage direct sur glose), semblant montrer, ce stade,
une aptitude des diverses souches bactriennes mtaboliser la sulcotrione avec plus ou
moins defficacit. Cependant, lagar peut, dans certains cas, reprsenter une source parasite
de carbone du fait de ses impurets ventuelles et gnrer des biais exprimentaux. La figure
IV-2-1 reprsente des exemples de colonies cultives dans ces conditions. La suite de notre
travail a donc consist mesurer la capacit de dgradation des isolats aprs ensemencement
dans des cultures liquides (MS) supplmentes en sulcotrione.

Nous avons donc prfr, ce stade, utiliser, sur les huit souches isoles, la technique de
batch (cf figure III-2-4), mthodologie qui nous a permis daugmenter, par concentration
pralable, la biomasse microbienne en phase exponentielle de croissance, au sein du milieu
liquide (MS) et, de faon concomitante, limpact sur la dgradation de la substance active et
lapparition de mtabolites. Afin dobtenir une biomasse importante sans pour autant perdre la
capacit dgradante vis--vis de lherbicide, chaque souche a t cultive pendant 15 heures
en milieu riche (bouillon TS supplment en sulcotrione) puis re-ensemence par dilution en
milieu liquide (MS + sulcotrione) de faon obtenir une absorbance voisine de 0,300 600
nanomtres.
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

132




















Figure IV-2-1 : Colonies isoles sur milieu minimum (MS) supplment en sulcotrione
comme seule source de carbone et/ou dnergie aprs croissance 24C lobscurit.

Parmi les huit souches testes, seule la souche dapparence opaque, dnomme 1OP, a
prsent une croissance notable visualise par le suivi de labsorbance. Sa cintique a prsent
deux phases : une phase de latence denviron six jours et une phase de croissance continue
atteignant une absorbance de 0,700, trente jours aprs lensemencement. Aucune
augmentation de labsorbance, donc de la biomasse microbienne, na t observe au bout des
trente jours pour les 7 autres souches, incubes dans les mmes conditions.
La figure IV-2-2 prsente le suivi de labsorbance pour la souche 1OP (dans le milieu MS
supplment en sulcotrione) vs la souche 1TRANS, choisie comme contrle ngatif de
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

133
croissance parmi les 7 souches nayant pas prsent de croissance suffisamment significative
lors de nos essais pour tre retenues comme souches potentiel de dgradation intressant.


Figure IV-2-2 : Suivi de la croissance des souches 1OP vs 1TRANS dans le milieu de culture
(MS) supplment en sulcotrione par mesure de labsorbance 600 nm.



Paralllement, une exprimentation comparable (contrles) mais mene en milieu liquide
(MS) non supplment en sulcotrione, partir de ces deux mmes souches 1OP et 1TRANS,
na montr aucune augmentation de labsorbance, donc de la biomasse, lissue des 30 jours
de culture (cf figure IV-2-3).

!"
!#$"
!#%"
!#&"
!#'"
!#("
!#)"
!#*"
!#+"
!" (" $!" $(" %!" %(" &!"
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

(
6
0
0

n
m
)

Temps d'incubation (jours)
Souche 1OP Souche 1TRANS
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

134

Figure IV-2-3 : Suivi de la croissance des souches 1OP vs 1TRANS dans le milieu de culture
(MS) non supplment en sulcotrione par mesure de labsorbance 600 nm.


Ces rsultats nous permettent de faire les remarques suivantes :

- Le milieu (MS) ne contient donc pas, a priori, de source nutritive carbone assimilable par
ces deux souches.
- Les souches 1OP et 1TRANS ne prsentent pas un caractre de croissance de type
autotrophe chimiolithotrophe.
- La sulcotrione semble constituer la seule source de carbone et/ou dnergie du milieu (MS)
supplment pour la souche 1OP.

3- Etude du potentiel de dgradation des isolats dgradants : suivi


de la dissipation de la sulcotrione dans le milieu de culture (MS)


Laugmentation significative de la biomasse pour la souche 1OP constitue un lment
important permettant de prjuger de son rle biodgradant vis--vis de la sulcotrione.
!"
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!#%"
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!#)"
!#*"
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!" (" $!" $(" %!" %(" &!"
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

(
6
0
0

n
m
)

Temps d'incubation (jours)
Souche 1OP Souche 1TRANS
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

135
Nanmoins, il tait indispensable de confirmer la probable mtabolisation de lherbicide par
(i) le suivi de la concentration de la sulcotrione dans le milieu de culture (MS) supplment au
cours de ces 30 jours dincubation ; (ii) la mise en vidence de lapparition concomitante de
mtabolites de lherbicide.

Dans ce but, les mthodes chromatographiques (CLHP/UV), dcrites au chapitre III-1, ont t
largement utilises, aprs extraction daliquotes de milieu de culture par solvant organique.

La dissipation de lherbicide a t trs nettement mise en vidence dans le milieu (MS
supplment) conscutivement son ensemencement avec la souche 1OP :
- Une phase de latence dune dure denviron 6 jours a t observe avant le dbut de la
dissipation effective de la sulcotrione. Ce rsultat est en accord avec la phase de latence
observe, dans les mmes conditions, lors du suivi de la croissance de la biomasse par mesure
de labsorbance (cf figureIV-2-2). Ce dlai peut sexpliquer par le temps ncessaire pour
induire lexpression des gnes dans le gnome de la souche 1OP et la synthse des enzymes
cataboliques impliques dans la transformation de lherbicide.
- A partir du 6
ime
jour dincubation, la cintique de dissipation de la sulcotrione peut
raisonnablement tre dcrite par une loi de premier-ordre :

Ln C = - 0,081 t + Ln 121

avec r = 0,993 (n=3) et C reprsentant la concentration de lherbicide en moles.L
-1
.

Le temps de demi-vie (t
1/2
) a pu tre estim environ 15 jours aprs le dbut de lincubation.
Dans ces conditions, le pourcentage de dgradation, li lactivit mtabolique de la souche
1OP, a t estim 88 % au bout de 27 jours.

Lors de cette tude, deux contrles ont t utiliss : un contrle avec la souche 1TRANS
ensemence et incube dans les mmes conditions, et un deuxime contrle men sur le
milieu (MS) supplment mais non ensemenc. Lensemble de ces rsultats est prsent dans
la figure IV-2-4.
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

136



Figure IV-2-4 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione en fonction du temps dans le milieu
de culture (MS) supplment : ensemenc par 1OP ; ensemenc par 1TRANS ; non
ensemenc.

Au cours de lincubation des 2 lots contrles , aucune dissipation significative de la
sulcotrione na t observe. Les quations relatives la dgradation nont pas t tablies.
Labsence dvolution du contrle non ensemenc comparativement la souche 1OP
permet daffirmer que la part de dgradation par voie chimique (hydrolyse principalement, les
incubations ayant t ralises lobscurit) apparat ngligeable par rapport au processus
biologique.
Par ailleurs, ces rsultats confirment une des donnes obtenues par spectrophotomtrie visible
lors du suivi de la croissance bactrienne 600 nm: le profil cintique de la souche 1TRANS
tant similaire celui du contrle non ensemenc, cette souche ne prsente donc pas
daptitude mtaboliser la substance active.
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

137
La capacit de la souche 1OP utiliser la sulcotrione (88 % de dgradation), lorsque ce
compos constitue la seule source de carbone et/ou dnergie du milieu, est donc confirme,
rsultat corrobor par laugmentation importante de la biomasse dj dcrite (absorbance
variant de 0,300 0,700 au bout de 30 jours).

4- Recherche de mtabolites de la sulcotrione dans le milieu de


culture (MS)

La recherche de lapparition concomitante des mtabolites principaux : lacide 2-


chloro-4 mthyl sulfonyl benzoque (CMBA) et la 1,3-cyclohexane dione (CHD) a t
entreprise pour confirmer la mtabolisation et acqurir, si possible, des informations relatives
aux voies mtaboliques empruntes.
Ces deux mtabolites ont t recherchs tout au long du processus dincubation par mthode
de chromatographie liquide avec dtection UV ( = 265 nm). Les chromatogrammes
correspondants sont joints en annexe 2. La prsence de CMBA a t formellement confirme
pour lisolat 1OP vs 1TRANS par CPG/SM (annexe 3) aprs mthylation de la fonction
carboxylique. Lacquisition rcente dun couplage CLHP/SM nous a permis de confirmer les
rsultats concernant la CHD.

Les rsultats sont prsents dans le tableau IV-2-1 et repris dans la figure IV-2-5 qui montre
clairement que le CMBA commence se former dans le milieu de culture (MS) supplment
et ensemenc par la souche 1OP ds la fin de la phase de latence pralable la dissipation
effective de la sulcotrione. Cette augmentation est constante entre 6 et 27 jours, le rapport
molarit en CMBA / molarit initiale en sulcotrione atteignant 44 % lissue de ltude.
Le bilan molaire (teneur en sulcotrione non mtabolise + teneur CMBA form x 100 / teneur
initiale en sulcotrione) fait tat dune diminution sensible entre le 15
ime
et le 27
ime
jour
dincubation. A ce stade, nous ne pouvons quavancer lhypothse dune possible dgradation
du CMBA lui-mme par la souche 1OP, conscutivement lappauvrissement en sulcotrione
du milieu.
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

138

Figure IV-2-5 : Suivi de laccumulation de lacide 2-chloro-4 methylsulfonyl benzoque
(CMBA) et de la dissipation de la sulcotrione en fonction du temps dans le milieu de culture
(MS) supplment et ensemenc par la souche 1OP.


La 1,3-cyclohexanedione (CHD), identifie au cours du travail de H.Chaabane dans le sol de
Perpignan des concentrations trs faibles, na jamais t dtecte par CLHP/UV (< l.d. : 0, 5
mg.L
-1
) dans les milieux de culture (MS) ensemencs par 1OP ou 1TRANS. Ce rsultat
ngatif concernant la 1,3-cyclohexanedione a t confirm par SM et SM-SM (CLHP et
mthode infusion ).
Lattaque de la partie cyclohexanedione de la molcule de sulcotrione et son utilisation
comme source de carbone et/ou dnergie par la souche dgradante 1OP semblent donc
probables. A ce stade de nos travaux, et en se rfrant des donnes de la littrature sur des
tudes cibles relatives au mtabolisme de diverses di- et tri-ctones, plusieurs hypothses ont
pu tre envisages, concernant la voie mtabolique emprunte ; nous en avons retenu trois,
sans exclure cependant dautres possibilits :

!"
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(

M
)

Temps d'incubation (jours)
Concentration sulcotrione 1OP Concentration CMBA 1OP
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

139
- (a) une coupure hydrolytique au niveau du carbonyle en entrainant la formation exclusive
de la CHD et du CMBA, suivie dune attaque plus ou moins rapide de la CHD par des
systmes enzymatiques adapts (hydrolases ?). Dans notre cas, cette hypothse semble
cependant peu probable du fait de la non-dtection de la 1,3-cyclohexanedione dans les
prlvements effectus partir de ce milieu de culture, quel que soit le stade dincubation.

- (b) le clivage de la molcule de sulcotrione par ouverture du noyau 1,3-cyclohexanedione,
aboutissant un premier mtabolite driv de lacide heptanoque : lacide 5,7-dicto-7-(2-
chloro-4-mthylsulfonylphnyl) heptanoque, dj dcrit dans certains sols par Rouchaud et
al. (1998a). Ce compos subit ensuite un clivage hydrolytique enzymatique aboutissant un
compos aliphatique en C
5
(acide glutarique) mtabolisable via le cycle des acides
tricarboxyliques (TCA) et un driv de lactophnone (1-actyl-2-chloro-4-mthylsulfonyl-
benzne) se transformant rapidement en CMBA. Le driv heptanoque na jamais t
retrouv au cours de notre tude.

- (c) le clivage de la sulcotrione par un mcanisme oxydatif, dj dcrit pour certaines
dictones par Dangel et al. (1989) et par Grogan (2002, 2005), catalys par des systmes
enzymatiques de type catchol-dioxygnases et aboutissant une coupure de la liaison C-C au
niveau de la -dictone et la formation dun compos aliphatique empruntant galement la
voie mtabolique des TCA. Plusieurs auteurs (Rouchaud et al., 1996 ; Lin et al., 2000 ;
Huang et al., 2002 ; Wu et al., 2002 ; Szczecinski et al., 2008) ont dcrit lexistence dun
grand nombre de formes tautomres cto-noliques dans la famille des benzoylcyclohexane-
1,3-diones. Lexistence de formes tautomres de la partie 1,3 cyclohexanedione de la
sulcotrione, prsentant une relative analogie structurale avec certains drivs catcholiques,
soit directement, soit aprs intervention pralable sur le carbone 3 dune monooxygnase
flavinique de type hydroxylase large spcificit, pourrait expliquer, via lintervention de la
catchol 2,3-dioxygnase, une attaque enzymatique cible de la substance active par la souche
1OP. Une des caractristiques essentielles de ce type denzyme est davoir une spcificit de
substrat gnralement plus large que les catchol 1,2-dioxygnases (Hirose et al., 1994). Le
fer ltat rduit (Fe
2+
) permet linteraction directe de loxygne diatomique avec le mtal
(Kita et al., 1998). Au cours de la catalyse enzymatique lors de linteraction avec le site actif
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

140
de lenzyme, le substrat na pas forcment besoin de subir un changement dorientation aussi
important et aussi prcis que dans le cas dune catchol 1,2-dioxygnase (Arciero et
Lipscomb, 1986). Cette moins grande spcificit de substrat pourrait ventuellement
expliquer lattaque de la partie 1,3-cyclohexanedione sous une des ses formes cto-noliques.
A ce stade, il nous a sembl intressant de rappeler que laction herbicide de la sulcotrione
(Pallett et al., 2001 ; Dayan et al., 2007) sexerce par inhibition comptitive de la 4-
hydroxyphnylpyruvate dioxygnase (HPPD, EC 1.13.11.27, EC 1.14.2.2), ce qui permet
denvisager dautres interactions possibles dioxygnase - sulcotrione.

Jours
Concentration en
sulcotrione
mg.L
-1

(M)

Concentration
en CMBA
mg.L
-1

(M)
Concentration
en CHD
mg.L
-1

(M)
Rapport molarit
CMBA/sulcotrione
initiale
(%)
Bilan
molaire
(%)
0 36 3
(110 10)

ND (< 0,5) ND (< 0,5)
- -
6 37 3
(114 13)

ND (< 0,5) ND (< 0,5)
- -
15 21 2
(65 7)

6 0,5
(25 2)
ND (< 0,5)
22 82
27 5 1
(16 3)

12 1
(48 3)
ND (< 0,5)
44 59

Tableau IV-2-1 : Evolution des concentrations en substance active et mtabolites dans le
milieu de culture (MS) supplment en sulcotrione et ensemenc par lisolat bactrien 1OP
(ND : non dtect).


A titre comparatif, dans le cas de la msotrione, Durand et al. (2006b et 2010) et Batisson et
al. (2009) ont propos un mcanisme de dgradation apparent par clivage oxydatif de la
partie 1,3-cyclohexanedione catalys par le genre Bacillus, via deux voies diffrencies : une
voie mtabolique majeure, dans laquelle lherbicide est dabord attaqu par une nitrorductase
au niveau du radical nitro en position 4 du noyau aromatique, donnant un driv
Quatrime partie Chapitre 2 : Isolement de souches bactriennes potentiellement
dgradantes de la sulcotrione

141
hydroxylamine intermdiaire, puis subit un clivage oxydatif de la partie 1,3-cyclohexanedione
pour donner lacide glutarique et lacide 2-amino-4-mthylsulfonylbenzoque (AMBA). Dans
le cas de la voie mtabolique mineure, le clivage oxydatif de la 1,3-cyclohexanedione semble
tre la seule attaque enzymatique permettant de cliver la msotrione en acide glutarique et en
acide 4-mthylsulfonyl-2-nitrobenzoque (MNBA) donnant presque directement lAMBA
aprs rduction du MNBA.
La connaissance prcise du mcanisme de mtabolisation de la sulcotrione par la souche 1OP
ncessiterait, notre avis, une tude spcifique beaucoup plus approfondie.

A ce stade de notre tude, parmi les huit souches rsistantes la sulcotrione isoles sur milieu
(NS supplment) et purifies, seule lune dentre elles (isolat 1OP) a montr une forte
aptitude mtaboliser la sulcotrione en lutilisant comme source de carbone et /ou dnergie
sur milieu (MS), avec une vitesse de dgradation leve (temps de vie de 15 jours et
pourcentage de dgradation voisin de 88 %). Nanmoins, ce potentiel biodgradant na pu
tre caractris qu la suite dune tape de concentration de la biomasse microbienne (batch
culture), ce qui permet dvoquer la notion de seuil de population microbienne, ncessaire
lobservation du processus mtabolique.
La suite de ce travail a donc consist : i) identifier, dun point de vue phylogntique, cette
souche bactrienne efficace en lopposant la souche 1TRANS, choisie parmi les sept
souches faible activit biodgradante et ii) caractriser dun point de vue fonctionnel ces
deux isolats par lutilisation de cibles molculaires adaptes.



Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

142
Chapitre3Caractrisationphylogntiquedesisolats1OP
et1TRANS

1- Vrification de la qualit de lADN matrice



Aprs extraction et purification de lADN gnomique des isolats, nous avons effectu
une quantification et une valuation de la qualit des chantillons par dosage au
spectrophotomtre 260 et 280 nm. La qualit des ADN obtenus pour les souches 1OP et
1TRANS sest avre satisfaisante au regard des rapports dabsorbance (rapports A260/A280
et A260/A230 proches de 1,80 pour les deux isolats). Les rsultats sont prsents dans le
tableau IV-3-1.



SOUCHE 1OP
ADN gnomique
SOUCHE 1TRANS
ADN gnomique
Concentration (ng.L
-1
)

486 51

371 56
A260/A280

2,09 0,01

2,06 0,01
A260/A230

1,88 0,19

1,70 0,23

Tableau IV-3-1 : Quantification et valuation de la qualit de lADN gnomique des isolats
bactriens 1OP et 1TRANS.


2- Analyse du polymorphisme de squence des ADNr 16S amplifis
(ARDRA) des isolats

Les empreintes molculaires ont t obtenues aprs utilisation des deux enzymes de
restriction Alu I et Hae III, largement utilises pour la caractrisation de communauts
bactriennes et/ou disolats bactriens issus de nombreux groupes (Pukall et al., 1998). Les
souches bactriennes 1OP et 1 TRANS ont montr des empreintes identiques aprs digestion
par Alu I, composes de quatre bandes majoritaires denviron 70, 210, 380 et 550 paires de
bases. Dans le cas de la digestion avec Hae III, les profils ARDRA ont t galement
Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

143
identiques pour les deux isolats, mettant en vidence cinq bandes majoritaires denviron 30,
120, 180, 210 et 300 paires de bases. Les rsultats obtenus sont prsents dans les figures IV-
3-1 et IV-3-2.

















Figure IV-3-1 : Empreintes ARDRA des isolats 1OP et 1TRANS gnres aprs digestion
des ADNr 16S par Alu I et migration sur gel dagarose (1%). La taille des fragments est
indique en paires de bases (pb).



















Figure IV-3-2 : Empreintes ARDRA des isolats 1OP et 1TRANS gnres aprs digestion
des ADNr 16S par Hae III et migration sur gel dagarose (1%). La taille des fragments est
indique en paires de bases (pb).
Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

144
Les profils de restriction obtenus aprs digestion des ADNr 16S des deux isolats 1OP et
1TRANS sont donc apparus identiques, et cela, quelle que soit lendonuclase utilise. En
outre, lutilisation simultane des deux enzymes de restriction Hae III et Alu I a galement
gnr des profils ARDRA identiques pour les deux isolats.
A ce stade, il nous a donc t impossible de diffrencier taxonomiquement les deux souches
bactriennes par lutilisation de cette mthode molculaire, lanalyse du polymorphisme de
longueur des squences de lADNr 16S de lopron ribosomique bactrien nayant pas rvl
de diffrence entre 1OP et 1TRANS. Pourtant, cette technique de caractrisation molculaire
a largement t dcrite dans la littrature comme suffisamment fiable, robuste et
particulirement adapte comme outil dapproche taxonomique globale des microorganismes
cultivables et non-cultivables (Vaneechoutte et al., 1992 ; Martinez-Murcia et al., 1995). De
plus lARDRA permet gnralement la discrimination de populations microbiennes jusquau
niveau du genre bactrien (Martin-Laurent et al., 2001).

A ce stade de notre travail, les rsultats de lARDRA semblent donc indiquer que les deux
isolats 1OP et 1TRANS appartiennent donc au mme genre bactrien. Afin damliorer la
discrimination taxonomique des deux isolats, nous avons souhait utiliser une mthodologie
diffrente et plus rsolutive que lARDRA, la REP-PCR.



3- Analyse des isolats bactriens par amplification des squences
rptitives (REP-PCR)


Lutilisation de la REP-PCR comme mthode dtude taxonomique complmentaire a
t retenue pour deux raisons majeures : (i) cette mthode permet gnralement de
diffrencier des souches bactriennes appartenant des groupes phylogntiquement trs
proches (Versalovic et al., 1991 ; Schneider et de Bruijn, 1996 ), (ii) elle permet de raliser
une analyse de la diversit gntique plus fine que la technique de lARDRA, pouvant dans
certain cas discriminer des souches microbiennes jusquau niveau de lespce (Frey et al.,
1996). Les profils REP-PCR des isolats 1OP et 1TRANS sont prsents figure IV-3-3.


Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

145















Figure IV-3-3 : Profils REP-PCR des isolats 1OP et 1TRANS.
Puits 1, 2, 5 et 6: REP PCR ralise avec 1 ng.L
-1
dADN

matrice. Puits 3, 4, 7 et 8: REP
PCR ralise avec 2 ng.L
-1
dADN matrice.

A lissue de cette tape, les profils REP-PCR respectifs des isolats 1OP et 1TRANS se sont
avrs similaires, confirmant ainsi les premiers rsultats obtenus par lARDRA. De plus, cinq
bandes majoritaires denviron 550, 400, 270, 150 et 100 paires de bases ont t retrouves
pour les deux isolats 1OP et 1TRANS.
Ces rsultats suggrent donc que les deux souches 1OP et 1TRANS appartiennent trs
probablement la mme espce bactrienne.

