La biotecnologa moderna tiene un papel im- portante en la restauracin de sitios daados ambientalmente. El reto actual es desarrollar herramientas biotecnolgicas que formen par- te de procesos limpios y efcientes energtica- mente para la prevencin, el control y la reme- diacin de contaminaciones ambientales. La investigacin en este campo est sustentada en herramientas metodolgicas de diferentes reas del conocimiento, como lo son la bioin- geniera, enzimologa, ingeniera de protenas, microbiologa aplicada y termodinmica de solventes. El esfuerzo del laboratorio de Biotec- nologa Ambiental se centra en la modifcacin enzimtica de sustancias contaminantes, princi- palmente hidrocarburos aromticos policclicos y plaguicidas. Adems de investigaciones con otros compuestos hidrfobos de alto impacto ambiental, como los colorantes industriales, los compuestos azufrados heterocclicos y los policlorofenoles. Es imperativo que las trans- formaciones enzimticas o microbiolgicas de dichos contaminantes, conlleven a la reduccin o eliminacin de su impacto ambiental. Por otro lado, la bsqueda y diseo de nue- vos biocatalizadores se realiza a travs del uso de tcnicas de mutacin sitio-dirigida, tecno- loga enzimtica o modifcacin qumica de protenas. Se han explorado diversas fuentes de enzimas en la naturaleza. Especialmente, los microorganismos responsables de la de- gradacin de la lignina son productores de una batera de enzimas de baja especifcidad y con un alto potencial para su uso en la transforma- cin de compuestos contaminantes y xenobi- ticos. El desarrollo de nuevos biocatalizadores con mejores propiedades catalticas, cinticas o de estabilidad, se ha sustentado en el uso de las tcnicas de mutacin sitio-dirigida, o en las tcnicas de modifcacin qumica de pro- tenas. Esta ltima permite conjugar nuevos grupos funcionales (acilacin, sililacin, pegila- cin, etc.) en los sitios reactivos de los residuos aminocidos de las protenas. De esta manera, se ha logrado disear y construir biocataliza- dores semisintticos que pueden disolverse en solventes orgnicos, que tienen mayor es- tabilidad y actividad a altas temperaturas o que incrementan el rango de sustratos que re- conoce una enzima. Todo este potencial de la biocatlisis se ejemplifca aqu, en la transfor- macin biocataltica de contaminantes como los colorantes industriales, los plaguicidas y los compuestos derivados del petrleo, como los hidrocarburos policclico aromticos y los com- puestos organoazufrados.
3 4 7 Biotecnologia V14 CS3.indd 347 11/14/07 5:04:21 PM 348 | El citocromo c