4- Squenage de lADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS


Lamplification, partir de lADN gnomique, dune portion importante de lADNr 16S des
isolats 1OP et 1TRANS laide des amorces universelles 27f et 1492r (Gurtler et Stanisich,
1996), a gnr des amplicons de bonne qualit, de taille comprise entre 1000 et 1650 paires
de bases pour les deux souches bactriennes. Les rsultats sont illustrs dans la figure IV-3-4
et le tableau IV-3-2.


Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

146
















Figure IV-3-4 : Migration sur gel dagarose (1%) des ADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS
aprs amplification PCR laide des amorces universelles 27f et 1492r.





SOUCHE 1OP
ADNr 16S

SOUCHE 1TRANS
ADNr 16S
Concentration (ng.L
-1
)

32,2 1,2

40,0 2,9
A260/A280

1,84 0,03

1,92 0,03
A260/A230

1,76 0,06

1,79 0,13

Tableau IV-3-2 : Quantification et valuation de la qualit des ADNr 16S des isolats
bactriens 1OP et 1TRANS, obtenus aprs amplification PCR et purification.

Deux ractions damplification PCR sur colonies (lune pour les clones provenant de 1OP,
lautre pour les clones provenant de 1TRANS), laide des amorces T7 et SP6 et partir de
20 colonies blanches bien distinctes, obtenues aprs transformation des souches Escherichia
coli DH5

(Invitrogen) ultra-comptentes, (1OP ou 1TRANS), ont t effectues afin de ne
pas slectionner de faux positifs avant le squenage. Cela a permis de confirmer, de facto,
que les clones retenus pour le squenage (couleur blanche des colonies) prsentent bien le
Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

147
vecteur de clonage contenant comme insert dintrt les ADNr 16S des isolats bactriens
respectifs. La figure IV-3-5 prsente une photographie des deux banques de clones dADNr
16S-PCR-colonies positives utilises pour le squenage.



















Figure IV-3-5 : Mise en culture des colonies recombinantes (colonies blanches T7-SP6-PCR
positives) pour la prparation de lADN plasmidique (MiniPreps) destin au squenage,
partir des banques de clones dADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS (milieu glos LB +
Ampicilline).


Nous avons obtenu 15 colonies blanches positives prsentant linsert dintrt partir de la
banque dADNr 16S 1TRANS (les clones 5, 6, 11, 13 et 20 nayant pas t retenus) et 12
colonies positives en ce qui concerne la banque 1OP (les clones 27, 31, 32, 33, 36, 37, 38 et
39 nayant pas t retenus). Les figures IV-3-6 (a) et (b) prsentent le rsultat des deux
ractions damplification PCR sur colonies aprs migration sur gel dagarose 1%.

Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

148

Figure IV-3-6 (a) : Migration sur gel dagarose (1% ) des amplicons aprs amplification PCR
partir des colonies blanches issues de la banque dADNr 16S de la souche 1OP.


Figure IV-3-6 (b) : Migration sur gel dagarose (1% ) des amplicons aprs amplification PCR
partir des colonies blanches issues de la banque dADNr 16S de la souche 1TRANS.


Nous avons ralis un squenage systmatique de 12 clones positifs extraits des banques
pour chaque isolat. Pour chaque squence dADNr 16S, un squenage a t effectu dans les
Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

149
sens 53 et 35 laide des amorces T7 ou SP6, afin de disposer dun nombre suffisant
de donnes pour mener bien notre analyse phylogntique.
A lissue du squenage denviron 1500 pb, soit la quasi-totalit de lADNr 16S de chaque
isolat, nous avons obtenu 24 squences de trs bonne qualit pour chaque isolat, douze dans
chacun des sens 53 et 35.
Le traitement des squences provenant de 1OP et de 1TRANS par le logiciel SeqManNGen


(DNASTAR, USA) a permis dobtenir une squence consensus dADNr 16S reprsentative
de chaque souche. Lalignement des deux squences consensus a rvl une identit de
squence voisine de 100 %. Le rsultat de lalignement est prsent figure IV-3-7.
Les squences ont t dposes dans la base de donnes GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)sous les numros daccession JF303892 et JF303891
pour 1OP et 1TRANS respectivement.

A la lumire de ces rsultats, nous pouvons donc conclure que les isolats 1OP et 1TRANS
sont deux souches appartenant la mme espce bactrienne. Ce rsultat est donc totalement
en accord avec les donnes obtenues lors de la caractrisation taxonomique, initie par
lanalyse du polymorphisme de lADNr 16S (ARDRA), puis par REP PCR, ces deux
techniques nayant pas rvl de diffrence significative entre les deux isolats.


BIODE 1 AGAGTTTGATCMTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGC 60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 1 AGAGTTTGATCMTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGC 60

BIODE 61 GGATGAYRGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCT 120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 61 GGATGAYRGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCT 120

BIODE 121 GCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGA 180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 121 GCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGA 180

BIODE 181 GAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTT 240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 181 GAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTT 240

BIODE 241 GGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCA 300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 241 GGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCA 300

BIODE 301 CACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACA 360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 301 CACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACA 360

BIODE 361 ATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAG 420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 361 ATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAG 420

Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

150
BIODE 421 CACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCGAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACA 480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 421 CACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCGAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACA 480

BIODE 481 GAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTA 540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 481 GAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTA 540

BIODE 541 ATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCC 600
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 541 ATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCC 600

BIODE 601 CGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTG 660
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 601 CGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTG 660

BIODE 661 GAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG 720
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 661 GAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG 720

BIODE 721 ACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT 780
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 721 ACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT 780

BIODE 781 ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGGTTTTAG 840
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||
N-BIO 781 ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGRTTTTAG 840

BIODE 841 TGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCA 900
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 841 TGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCA 900

BIODE 901 AATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG 960
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 901 AATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG 960

BIODE 961 AAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGG 1020
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 961 AAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGG 1020

BIODE 1021 GAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA 1080
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 1021 GAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA 1080

BIODE 1081 GTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAA 1140
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 1081 GTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAA 1140

BIODE 1141 GGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTT 1200
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 1141 GGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTT 1200

BIODE 1201 ACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGT 1260
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 1201 ACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGT 1260

BIODE 1261 GGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGA 1320
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 1261 GGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGA 1320

BIODE 1321 AGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG 1380
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 1321 AGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG 1380

BIODE 1381 TACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTC 1440
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
N-BIO 1381 TACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTC 1440

BIODE 1441 GGGGGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAWCCGT 1500
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||
N-BIO 1441 GGGGGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTADCCGT 1500

Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

151
BIODE 1501 A 1501
|
N-BIO 1501 A 1501


Figure IV-3-7 : Alignement des squences consensus des ADNr 16S des isolats 1OP et
1TRANS. BIODE : souche 1OP ; N-BIO : souche 1TRANS.


La comparaison des deux squences consensus dADNr 16S avec les squences disponibles
dans la base de donnes GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) nous a permis de
conclure que les isolats 1OP et 1TRANS prsentaient un haut niveau dhomologie (99 %)
avec le genre Pseudomonas de la classe des Protobactries.
Nous avons donc construit larbre phylogntique partir dalignements multiples des
squences de lADNr 16S de nos deux isolats et des squences dEubactries prsentes dans
GenBank, correspondant aux souches bactriennes suivantes: Arthrobacter creatinolyticus
F75208 (HQ908759), Arthrobacter nicotianae HMF5 (GU220490), Streptomyces sp. SNI5
(GU320191), Rhizobium leguminosarum V-6 (GU306144), Agrobacterium tumefaciens
YQH34 (HQ143653), Methylopila sp. JZL-4 (FJ502233), Burkholderia cepacia RFW-8
(HQ650586), Comamonas testosteroni H18 (EU887829), Acidovorax sp. p4(HQ652596),
Pseudomonas putida A (HQ697262), Pseudomonas putida T2g (AB539810), Pseudomonas
aeruginosa P28 (HQ697285), Pseudomonas fluorescens C7R12 (AM229082), Pseudomonas
fluorescens (HQ880245), Pseudomonas sp. ADP (AM088478).
Lanalyse phylogntique nous a rvl que nos deux isolats 1OP et 1TRANS sont deux
souches bactriennes appartenant lespce Pseudomonas putida.
Nous avons donc propos de nommer nos deux isolats Pseudomonas sp. 1OP et Pseudomonas
sp. 1TRANS. Ces deux souches ont donc t classes comme Bacteries, phylum des
Proteobacteries, classe des protobactries, ordre des Pseudomonadales, famille
Pseudomonaceae, genre Pseudomonas.
Lobservation macroscopique des isolats sur milieu glos nous a permis de mettre en
vidence que les deux souches prsentaient des colonies de type S (smooth), cest--dire
surface lisse et bords rguliers, bombes, de couleur blanche (lgrement plus opaque pour
lisolat 1OP), de consistance plutt crmeuse, de taille rduite et donnant des suspensions
homognes.
Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

152
Lobservation microscopique de Pseudomonas sp. 1OP et Pseudomonas sp. 1TRANS a mis
en vidence des bactries de type Gram
-
et non sporulantes. En milieu liquide, la lecture de
ltat frais nous a permis dobserver des cellules mobilit importante de type polaire. Quel
que soit lisolat observ, il sagit de bacilles simples, de petite taille et de forme plutt
allonge.
Lobservation du critre biochimique par le test catalase a rvl un phnotype catalase
+
pour
les deux isolats, cela tant en accord avec les donnes de la littrature concernant le
mtabolisme de type arobie de Pseudomonas sp.
Larbre phylogntique obtenu en utilisant la mthode du Neighbor-Joining est prsent
figure IV-3-8. La robustesse de larbre a t vrifie par analyse par bootstraps. Les valeurs
suprieures 90 % sont reprsentes par les cercles noirs sur la figure. La distance
phylogntique est indique sur la barre d'chelle.


Page suivante, figure IV-3-8 : Analyse phylogntique des ADNr 16S des isolats
Pseudomonas sp. 1TRANS (NBD) et Pseudomonas sp. 1OP (BD). Les numros daccession
GenBank des squences dADNr16S utilises pour lanalyse sont indiqus entre parenthse
dans la lgende.



153

Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

154
5- Conclusion

Les rsultats du squenage nous permettent donc de dgager trois grandes rflexions:

(i) Nous avons pu identifier de faon formelle les deux souches bactriennes retenues lissue
de ltude de biodgradation de la sulcotrione comme tant affilies au genre Pseudomonas ;

(ii) les deux isolats obtenus lors de lapproche cultivable appartiennent au phylum des
Proteobacteria, un des quatre phyla dominants les plus frquemment retrouvs dans les
banques dADNr 16S isols partir dchantillons environnementaux (Dunbar et al., 1999 et
2002 ; Mc Garvey et al., 2004 ; Schloss et al., 2004 ; Acinas et al., 2005 ; Janssen, 2006 ;
Herrera et al., 2007),

(iii) Ce phylum appartient galement au groupe des big four (Proteobacteria, Firmicutes,
Actinobacteria et Bacteroidete), dcrit par Hugenholtz (2002) comme majoritaire dans les
collections de souches cultivables provenant dchantillons environementaux (cf paragraphe
I-2-1);

(iiii) lisolement des deux souches bactriennes Pseudomonas sp. 1OP et Pseudomonas sp.
1TRANS, appartenant la mme espce mais prsentant des phnotypes dgradants
diffrents, met en exergue le caractre versatile de cette capacit de biodgradation vis--vis
de la sulcotrione.

En ce qui concerne le phnotype dgradant de lisolat Pseudomonas sp. 1OP, nos
rsultats sont en accord avec les donnes de la littrature, propos de la capacit du Genre
Pseudomonas dgrader un nombre important de xnobiotiques prsents dans
lenvironnement, et notamment dans les sols. Diverses souches appartenant ce genre
bactrien ont en effet t dcrites comme capables de dgrader un certain nombre de produits
phytosanitaires issus de diffrentes familles. Cest notamment le cas de la souche
Pseudomonas sp. ADP, isole partir d'un site de stockage d'herbicides par Mandelbaum et
Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

155
al. (1995), capable de mtaboliser l'atrazine des concentrations trs leves (80 % environ
de minralisation des concentrations > 1000 ppm).
Daugherty et Karel (1994) ont eux aussi isol une souche de Pseudomonas cepacia DBO1
utilisant lacide 2,4-dichlorophnoxyactique comme source de carbone et/ou dnergie.
Kamanavalli et Ninnekar (2000) ont galement isol du sol, par enrichissements successifs,
un Pseudomonas sp. dgradant le propoxur (2-isopropoxyphnyl-N-mthylcarbamate). Cette
souche a t capable de se dvelopper en utilisant ce compos comme seule source de carbone
et d'azote, partir de concentrations relativement leves du produit phytosanitaire (2 g.L
-1
) et
accumulant au cours du temps, le 2-isopropoxyphenol comme mtabolite principal dans le
milieu de culture. Bajaj et al. (2010) ont galement caractris un Pseudomonas sp. IITR01
capable de mtaboliser l-endosulfan et lendosulfan-sulfate. Fan et al. (2010) ont isol puis
identifi par squenage de lADNr 16S, un Pseudomonas sp. capable de dgrader un
fongicide, le carbendazime, avec un taux de dgradation voisin de 90 % au bout de 3 jours.
Ces auteurs ont propos une voie de biodgradation dans laquelle le carbendazime est d'abord
converti en 2-aminobenzimidazole, puis transform en 2-hydroxybenzimidazole, en 1,2-
diamino, en catchol, et finalement en dioxyde de carbone.

A notre connaissance, il nexistait pas dans la littrature de donnes relatives la dgradation
de la sulcotrione catalyse par des microorganismes isols.

Dans le cas dautres herbicides appartenant la famille des trictones, Durand et al. (2006a,
2006b et 2010) ont pu isoler, partir deau de nuage, une souche bactrienne affilie au genre
Bacillus, capable de dgrader la msotrione en moins de 10 heures de culture et cela, pour une
large gamme de concentration en substance active (0,1 5 mmol.L
-1
). Ces auteurs ont
galement pu mettre en vidence lapparition de plusieurs mtabolites diffrents au cours de
la priode dincubation et proposer deux voies mtaboliques possibles. De mme, Batisson et
al. (2009) ont isol du sol une autre souche, galement affilie au genre Bacillus (isolat
Mes11), utilisant la msotrione comme source de carbone et/ou dnergie et dgradant
totalement la substance active en moins de 24 heures pour une concentration de 1 mmol.L
-1
.
Trois mtabolites dj identifis par Durand et al. (2006a, 2006b et 2010) ont t retrouvs
dans le milieu de culture. Dans ce cas, il est intressant de noter que les auteurs ont montr
que la souche tellurique Bacillus sp. Mes11 tait incapable de dgrader la sulcotrione.
Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

156

En conclusion, puisque les deux isolats 1OP et 1TRANS prsentent deux phnotypes distincts
vis--vis du caractre dgradant mais sont deux souches appartenant la mme espce, ce
rsultat nous amne proposer deux hypothses pouvant probablement expliquer cette
diffrence phnotypique:

(i) la prsence dvnements mutationnels pliotropes chez les isolats sulcotrione-rsistants,
selon un modle alatoire (Lederberg J. et E., 1952) ou non alatoire, aurait slectionn,
uniquement chez lisolat 1OP, des cellules bactriennes aptes se dvelopper sur milieu
slectif (MS) aprs cinq cycles de cultures liquides rptes avec pression de slection de
lherbicide (C
1
C
5
);

(ii) lintervention dlments gntiques mobiles (MGE), prsents dans le gnome de lisolat
1OP et ayant t activs conscutivement aux conditions de cultures rptes, serait
responsable de lapparition du phnotype dgradant.

La premire hypothse nous semble la moins probable, pour plusieurs raisons : en premier
lieu, la probabilit dapparition de mutation est un phnomne rare (taux de mutation moyen
est de l'ordre de 10
-6
10
-7
, le temps de gnration constituant gnralement lunit de temps
retenue), n'affectant gnralement qu'un faible pourcentage de cellules au sein d'une
population abondante. Dans le cas de nos cultures rptes (C1C5), il semblerait que le
nombre de cycles soit insuffisant et le temps de gnration trop long pour gnrer lapparition
de phnotypes dgradants.

Nous prfrons privilgier la deuxime hypothse : en effet, l'implication des lments
gntiques mobiles (MGE) tels que les bactriophages, plasmides, et transposons dans ces
processus cataboliques adaptatifs a t largement dcrite dans la littrature comme des acteurs
fondamentaux du transfert gntique horizontal dans la matrice sol (Sikorski et al., 2002 ;
Thomas et Nielsen, 2005). Ces structures gntiques sont des lments cls pour le transfert
de gnes entre bactries (Wilkins, 1995 ; Davison, 1999 ; Nielsen et al., 2000 ; Jain et al.,
2002), contribuent directement leur volution, et, dans certains cas, jouent un rle dans la
spciation bactrienne (Majewski et Cohen, 1999 ; Bergstrom et al., 2000 ; Ochman et al.,
Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

157
2000 ; Nielsen et van Elsas, 2001 ; Majewski et al., 2000). Dans le cas des biodgradations,
ces MGE sont de puissants outils adaptatifs pour le dveloppement de mtabolismes
alternatifs au sein des populations microbiennes (Ashelford et al., 1999, 2000 et 2003 ;
Ashelford et al., 2000 ; Top et Springael, 2003 ; Thomas et al., 2005 ; Frost et al., 2005).
Lintervention des MGE dans les biodgradations a t particulirement dcrit pour le genre
bactrien Pseudomonas, sur une gamme tendue de composs organiques (Kostal et al.,
1998 ; Chang et al., 2001; Top et al., 2002 ; Bandounas et al., 2011 ; Zhou et al., 2011 ; Zhao
et al., 2011 ; Chanika et al., 2011). De plus, de nombreuses tudes ont dmontr que ce
potentiel mtabolique modelable tait souvent d, au sein des MGE, lactivit dun ou
plusieurs plasmides cataboliques de type conjugatif, de taille comprise entre 50 220 kb
environ et /ou la prsence de gnes cataboliques lintrieur dlments transposables
(Lilley et Bailey 1997 ; Ogawa et al., 2004 ; Williams et al., 2004 ; Yano et al., 2007).

A ce stade de notre travail, nous proposons plusieurs possibilits propos de la nature des
MGE responsables du phnotype dgradant, parmi lesquelles :

i) la prsence dun plasmide de type conjugatif, portant le ou les gnes cataboliques
impliqus ;
ii) la prsence dlments transposables localiss sur le chromosome bactrien et
contenant le ou les gnes cataboliques ;
iii) la prsence dlments transposables, eux-mmes localiss sur un plasmide de type
conjugatif et contenant le ou les gnes cataboliques.

partir de nos rsultats, et en les confrontant aux schmas de dgradation classiquement
proposs pour Pseudomonas sp. il est possible denvisager la prsence simultane de gnes
codant pour des dioxygnases affinit et/ou activit accrues pour la sulcotrione,
responsables de lattaque de la substance active au niveau de la partie 1,3-cyclohexanedione.

Nous avons souhait vrifier cette hypothse en essayant didentifier et de localiser les gnes
cataboliques impliqus dans la dgradation de la sulcotrione chez lisolat Pseudomonas sp.
1OP. Nous avons donc recherch la prsence de gnes codant deux familles de dioxygnases
(catchol 2,3-dioxygnase et catchol 1,2-dioxygnase) chez Pseudomonas laide damorces
Quatrime partie Chapitre 3 : Caractrisation phylogntique des isolats 1OP et
1TRANS

158
hautement spcifiques, ayant dj donn des rsultats probants lors dtudes similaires (Sei et
al., 1999 ; Jussila et al., 2006 ; Guzik et al., 2011).
Quatrime partie Chapitre 4 : Caractrisation fonctionnelle des isolats 1OP et
1TRANS

159
Chapitre4Caractrisationfonctionnelledesisolats1OPet
1TRANS

1- Prambule

Le rle mtabolique des intermdiaires catcholiques, impliqus dans les


biodgradations microbiennes en conditions arobies et notamment chez Pseudomonas sp., a
largement t dcrit depuis plusieurs dcennies (Chatterjee et al., 1981 ; Chatterjee et
Chakrabarty, 1982 ; Hickey et Focht, 1990 ; Aemprapa et Williams, 1998 ; Nakai et al.,
1995 ; Lee et al., 1995 ; Wikstrm et al., 1996 ; Joshi et Walia, 1996a et 1996b ; Kitayama et
al., 1996a et 1996b ; Moiseeva et al., 2002 ; Otenio et al., 2005 ; Guzik et al., 2009). Le
catchol (1,2-dihydroxybenzne) et par extension les catchols substitus, constituent des
intermdiaires essentiels dans ces carrefours mtaboliques microbiens, et, notamment, pour
des composs tels que les benzoates, naphtalnes, tolunes, salicylates, phnols et drivs
chlors et/ou mthyls (Dagley et Gibson, 1965; Dagley, 1986 ; Reineke et Knackmuss, 1988
; Jeenes et al., 1982). Un large ventail d'enzymes est labor par les microorganismes, afin
de convertir progressivement les composs aromatiques au cours dtapes successives et de
les amener, jusquau stade ultime des intermdiaires catcholiques. Deux voies enzymatiques
parfaitement dfinies et spcifiques, la voie mta et/ou la voie ortho prennent en charge les
catchols et leurs drivs (cf paragraphe III-3-2-4). En ce qui concerne la voie mta, elle fut
tout dabord mis en vidence chez des souches de Pseudomonas qui avaient la capacit de
mtaboliser le phnol et galement le crsol ou le mthylphnol (Dagley et Gibson, 1965).
Herrmann et al. (1995 et 1998) ont galement montr que la souche Pseudomonas putida H
mtabolisait le crsol grce la prsence du gne phlH situ sur le plasmide PHE (220 kb)
lintrieur dlments transposables. Cette voie fonctionne galement dans la dgradation de
phnols et de mthyl-phnols substitus pour un nombre important d'espces de Pseudomonas
diffrentes (Kukor et Olsen, 1991; Shingler et al., 1989 ; Bartilson, 1990 ; Takenaka et al.,
1998). Au cours des dernires dcennies, les donnes rcoltes propos de ces deux voies
mtaboliques se sont depuis largement enrichies (Assinder et Williams, 1990 ; Loh et Chua,
2002 ; Cao et al., 2002 et 2009 ; Jimenez et al., 2002 ; Toyama et al., 2010).
Au regard de ces donnes, et en les confrontant nos prcdents rsultats (tude du potentiel
de biodgradation et caractrisation phylogntique des isolats), nous avons souhait savoir si
Quatrime partie Chapitre 4 : Caractrisation fonctionnelle des isolats 1OP et
1TRANS

160
nos deux souches Pseudomonas sp. 1OP et Pseudomonas sp. 1TRANS pouvaient
ventuellement exprimer ce potentiel gntique catcholique.

2- Dtection des gnes XylE codant lenzyme catchol 2,3-


dioxygnase

La catchol 2,3-dioxygnase, code par le gne XylE se trouvant sur le plasmide TOL pWW0
(117 kb environ), constitue une des enzymes cls de la voie catabolique mta, puisquelle
catalyse louverture du cycle aromatique du catchol (Kita et al., 1999). Les gnes Xyl se
trouvant sur le plasmide TOL sont organiss en oprons et sont situs lintrieur dlments
transposables (Assinder et Williams, 1994). Nous avons cherch savoir si les gnes XylE
taient prsents dans le gnome de nos deux isolats. Les rsultats de lamplification des gnes
XylE sont prsents dans la figure IV-4-1.












Figure IV-4-1 : Migration des produits PCR sur gel dagarose (1,2%) aprs amplification de
lADN gnomique des deux isolats 1OP et 1TRANS, laide des amorces XylEaf et XylEar.
Contrle 1 : ADN gnomique E. coli DH5 ; contrle 2 : ADN plasmidique pCambia 3300.
La taille des fragments est indique en paires de bases (pb).


Les rsultats obtenus entranent plusieurs remarques :
(i) Le couple damorces XylEaf et XylEar (Jussila et al., 2007) nous a permis damplifier de
lADN gnomique pour les deux isolats ;
Contrle 1 Contrle 2
1 Kb+
300
500
800
Isolat
1TRANS
Isolat
1OP
Quatrime partie Chapitre 4 : Caractrisation fonctionnelle des isolats 1OP et
1TRANS

161
(ii) Nous avons obtenu plusieurs bandes, et cela quelle que soit la souche bactrienne
considre ;
(iii) Les profils de migration sont diffrents entre les deux isolats : trois bandes dADN
majoritaires de 300, 500 et 800 pb environ sont observes pour lisolat Pseudomonas sp.
1TRANS contre deux seulement (300 et de 800 pb) pour lisolat Pseudomonas sp. 1OP ;
(iiii) La bande de taille approximative de 500 pb est retrouve uniquement chez lisolat
Pseudomonas sp. 1TRANS, contrairement aux bandes 300 et 800 pb environ communes aux
deux isolats,

Les deux contrles ngatifs constitus dADN gnomique de la souche E. coli DH5 de
gnotype F
-
(contrle 1) et de lADN plasmidique (contrle 2) nont donn aucun signal
damplification.

Jussila et al. (2007) ont montr que les amorces XylEaf et XylEar quils ont dessines,
amplifient de faon spcifique la rgion de 731 pb du gne XylE port par le plasmide
archtypal TOL pWW0. Au cours de leurs travaux, ces auteurs ont galement montr quune
temprature dhybridation de 70C lors de la PCR permettait de saffranchir de lobtention de
faux-positifs, conscutivement une amplification possible des gnes nahH prsentant des
squences trs comparables avec celles des gnes XylE dj dcrites par Ghosal et al. (1987).
Dans ces conditions, la bande de taille lgrement infrieure 800 pb, retrouve chez les deux
isolats, pourrait constituer le signal damplification attendu.
En revanche, lobtention de deux bandes supplmentaires de 300 et 500 pb environ chez
lisolat Pseudomonas sp. 1TRANS, et dune seule bande supplmentaire de 300 pb chez
lisolat Pseudomonas sp. 1OP, nous amne nous interroger sur ce rsultat.

A ce stade, nous avons envisag deux hypothses:
(i) des amplifications non spcifiques seraient responsables de la prsence des fragments
additionnels de 300 et/ou de 500 pb,
(ii) lamplification laide du couple damorces XylEaf et XylEar est vritablement spcifique
des squences du gne XylE, et ce rsultat met donc en vidence une organisation gntique
diffrente de lopron Xyl pour les deux souches bactriennes tudies. Dans ce cas, la
Quatrime partie Chapitre 4 : Caractrisation fonctionnelle des isolats 1OP et
1TRANS

162
prsence de rarrangements gntiques dans le gnome des deux isolats est fortement
envisageable.

Dans la premire hypothse, il est possible que des hybridations non spcifiques soient
intervenues. Dans le cas de travaux similaires, partir dalignements multiples de 20
squences de C23O extraites de GenBank, Sei et al. (1999) ont montr que lanalyse par PCR
de 12 souches bactriennes de rfrence exprimant la catchol 2,3-dioxygnase, avait
galement donn des fragments additionnels de diffrentes tailles pour quatre isolats, dont
trois souches de Pseudomonas putida (souche BH-pheB, Takeo et al., 1995 ; souche MT15-
cdo, Keil et al., 1985 ; souche mt2-pWW0 XylE, Nakai et al., 1983). Ces auteurs ont
galement t confronts au mme phnomne en dtectant des fragments non spcifiques
lors de southerns effectus sur les souches de rfrences PCR-positives. En outre,
lanalyse par PCR de 106 isolats inconnus, prsentant un phnotype dgradant vis--vis du
phnol et du benzoate, a galement gnr 35 % de fragments de taille non attendue (> 380
pb).
Jussila et al. (2007) ont dessin les amorces XylEaf et XylEar partir de la squence du gne
XylE (GenBank V01161 ; Nakai et al., 1983) et par comparaison avec des squences
homologues retrouves dans GenBank. La spcificit de ces amorces a t ensuite teste avec
diffrentes tempratures dhybridation (61 72C), partir dADN gnomique purifi de 12
souches reconnues comme exprimant ou non la catchol 2,3-dioxygnase. Ces auteurs ont
retenu une temprature dhybridation de 70C lors des cycles de PCR et ont dcrit que, pour
des identits de squences du gne XylE infrieures ou gales 81%, des amplicons non
spcifiques avaient t obtenus avec un signal cependant trs faible (souche Pseudomonas
putida HS1 avec le plasmide TOL/pDK1 ; Kunz et Chapman, 1981). Dans notre cas et quels
que soient les fragments considrs, nous avons obtenu un signal intense des bandes dADN,
et cela pour les deux isolats 1OP et 1TRANS.

En ce qui concerne la seconde hypothse, plusieurs remarques sont faire : certaines souches
de Pseudomonas sp. peuvent prsenter plusieurs copies de lopron de la voie mta et/ou
plusieurs copies des gnes codant lenzyme catchol 2,3-dioxygnase. Pseudomonas putida
MT53 (DSMZ 4303) porte la fois deux copies de lopron de la voie mta sur le plasmide
pWW53 et deux copies du gne codant la catchol 2,3-dioxygnase, lun se trouvant sur le
Quatrime partie Chapitre 4 : Caractrisation fonctionnelle des isolats 1OP et
1TRANS

163
plasmide archtypal pWW0, lautre sur le plasmide de type pDK1 (Keil et al., 1985a et
1985b ; Kok et al., 1999 ; Nojiri et al., 2004). Cette souche arbore donc trois plasmides
distincts codant pour des catchol 2,3-dioxygnases prsentant des spcificits de substrat
nettement diffrentes (Jussila et al., 2007). Chez Pseudomonas aeruginosa JI104, trois copies
homologues du gne XylE ont t caractrises. Jussila et al. (2007) ont pu vrifier ces
donnes lors de leurs travaux avec lutilisation du couple damorces XylEaf et XylEar.
La prsence des gnes XylE, situs lintrieur dlments transposables sur le plasmide
archtypal TOL pWW0 (Assinder et Williams, 1990 ; Williams et al., 2004), pourrait
autoriser la mise en place dvnements gntiques de duplication/dltion, pouvant expliquer
la prsence des deux fragments supplmentaires (300-500 pb). Dans ce cas, la diffrence de
signal obtenu entre lisolat 1OP et lisolat 1TRANS pourrait mettre en vidence un fort lien
de causalit entre phnotypes dgradant ou non dgradant et nombre de fragments obtenus.
Lors de la phase dadaptation des isolats sulcotrione-resistants (dveloppe au cours de notre
stratgie cultivable), les cultures rptes avec pression de slection de lherbicide auraient pu
provoquer des rarrangements gntiques par transposition et/ou recombinaison chez les
diffrents isolats. Jeenes et al. (1982) ont dj dcrit ce type dvnements chez Pseudomonas
sp. Ces auteurs ont dcrit des mutants prsentant un nouveau phnotype dgradant vis--vis
de composs benzoques halogns, confr par lexpression dune catchol 2,3-dioxygnase
non spcifique mais fonctionnelle, aprs une rorganisation structurale du plasmide pWW0
(dltions) et une mutation du gne XylE. A titre purement hypothtique, nous pourrions donc
envisager que les rarrangements gntiques oprs chez lisolat Pseudomonas sp.1OP
auraient pu favoriser son potentiel dgradant vis--vis de la sulcotrione.

A lissue de nos rsultats, il semble intressant dapprofondir ce ciblage des gnes codant la
catchol 2,3 dioxygnase par loptimisation des conditions analytiques, en testant nos deux
isolats avec dautres couples damorces. Le couple 230f et C23Or, dessin par Sei et al.
(1999) partir dalignements multiples de 20 squences des gnes C23O extraites de
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), ciblant une rgion plus courte du gne
(380 pb), pourrait tre test partir de lADN gnomique des isolats 1OP et 1TRANS. Enfin,
lutilisation de contrles positifs avec des souches de rfrence affilies au genre
Pseudomonas exprimant la catchol 2,3-dioxygnase pourrait tre envisag.

Quatrime partie Chapitre 4 : Caractrisation fonctionnelle des isolats 1OP et
1TRANS

164
Toutefois, afin didentifier de faon formelle les squences des fragments amplifis, nous
avons souhait squencer lensemble des amplicons (300, 500 et 800 pb) pour les deux isolats
1OP et 1TRANS. Le rsultat du squenage nous permettra dvaluer la qualit de notre
mthodologie de ciblage des gnes.

3- Dtection des gnes C12O codant lenzyme catchol 1,2-


dioxygnase


Le gne codant la catchol 1,2-dioxygnase (C12O) a galement t recherch chez nos deux
isolats Pseudomonas sp. 1OP et Pseudomonas sp. 1TRANS, selon la mthode dcrite par Sei
et al. (1999), galement utilise par Guzik et al. (2011). Les rsultats de lamplification sont
prsents dans la figure IV-4-2.













Figure IV-4-2 : Migration des produits PCR sur gel dagarose (1,2%) aprs amplification de
lADN gnomique des deux isolats 1OP et 1TRANS laide des amorces C12Of et C12Or.
La taille des fragments est indique en paires de bases (pb).

Nous avons obtenu des produits PCR pour les deux souches bactriennes. Aprs migration
des amplicons, les deux isolats prsentent une bande majoritaire de bonne qualit, de taille
approximative de 500 pb avec, toutefois, un signal dintensit lgrement plus leve pour
lisolat 1OP. Un fragment de taille voisine de 100 pb, prsentant un signal plus faible est
galement retrouv pour 1OP et 1TRANS. Toutefois, lutilisation des amorces C12Of et
C12Or na pas gnr, chez nos deux isolats, les amplicons de 282 pb que Sei et al. (1999)
avaient obtenus partir de 9 souches bactriennes de rfrence (sur 11 au total) exprimant la
Quatrime partie Chapitre 4 : Caractrisation fonctionnelle des isolats 1OP et
1TRANS

165
catchol 1,2-dioxygnase, dont 7 souches affilies au genre Pseudomonas. Les deux contrles
ngatifs (non prsents sur la figure IV-4-2), identiques ceux utiliss lors de lamplification
des gnes XylE, nont pas donn de rponse.
Plus rcemment, avec les mmes amorces, Guzik et al. (2011) ont galement obtenu un
fragment damplification unique partir de la souche Pseudomonas putida N6 (EF208895.1),
mais de taille lgrement suprieure celui attendu (380 pb au lieu de 282 pb).

Nous avons donc effectu le squenage de lamplicon de 500 pb provenant de Pseudomonas
sp. 1OP et de Pseudomonas sp. 1TRANS, afin de savoir sils correspondaient bien la
squence codante du gne C12O.

4- Squenage des amplicons XylE



Deux tentatives de squenage des diffrents fragments dADN obtenus (800, 500 et 300 pb)
ont donn des chromatogrammes de trop mauvaise qualit pour quils puissent tre
correctement exploits. Un nouveau squenage est actuellement en cours.

5- Squenage des amplicons C12O



Nous avons squenc la totalit des 500 paires de bases des fragments dADN obtenus aprs
amplification de lADN gnomique des isolats 1OP et 1TRANS. Les alignements multiples,
effectus laide du logiciel CLUSTALX, ont montr que ces squences prsentaient entre
elles un trs fort pourcentage didentit (suprieur 90 %). Le rsultat des alignements
multiples est prsent dans la figure IV-4-3.

Quatrime partie Chapitre 4 : Caractrisation fonctionnelle des isolats 1OP et
1TRANS

166

Figure IV-4-3 : Alignements multiples des squences provenant des fragments dADN (taille
approximative 500 pb) obtenus lors du ciblage du gne C12O chez les isolats 1OP et
1TRANS, laide du logiciel ClustalX V. 2.0.10 (Thompson et al., 1997).


Le rsultat du BLAST effectu laide du logiciel blastn, dans GenBank a montr que les
squences obtenues ne correspondaient pas au gne C12O codant lenzyme catchol 1,2-
dioxygnase.
Toutefois, la squence a prsent 89 % didentit avec le gne codant lenzyme 4-
diphosphocytidyl-2-C-mthyl-D-rythritol kinase (CMK) de Pseudomonas sp. Une analyse
laide de blastx a bien confirm que ces squences nuclotidiques (500 pb) taient
relativement proches de la squence de la kinase (95 % de similarit).
Ces rsultats constituent une premire tape dans la caractrisation fonctionnelle des deux
isolats propos des gnes C12O. Toutefois, il est ncessaire damliorer nos conditions
opratoires (PCR), puisque la dtection des gnes codant lenzyme catchol 1,2-dioxygnase
chez 1OP et 1TRANS, partir des conditions dcrites par Sei et al. (1999), na pas t
possible.



167

Conclusion gnrale et perspectives


Conclusion gnrale et perspectives



168
Le travail prsent a permis dapprofondir les connaissances relatives au
comportement dun herbicide de la famille chimique des trictones, la sulcotrione. Cette
substance active est notamment propose dans les itinraires techniques masicoles, avec des
doses dapplication nettement infrieures celles antrieurement prconises pour des
herbicides plus anciens.
La littrature spcialise et, plus particulirement une tude prcdemment ralise au
Laboratoire de Chimie des Biomolcules et de lEnvironnement, nous a fourni des donnes
importantes sur la phnomnologie comportementale de cet herbicide, que nous avons
cependant souhait complter par une approche plus biologique des processus de
biodgradation.

Grce des mthodes danalyses chimiques valides et adaptes aux exigences de ce travail,
nous avons pu confirmer la ractivit biologique du sol de Perpignan vis--vis de la
sulcotrione. Ce sol se caractrise par un potentiel de dgradation important, puisque 90%
environ de la substance active initiale est dgrade aprs 30 jours, en conditions de laboratoire
(temps de vie de 8 10 jours). Aucune diffrence na t observe entre des prlvements
dorigine identique mais prsentant des historiques de traitement diffrents. Paralllement,
une tude comparable mene sur ces mmes sols, pralablement striliss, a montr une
dgradation ngligeable, confirmant le rle prpondrant de la biodgradation.

Le prcdent travail (H. Chaabane) faisait tat, titre de perspective, de lventualit de
linstallation dun phnomne de biodgradation acclre, li un processus adaptatif de la
microflore indigne conscutivement des traitements rpts. Notre tude a donc consist
exposer les sols de Perpignan quatre traitements successifs en microcosmes, afin de
caractriser dventuelles diffrences au niveau des profils cintiques de dissipation de la
substance active. Quels quaient t le nombre de traitements et lhistorique des sols non
striliss, ces profils cintiques ont tous t trs comparables. Dans nos conditions
opratoires, lapparition dune biodgradation acclre de la sulcotrione na donc pas t
observe. Ce rsultat va dans le sens de donnes bibliographiques qui font tat de la ncessit
de traitements rpts sur des priodes beaucoup plus longues et/ou avec des doses
dapplication nettement suprieures avant dobserver la mise en place dune biodgradation
acclre lchelle de la parcelle agricole. Par ailleurs, lobservation des profils de
Conclusion gnrale et perspectives



169
dgradation, et notamment labsence de dlai de latence en dbut dincubation, orientent vers
une approche co-mtabolique du phnomne de biodgradation dans ce sol.

La ractivit biologique intrinsque des sols de Perpignan (4S) et (C) a suggr la possibilit
dy trouver des souches microbiennes dotes de capacits gntiques dgrader plus ou
moins spcifiquement la sulcotrione. Afin de contourner les difficults inhrentes la
problmatique disolement de souches telluriques sur milieu synthtique, nous avons donc
entrepris une approche cultivable originale, sappuyant sur lutilisation combine de divers
milieux de culture, dans le but de slectionner, partir du sol (4S), des isolats potentiellement
biodgradants. Cette stratgie exprimentale nous a permis disoler huit souches sulcotrione-
rsistantes, parmi lesquelles une seule sest avre capable de mtaboliser la sulcotrione. A
notre connaissance, il sagit de la premire description dune telle souche, cultivable en
laboratoire et utilisant cet herbicide comme source de carbone et/ou dnergie. Cet isolat
bactrien, dnomm 1OP lors de nos essais, a t formellement identifi, aprs squencage de
lADNr 16S, comme tant affili au genre Pseudomonas, espce putida. Cette souche, apte
utiliser la sulcotrione en culture liquide, a prsent un potentiel de dgradation lev : 88 %
de la sulcotrione initiale a t dgrad au bout de 30 jours de culture, le temps de vie tant
estim environ 15 jours. Contrairement aux donnes releves lors de ltude en
microcosmes de sol, la dissipation de la substance active correspond dans ce cas un
processus de mtabolisme direct, une phase de latence (5-6 jours) ayant t clairement mise
en vidence lors de la dgradation de la sulcotrione, qui, par ailleurs, constitue la seule source
de carbone et dnergie du milieu. Ds la fin de cette priode de latence, la cintique observe
montre lapparition concomitante de lacide 2-chloro-4-mthylsulfonyl benzoque (CMBA),
un des mtabolites majeurs connus. Son augmentation est constante entre 6 et 27 jours, le
rapport molarit en CMBA / molarit initiale en sulcotrione atteignant 44 % lissue de
ltude.
En revanche, la 1,3-cyclohexanedione (CHD) na jamais t dtecte au cours de la priode
de culture. Le processus de dgradation peut, ds lors, tre interprt comme une attaque
cible de la souche Pseudomonas sp. 1OP au niveau de la partie CHD de la molcule de
sulcotrione, avec utilisation de cette partie comme source de carbone et/ou dnergie.


Conclusion gnrale et perspectives



170

Les donnes recueillies au cours de notre travail vont dans le sens de la littrature,
relativement fournie, soulignant le large potentiel catabolique du genre Pseudomonas ainsi
que son rle largement dcrit dans le domaine des biodgradations. Cependant, des tudes
rcentes ont mis en vidence lintervention dun autre genre bactrien (Bacillus) dans la
biodgradation de la msotrione, herbicide galement de la famille des trictones ; cette
souche de Bacillus sp. sest avre incapable de mtaboliser la sulcotrione. Ce travail entraine
galement une rflexion sur la place de la souche Pseudomonas sp.1OP vis--vis de la
diversit des communauts microbiennes du sol tudi.
Notre tude confirme galement la reprsentativit du Phylum des Proteobacteria au niveau
de lensemble des souches bactriennes telluriques cultivables prsentes au sein de
lcosystme sol.

Parmi les sept autres souches bactriennes isoles du sol et sulcotrione-rsistantes, mais
incapables de dgrader la sulcotrione, lisolat 1TRANS prsentait un morphotype trs
semblable celui de 1OP sur milieu glos. Il a t retenu comme contrle comparatif lors
de lidentification phylogntique et a t identifi comme appartenant galement au genre
Pseudomonas espce putida.
La mise en vidence dun phnotype dgradant la sulcotrione a mis en lumire
lextraordinaire plasticit gntique dune fraction de la microflore du sol gntiquement apte
dgrader certains produits phytopharmaceutiques. De plus, la caractrisation de deux
souches appartenant la mme espce, mais prsentant des phnotypes diffrents en ce qui
concerne le caractre dgradant vis--vis de lherbicide, souligne le caractre versatile de ce
potentiel de biodgradation. Ce rsultat nous amne proposer lintervention dlments
gntiques mobiles rgulant ces mcanismes molculaires adaptatifs, via la prsence de
plasmides conjugatifs et/ou dlments transposables (squences dinsertion ou transposons)
codant les enzymes cataboliques chez Pseudomonas sp. 1OP, intervention dj dcrite pour
diverses souches dans le cas de latrazine. Cette perspective volutive, en attente de
confirmation par squenage, va cependant dans le sens des premires donnes recueillies lors
notre tude fonctionnelle, effectue sur les isolats 1OP et 1TRANS, par ciblage des gnes
codant les enzymes impliques dans le mtabolisme de la voie catcholique. La mise en
vidence, au niveau gnomique, dune rponse diffrente entre lisolat 1OP et lisolat
Conclusion gnrale et perspectives



171
1TRANS lors du ciblage du gne codant la catchol 2,3 dioxygnase, pourrait tayer cette
hypothse de travail. De plus, les gnes codant la voie de catabolisme catcholique mta sont
prsents chez Pseudomonas sp. et sont, dans la majorit des cas, ports par des plasmides
conjugatifs de taille suprieure 50 kb, eux-mmes situs lintrieur dlments
transposables.



Perspectives de travail



Ces rsultats exprimentaux nous ont donc permis dapprofondir ltat des connaissances sur
la dgradation biologique de la sulcotrione dans un sol agricole, mais galement douvrir
certaines perspectives de travail, tant dans le domaine fondamental que dans un domaine plus
appliqu pouvant conduire une valorisation technologique.

Lisolement des lments gntiques mobiles intervenant dans le processus de biodgradation
constituerait une premire tape incontournable avant de les identifier, de la faon la plus
formelle possible, et de caractriser les mcanismes molculaires impliqus, par
lintermdiaire dune approche de gnomique volutive. Lvaluation de la mobilit de ces
gnes cataboliques et leur rle potentiel au niveau du transfert gntique horizontal au sein de
la microflore tellurique constituerait une avance capitale dans la valorisation de ce travail.

Notre tude na pu que proposer des hypothses concernant les voies mtaboliques impliques
dans la biodgradation de la sulcotrione par Pseudomonas sp.1OP en culture liquide. Ce
travail pourrait tre complt, dans ce sens, par la combinaison de lexploitation des donnes
du squenage des gnes codant la catchol 2,3-dioxygnase et lutilisation de techniques de
mutagnse dirige par transposons partir de notre souche. Ltude parallle des cintiques
enzymatiques partir des phnotypes mutants obtenus aiderait galement mieux
apprhender les voies de rgulation mtaboliques.

Conclusion gnrale et perspectives



172
Sur un plan purement cultivable, le pouvoir dgradant de lisolat 1OP pourrait tre test, dans
un premier temps, sur les mtabolites identifis de lherbicide, mais galement sur divers
composs plus ou moins proches chimiquement de la sulcotrione, et, terme, sur certains
cocktails de xnobiotiques.

Une tape supplmentaire de valorisation serait lexploitation conditionnelle de la souche
des fins de dpollution environnementale.



173









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207












Valorisation des travaux de recherche
Valorisation des travaux de recherche



208
Publicationn1(SOUSPRESSE)

Article soumis le 30 mars 2011 la revue Pest Management


Science, corrig le 24 mai 2011, accept le 24 juin 2011.

Isolation and Characterization of a Bacterial Strain Degrading the


Herbicide Sulcotrione from an Agricultural Soil.



Christophe CALVAYRAC
a,b
, Fabrice MARTIN-LAURENT
c
, Alexia FAVEAUX
a
, Nathalie
PICAULT
b
, Olivier PANAUD
b
, Camille-Michel COSTE
a
, Hanene CHAABANE
d
and Jean-
Franois COOPER
a



a
Laboratoire de Chimie des Biomolcules et de lEnvironnement (LCBE, EA 4215),
Universit de Perpignan Via Domitia (UPVD), 52 avenue Paul Alduy 66860 Perpignan,
France.
b
Laboratoire Gnome et Dveloppement des Plantes (UMR, 5096 CNRS-UPVD), Universit
de Perpignan Via Domitia (UPVD), 52 avenue Paul Alduy 66860 Perpignan, France.
c
INRA, Universit de Bourgogne, UMR1229 Microbiologie du Sol et de l'Environnement,
CMSE, 17 rue Sully, BP 86510, F-21065 Dijon, France.

d
Unit de recherche Protection Intgre des Cultures, Institut National Agronomique de
Tunisie
43, av Charles Nicolle, 1082 Tunis Mahrajne, Tunisie.

Corresponding author. Tel: +33 (4) 68 66 20 81


Fax: +33 (4) 68 66 81 38; E-mail : cooper@univ-perp.fr

Valorisation des travaux de recherche



209

Keywords: Sulcotrione, Biodegradation, Soil, Pseudomonas putida, Metabolites.

Running title : Biodegradation of sulcotrione in soil. Intervention of Pseudomonas sp.

1- Abstract

BACKGROUND: Dissipation kinetics of sulcotrione herbicide, previously four times sprayed
on a French soil, was studied using a laboratory microcosm approach. Then, advanced
cultivation-based approach was performed to isolate bacteria responsible for
biotransformation of sulcotrione. Chromatographic methods were used as complementary
tools to define its metabolic pathway.
RESULTS: Soil microflora was able to quickly biotransform the herbicide (DT
50
ca 8 days).
2-chloro-4-mesylbenzoic acid, one of its main metabolites, was clearly detected. However, no
accelerated biodegradation process was observed. Eight pure sulcotrione-resistant strains were
isolated but only one (1OP) was capable to degrade this herbicide with a relative high
efficiency and to use it as sole carbon source and energy. In parallel, another sulcotrione-
resistant strain (1TRANS) was shown to be unable to degrade the herbicide. Amplified
ribosomal restriction analysis (ARDRA) and repetitive extragenic palendromic PCR genomic
(REP-PCR) fingerprintings of strains 1OP and 1TRANS gave indistinguishable profiles.
CONCLUSION: Sequencing and aligning analysis of 16S rDNA genes of each pure strain
revealed identical sequences and a close phylogenetic relationship (99 % sequence identity) to
Pseudomonas putida. Such physiological and genetic properties of 1OP to metabolize
sulcotrione were probably governed by mobile genetic elements in the genome of the bacteria.


1 INTRODUCTION
Sulcotrione [2-(2-chloro-4-methylsulfonylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione] is a triketone
herbicide applied at 300-450 g ha
-1
on corn crop to control the development of a wide range
of annual and perennial broadleaf weeds.
A large proportion of this herbicide reaches the soil where both abiotic (i.e sorption, chemical
degradation) and biotic (biodegradation) processes control the fate and the activity of this
Valorisation des travaux de recherche



210
herbicide. 2-chloro-4-mesylbenzoic acid (CMBA) and 1,3-cyclohexanedione (CHD) have
been described as two biodegradation and hydrolysis transformation products.
1-8
A derivative
of phenylheptanoic acid was also described under special conditions.
6-7,9
Up to now, no report
showed the existence of accelerated biodegradation of sulcotrione as a result of repeated
applications. Soil microorganisms able to transform sulcotrione are not yet described,
contrarily to mesotrione, another herbicide belonging to the triketone family.
10-14
In this
context, the aim of our work was to evaluate the response of an agricultural soil, regularly
treated with sulcotrione, possibly adapted to its biodegradation, in order to isolate novel and
efficient sulcotrione degraders. Sulcotrione transformation was monitored in the soil using
chromatographic methods. Sulcotrione-degrading bacterial strain was isolated by conducting
an adaptation culture to the sulcotrione. Isolate was characterized by ARDRA, REP-PCR and
by cloning/sequencing of partial 16S rDNA sequence. Its capacity to degrade aerobically
sulcotrione was estimated.

2 MATERIALS AND METHODS
2.1. Experimental design

2.1.1. Experimental field site
The experimental field site was set up at the University of Perpignan, France (42 40' 55" N,
2 53' 49" E). The field was divided in two plots of 184 m each, separated by a buffer strip.
One plot (4S) was treated with 300 g ha
-1
of sulcotrione (Mikado

) four times with one month


interval. After this, plot 4S was neither pesticide treated nor cultivated for 24 months. The
second plot (C), used as control, was never treated with sulcotrione. According to FAO
classification, the soil is a clayey sandy loam soil. Soil physicochemical characteristics were:
clay 13.9 %, silt 60.5%, sand 25.6 %, soil moisture 25 %, organic carbon 0.9 %, organic
nitrogen 0.98 g kg
-1
, C/N ratio 9.64, cation exchange capacity (CEC) 15.5 meq 100 g
-1
,
Ca
2+
/CEC 214 % and pH in water 8.1. Soil samples were collected from the surface layer (0-7
cm) of the experimental field. Composite samples were sieved to 2 mm and stored in the dark
at 4C until used.



Valorisation des travaux de recherche



211
2.1.2 Sulcotrione biodegradation
The ability of the microflora of the soil samples collected on the experimental field (4S and
C) to degrade sulcotrione was tested under laboratory conditions. Each microcosm, prepared
with 10 g of moist soil placed in Petri dishes (5.5 cm i.d.), were treated with 550 L sterile
aqueous sulcotrione solution at 22 mg L
-1
(i.e. 1.2 g of sulcotrione per g

of soil) and
homogeneized. Treatments were applied four times at day 0, 30, 60 and 90 (T1
D0
, T2
D30
,
T3
D60
and T4
D90
), necessiting the preparation of forty microcosms for each soil type. All
analysis were made in duplicate. In addition, autoclaved controls were set up to estimate the
occurrence of abiotic biodegradation (St4S and StC). All samples were kept in the dark to
avoid photodegradation of the sulcotrione. Thorough the incubation period, soil moisture
content was kept at 25 % (moist weight), making it comparable to field moisture. After each
treatment, each entire soil aliquot (10 g) was regularly sampled (i.e. after 0, 2, 7, 15 and 30
days) to monitor sulcotrione dissipation.

2.2. Chemical Analysis
2.2.1. Reagents
Standard of sulcotrione (98.8 % purity) a weak acidic herbicide, pKa value 2.87, MW
328.77 g mol
-1
and water solubility 165 mg L
-1
at 25C - was purchased from Sigma-Aldrich,
France. Standards of 1,3-cyclohexanedione (CHD) (97.0% purity) and 2-chloro-4-
mesylbenzoic acid (CMBA) (95.0% purity) were purchased from Fluka and Acros Organics,
respectively.
Methanol and acetonitrile (HPLC quality) were purchased from Carlo Erba, dichloromethane
for pesticide analysis from Riedel-deHan GmbH, trifluoroacetic acid (TFA) (99.0% purity)
from Aldrich, hydrochloric acid (38.0%) from Prolabo and water was Milli-Q quality.
(Trimethylsilyl) diazomethane 2.0 M in diethyl ether was supplied by Sigma-Aldrich.
Supelclean
TM
ENVI-Chrom P SPE cartridges were supplied by Supelco, France.

2.2.2. Analytical procedure
2.2.2.1. Degradation of sulcotrione in soil samples
Extraction step
Soil samples (10 g) were extracted twice with 60 and 30 mL of a mixture acetonitrile /0.1 M
HCl (90/10; v/v) over 30 and 15 min periods, then filtered on a Whatman filter GF/A. The
Valorisation des travaux de recherche



212
organic filtrate was evaporated at 30 C and the acidic aqueous solution was then extracted
twice with 5.0 mL of dichloromethane. The organic phase was evaporated to dryness, and the
extract was solubilized in 0.10 M HCl. It was then purified on an EnviChrom P cartridge,
eluted with methanol (5 mL) and concentrated to 1 mL. The extract was finally analysed by
HPLC. One blank (sulcotrione-free soil) was systematically included and analysed under the
same conditions.

Chromatographic analysis
Soil extracts were analysed using Shimadzu HPLC apparatus equipped with a Supelco ODS
Hypersil C
18
column (5 m, 250 mm x 4.6) and a SPD-10 Avp UV/Vis detector set at 265 nm.
The mobile phase consisted of a mixture of water acidified by 0.3 % trifluoroacetic acid (AW)
and acetonitrile (ACN), delivered at a flow rate of 1 mL min
-1
and using a gradient system
[70/30 (AW/ACN) at t = 0 min to 50/50 (AW/ACN) at 8 min, then maintained for 10 min].

Analytical performance
This analytical method was an adaptation of the procedure previously published by Chaabane
et al.
9
Quantification limit was estimated to 0.05 g g
-1
for sulcotrione herbicide, with a mean
recovery rate of 87 % 10.

2.2.2.2. Degradation of sulcotrione by the bacterial culture
Extraction step
One mL aliquots of the bacterial culture (selected among sulcotrione-resistant ones) were
centrifuged (15 min, 1100 g) at room temperature. The supernatant was recovered, acidified
with 0.3 mL of 0.16 M HCl and brought to 2.5 mL with distilled water. Then, the acidic
aqueous solution was extracted twice with 2.5 mL dichloromethane. The organic phase was
evaporated to dryness, solubilized in 1 mL methanol before analysis. No adsorption of
sulcotrione was observed on centrifuge tubes.

High performance liquid chromatography (HPLC/UV) of sulcotrione and its main mtabolites
Culture media extracts were analyzed using Jasco HPLC apparatus equipped with a Supelco
ODS Hypersil C
18
column (5 m, 250 mm x 4.6) and an UV/Visible Detector Jasco 875-UV
set at 265 nm. The mobile phase consisted of a mixture of water acidified by 0.3 %
Valorisation des travaux de recherche



213
trifluoroacetic acid (AW) and acetonitrile (ACN), delivered at a flow rate of 1 mL.min
-1
. To
improve the separation of the active ingredient and its metabolites during degradation
kinetics, a gradient system [70/30 (AW/ACN) from 0 to 4 min, evolving to 40/60 (AW/ACN)
at 7 min, then maintained for 15 min] was used. Detection of sulcotrione and its main
metabolites (1,3-cyclohexanedione and 2-chloro-4-mesylbenzoic acid) was done at 265 nm.
Retention times were estimated as follows: sulcotrione (11.1 min), CMBA (5.1 min) and
CHD (4.5 min).

High performance liquid chromatography/Mass spectrometry (HPLC/ESI/MS) analysis of
metabolite 1,3- cyclohexanedione (CHD)
LC/MS analysis was carried out on a LCQ-Fleet (Thermo Fisher Scientific) equipped with an
Electrospray Ionisation (ESI) source and a 3D ion-trap analyser. LC analysis was achieved
using an Accela Thermo Fisher chromatograph equipped with an Accela 600 pump, an Accela
Autosampler and a diode array detector (Accela PDA detector). Full scan spectra from m/z 60
to 300 in both positive (source voltage 4 kV) and negative (source voltage 3.5 kV) ion modes
were recorded. Separation was carried out at room temperature using a Phenomenex Gemini
C
6
-Phenyl column (150 x 3.0 mm; 5 m). The mobile phase consisted of a mixture of 0.1 %
formic acid water (A-W) and 0.1 % formic acid acetonitrile (A-ACN) delivered at a flow rate
of 0.4 mL min
-1
, with a gradient system: 90/10 (A-W/A-ACN) from 0 to 2 min, evoluting to
10/90 (A-W/A-ACN) at 20 min. Under these conditions, retention time of 1,3 CHD was 4.51
min. Quantification limit was estimated in positive mode to 0.5 mg L
-1
.

Gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis of metabolite 2-chloro-4-
mesylbenzoic acid (CMBA) after derivatization
In presence of methanol, trimethylsilyldiazomethane (TMS) gives methyl esters in good
yields at room temperature with various carboxylic acid including aromatic, heteroaromatic,
alicyclic and aliphatic ones. The esterification proceeds instantaneously and quantitatively
when an excess of TMS is used and the reaction can be easily monitored by the disappearance
of the yellow colour.
15

Twenty five L of TMS prepared in diethyl ether solution was added to 0.5 mL of culture
media extract mixed with 0.5 mL of methanol. After 2 hours reaction time, the extract was
analysed by GC/MS.
Valorisation des travaux de recherche



214
GC/MS analysis was carried out on a Focus GC connected to a mass spectrometric detector
DSQII (Thermo Fisher Scientific) equipped with a column G-SQC GC, 15 m x 0.25 mm x
0.25 m (5% Phenyl Methylpolysiloxane), initial oven temperature 80 C, for 1 min raised at
10C min
-1
to 260 C for 15 min; carrier gas helium 6.0; electron impact mode 70 eV; full
scan mode; split injection mode; transfer line temperature 300 C. Under such conditions,
retention time of methylated CMBA was 14.81 min and characteristic m/z ions were 155, 217
and 248 (Fig. 1). A calibration curve was established on m/z 217 for the range of
concentration 0.4 to 20 mg L
-1
(y = 364 x 62, r = 0,996).

Analytical performances
Culture media samples were spiked with known amounts of analytical standards of
sulcotrione, CHD and CMBA (2 to 30 mg L
-1
). Calculations were made by HPLC/UV and/or
GC/MS, after analysis in duplicate, using calibration curves. The mean recoveries were
estimated at 75 6 %, 55 8 %, 75 10 % for sulcotrione, CHD and CMBA, respectively.
The limits of quantification, defined as the sample concentration required giving a signal-to-
noise ratio of 5:1, were estimated to 0.5 to 1.0 mg L
-1
.

2.3. Isolation of sulcotrione degrader
2.3.1. Culture media and cells preparation
A culture medium (NS), where the nutrient source was the control soil C, was prepared and
used to promote the growth of bacteria previously described as hardly cultivable on the
conventional culture media.
16
Briefly, soil was sieved through a 2 mm mesh, dried at 65 C
for 3 days. The culture media was prepared by adding 40 g of soil and 2 g of agar in a final
volume of 100 mL of deionised water. After sterilization the medium was supplemented with
sterilized solutions of sulcotrione (30 mg L
-1
) and of cycloheximide (50 mg L
-1
) and poured
into Petri dishes to solidify.
A sterile mineral salt medium (MS), modified from Rousseaux et al.,
17
was used for both the
adaptation culture and the biodegradation assays of sulcotrione-degrading strains. This
medium contained per litre: 1.6 g K
2
HPO
4
, 0.4 g KH
2
PO
4
, 0.2 g MgSO
4
.7H
2
O, 0.1 g NaCl,
0.002 g CaCl
2
, 3.5g (NH
4
)
2
SO
4
, 30 mg sulcotrione, 1 mL of salt stock solution, 1mL of
vitamin stock solution, 1mL of FeSO
4
.6H
2
O stock solution (5 g L
-1
). The salt stock solution
contained 2 g boric acid; 1.8 g MnSO
4
.H
2
O, 0.2 g ZnSO
4
, 0.1 g CuSO
4
, 0.25 g Na
2
MoO
4
(per
Valorisation des travaux de recherche



215
litre). The vitamin stock solution contained 100 mg L
-1
of thiamine-HCl and 40 mg L
-1
of
biotin. 0.2 m filter sterilized sulcotrione, FeSO
4
.6H
2
O, and vitamin stock solutions were
added to the medium after sterilization. pH was adjusted at 7.7 with aqueous 0.1 M NaOH
solution. A solid sulcotrione-MS medium obtained by adding 15 g L
-1
agar (Biokar
Diagnostics, France) was used to test the capacity of the strains to growth on such solid
medium.
Triptic soy broth medium (TS) obtained by adding 15 g L
-1
agar (Biokar Diagnostics, France)
supplemented with sulcotrione (30 mg L
-1
) was used to purify bacterial strains by successive
stricking. A sulcotrione-(TS) medium (BioMrieux, France) was also used to improve
microbial biomass culture during batch cultures for degradation assays. Microbial biomass
was harvested by centrifugation (15 min, 1600 g at 4C) and the pellet was washed twice with
Knapp buffer (1 g KH
2
PO
4
; 1 g K
2
HPO
4
; 4 mg FeCl
3
; 40 mg MgSO
4
.7H
2
, per litre of
deionized water, pH 6.6) as described earlier
18
before being resuspended in sulcotrione-MS
medium to obtain an absorbance of ca 0.3 at 600 nm.

2.3.2. Adaptation cultures to the sulcotrione
Ten grams of soil 4S were suspended in 90 mL 0.9% NaCl and placed on orbitary shaker at
200 rpm for 30 min. Duplicates were carried out. Five hundred L soil suspension aliquots
were plated on NS-sulcotrione or NS medium. Plates were incubated in the dark at 28C for 7
days. Growing colonies identified as sulcotrione-resistant strains and/or possible degraders
were selected, grown in 100 mL of Triptic soy broth (TS) medium supplemented with
sulcotrione for 24 hours at 30C under agitation. They were then plated on TS agar with
sulcotrione.
For each isolated bacterial strain, a selective adaptation step was then carried out by
performing five successive cultures (A
1
to A
5
) in 100 mL sulcotrione MS medium at 28C
under agitation at 150 rpm for 20 days. Subsequent studies were performed using A
5

adaptation solutions.

2.3.3. Estimation of sulcotrione-degrading capabilitiy of the bacterial isolates
One mL of the A
5
bacterial culture was grown in TS supplemented with sulcotrione. After 15
hours of culture, bacterial cells were harvested in the late-exponential-growth phase, by
centrifugation (15 min, 1100 g, 4 C). The bacterial pellet was washed twice with Knapp
Valorisation des travaux de recherche



216
buffer and was resuspended in sulcotrione-MS medium to obtain an absorbance of ca 0.3 at
600 nm. They were then incubated at 28C in the dark on an orbital shaker (200 rpm). One
mL aliquot of each bacterial suspension was then regularly sampled (0, 6, 15 and 27 days) and
analyzed to establish the kinetics of degradation of sulcotrione and of appearance of its main
metabolites. These degradation tests were realized in triplicate. One control without bacterial
inoculums was also included.

2.3.4. ARDRA, REP-PCR, partial 16S rRNA cloning and sequencing
The extraction of bacterial genomic DNA was done following the protocol previously
described by Cheneby et al.
19
and purified using the GENECLEAN

Turbo Kit according to


the manufacturers instructions (MP Biomedicals, Europe). DNA quality was checked by 1%
(w/v) agarose gel 1x TBE buffer and quantified by spectrophotometry (NanoDrop

2000,
Thermo Fisher Scientific).
Partial 16S rRNA sequences were amplified by PCR in 50 L volume reaction containing 1
M concentration of the universal primers 27f (5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3)
and 1492r (5-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3), 200 M of each dNTP (Promega,
USA), 2.5 U of GoTaq DNA polymerase (Promega, USA) and 25 ng of DNA.
20
PCR
reactions were carried out in a PTC-200 gradient cycler (MJ Research) under the following
conditions: 5 min at 94C, 35 cycles of 1 min at 94C, 1 min at 55C, and 2 min at 72C, plus
an additional 15-min cycle at 72C. PCR products were then separated by electrophoresis on a
1% agarose gel, purified using the GENECLEAN

Turbo Kit and quantified by


spectrophotometry.
ARDRA profiles were obtained by digesting 16S rRNA PCR fragments (7 L) with the
restriction endonucleases Alu I and Hae III (New England Biolabs

) overnight at 37C. The


obtained restriction fragments for each isolate were separated on a 2% (v/w) Metaphor
agarose gel in 1x TBE buffer (80 V for 3.5 h).
Repetitive extragenic palendromic PCR (REP-PCR) was carried out with REP1R-I and
REP2-1 primers which targets the conserved stem of each REP-like sequence in the
genome.
21
DNA amplification was carried out in a 25 L mixture using 50 ng of extracted
DNA as template in 5 L of 5x Giescher buffer [83 mM (NH
4
)
2
SO
4
; 335 mM Tris HCl, pH
8.8; 150 mM -mercaptoethanol; 33.5 M EDTA, pH 8.8], 6.5 mM MgCl
2
, 0.16 mg mL
-1

Bovine Serum Albumin (BSA, New England Biolabs

), 1.25 mM of each dNTP, 0.1 L mL


-1

Valorisation des travaux de recherche



217
dimethyl sulfoxide, 2 M of each of the two primers (REP1R-I and REP2-1) and 1 U of
GoTaq DNA polymerase. Amplifications were carried out in a PTC-200 gradient cycler (MJ
Research): 1 cycle at 95 C for 6 min, 30 cycles at 94C for 1 min, 40C for 1 min and 65C
for 4 min, plus an extension cycle at 65C for 16 min.
17
Amplified DNA fragments were
separated by electrophoresis on 1% agarose gel. PCR reactions were performed independently
in duplicate to ensure the consistency of the REP-profiles obtained.
16S rRNA PCR products were cloned into the pGEM-T Easy vector according to providers
recommendation (Promega, USA). Recombinant plasmids of interest were then purified by
using Wizard

Plus Minipreps DNA Purification Systems kit (Promega). Both DNA strands
of the insert were sequenced with an Applied Biosystems Hitachi 3130xl Genetic Analyzers
by using SP6 and T7 primers. Sequences of recombinant clones from the degrading and the
non-degrading strains were treated by SeqManNGen

software (DNASTAR, USA) to provide


consensus sequences and then were compared to known sequences found in the GenBank
database using Blast.
22
Sequences were deposited in GenBank under the accession numbers
JF303891 (1TRANS strain) and JF303892 (1OP strain). Multiple alignments were realised
using the ClustalX programme.
23
Phylogenetic tree was elaborated using the NJ plot
programme.
24


3 RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Sulcotrione degradation kinetics in Perpignan soils
The microflora of the Perpignan soil was previously shown to transform sulcotrione to CHD
and CMBA by cleaving the bound between 1,3-cyclohexanedione (CHD) and the benzoic
ring.
3
Here we report the transformation of sulcotrione observed only in 4S and C soils and
not in both sterilized soil (StC and St4S), further confirming that the predominace of the biotic
pathway for sulcotrione dissipation in the soil of Perpignan. Similar kinetics of dissipation
were observed in C and 4S soils which were differing by the herbicide treatment, the first
being never treated with it and the last having been treated four times at the agronomic dose
24 months ago. Indeed, after 30 days of incubation (treatment 1), almost 90 % of the applied
sulcotrione was dissipated with half-lives averaging 8 days, without significant differences
between C and 4S plots. For both soil no lag phase period was observed, which suggests that
co-metabolic process is responsible for sulcotrione dissipation. By fitting sulcotrione
dissipation kinetics with R values close to 0.9, one could observe similar half life (DT
50
8
Valorisation des travaux de recherche



218
days) and dissipation rates (k 0.08 day
-1
) in C and 4S soils (Table 1). As compared to the
literature, sulcotrione dissipation recorded in the soil of Perpignan is rather rapid when
considering DT
50
values.
3,4,6-8,25
In addition, since the plots C and 4S showed similar capacity
to dissipate sulcotrione, beside different herbicide treatment, the possible accelerated
biodegradation (ABD) of sulcotrione seems unlikely. To further explore this possibility, C
and 4S soils were submitted to 3 additional sulcotrione treatments under laboratory conditions
(T2
D30
, T3
D60
and T4
D90
). Similar kinetics of dissipation of sulcotrione and kinetics
parameters (k and DT
50
) were observed in these two plots differing by their scenario of
exposure to the sulcotrione (Table 1). In addition, no correlation could be found between the
rate of degradation (k) and the number of sulcotrione treatments. These results further confirm
that sulcotrione degradation is most likely resulting from co-metabolic process and that
accelerated biodegradation was not occurring in the soil of Perpignan. This feature was also
observed for several other herbicides belonging to s-triazine or substituted ureas families, for
which degradation was for a long period resulting from co-metabolic activity of the soil
microflora prior to the adaptation of the soil microflora to metabolic degradation relying on
specific catabolic pathways. The switch between co-metabolic and metabolic degradation of
these two classes of herbicides occurred after almost 30 years of repeated exposure to these
compounds of the agricultural fields. In order to get a better insight in the processes involved
in the dissipation of sulcotrione from the soil of Perpignan, adaptation cultures already shown
to be successful to isolate different pesticide degrading strains including atrazine, isoproturon,
carbofuran, mesotrione was established.
10-11,26-29

3.2. Isolation of sulcotrione-degrading bacterial cultures
The first step of the isolation process relied on the use of a soil agar medium NS
supplemented with sulcotrione, adapted from Ferreira et al.,
16
and which was shown to
promote the growth of pesticide-degrading bacterial strains known to be difficult to cultivate
on conventional media, like most of the soil microbes. Starting from soil suspensions plated
on NS-sulcotrione medium, numerous bacterial colonies showing different morphotypes
grew. Eight colonies of the dominant morphotype, forming little white colonies, showing
viscid consistency without mycelial growth were further purified by successive plating.
Excepted their opaque or translucent appearance, these isolates showed comparable
morphology, forming white colonies with a diameter of ca 2.5 mm and following
Valorisation des travaux de recherche



219
characteristics: smooth, circular form, convex elevation. Each of the eight colonies was then
cultivated repeatedly on MS-sulcotrione (A
1
A
5
) where they were able to grow.
Nevertheless, as agar can also represent a source of carbon, the aptitude of this bacterial
isolates to degrade sulcotrione was checked in MS-sulcotrione liquid medium.

3.3. Estimation of sulcotrione-degrading capacity of bacterial isolates
To get enough microbial biomass to set up a batch experiment to follow sulcotrione
transformation, each of the eight cultures were grown for 15 h in TS-herbicide medium. They
were then diluted to 0.3 OD at 600 nm in MS herbicide-supplemented medium. Dissipation of
herbicide and concomitant accumulation of CMBA and CHD in the culture medium was
monitored by high performance liquid chromatography. Among the eight isolates tested here,
only 1OP showed an increased OD from 0.3 to ca 0.7 after 30 days of incubation (Fig. 2),
reflecting a bacterial growth using sulcotrione as carbon source. 1TRANS, one of the seven
non growing strains was chosen as a non-degrading control. No significant growth was
measured neither for 1OP nor 1TRANS in MS sulcotrione-free medium under the same
incubation conditions. One could conclude that no interfering carbon sources are contained in
MS medium and, that sulcotrione most likely constitutes the sole carbon and energy source
for the growth of 1OP strain. HPLC/UV monitoring clearly showed the dissipation of
sulcotrione in 1OP culture and not in the two controls 1TRANS, the non-degrading isolate,
and the uninoculated MS-sulcotrione medium (Fig. 3). Sulcotrione dissipation was clearly
effective after six days lag phase which was in accordance with the lag phase observed for the
biomass development (Fig. 2). One could hypothesize that this lag phase is the time necessary
to induce the expression of the genes and the synthesis of the catabolic enzymes responsible
for sulcotrione transformation. From the seventh day of incubation, sulcotrione dissipation
kinetics could be reasonably described by a first-order kinetics (C = 121 e
-0.081t
,

R

= 0,993, n
= 3). DT
50
could be estimated to ca 15 days after the beginning of the incubation.
During the time course of sulcotrione transformation, one could observe the appearance of 2-
chloro-4-mesylbenzoic acid (CMBA), known as the main metabolite of sulcotrione herbicide
(Fig. 3). It has to be noticed that this metabolite was not observed in none of the two controls
1TRANS, the non-degrading isolate, and in the uninoculated MS-sulcotrione medium. CMBA
was detected from the sixth day of incubation which is in accordance with the lag phase
observed for the initiation of sulcotrione disappearance. After 1 month of incubation, the
Valorisation des travaux de recherche



220
concentration of CMBA reached 12 1 mg L
-1
(48 3 M) in the culture medium. This
result was confirmed by GC/MS analysis after derivatization of CMBA to give the
corresponding methyl ester. In addition, one could observe that molar recovery taking into
account sulcotrione and CMBA was slightly decreased between day 15 (0.065 7 mole L
-1
+ 0.025 2 mole L
-1
, respectively) and day 27 (0.017 2 mole L
-1
+ 0.048 3 mole L
-1
,
respectively), suggesting a possible degradation of benzoic acid derivative CMBA by 1OP.
Finally, based on the results presented here, one could conclude that 1OP strain was capable
of using sulcotrione as a carbon source for its growth by degrading sulcotrione to CMBA.
1,3-cyclohexanedione (CHD), the other degradation product of sulcotrione, previously
identified at very low concentrations in the Perpignan soil
3
was not detected (< 0.2 mg L
-1
) in
the culture media of strain 1OP neither by HPLC/UV nor by HPLC/MS/MS. One could
explain this discrepancy by chemical transformation by hydrolysis of CHD to 5-oxohexanoic
acid at pH>7, or by an oxidation mechanism catalysed by enzymatic cleavage of C-C bonds
in the -diketone before entering the tricarboxylic acid cycle (TCA), as previously
reported.
30,31-32
It is noteworthy that for mesotrione, another herbicide belonging to triketone
family but with a nitro radical, a minor metabolic route catalysed by a Bacillus sp. with a
comparable mechanism was reported.
11-12


3.4. Characterization of sulcotrione degrading (1OP) and non-degrading (1TRANS) strains
by ARDRA, REP-PCR and 16S rDNA sequencing
The amplified ribosomal rDNA restriction analysis technique (ARDRA) has been reported as
a reliable and valuable tool for phylogenetic and taxonomic studies of large sets of cultured or
uncultured microorganisms from different habitats.
33-36
In this study, 1OP and 1TRANS
isolates strains were characterized by ARDRA with AluI and HaeIII restriction
endonucleases. 1OP and 1TRANS bacterial strains showed similar ARDRA profiles made of
four major bands of approximately 550, 380, 210 and 70 bp in length. In order to get more
taxonomical information than the genus level offered by ARDRA fingerprinting 1OP and
1TRANS isolates were analysed by repetitive extragenic palindromic-PCR (REP-PCR) which
provides a rapid identification of bacterial isolates and are useful for the analysis of
prokaryotic genomes.
18,21
Again 1OP and 1TRANS bacterial strains showed similar REP-
PCR profiles made of five major bands of approximately 550, 400, 270, 150 and 100 bp in
length (Fig. 4). This observation suggests that 1OP and 1TRANS belong to the same bacterial
Valorisation des travaux de recherche



221
species. 16S rRNA sequencing further revealed that these two isolates showed identical 16S
rRNA sequences. We conclude that these isolates were different strains from the same
species. Comparison of 16S rRNA sequence with those found in GenBank showed highest
level of similarity (99% of similarity) to Pseudomonas sp. Furthermore, multiple alignments
revealed that 1OP and 1TRANS 16S rRNA sequences were closely related to Pseudomonas
putida strains both for 1OP and 1TRANS (Fig. 5). Based on 16S rDNA phylogenetic data, we
suggest naming our sulcotrione-degrading isolate Pseudomonas sp. 1OP. It was classified as
Bacteria, phylum Proteobacteria, class Gammaproteobacteria, order Pseudomonadales,
family Pseudomonaceae and genus Pseudomonas, with the following characteristics: rod
shaped, Gram-negative, one or more flagella providing motility, positive catalase test and
non-spore forming bacteria. Several strains belonging to Pseudomonas genus able to degrade
various pesticides have been described earlier among which Pseudomonas sp. ADP degrading
atrazine,
37
Pseudomonas cepacia DBO1 degrading 2,4-dichlorophenoxyacetic,
38
Pseudomonas
sp. degrading propoxur (2-isopropoxyphenyl-N-methylcarbamate).
39
Interestingly, the
isolation of two strains identical from the taxonomical point of view but differing by their
sulcotrione-degrading capacity, highlights the versatility of the degrading character. One
could hypothesize that such versatility might be due to mobile genetic elements (MGE)
surrounding catabolic genes in the genome of 1OP. MGE as plasmids, transposons, integrons,
genomics islands and bacteriophages were acting as a powerful evolutionary engine and
regulator on microbial populations and were collectively referred as drivers or vectors of the
horizontal gene pool
40,41
. Such properties are known to be associated with various strains of
genus Pseudomonas and its relatives, and were often specified by large (> 50kb) catabolic
plasmids, though the catabolic genes could also be loaded on transposable elements.
42-44

Further work will aim to differentially characterize the genetic determinants of the
sulcotrione-degrading ability of Pseudomonas sp. 1OP.

4 CONCLUSION
This work confirms the aptitude of the soil microflora of Perpignan to transform the
sulcotrione, although no enhanced biodegradation was observed after repeated exposure to
this herbicide. We report for the first time the isolation of a sulcotrione-degrading strain,
identified as Pseudomonas putida strain 1OP. This bacterial strain was shown to transform
sulcotrione to 2-chloro-4-mesylbenzoic acid (CMBA). Nevertheless, 1,3-cyclohexanedione
Valorisation des travaux de recherche



222
(CHD), another known sulcotrione metabolite was not detected. Based on the evolution of the
molar recovery of sulcotrione and CMBA during the time course of dissipation kinetics, we
hypothesized that Pseudomonas putida strain 1OP may start degrading the benzoic acid
derivative (CMBA) several days after its formation in the liquid medium.

ACKNOWLEDGEMENTS

The PhD work of Christophe Calvayrac was funded by Bayer Cropscience. The authors also
acknowledge the members of Laboratories of UPVD (LCBE, LGDP, IMAGE and IUT),
INSA Toulouse and INRA Dijon, France.


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Valorisation des travaux de recherche



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Valorisation des travaux de recherche



227



















Fig. 1: Electronic impact/mass spectrometry (EI/MS) spectrum of methylated CMBA
analytical standard
(20 mg L
-1
).








!
Valorisation des travaux de recherche



228







Fig. 2: Growth measurement of strain 1OP vs 1TRANS on mineral salt medium (MS)
supplemented with sulcotrione (100 M).










!
Valorisation des travaux de recherche



229









Fig. 3: Dissipation of sulcotrione and accumulation of CMBA by strain 1OP vs control and
strain 1TRANS in liquid mineral salt medium MS supplemented with sulcotrione (100 M).
Errors bars indicated standard deviation.









!
Valorisation des travaux de recherche



230


















Fig. 4: REP PCR analysis of the isolates 1OP and 1TRANS. REP-PCR were performed in
duplicate for each isolate with 1 ng L
-1
or 2 ng L
-1
of DNA. Lane M represents the
molecular-weight marker 1 Kb Plus DNA Ladder (sizes indicated in base pairs). Lanes 1 and
2: 1TRANS (1 ng L
-1
), lanes 3 and 4: 1TRANS (2 ng L
-1
), lanes 5 and 6: 1OP (1 ng L
-1
),
lanes 7 and 8: 1OP (2 ng L
-1
).









!
Valorisation des travaux de recherche



231











Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic analysis resulting from the multiple alignment of 16S
rRNA gene sequences of Pseudomonas putida strains 1TRANS (NBD) and 1OP (BD) with
those retrieved from GenBank database Arthrobacter creatinolyticus strain F75208
(HQ908759), Arthrobacter nicotianae strain HMF5 (GU220490), Streptomyces sp. SNI5
(GU320191), Rhizobium leguminosarum strain V-6 (GU306144), Agrobacterium tumefaciens
strain YQH34 (HQ143653), Methylopila sp. JZL-4 (FJ502233), Burkholderia cepacia strain
RFW-8 (HQ650586), Comamonas testosteroni strain H18 (EU887829), Acidovorax sp.
p4(HQ652596), Pseudomonas putida strain A (HQ697262), Pseudomonas putida strain T2g
(AB539810), Pseudomonas aeruginosa strain P28 (HQ697285), Pseudomonas fluorescens
strain C7R12 (AM229082), Pseudomonas fluorescens strain (HQ880245), Pseudomonas sp.
strain ADP (AM088478). Bootstrap values greater than 90 % are marked as black circles. The
phylogenetic distance is shown on a scale bar.




!
Valorisation des travaux de recherche



232





















Table 1: Degradation coefficients (k) and half-live (DT
50
) for all soils.





k (days
-1
) DT
50
(days) R
2


Treatment 1 (T1
D0
)

0.083

8

0.894
Treatment 2 (T2
D30
) 0.060 11.5 0.955
C Plot Treatment 3 (T3
D60
) 0.100 7 0.989
Treatment 4 (T4
D90
) 0.100 7 0.962

Mean value


0.085 0.020

8 2.5

-

Treatment 1 (T1
D0
)

0.088

8

0.872
Treatment 2 (T2
D30
) 0.093 7 0.936
4S Plot Treatment 3 (T3
D60
) 0.068 10 0.955
Treatment 4 (T4
D90
) 0.089 8 0.828

Mean value


0.084 0.012

8 2.0

-

StC Plot

Treatment 1 (T1
D0
)


0.0004

-

-

St4S Plot

Treatment 1 (T1
D0
)


0.0004

-

-
Valorisation des travaux de recherche
Publication n2
Pest Management Science Pest Manag Sci 64:86-93 (2008)
Behaviour of sulcotrione and mesotrione sc
where sciencemeets business
in two soils
www.sod.org
Hanene Chaabane,
1
Emmanuelle Vulliet,2 Christophe Calvayrac,
1
Camille-Michel Coste
1
and Jean-Franyois Cooper
1
*
1 Laboratore de Chme des Bomo/cu/es et de /'Envronnement, Centre de Phytopharmace, Unverst de Perpignan, 52 avenue Pau/
A/duy, 66860 Perpignan, France
2Service Central d'Analyses, CNRS, Chemin du Canal - BP 22- 69390 Vemaison, France
Abstract: The behaviour of sulcotrione, a recendy introduced triketone herbicide, in various soil types was studied
under laboratory conditions. In particular, degradation and sorption processes were examined on Ghent and
Perpignan soils. Kinetics showed that the degradation ofsulcotrione \vas influenced by biotic andlor abiotic factors.
Half-lives ranged between 45 and 65 days. Among the degradation compounds identified were 1,3-cyc1ohexanedione
(CHD) and 2-chloro-4-mesyl benzoic acid (CMBA) , previously described as hydrolysis products, and, under special
conditions, a derivative ofphenylheptanoic acid (PHD). This new degradation product suggested that sulcotrione
could follow two possible pathways in the soil, as in water. During the sorption study, a moderate retention
of sulcotrione and CMBA relative to CHD and PHD, which were high1y adsorbed whatever the soil type, was
reported. Experlments carrled out under the same conditions for sulcotrione and mesotrione, another triketone
herbicide recommended in maize culture, made it possible to compare the twotriketones and to conclude that they
exhibited relatively similar behaviour in the soil, Le. that their leaching potential needs to be proper1y addressed
and risks evaluated.
2007 Society of Chemical Industry
Keywords: sulcotrione; mesotrione; sol1; degradation; degradation products; sorption
1 INTROOUCTION
Among the long list of pesticides used for weed contro 1
in maize, two triketone herbicides, sulcotrione [2-(2-
chloro-4-mesylbenzoyl) cyclohexane-l ,3-dione] and
mesotrione [2-( 4-mesyl-;2-nitrobenzoyl) cydohexane-
1,3-dione] (Fig. 1), have proved their efficiency
against a broad spectrum of weeds.
1
,2 Their target
enzyme is 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,3-5
the inhibition of which leads to disturbance of plas-
toquinone and a-tocophrol biosynthesis. Intermil
symptoms are bleaching followed by necrosis and
death oftreated plants. Sulcotrione and mesotrione are
mainly recommended for post-emergence treatments,
at respective application doses of 300 and 150 g ha -[ ,
lower than those of atrazine or pendimethaline.
After direct application andlor foliage wash-off, a
large proportion of these triketone herbicides reaches
the soil, which always plays a key role in their
environmental fate. Soil sorption and degradation,
the major processes controlling pesticide actlVlty,
persistence and availability for transfer, are affected
by soil properties such as pH, day and organic
matter corrtents, t J . ~ e nature of the chemical arra
environmental conditions.
Literature concerning sulcotrione and mesotrione
provides only a few reports about their behaviour in
soil. Recent work has shown that sulcotrione exhibits
a moderate retention capacity, whatever the selected
soil.
6
Comparable results have beeri t;eported for
mesotrione.
7
For the degradation process, half-lives calculated for
sulcotrione and mesotrione have varied respectively
between 2 and 144 days and between 4 and
32days.7-10
The aim of this work was to assess the degradation
and sorption of sulcotrione and to compare these with
the degradation and sorption of mesotrione under
the same conditions. Their leaching potential towards
water resources could then be evaluated according to
their adsorption coefficients and half-lives.
2 MATERIALS ANO METHOOS
2.1 Chemicals
Standards of sulcotrione (purity 99.2%, molecular
mass 328 and water soIubility 165 mg L -1 at 25 oC)
and mesotrione (99.6%, molecular mass 339 and
water solubility 160 mg L -1 at 20 OC) were respectively
purchased from RiedeI-deHaen Gmbh (Germany) and
supplied by Syngenta (France). Both sulcotrione ana
mesotrione are weak acidic herbicides, with pKa values
of 2.87 and 3.12.
Standards of 1,3-cydohexanedione (CHD) (97.0%)
and 2-chloro-4-mesylbenzoic acid (CMBA) (95.0%)
233
Valorisation des travaux de recherche
o o el
6 : ~ 1iSO'CH'
Sulcotrione Mesotrione
Figure 1. Molecular structures of sulcotrione and mesotrione.
were respective1y supplied by Fluka and Acros
Organics. The phenylheptanoic acid derivative (PHD)
was synthesised as previously described.
11
Methanol and acetontrile (HPLC quality) were
purchased from Carlo Erba, dichloromethane (for pes-
ticide analysis) from Riede1-deHaen GmbH, trifluo-
roacetic acid (TFA) (99.0%) fromAldrich, hydroch10-
re acid (38.0%) from Prolabo and water was Milli-Q
quality. Stock solutions of each compound were pre-
pared at 1000 mg L -1 in methanol. For retention
studes, working solutions (0.25, 0.5, 1, 2.5, 10, 20
and 30 mg L -1) were prepared by di1ution of each
stock solution in distilled water, with the methano1
percentage never exceeding 3%.
Supe1clean EnviChrom P eartridges (3 mL, 0.25 g)
were purchased from Supelco and used for solid-phase
extraction of soil samples.
2.2 Soils
Two soils, Perpignan (France) and Ghent (Be1gium),
were se1eeted aecording to their physicoehemical
properties (Tab1e 1). The Freneh soi1 (a clayey sandy
loam soil, aeeording to FAO classificaton) was free of
any sulcotrione and/or mesotrione treatments, whereas
the Be1gian one (a sandy 10am sol) had been treated
yearly with sulcotrione from 1992 until 2003. The
two soi1 types were presieved to <2 mm and air
dried at ambient temperature. Pedo10gica1 analyses
were earried out by Laboratoire d' Ana1yses Agrieoles,
Perpignan, Franee, and Laboratory of Herbology,
Ghent Universty, Belgium. Sol moisture contents
were determined in the authors' 1aboratory aecording
to the method published by Mathieu and Pieltain 12 as
3.4 and 1.60% for the soil of Perpignan and Ghent
respective1y.
2.3 Degradation process
In order to assess the relative parts of the abiotic and
biotic ways in the degradation proeess, the kinetics of
degradation were determined using three protocols:
Table 1. Physicochemical properties of selected soils
CECb
Clay
(%)
Silt
(%)
Sand OCa (meq Ca
2
+
(%) pH (%) 1009-1) CEC (%)
Perpignan 13.9 60.5 25.6 8.1 0.9
Ghent 23.0 41.4 35.6 6.6 2
a Organic Carbono
b Cation Exchange Capacity.
Pest Manag Sci 64:86-93 (2008)
15.5
9.4
214.0
Behaviour of sulcotrione and mesotrione in soils
Perpignan and Ghent unsterilised soi1s maintained
at 25 oC (protoco1 1);
Ghent unsterilised soil maintained at higher tem-
peratures, 40 and 60 oC (protocol 2);
Perpignan and Ghent sols twice autoclaved at
120 oC over a period of 30 min, maintained at 25 oC
(protocol 3).
Sulcotrione additions were earried out under a
laminar flow hood.
For ea eh sol and for the three protoco1s, seven
sol samp1es (10.0 g) were treated in glass petri dishes
with a methanolic solution of sulcotrione (10.0 mg
L -1) or mesotrione (5.0 mg L -1, on1y for protocol
1) to give 0.5 or 0.25!J,gg-l, which corresponds
to the recommended application dose for each
triketone. AH samples were kept in darkness to avoid
photodegradation. Soil moisture content was fixed at
30% of dry weght and maintained constant during
the experimento At fixed dates (O, 3, 7, 14, 30, 60
and 120 days), one petri dish of eaeh soil (10.0 g) was
taken, extraeted and analysed by high-performance
liquid chromatography (HPLC) (see Section 2.5).
2.4 Batch sorption study
Aecording to OECD guideline,13 a sorption kinetic
study is needed to evaluate the agitation period
required to reaeh the equilibrium state, corresponding
to adsorption on the most accessible sites. For
eaeh compound, 1.0 g of soil was introduced into
a centrifugation glass tube contaning 5.0 mL of
working solution (initial concentration 30 mg L -1)
and shaken mechanicaHy for 0.5, 1, 2, 4, 8
and 24 h. The soil/solution suspension was then
centrifuged at 3500 x g for 10 min and the supematant
was analysed by HPLC (Section 2.5). Calcu1ations
were performed using an indirect method
13
based
on the difference between initia1 and equilibrium
concentrations in the supernatant, and led to the
establishment of distribution coefficient I ~ from the
following equation:
Kd = (Aeq x V
o
)/(100 - Aeq) x msoil (1)
where Aeq is the adsorption percentage at the
equilibrium state, Va is the ni tia! vo1ume of liquid
phase and msoil is the mass of soiL
The agitation time (8 h for sulcotrione and 24 h
for its degradation products and mesotrione) deduced
from adsorption kinetic plots was used for determining
the adsorption isot..1-}erms. Glass tubes containing
5.0 mL o working solution and 1.0 g of soil were
shaken mechanically during this agitation periodo
Samples were then centrifuged at 3500 x g for 10 min
and the supernatants were analysed by HPLC. Two
blanks (sol with aqueous solution free of chemicals
and aqueous solution without soil) were performed
under the same eonditions. Adsorption isotherms were
obtained by plotting solid-phase concentration, Os (mg
kg-
1
), versus liquid phase concentration at equilibrium
87
234
Valorisation des travaux de recherche
H Chaabane er al.
state, Ce,ads (mg L -1). The Freundlich model was
used to describe experimental results according to the
equation
(2)
where Kfa and linfa are empirical constants represent-
ing respectvely the Freundlch coefficient for adsorp-
tion and the slope of the isotherm which expresses its
degree of non-linearity.
Desorpton experiments were carried out on soil
samples treated at the highest concentration in the
adsorption process. After HPLC analysis, the super-
natant was removed and replaced with the same
volume of distilled water. The remainng slurry was
shaken for the same period (8 and 24 h) and cen-
trifuged at 3500 x g for 10 min, and the supernatant
was then removed and analysed. This desorption
procedure was repeated 3 times consecutively. The
amount of each chemical remaining adsorbed in the
sol after each desorption step, c
s
, was evaluated.
Desorption isotherms were obtained by plotting C
s
against Ce (the concentration of the compound in the
liquid phase after each desorption step). The fo11owing
Freundlich relationship was used to characterise the
desorption process:
where G
so
is the solid-phase concentration (mg kg-
1
)
of the compound adsorbed on the soil at equilibrium
status, Ceo is the compound concentration in the
liquid phase at equilibrium after adsorption and Kfd
and 11 nfd are respectively the empirical coefficient for
desorption and the slope of the curve which expresses
the desorption intensity of the compound from the
soil.
For both knetic and isotherm studies, experiments
were carried out in duplicate.
2.5 Analytical methodology
2.5. 1 Soil samples
Extracton step. In order to fo11ow triketone degrada-
tion, soil samples were extracted with 60 mL and then
with 30 mL of acetonitrile + 0.1 M hydrochloric acid
(90 + 10 by volume) over 30 and 15 min periods,
then filtered on a Whatman filter GF/A. The organic
filtrate was evaporated at 30 oC and the acidic aque-
ous solution was then extracted with dichloromethane
(2 x 5.0 mL). The organic phase was evaporated to
dryness, solubilised in 0.1 M hydrochloric acid, puri-
fied on preconditioned EnvChrom P cartridge and
fina11y eluted with methanol (5 mL). This final extract
was analysed by HPLC. One blank (sol with the
respective volume of methanol free from triketone)
was analysed under the same conditions.
Ghromatographc analysis. Soil extracts were analysed
usng a Shimadzu HPLC apparatus equipped with a
Supelco ODS Hypersil C
I8
column (5 11m, 250 mm x
4.6mm) and a SPD-I0 Avp UVNis detector set at
254 nm. The mobile phase consisted of a mixture of
water acidified' with 0.3 % trifl uoroacetic acid (A W)
and acetonitrile (ACN) delivered at a flowrate of
1 mL mn-l. A gradent system [70/30 (AW/ACN) at
t = O min to 50/50 (AW/ACN) at 8 min, maintained
for 10 mn] was used to mprove the separation
of the active ingredient and its metabolites during
degradaton and adsorption kinetics.
Analytical performance. The analytical method (sol
extracton and HPLC analysis) was based on the
procedures previously published
3
,14 and performed
for a11 soil/compound couples (Table 2).
2.5.2 Water samples
Water samples (for batch sorption study) were directly
analysed without any extraction concentraton step.
Chromatographc analysis was performed under the
same condtions as for sol samples, using isocratic.
mode when analysis concerned only one compound
Cfor isotherm study, since no degradation was observed
during adsorption kinetics). The proportions of mobile
phase were respectively 80/20 (AW/ACN) for CHD,
70/30 for CMBA and 50/50 for PHD, sulcotrione and
mesotrione. The detection limit was 0.05 mg L -1 for
all compounds under our chromatographic conditions.
3 RESUL TS ANO OISCUSSION
3.1 Triketone degradation and soil properties
The decline of sulcotrione concentration in soils
was plotted against incubation period as presented
in Figs 2a and b. Degradation rates, fo11owed over
a period of 120 days in Perpignan and Ghent ~ o i l s
according to protocol 1, were represented reasonably
by first-order kinetics
C = C
o
x e-
kt
(4)
(with r
2
values higher than 0.9), from which half-
life values were determined (these are reported
in Table 3). In equation (4), C
o
is the initial
concentration of the triketone, C is the concentration
after each incubation period t (days) and k is the
apparent kinetic constant.
The disappearance ofsulcotrione over an incubaton
period of 60 days was estimated as 55 and 45% of the
initial application dose and half-lives as 45 and 65 days,
respectively, on Ghent and Perpignan soils. .
Table 2. Analytical performance of the method used tor soil extraction and HPLC analysis
Oe!ection limi! (..g g-1)
Recovery rate (%)
88
Sulcotrione
0.05
90( 10)
CHD
0.001
50 ( 10)
235
CMBA
0.05
80 ( 10)
PHO
0.05
70 ( 10)
Mesotrione
0.01
70 ( 10)
Pes! Manag Sci 64:86-93 (2008)
Valorisation des travaux de recherche
'1
+ mesotrione sulcotrione

\.
01
0:6:
01
.6
(,)
+
;:1!

o 50 100 150
(a) Incubation period (days)
'1
+ mesotrione sulcotrione
:
.. ,

o 50 100
(b) Incubation period (days)
Figure 2. Rate of degradation of sulcotrione and mesotrione,
according to protocol 1, in (a) Ghent and (b) Perpignan soil.
Table 3. Degradation coefficients, K, and half-lives, DTsQ , for all
soil/triketone couples
Sulcotrione Mesotrione
OT50 OT50
150
K(day-1) (days) (2 K(day-1) (days) (2
Ghent
Perpignan
0.015
0.006
45 0.99
65 0.91
0.02
0.13
34 0.95
5 0.92
During this monitoring, degradation produets oE
sulcotrione were identified as CHD and CMBA
and sometimes PHD, and quantified. Their levels
are plotted against incubation period in Figs 3a and
b. These degradation produets had previously been
Eound during hydrolysis in aqueous media, where their
presence was particularly pH dependent.
11
Whatever
the soil type, analyses oE soil extracts showed the
presence oE CHD and CMBA, but PHD was deteeted
only in the Ghent soil which had a pH (6.6) slightly
lower than that of the Perpignan soi1. Therefore,
the two degradarion pathways already described in
,aqueous media can be found in the soi1, depending on
,pH value.
The firsr degradation pathway (A) consists oE a
hydrolytic cleavage berween 1,3-cyclohexanedione
and rhe benzoic ring, leading ro CHD and CMBA.
In Perpignan soil, only rhis degradarion pathway
occurred, since pH condirions were re1atively alkaline.
In Belgian soil, in parallel ro this firsr pathway, sul-
cotrione could Eollow another mechanism (B) leading
to PHD which is larer rransformed into CMBA. In
Pest Mana!! Sci 64:86-93 (2008)
Behaviour of sulcotrione and mesotrione in soils
0.003 s CMBA X
i: 0.002 Si:
"O
E

(.) 0.001
:
PHD ::: sulcotrione + CHD
:::

O 50 100 150
(a) Incubation period (days)
0.003
CHD R CMBA )K Sulcotrione
0.002
C1
"O
E

:tSK
(.)
0.001
)K
ilIi

i!I
)K
!I
O
O 50 100
(b) Incubation period (days)
Figure 3. Formation of degradation products of sulcotrione in
(a) Ghent and (b) Perpignan soil.
150
water and using a high initial sulcotrione concentra-
tion (30 mg L -1), during this last step, 1-(2-chloro-
4-mesyl)ethanone was detected as an intermediary
compound (lC) (Fig. 4), while it was nor Eound in the
soil under the present experimental conditions.
However, although the pH role appears evident, it is
suggested that biotic Eactors have a possible infiuence
on the degradation proeess. In fact, experiments
carried out in Perpignan soil after sterilisation
(protocol 3) showed that such treatment seemed
hardly to affeet sulcotrione degradation (Fig. 5b).
However, the predominance of the biotic pathway
over ehemical hydrolysis was les s evident in Ghent
soil (Fig. 5a). These results suggest that sulcotrione
can be degraded Eollowing both biotie and abiotic
ways, on soil origino This observation
was confirmed at high temperatures (protocol 2,
40 and 60 oC), especial1y in Ghent soil, where
sulcotrione appeared more stable at 40 oC (half-life
not evaluated) than at 25 oC (45 days) and at 60 oC
(32 days). An Arrhenius diagram, plottirtg In Kobs
against 1/ T (K) (Fig. 6), confirms that sulcotrione
follows three types oE pathway: a biotic pathway
at 25 oC, a predominant abiotic pathway at 40 oC
(where microorganisms can be affected) and an abiotic
pathway with a possible intervention oE thermophile
bacteria at 60 oc.
Furthermore, an available comparison between
the degradation oE sulcotrione and mesotrione was
possible; using the same experimental conditions
as described Eor prorocol l. The disappearance oE
mesotrione 14 days aEter treatment was estimared as
65 and 90% oE the initial applied dose, against 16
89
236
Valorisation des travaux de recherche
H Chaabane et al.
Sulcotrione CHD
(a)
o O CI

Sulcotrione
(b) CMBA
Figure 4. Degradation pathways (A and B) of sulco trio ne .
... Autoclaved soil Unsterilised soil
* Autoclaved soil Unsterilised soil
0.8
0.8
0.6
0.6



0.2

O 50 100 150 O 50 100 150
(a) Incubation period (days) (b) Incubation period (days)
Figure 5. Degradation rate of sulcotrione under sterilised conditions in (a) Ghent and (b) Perpignan soil (protoGol 3).
o
0.0 29 0.003 0.0031 0.0032 0.0033 0.0034
-1
-2
'" .c
'::t:.
0
-3
E
-4
A
-5 A"
-6
Figure 6. Arrhenius diagram for degradation of sulcotrione at 25, 40
and 60 oc in Ghent soil.
90
and 33% for sulcotrione, respectively, on Ghent and
Perpignan soils (Figs 2a and b). Whatever the soil
type, mesotrione (with the highest apparent constant,
k = 0.13 day-l) seemed to be more rapidly degraded
than sulcotrione. Half-lives for the two soils varied
between 5 and 34 days for mesotrione and between 45
and 65 days for sulcotrione (Table 3).
The present results suggested that physicochemical
properties of each soil (pH and OC) (see Table 1)
infiuenced the degradation process. Owing to their
weak acidic nature, the two triketones dissociate from
molecular to anionic form as the pH rises. Moreover,
the authors reponed in earlier work
11
that their anionic
form was more resistant to hydrolysis and photolysis
processes. However, in soil, the proportion ofionic and
Pest Manag Sci 64:86-93 (2008)
237
Valorisation des travaux de recherche
molecular forms is often difficult ro evaluate exactly
owing to the hard-to-foresee difference between the
pH value on the soil surface and in the outer bulk soil
solution.
7
Under these experimental conditions (25 oC,
unsterilised soils and a soil moisture content of 30%),
close to conditions, the relatively high stability
of sulcotrione (under its anionic form) in Perpignan
soil could be attributed ro the alkaline pH of this
soil. For mesotrione, the present experimental results
showed that it disappeared more rapidly than sul-
cotrione in Perpignan soil, whereas on the Ghent
soil there was no important dfference between the
degradation behaviour of the two compounds (45 and
34 days respectively for sulcotrione and mesotrione).
This observation suggested the presence of other fac-
tors influencing the degradaton process. The rapid
disappearance of mesotrione in Perpgnan soil could
. be attributed to its possible reduction to the corre-
sponding amino compound owing to the hypothetical
presence of specific microflora.
With the exception of the half-life of mesotrione
i in Perpignan soil (5 days), all other half-lives were
, relatively high (34-65 days) and could be due ro the
presence of nitro and halogen moieties that did not
, allow rapid mineralisation of the compounds.
15
3.2 Sorption behaviour of sulcotrione and
mesotrione
The sorption behaviour of sulcotrione, CHD and
CMBA has been reported previously.
6
It was shown
that sulcotrione and CMBA are moderately adsorbed
whatever the soil type, whereas CHD presents the
highest adsorption capacity. Values of adsorption
coefficients are reported in Table 4.
As a consequence of identification of degradaton
pathway B, identification of PHD as a new metabolite
led the authors to study ts sorption characteristics
under the same conditions. Using kinetic and isotherm
, studies, the distribution and sorption coefficients Kct
, and K
fa
were determined for PHD. Kinetic results
showed that PHD exhibits an adsorprion behaviour
relatively close to that of CHD (K
d
varied between
: 0.18 and 5.40 L kg-
1
for CHD and between 2.00 and
5.00 L kg-
I
for PHD). This preliminary observation
was confirmed by an isotherm study, with K
fa
values
of 1.6 and 25.0 respectively for Perpignan and Ghent
soil. As with CHD, the metabolire PHD seemed ro be
more adsorbed than CMBA and sulcorrione (Fig. 7).
Perpignan soil had the iowest Kfa values. Even if it is
difficult to classify soils using Kfa values when linfa
is significantly different from 1, it seemed possible to
consider Perpignan soil as having the lowest adsorption
capacity. This soil is characterised by a low organic
matrer content and a slightly alkaline pH (Table 1)
compared with Ghent soil. The acidic character of
sulcotrione and its degradation products allow possible
repulsion between their anionic forms and negatively
charged soil surfaces. This observation has al so be en
Pest Manag Sci 64:86-93 (2008)
Behaviour of sulcotrione and mesotrione in soils
Table 4. Adsorption coefficients of sulcotrione, its degradation
products and mesotrione
Sorptlon coefficlent Ghent soll Perplgnan soll
Sulcotrlone Kfa
1.54 1.30
a
1nfa 1.02 0.87
a

Koc 74.0 144.0
a
K
fd
0.026 n.d.
Total desorptlon (TO%) 91.0 n.d.
CHO
Kta
10.0 1.4
1/nfa 0.52 0.64
Koc 492.0 155.0
Ktd
n.d. n.d.
TO% 2.5 11.0
CMBA Kfa
0.39 0.35
1nfa 1.02 0.87
Koc 20.0 39.0
Kfd n.d. n.d.
TD% n.d. 4.0
PHO Kfa 25.0 1.6
1nfa 0.91 0.85
Koc 1231.0 178.0
Kfd n.d. n.d.
TO% 12.0 14.0
Mesotrlone Kfa
1.57 0.14
1nfa 0.55 1.43
78.0 16.0
Kfd 10.08 n.d.
TO% 30.00
a Adsorption coefficient only far low concentrations.
150
-*-sulcotrione --+-CHD ___ CMBA -lf- PHD
30
1501-*-sulcotrione --+-CHD ___ CMBA -lf- PHD
100
el
el

O 50 I

o 5 10 15 20 25 30
(b)
Ce (mg L-
1
)
Figure 7. Adsorption isotherms of sulcatrione and its degradation
products in (a) Ghent and (b) Perpignan soil.
reported for other weak acidic herbicides such as 2,4-
D
1
6 and 1FT. 17
In parallel to sulcotrione and its degradation
products, a sorption srudy of mesotrione was
conducted under the same conditions. Kinetic results
91
238
-.0;,.., .-.
Valorisation des travaux de recherche
H Chaabane et al.
150
100
el

O'" 50
__ Ghent
..... Perpignan
o -,-----,--:_
(a)
I
el

150
100
O"' 50
o 5 10 20 25 30
__ Ghent Perpignan
-
.... _ ....._ .. _"',... =======- ..
O 5 10 15 20 25 30
(b)
Figure 8. Adsorption isotherms of (a) sulcotrione and (b) mesotrione
on Ghent and Perpignan soils.
showed that Kd for mesotrione ranged from 0.22
to 0.44 L kg-
1
For sulcotrione, no adsorption was
observed on Perpignan soil, but on Belgian soil Kd
was 0.66 L kg-
1
This moderate adsorption of the
two triketones was verified by isotherm results. As
shown in Fig. 8, according to the classification ofGiles
et al., 18 adsorption isotherms are L-type, expressing a
moderate affinity between soil and herbicide and a
decrease in the availability of adsorption sites with
increasing liquid concentration. Experimental data
were well fitted by the Freundlich model [equation (2),
r
2
values ranging between 0.89 and 0.91], and
a log-log transformation allowed us to estimate
Kfa and linfa reported in Table 4. The adsorption
coefficient normalised to the organic carbon content
of the soil, K
oc
, is a useful indicator of the binding
capacity of a chemical on organic matter of soil and
allows a comparison between different compounds.
According 10 K
fa
and Koc values, adsorption capacity
was slightly more important on Ghent than on
Perpignan soil, where K
fa
was established only for low
concentrations as no adsorption was determined using
high concentrations. Adsorption of the two triketones
was slightly different, and this was probably due
to their molecular structure, particularly the moiety
in position 2 of the cyc1ic ring (Fig. 1). The N0
2
moiety could exercise more steric hindrance than CI
to reaching adsorption sites.
As previously reported,
6
sulcotrione adsorption in
soils increased with c1ay content, while organic matter
content and pH played a minor role, and this result
seemed to be verified for mesotrione.
92
The Freundlich relationship was tried for al!
compounds to evaluate desorption experimental
results. For sulcotrione, the K
fd
values and the total
desorption percentage (70%) showed its relatively high
desorption capacity. For the degradation products, the
present results did not fit the Freuncilich equation
well. However, the total desorption percentage
( < 15 %) (Table 4) showed their lower aptitude for
desorption under the present experimental conditions.
For mesotrione, the desorption percentage (30%)
was lower than for sulcotrione, suggesting that the
adsorption process was not totally reversible and led
to the presence of a hysteresis phenomenon.
4 CONCLUSION
This study, carried out on two soil types with different
physicochemical properties, provides supplementary
information about sulcotrione behaviour in soils. A
comparison with mesotrione could be established
as experiments were carried out under the same
conditions. The two triketones exhibited moderate
adsorption in both soil types tested. However,
degradaton processes depended on soil type and
campound properties.
It was proposed to evaluate the potential for
reaching water resources accordiilg to the sorption
and degradation coefficients. Among the list of
mathematical models, the groundwater ubiquity score
(GUS)19 is the most simple model giving preliminary
but available information about the leaching potential
of the two triketones. According to the equaton
GUS = 10g(tl/2
so
i') x [4 -log(Koc)] (5)
the GUS values are 3.5, 3.2, 3.3 and l.9 for the
couples sulcotrione or mesotrione/Ghent
and sulcotrione or mesotrione/Perpignan. In both soil
types, sulcotrione and mesotrione could be c1assified
as substances for which the leaching potential must be
addressed (with GUS values higher than 2.8), even if
this potential seemed to be limited for mesotrione
in Perpignan soil. In order ro refine the leaching
patential, these results might be complemented with
experimental values obtained using leaching soil
column or lysimeter devices. However, a proper
assessment of risk for leaching should be performed
with data obtained from GLP studies (adsorption,
laboratory degradation rate) and with calculations
of predicted environmental concentrations under
the scenarios developed by the European FOCUS
group.20
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93
240
Valorisation des travaux de recherche



241
Communicationscientifique

Actes du 37
me
congrs du Groupe Franais des Pesticides,
Bordeaux (mai 2007)

Transfert de la Sulcotrione, Herbicide du Mas, sur Mini-colonnes de Sol Reconstitu





Hanne Chaabane, Christophe Calvayrac et Jean-Franois Cooper

Laboratoire de Chimie des Biomolcules et de lEnvironnement, Centre de Phytopharmacie,
Universit de Perpignan, 52 avenue Paul Alduy, 66860 Perpignan, France


1- Introduction

Le devenir dun produit phytopharmaceutique et de ses produits de dgradation, aprs
application au champ, est fortement conditionn par les processus de dgradation et de
rtention. Ces processus ont t tudis dans le cas de la sulcotrione [2-(2-chloro-4-
methylsulfonylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione], substance active herbicide de la famille des
trictones, aussi bien dans leau (avec ou sans irradiation) que dans le sol (Chaabane, 2005,
Chaabane et al., 2005, Chaabane et al., 2007a et b). Les mmes produits de dgradation (1,3-
cyclohexanedione ou CHD, acide 2-chloro-4-mthylsulfonylbenzoque ou CMBA, drivs de
lactophnone et de lacide phnyl heptanoque) ont t identifis dans les deux cas
(Chaabane et al., 2007a et b).
Les processus de dgradation et dadsorption-dsorption participent au transfert horizontal
et/ou vertical de la substance active et des produits de dgradation. Le modle empirique de
Gustafson (1989), qui met en relation le temps de demi-vie ainsi que les constantes
dadsorption, nous a permis destimer le potentiel de lessivage de la sulcotrione (Chaabane,
2005): cette molcule pourrait tre classe parmi les substances prsentant un risque de
transfert relativement facile vers les eaux souterraines. Dans la littrature, certains rsultats
Valorisation des travaux de recherche



242
corroborent notre estimation (Cherrier, 2003), dautres indiquent labsence de transfert de la
sulcotrione au del de 20 cm de profondeur (Rouchaud et al., 1996 et 1998a et b, Baer et

Calvet, 1999). Cela nous a conduit tudier le mcanisme de transfert de la sulcotrione
laide dun dispositif exprimental appropri.
En parallle, un autre objectif de cette tude tait de comparer le potentiel de lessivage de la
sulcotrione celui de deux autres substances actives souvent dtectes dans les ressources en
eau: latrazine et la bentazone, dont lutilisation a t ou reste homologue en masiculture.

2- Matriels et mthodes

2-1 Ractifs chimiques

- Standards analytiques: La sulcotrione (99,2%), latrazine [(2-chloro-4-ethylamino-6-
isopropylamino-S-triazine] et la bentazone [3-isopropyl-(1H)-Benzo-2,1,3-thiadiazin-4-(3H)-
one 2,2-dioxide] proviennent de Riedel-de Han. Leurs proprits physico-chimiques ainsi
que les doses agronomiques recommandes sont runies dans le tableau 1. Une solution mre
de chaque substance active a t prpare dans le mthanol 1000 mg.L
-1
et conserve
lobscurit 4C. Les solutions de traitement ont t prpares 100 mg.L
-1
par dilution des
solutions mres dans leau distille. La CHD (97,0%), le CMBA (95,0%) et la 1-(2-chloro-4-
methylsulfonyl) thanone (96,6%) proviennent respectivement de Fluka Chemica, Acros
Organics et Bayer CropScience. Lacide 5,7-dicto-7-(2-chloro-4-mthylsulfonylphnyl)
heptanoque (96,6%) a t synthtis suivant la mthode publie par Chaabane et al. (2007b).

- Autres ractifs : Les solvants organiques (Mthanol, actonitrile sont de qualit
CLHP, le dichloromthane est de qualit pour analyses de rsidus de pesticides) sont fournis
par Carlo Erba, lacide trifluoroactique (TFA, 99,0%) de la part dAldrich, lacide
chlorhydrique (HCl, 38%) de Prolabo et leau est de qualit milliQ.




Valorisation des travaux de recherche



243





Tableau 1 : Proprits physico-chimiques de substances actives utilises.


2-2 Sols

Deux types de sols, nomms Perpignan (sol limono-sablo argileux, pH= 8,1 et M.O= 1,7%)
et Belgique (Sol sablo-limoneux, pH= 6,6 et M.O= 3,5%) ont t slectionns, tamiss (<
2mm), schs lair libre et conservs +4C jusqu leur utilisation.

2-3 Dispositif experimental

Des mini-colonnes de sol reconstitu (diamtre interne 8,0 cm et hauteur 15,0 cm, munies
dun tamis et dun entonnoir) ont t places en plein champ ou sous serre. Dans chaque mini-
colonne a t place une couche fine de bille en verre de 0,6 mm de diamtre puis 10,0 cm de
chaque type de sol correspondant respectivement 550 g et 625 g (Perpignan et Belgique) en
tenant compte de la densit de chaque type de sol, respectivement 1,1 et 1,3.
Afin dtudier leffet de ltat initial du sol avant traitement, deux tats hydriques des sols ont
t choisis correspondant aux sols "naturels" de Belgique et de Perpignan sans humidification
pralable : BN et PN et aux sols saturs BS et PS, pralablement saturs en eau, par un
passage rgulier deau distille durant un jour avant traitement.
Les sols (PN, PS, BN et BS) ont t traits au double de la dose recommande pour la
sulcotrione (600 g.ha
-1
). Les mini-colonnes ont t places sous serre et ont reu un volume
Standard
analytique
Poids molculaire
g.mol
-1

pKa Hydrosolubilit
mg.L
-1

Dose agronomique
recommande g.ha
-1

Sulcotrione 328 2,87 165 300-450
Atrazine 215 1,7 33 1100
Bentazone 240 3,3 570 1392
Valorisation des travaux de recherche



244
deau de 50 mL, tous les quatre jours environ, afin de se rapprocher des conditions naturelles.
Dans le cas des traitements avec latrazine, la bentazone et la sulcotrione, nous avons opt
pour des traitements simulant les doses agronomiques recommandes, soit 550, 696 et 150 g
de substance active par mini-colonne de sol (tableau 1). Lexprimentation a t mene sous
serre seulement avec le sol de Perpignan initialement satur en eau avant le traitement.
Paralllement aux mini-colonnes traites, deux blancs de chaque type de sol ont t conduits
dans les mmes conditions pour vrifier labsence dinterfrence au niveau des
chromatogrammes des extraits de sol ou des percolats.

2-4 Mthodologie analytique

Afin de suivre lvolution de la sulcotrione, de ses mtabolites, de latrazine et de la
bentazone, les percolats ont t rcuprs aprs chaque apport deau puis analyss sans
concentration pralable par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP).
Lvolution de lensemble des molcules travers le profil du sol a t suivie, aux dates
prfixes (0, 4, 7, 15, 30 et 60 jours aprs le traitement), en procdant un fractionnement du
profil en trois horizons (h1=0-3, h2=3-6 et h3=6-10 cm). Chaque horizon a t par la suite
homognis et un chantillon de 10 g a t extrait suivant la mthode prcdemment publie
(Chaabane et al., 2007a) puis analys par CLHP. Le systme chromatographique utilis est
une chane CLHP Shimadzu quipe de deux pompes LC-10ADvp (dbit 1mL.min
-1
, les
modes en gradient dlution utiliss sont prsents dans le tableau 2), dune colonne Supelco
ODS Hypersil C
18
(5m, 250 mm x 4,6 mm) et dun dtecteur UV/Visible SPD-10Avp fix
254 nm.









Valorisation des travaux de recherche



245
Molcule Phase mobile Gradient dlution
Sulcotrione et ses
mtabolites
Bentazone
A = actonitrile
B = eau acidifie par
le TFA 0,3 %
30% 50% (A) en 8 min, puis
maintien 50% (A) pendant 10 min
Atrazine et ses
mtabolites
A = actonitrile
B = eau milliQ
30% (A) / 70% (B) : 1min
30% 60% (A) en 6 min puis
maintien 60% (A) pendant 8.50 min.
Tableau 2 : Conditions danalyse chromatographique.

3- Rsultats et discussion

3-1Transfert de la sulcotrione sur mini-colonnes de sol reconstitu, sous serre

3-1-1 Dynamique de lessivage de la sulcotrione : Analyse des percolats

Lvolution des volumes deau percols ainsi que la concentration de la sulcotrione dans les
deux types de sols de Perpignan et de Belgique, quel que soit leur tat avant traitement, sont
prsents dans les figures 1a et 1b. Au cumul des volumes deau percols la fin du suivi,
nous pouvons conclure que quel que soit ltat initial du sol, le sol de Belgique semble
montrer une rtention deau lgrement suprieure celle du sol de Perpignan
(respectivement 339, 98, 415 et 141 mL sur BS, BN, PS et PN, figure 1). Ce comportement
hydrique, avec une diffrence significative suivant ltat du sol avant traitement, aura une
influence sur la dynamique de lessivage de la sulcotrione et ventuellement de ses
mtabolites. En effet, les premiers rsidus de sulcotrione ont t dtects ds le 3
me
apport
deau (150 mL), ce qui correspondrait au volume de la macroporosit occupe par leau
mobile du sol satur.






Valorisation des travaux de recherche



246





a) b)
Fig. 1 : Dynamique de lessivage de la sulcotrione dans les percolats a)- du sol de Perpignan et
b)- du sol de Belgique.



Les concentrations sont nettement suprieures dans les percolats du sol de Perpignan par
rapport celles enregistres sur le sol de Belgique (figure 1). Ce rsultat laisse penser un
mouvement de la sulcotrione (moyennement soluble et faiblement retenue sur ce type de sol
(Chaabane et al., 2005) en profondeur avec le flux deau travers les macropores. Ces
concentrations tendent diminuer malgr un apport deau rgulier, expliquant soit une
dispersion de la substance active et formation de rsidus lis, soit lintervention dune
dgradation biotique.
En rsum, les quantits exportes semblent fortement corrles aux volumes deau drains,
et montrent que malgr des concentrations sensiblement identiques dans le cas du sol de
Belgique, les quantits exportes sont trois fois plus importantes sur le sol satur (2%) que sur
le sol naturel (0,85%). Ces quantits restent nettement infrieures celles dtectes sur le sol
de Perpignan avec un maximum de 18% sur le sol initialement satur en eau (PS).
Valorisation des travaux de recherche



247
Concernant les mtabolites dtects dans les percolats, nous avons identifi uniquement le
CMBA (prcdemment dcrit en conditions de laboratoire par Chaabane et al. (2005)) qui a
manifest le mme comportement de lessivage que la molcule mre. Dans les percolats du
sol de Belgique, aucun mtabolite na t dtect des teneurs suprieures la limite de
dtection de notre mthode danalyse.
Au vue des quantits de sulcotrione et de ses mtabolites exportes tout au long du suivi, nous
pouvons dduire que la sulcotrione est assez faiblement transfre au del de 10 cm de
profondeur.

3-1-2 Dynamique de lessivage de la sulcotrione : Analyse des horizons de sol

Les teneurs en rsidus de sulcotrione distribus dans les horizons des sols de Belgique et de
Perpignan sont prsentes dans les figures 2a et 2b, aussi bien pour les sols naturels
quinitialement saturs en eau. Lanalyse des horizons de sols permet de confirmer les
rsultats de lanalyse des percolats (2.1.1). Les concentrations de la sulcotrione dtectes dans
le sol de Perpignan sont nettement plus faibles que dans les horizons du sol de Belgique.









a)- Sol de Perpignan b)- Sol de Belgique
Fig. 2 : Dynamique de lessivage de la sulcotrione travers le profil du sol.





4J8J
32J61J
PN
PS
4J8J
32J
BN
BS
61J

Valorisation des travaux de recherche





248












Fig. 3: Comparaison des rsidus de la sulcotrione par rapport ceux de latrazine et de la
bentazone, dans les mini-colonnes de sol reconstitu.

Les proprits physico-chimiques de ce type de sol, entranant une rtention plus importante
de la sulcotrione comparativement au sol de Perpignan, pourraient expliquer ces teneurs
leves et la persistance surtout sur sol "naturel". Ces rsultats montrent : (i) une stabilisation
des rsidus dans lhorizon superficiel (h1=0-3cm) jusqu 15 jours aprs le traitement sur le
sol de Belgique (ii) une distribution plus homogne sur le sol de Perpignan entre les horizons
h1 et h2 et (iii) une absence de rsidus dans lhorizon h3 expliquant labsence de sulcotrione
dans les percolats.
Lanalyse des horizons de sols a rvl la prsence des produits de dgradation identifis,
notamment le CMBA (prcdemment dtect dans les percolats) et la CHD sur le sol de
Perpignan (naturel et satur) et en plus le driv de lacide phnyl heptanoque sur le sol de
Belgique. Ce mtabolite a t particulirement identifi dans lhorizon superficiel (0-3cm) ce
qui pourrait tre expliqu soit par sa forte rtention et donc sa stabilisation en surface ou
encore par son unique formation par voie biotique qui serait absente en profondeur.

3-2 Transfert de la sulcotrione sur mini-colonnes de sol reconstitu, en plein champ

Valorisation des travaux de recherche



249
En parallle, le dispositif exprimental a t plac en plein champ en conditions naturelles de
temprature et de prcipitations. Trois pisodes pluvieux ont t enregistrs tout au long du
suivi, dont seulement un survenu le 12/02/2005, qui tait efficace. Les percolats analyss ont
rvls des quantits de sulcotrione exportes nettement suprieures celles enregistres en
conditions sous serre (particulirement sur sol naturel BN et PN respectivement 5 et 3%).

Lanalyse des horizons de sols montre galement des teneurs plus importantes sur le sol de
Belgique, quel que soit ltat initial du sol dans les divers horizons jusqu 53 jours aprs
traitement. Ce rsultat peut expliquer une certaine activit rsiduelle de la sulcotrione dans le
sol, prcdemment souligne par Cools et al. (1997).
Par contre, trois mois aprs traitement, la sulcotrione na t dtecte ni dans les percolats ni
dans les horizons de sol, une profondeur de 10cm.

3-3 Comparaison du potentiel de lessivage de la sulcotrione, de la bentazone et de latrazine

Les rsultats de lanalyse des percolats rvlent que les pourcentages dexportation de la
sulcotrione et de latrazine (sensiblement identiques, respectivement 2 et 3%) restent
nettement infrieurs celui de la bentazone (13% de la dose initiale applique).
Lvolution des rsidus de chaque substance active dans la mini-colonne durant le suivi est
reprsente par la figure 3.


Sur le sol de Perpignan (PS), les teneurs en sulcotrione nexcdent pas 1% jusqu la fin du
suivi. Ces faibles teneurs par rapport aux rsultats prcdents seraient expliques par des
conditions climatiques, notamment de temprature, diffrentes par rapport au premier suivi.
Dans le cas de latrazine, les teneurs, importantes au dbut du suivi, tendent diminuer quel
que soit lhorizon de sol pour atteindre au total 10% de la dose initiale sur lensemble du
suivi. Malgr une dose dapplication 5 fois plus importante que celle de la sulcotrione, les
teneurs restent faibles tmoignant une dgradation rapide de cette substance active dans ce
type de sol. Un rsultat similaire, sur des colonnes de sol non perturb, a t prcdemment
soulign par Cherrier (2003).
Valorisation des travaux de recherche



250
Dans le cas de la bentazone, nous avons enregistr une rpartition plus homogne travers le
profil du sol tmoignant un dplacement rapide avec le mouvement de leau, li sa forte
hydrosolubilit. Au cours du temps, les teneurs en bentazone tendent diminuer montrant le
mouvement de transfert avec le flux prfrentiel et rappelant les fortes concentrations
enregistres dans les percolats.

4- Conclusion

Les rsultats de ce prsent travail nous ont permis de modrer les prvisions tablies daprs
les calculs moyennant le modle GUS. Ltat du sol sec avant traitement contribue limiter le
transfert de la sulcotrione et favoriser sa stabilisation dans les horizons superficiels. Par
contre, elle semble facilement lessive sur sol initialement satur en eau malgr une
dgradation plus rapide. Les rsultats en plein champ restent tributaires de la frquence, du
volume et des dbits des apports deau aprs traitement.
La comparaison du comportement de lessivage de la sulcotrione, de latrazine et de la
bentazone nous a permis de conclure que cet herbicide trictone prsenterait un risque de
transfert et de stabilisation limit par rapport celui des deux autres substances actives.


5- Rfrences

Baer, U. et Calvet, R. Fate of soil applied herbicides: experimental data and prediction of
dissipation kinetics. J. Environ. Qual. 1999, 28, 1765-1777.
Chaabane, H.; Cooper, J.F.; Azouzi, L. et Coste, C.M. Influence of soil properties on
adsorption-desorption of sulcotrione and its hydrolysis metabolites on various soils. J. Agric.
Food Chem. 2005, 53, 4091-4095.
Chaabane, H. Etude de la stabilit et du comportement de la sulcotrione dans l'environnement
: eaux et sols agricoles. Thse de l'Universit de Perpignan, 2005, 154 p.
Chaabane, H.; Vulliet, E.; Cooper, J.F.; Calvayrac, C. et Coste, C.M. Behaviour of sulcotrione
on various soils : comparison with another triketone herbicide. Pest Management Science
2007a, Sous press.
Valorisation des travaux de recherche



251
Chaabane, H.; Vulliet, E.; Joux, F., Lantoine, F.; Conan, P.; Cooper, J.F. et Coste C.M.
Photodegradation of sulcotrione in various aquatic environments and toxicity of its
photoproducts for some micro-organisms. Water Research 2007b, 41, 1781-1789.
Cherrier, R. Impact sur l'environnement de deux herbicides du mas: la sulcotrione et
l'atrazine Influence du changement d'apports organiques. Thse de l'INPL-Nancy, 2003, 175
p.
Cools, K.; Bulcke, R. et Callens, D. Response of replacement crops to soil-applied
sulcotrione. Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent. 1997, 64, 721-726.
Gustafson, D. I. Groundwater Ubiquity Score : a simple method for assessing pesticide
leachability. Environmental Toxicology and Chemistry 1989, 8, 339-357.
Rouchaud, J.; Thirion, A.; Callens, D. et Bulcke, R. Soil dissipation of the Post-Emergence
Sulcotrione in maize crops treated with organic fertilisers. Bull. Environ. Contam. Toxicol
1996, 57, 398-405.
Rouchaud, J.; Neus, O.; Bulcke, R.; Cools, K. et Eelen,H. Sulcotrione soil metabolism in
summer corn crops. Bull. Environ. Contam. Toxicol 1998a, 61, 669-676.
Rouchaud, J.; Neus, O.; Callens, D. et Bulcke, R. Sulcotrione soil persistence and mobility in
summer maize and winter wheat crops. Weed Research 1998b, 38, 361-371.



Annexes



252

Table des annexes

Annexe 1 : Fiche AGRITOX sulcotrione.





Annexe 2 : Chromatogrammes CLHP/UV du milieu de culture (MS)
pour lisolat bactrien 1OP.

Annexe 3 : Chromatogrammes CPG/SM du milieu de culture (MS)


pour les isolats bactriens 1OP et 1TRANS au bout de 27 jours
dincubation.
Annexes



253

ANNEXE1

AGRITOX - Base de donnes sur les substances actives
phytopharmaceutiques


FICHE SULCOTRIONE


Dernire mise jour de la fiche d'information le 05/11/2002

1 - IDENTIT
Substance active : sulcotrione
Source de l'information : union europenne
Activit biologique principale : herbicide
Famille chimique : trictone
Dnominations
ISO : sulcotrione
NOU : sulcotrione
PRO : sulcotrione
ANC : chlormesulone
CAS : 99105-77-8
Noms chimiques
CAS : 1,3-CYCLOHEXANEDIONE, 2-[2-CHLORO-4-
(METHYLSULFONYL)BENZOYL]-
CAS : 2-[2-chloro-4-(methylsulfonyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione
Formule brute : C14 H13 Cl O5 S
IUPAC : 2-(2-chloro-4-mesylbenzoyl)cyclohexane-1,3-dione
Poids molculaire : 328.77
Formule plane :

2 - PROPRITS PHYSIQUES ET CHIMIQUES

2.1 ETAT PHYSIQUE
solide amorphe
2.2 PRESSION DE VAPEUR (TENSION DE VAPEUR)
5.39 Pa 25 C
2.3 CONSTANTE DE HENRY
Annexes



254
2.4 SOLUBILITS DANS L'EAU
0.165 g/l
2.5 SOLUBILITS DANS LES SOLVANTS ORGANIQUES
acetone : 40 g/l
chlorobenzene : 10 g/l
ethanol : <6 g/l
xylene : <6 g/l
2.6 COEFFICIENT DE PARTAGE OCTANOL/EAU

2.7 VITESSE D'HYDROLYSE (STABILITE)
temps de demi-vie : 100 jour(s) au pH de 7 - Mthode : EPA
2.8 VITESSE DE PHOTOLYSE DANS L'EAU
2.9 RENDEMENT QUANTIQUE de la phototransformation dans l'eau lambda > 290
nanomtres
2.10 DISSOCIATION DANS l'EAU
3 - TOXICIT
3.1 ABSORPTION, DISTRIBUTION, LIMINATION ET MTABOLISME
3.2 ABSORPTION DERMALE
3.3 TOXICIT AIGU PAR VOIE ORALE
DL50 rat : >5000 mg/kg - Sexe : MF - Souche : Sprague Dawley - Vhicule :
en solution dans l'huile de mais - Mthode : EPA / OCDE
3.4 TOXICIT AIGU PAR VOIE DERMALE
DL50 lapin : >4000 mg/kg - Sexe : MF - Souche : Stauffland - Mthode :
EPA / OCDE
3.5 TOXICIT AIGU PAR INHALATION
Toxicit aigue par inhalation, 4 heures, rat - Sexe : MF - Souche : Wistar
derive
CL50 : >=1.63 mg/l d'air
3.6 IRRITATION CUTANE
Test d'irritation cutane, lapin : non irritant - Mthode : Draize
3.7 IRRITATION OCULAIRE
Test d'irritation oculaire, lapin : moderement irritant - Mthode : Draize
3.8 SENSIBILISATION CUTANE
Sensibilisation retarde par voie cutane, cobaye : sensibilisant
Magnusson et Kligmann
3.9 GNOTOXICIT
3.10 TOXICIT TERME ET CANCROGNSE
Toxicit par voie orale et tude de la cancrogense, 18 mois , souris - Sexe
: M - Souche : CD-1
DSE/CSE = 3000 ppm
Toxicit par voie orale et tude de la cancrogense, 18 mois , souris - Sexe
: F - Souche : CD-1
DSE/CSE = 350 ppm
Toxicit par voie orale, 2 ans , rat - Sexe : M - Souche : CD
DSE/CSE = 1 ppm
Toxicit par voie orale, 2 ans , rat - Sexe : F - Souche : CD
DSE/CSE = 20 ppm
3.11 TOXICIT SUR LA REPRODUCTION ET LE DVELOPPEMENT
Annexes



255
Reproduction sur deux gnrations par voie orale, rat
DSE parents = 0.05 mg/kg/j
DSE descendance = 0.05 mg/kg/j
DSE reproduction = 0.5 mg/kg/j
toxicite generale
Tratogense par voie orale, rat
DSE foetus = 100 mg/kg/j
Tratogense par voie orale, lapin
DSE foetus = 300 mg/kg/j
3.12 NEUROTOXICIT
3.13 AUTRES TUDES
3.14 DOSE JOURNALIRE ACCEPTABLE (DJA)
DJA = 0.0004mg/kg/j DSE = 0.04 mg/kg p.c./j (2 ans, voie orale, rat )
(Dcision de l'Union Europenne )
Observations :
la DJA est base sur une LOAEL mais le facteur de scurit 100 est suffisant compte tenu de
la pente de la courbe dose-rponse
3.15 DOSE DE RFRENCE AIGU (DRfA ou ARfD)
Observations :
non pertinent
3.16 NIVEAU D'EXPOSITION ACCEPTABLE POUR L'OPRATEUR (NEAO ou
AOEL)
AOEL = 0.0006 DSE = 0.06 mg/kg p.c./j (Reproduction sur deux
gnrations, rat )
(Dcision de l'Union Europenne )
4 - COMPORTEMENT DANS L'ENVIRONNEMENT
4.1 COMPORTEMENT DANS LE SOL
4.1.1 VOIES DE DEGRADATION
4.1.2 VITESSE DE DEGRADATION
4.1.2.1 VITESSE DE DEGRADATION : EN LABORATOIRE, CONDITIONS
AEROBIES
Substance active
DT50 (exprim en jours) : 24
DT90
Temp : 25 C
Sol : limon fin - USA - Atterberry / Iowa - MO : 4.2 % - pH : 5.6
Substance active
DT50 (exprim en jours) : 15
DT90
Temp : 25 C
Sol : sable - FRA - Toulouse - MO : 1.4 % - pH : 5.2
Substance active
DT50 (exprim en jours) : 74
DT90
Temp : 25 C
Sol : limon sableux - USA - San Jose - MO : 0.3 % - pH : 7.3
4.1.2.2 VITESSE DE DEGRADATION : EN LABORATOIRE, CONDITIONS
ANAEROBIES
Annexes



256
4.1.2.3 VITESSE DE DEGRADATION : AU CHAMP
Substance active
DT50 (exprim en jours) - Min : 2 - Max : 6
DT90
Sol :
4.1.2.3 VITESSE DE DEGRADATION
4.1.2.4 PHOTODEGRADATION : EN LABORATOIRE, CONDITIONS AEROBIES
4.1.2.5 PHOTODEGRADATION : EN LABORATOIRE, CONDITIONS
ANAEROBIES
4.1.2.5 PHOTODEGRADATION
4.1.3 MOBILITE DANS LE SOL : ADSORPTION
Substance active
Koc : 6.6 -
Sol : sable - FRA - Toulouse - %MO : 1.4 % - pH : 5.2
Substance active
Koc : 5.3 -
Sol : limon sableux - FRA - Velisy - %MO : 6.6 % - pH : 4.9
Substance active
Koc : 8.98 -
Sol : limon sableux - USA - San Jose - %MO : 0.3 % - pH : 7.3
Substance active
Koc : 1.82 -
Sol : limon fin - USA - Atterberry / Iowa - %MO : 4.2 % - pH : 5.6
Substance active
Koc : 1.08 -
Sol : limon argileux - USA - Luling - %MO : 1.8 % - pH : 7.5
Substance active
Koc : 123 -
Sol : limon sableux - USA - %MO : 2 %
Substance active
Koc : 160 -
Sol : argile - X - %MO : 1.7 %
Substance active
Koc : 17 -
Sol : limon - X - %MO : 2.1 %
Substance active
Koc Min : 1.08 - Max : 8.98
Sol :
4.1.4 MOBILITE DANS LE SOL
4.1.4.1 MOBILITE DANS LE SOL : AUTRES ETUDES AU LABORATOIRE
4.1.4.2 MOBILITE DANS LE SOL : AUTRES ETUDES AU CHAMP
4.2 COMPORTEMENT DANS L'EAU
4.2.1 PRODUITS D'HYDROLYSE
4.2.2 VITESSE D'HYDROLYSE
temps de demi-vie : 100 jour(s) au pH de 7 - Mthode : EPA
4.2.3 PRODUITS DE PHOTOLYSE DANS L'EAU
4.2.4 VITESSE DE PHOTOLYSE DANS L'EAU
4.2.5 BIODEGRADATION FACILE
Annexes



257

4.2.6 VOIES DE DEGRADATION DANS LE SYSTEME EAU-SEDIMENT
4.2.7 VITESSE DE DISSIPATION DANS LE SYSTEME EAU-SEDIMENT
4.2.7.1 VITESSE DE DISSIPATION - CONDITIONS AEROBIES, OBSCURITE
4.2.7.2 VITESSE DE DISSIPATION - CONDITIONS AEROBIES, LUMIERE
4.2.7.3 VITESSE DE DISSIPATION - CONDITIONS ANAEROBIES, OBSCURITE
4.2.7.4 VITESSE DE DISSIPATION - CONDITIONS ANAEROBIES, LUMIERE
4.2.7.5 VITESSE DE DISSIPATION
4.3 COMPORTEMENT DANS L'AIR
4.3.1 PRESSION DE VAPEUR
5.39 Pa 25 C
4.3.2 CONSTANTE DE HENRY
4.3.3 VITESSE DE DEGRADATION DANS L'AIR

5 - COTOXICIT
5.1 EFFETS SUR LES OISEAUX ET SUR LES AUTRES VERTBRS
TERRESTRES
5.1.1 TOXICIT ORALE AIGU CHEZ LES OISEAUX
Anas platyrhynchos - DL50 : >1350 mg/kg p.c. - Vhicule : en solution dans
l'huile de mais - Mthode : EPA
Colinus virginianus - DL50 : >2250 mg/kg p.c. - Vhicule : en solution dans
l'huile de mais - Mthode : EPA
5.1.2 TOXICIT ALIMENTAIRE CHEZ LES OISEAUX
Anas platyrhynchos - CL50 : >5620 mg/kg aliment - Dure d'exposition : 5
jours - Vhicule : en solution dans l'huile de mais - Mthode : EPA
Colinus virginianus - CL50 : >5620 mg/kg aliment - Dure d'exposition : 5
jours - Vhicule : en solution dans l'huile de mais - Mthode : EPA
5.1.3 TOXICIT SUR LA REPRODUCTION CHEZ LES OISEAUX
5.1.4 TOXICIT ORALE AIGU CHEZ LES AUTRES VERTBRS TERRESTRES
5.1.5 TOXICIT CHRONIQUE CHEZ LES AUTRES VERTBRS TERRESTRES
5.2 EFFETS SUR LES ORGANISMES AQUATIQUES
5.2.1 TOXICIT AIGU CHEZ LES POISSONS
Cyprinus carpio - CL50 : 240 mg/l - Dure d'exposition : 96 heures -
Exposition statique
Oncorhynchus mykiss (ex Salmo gairdneri) - CL50 : 227 mg/l - Dure
d'exposition : 96 heures - Exposition statique
5.2.2 TOXICIT CHRONIQUE CHEZ LES POISSONS
5.2.3 BIOCONCENTRATION CHEZ LES POISSONS
5.2.4 TOXICIT AIGU CHEZ LES INVERTBRS AQUATIQUES VIVANT DANS
L'EAU OU LE SDIMENT
Daphnia magna - CE50 : >100 mg/l - Dure d'exposition : 24 heures
Daphnia magna - CE50 : >100 mg/l - Dure d'exposition : 48 heures
5.2.5 TOXICIT CHRONIQUE CHEZ LES INVERTBRS AQUATIQUES VIVANT
DANS L'EAU OU LE SDIMENT
5.2.6 EFFETS SUR LA CROISSANCE DES ALGUES ET SUR LES PLANTES
AQUATIQUES
algue - CEb50 : 3.5 mg/l
Annexes



258
5.2.7 AUTRES TUDES AQUATIQUES - EFFETS SUR MICRO ET MSOCOSMES
5.2.8 CONCENTRATION SANS EFFET PREVISIBLE POUR LES ORGANISMES
AQUATIQUES (PNEC)
PNEC = 5.1 g/L base sur :

tude : toxicit chez la plante aquatique (Lemna gibba)
CE50 = 0.051 mg/L FS = 10
dcision de AF le 30/03/10
5.3 EFFETS SUR LES ABEILLES
5.3.1 TOXICIT AIGU
Abeille - DL50 Contact : >200 g/abeille - DL50 Orale : >50 g/abeille
5.4 EFFETS SUR LES ARTHROPODES TERRESTRES AUTRES QUE LES
ABEILLES
5.5 EFFETS SUR LES VERS DE TERRE ET AUTRES MACRO-ORGANISMES NON
CIBLES DU SOL supposs tre exposs un risque
5.5.1 TOXICIT AIGU
5.5.2 EFFETS SUR LA REPRODUCTION
5.6 EFFETS SUR MICRO-ORGANISMES NON CIBLES DU SOL
5.7 EFFETS SUR D'AUTRES ORGANISMES NON CIBLES (FLORE ET FAUNE)
supposs tre exposs un risque
5.8 EFFETS SUR LES MTHODES BIOLOGIQUES DE TRAITEMENT DES EAUX
USES
6 - VALEURS REGLEMENTAIRES
CLASSEMENT TOXICOLOGIQUE selon les rgles de la directive 67/548/CEE
Dcision de la Commission des Toxiques le 13/01/93

Xn R36 R40 R43

Classe(s) CMR :
Substance cancrogne, troisime catgorie

Nocif (Xn)
R36 irritant pour les yeux
R40 effet cancrogne suspect - preuves insuffisantes
R43 peut entraner une sensibilisation par contact avec la peau



CLASSEMENT TOXICOLOGIQUE / ETIQUETAGE selon les rgles du rglement
(CE) N1272/2008
Classement adapt par ANSES selon les rgles de traduction du rglement CLP
Annexes



259
Pictogramme(s) de danger :
SGH07 SGH08

Mention avertissement : attention

Cancrognicit, catgorie 2
H351 Susceptible de provoquer le cancer

Irritation oculaire, catgorie 2
H319 Provoque une svre irritation des yeux

Sensibilisation cutane, catgorie 1
H317 Peut provoquer une allergie cutane

Annexes



260
ANNEXE2

Chromatogrammes CLHP/UV du milieu de culture (MS) pour lisolat


bactrien 1OP

Figure 1 : 0 jour de culture

Figure 2 : 6 jours de culture


Annexes



261

Figure 3 : 15 jours de culture

Figure 4 : 30 jours de culture



Annexes



262
ANNEXE3


Chromatogrammes montrant (a) la prsence de CMBA (extraction des fragments m/z, 110,
217, 248 et 250) dans le milieu (MS) supplment en sulcotrione, ensemenc par la souche
1OP au bout de 27 jours et (b) sa non dtection avec 1TRANS.

263
Table des matires

REMERCIEMENTS 3
SOMMAIRE 6
TABLEDESILLUSTRATIONS 9
INTRODUCTION 18
PREMIEREPARTIE:REVUEBIBLIOGRAPHIQUE 22
Chapitre1Soletdiversitmicrobienne 23
1Contexte 23
2Composantemicrobiennedusol 24
3Diversitmicrobiennedusol 26
Chapitre2Mthodologiesnonmolculairesappliquesltudedessouchesbactriennes
telluriques 27
1Mthodescultivablestraditionnelles 27
2Mthodescultivablesinnovantes 29
Chapitre3Mthodologiesmolculairesappliquesltudedessouchesbactriennestelluriques
31
1AnalysedesprofilsderestrictiondesADNr16Samplifis(ARDRA) 31
2AmplificationPCRdessquencesrptitives(REPPCR) 33
3SquenagedesADNr16SetAnalysephylogntique 35
31Principegnral 35
32Mthodedalignement 36
33Reconstructiondesarbresphylogntiques 37
34Estimationdelarobustessedesarbres 39
Chapitre4Dgradationbiologiquedesproduitsphytosanitairesdanslessols 41
1Dgradationbiologiqueetrcalcitrancemolculaire 41
2Inductionsenzymatiquesetadaptionsmicrobiennes 42
3Aspectscintiquesdeladgradationbiologique:Mtabolismedirectetcomtabolisme. 45
4Casparticulierdedgradationbiologique:labiodgradationacclre(BDA)despesticides 47
41Contexteetdfinition 47
42Mcanismesresponsablesdelabiodgradationacclre 48
DEUXIEMEPARTIE:PRESENTATIONGENERALEDELETUDE 51
Chapitre1Lafamilledesherbicidestrictones 52
1Contextehistorique 52
2Lasubstanceactive 54
21Fichedidentit 54
22Propritsphysicochimiques 54
23Lesformestautomriquesdelasulcotrione 55
3Modedactiondelasubstanceactive 56
4Approchestoxicologiqueetcotoxicologique 60
41Visvisdesmammifres 60

264
42Ecotoxicologie 60
5Comportementdanslesdiffrentscompartimentsdelenvironnement 61
51Danslamatriceair 61
52Danslamatriceeau 61
53Danslamatricesol 64
531Rtentionettransfertdelasulcotrioneetdesesproduitsdedgradation 64
532Dgradationdelasulcotrione 64
Chapitre2Matricedtude:lesoldePerpignan 67
1Situationgographiquedelaparcelle 67
2ParamtresdaphiquesdusoldePerpignan 68
3Historiquecultural 69
4Stratgiedchantillonnage 69
5Dispositifexprimental:lesmicrocosmes 70
TROISIEMEPARTIE:METHODOLOGIESDETRAVAIL 73
Chapitre1Mthodologiedelanalysechimique 74
1Analysedeschantillonsdesols 74
11RactifsetMatriels 74
111Standardanalytique 74
112Autresractifs 74
113Matrielclassiquedelaboratoire 74
114Appareillagechromatographiqueetconditionsdanalyses 75
12Protocoleopratoire 76
121Prparationdeschantillons 76
122Analysechromatographique 76
13Performancesdelamthodedanalyseetvalidation 77
2Analysedeschantillonsdemilieuxdeculture 77
21Ractifsetmatriels 77
211Standardsanalytiques 77
212Autresractifs 78
213Matrielsclassiquesdelaboratoire 78
214SpectrophotomtreUV/visible 78
215Appareillageschromatographiquesetconditionsdanalyses 78
2151CLHP/UV 79
2152CLHP/SM 80
2153CPG/SM 81
22Protocoleopratoire 83
221Pparationdeschantillons 83
222Analysechromatographique 84
23Performancesdelamthodedanalyseetvalidation 84
231CLHP/UV 84
232CLHP/SM 85
234CPG/SM 86
Chapitre2Mthodologiedelanalysebiologique 87
1Cadredeltude:organisationdestravaux 87
2Approchecultivable:essaidisolementdesouchesbactriennesdgradantlasulcotrione 87
21Principeetstratgiedetravail 87
22Milieuxdecultureetmatrielsutiliss 89
221Prparationdesmilieuxdeculture 89
2211Milieucomplexesolounutrientsoilmedium(NS) 89
2212Milieuminimum(MS) 90
2213MilieucomplexetryptocasinedesojaouTripticsoy(TS) 92
222Matrielsutilissdanslecadredelapprochecultivable 93
23Protocoleopratoire 93
231Isolementdesouchesbactriennessulcotrionersistantes 93

265
232Isolementdesouchesbactriennesdgradantlasulcotrione 95
2321Culturesliquidesrptesdesisolatsbactriensavecpressiondeslectionde
lherbicide 95
2322Estimationdelacapacitdedgradationdesisolatsbactriensvisvisdela
sulcotrione 96
233Caractrisationmorphologiqueetbiochimiquedesisolatsdgradants 98
3Approchemolculaire:caractrisationdesisolatsbactriensdgradantlasulcotrionevsisolatsnon
dgradants 99
31Principeetstratgiedetravail 99
32Protocoleopratoire 99
321ExtractionetpurificationdelADNgnomique 99
322QuantificationetcontrledelaqualitdelADNgnomique 100
323Caractrisationphylogntiquedesisolatsbactriens 101
3231AnalysedesprofilsderestrictiondesADNr16S(ARDRA) 101
3232AnalysedesisolatsbactriensparREPPCR 103
3233SquenagedesADNr16S 105
32331LigationdesproduitsPCRdelADNr16Sdansunvecteurdeclonage 105
32332Transformationdescellulescomptentesaveclevecteurdeclonage 106
32333TestPCRsurcoloniesdesclonesrecombinants 108
32334PrparationdelADNplasmidique(MiniPrep) 109
32335Ractiondesquenage 109
32336Traitementetanalysedessquences 111
324Caractrisationfonctionnelledesisolatsbactriens: 112
3241Contexte 112
3242DtectionparPCRdesgnesXylEcodantlenzymecatchol2,3dioxygnase 114
3243DtectionparPCRdesgnesC12Ocodantlenzymecatchol1,2dioxygnase 116
3244SquenagedesproduitsPCR 117
3245Traitementetanalysedessquences 117
325Caractrisationphysiologiquedesisolats 118
QUATRIEMEPARTIE:RESULTATSETDISCUSSION 119
Chapitre1ConfirmationdupouvoirbiodgradantdusoldePerpignanetrecherchedune
ventuellebiodgradationacclre(BDA) 120
1RactivitbiologiquedusoldePerpignan 120
2Rechercheduneventuellebiodgradationacclre(BDA) 124
3Conclusion 127
Chapitre2Isolementdesouchesbactriennespotentiellementdgradantesdelasulcotrione 129
1Recherchedesouchessulcotrionersistantes 129
2Isolementdesouchesbactriennesmtabolisantlasulcotrione 130
3Etudedupotentieldedgradationdesisolatsdgradants:suivideladissipationdelasulcotrione
danslemilieudeculture(MS) 134
4Recherchedemtabolitesdelasulcotrionedanslemilieudeculture(MS) 137
Chapitre3Caractrisationphylogntiquedesisolats1OPet1TRANS 142
1VrificationdelaqualitdelADNmatrice 142
2AnalysedupolymorphismedesquencedesADNr16Samplifis(ARDRA)desisolats 142
3Analysedesisolatsbactriensparamplificationdessquencesrptitives(REPPCR) 144
4SquenagedelADNr16Sdesisolats1OPet1TRANS 145
5Conclusion 154
Chapitre4Caractrisationfonctionnelledesisolats1OPet1TRANS 159
1Prambule 159
2DtectiondesgnesXylEcodantlenzymecatchol2,3dioxygnase 160
3DtectiondesgnesC12Ocodantlenzymecatchol1,2dioxygnase 164
4SquenagedesampliconsXylE 165
5SquenagedesampliconsC12O 165

266
CONCLUSIONGENERALEETPERSPECTIVES 167
REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUES 173
VALORISATIONDESTRAVAUXDERECHERCHE 207
Publicationn1(SOUSPRESSE) 208
Publicationn2 233
Communicationscientifique 241
TABLEDESANNEXES 252
ANNEXE1 253
ANNEXE2 260
ANNEXE3 262
TABLEDESMATIERES 263



DEGRADATION BIOLOGIQUE DE LA SULCOTRIONE DANS UN SOL
AGRICOLE : RECHERCHE DUNE EVENTUELLE BIODEGRADATION
ACCELEREE ET CARACTERISATION DE SOUCHES
BACTERIENNES POTENTIELLEMENT DEGRADANTES.

RESUME
La dgradation des produits phytopharmaceutiques dans le sol conditionne fortement leur
devenir et participe la rduction des risques de pollution diffuse dans les divers milieux
aquatiques, et notamment dans les eaux souterraines.
Notre travail avait donc pour objectif denrichir les connaissances sur la dgradation
biologique dans un sol agricole de la sulcotrione, herbicide largement utilis dans les
itinraires techniques masicoles. Le potentiel dgradant du sol de Perpignan a t mis en
vidence en conditions de microcosmes. En revanche, nos rsultats ont montr labsence de
phnomne de biodgradation acclre (BDA), malgr la rptition des traitements.
La deuxime partie de ltude a consist isoler et caractriser des microorganismes
telluriques intervenant au niveau de la ractivit dgradante de ce sol. Aprs isolement sur
milieux de culture synthtiques de huit souches bactriennes rsistantes la sulcotrione, une
seule sest avre prsenter un potentiel dgradant important, en utilisant lherbicide comme
source de carbone et/ou dnergie. Aprs squenage de lADNr 16S, cette souche a t
identifie comme appartenant au genre Pseudomonas espce putida.
Notre tude a permis de localiser le site dattaque enzymatique au niveau de la partie 1,3-
cyclohexanedione de la molcule de sulcotrione.

Mots cls : sulcotrione, sol, biodgradation, biodgradation acclre, Pseudomonas putida,
squenage ADNr 16S.

BIOLOGICAL DEGRADATION OF SULCOTRIONE IN AN
AGRICULTURAL SOIL : RESEARCH OF A POSSIBLE ENHANCED
BIODEGRADATION PROCESS AND CHARACTERISATION OF
DEGRADING BACTERIAL ISOLATES.

SUMMARY
Degradation of pesticides in soil plays a large part in the limitation of risks towards aquifers.
This study investigates the biological response of an agricultural soil of south of France after
several treatments with sulcotrione, a maize herbicide belonging the triketones group.
Although reactivity of the Perpignan soil was clearly confirmed, no enhanced biodegradation
was observed after repeated herbicide treatments, under microcosms conditions.
The second part of our work consisted on isolating and characterising bacterial strains
showing a notable capability to intervene in this biodegradation process. Eight sulcotrione-
resisting strains were isolated and tested in liquid culture with sulcotrione as sole carbone
and/or energy source. Only one was able to efficiently degrade the herbicide. Partial 16S
rDNA sequencing allows identification of this strain as Pseudomonas putida.
The enzymatic catalysis occurred at the level of the 1,3-cyclohexanedione moiety of the
sulcotrione molecule.

Key words: sulcotrione, soil, biodegradation, enhanced biodegradation, Pseudomonas
putida, 16S rDNA sequencing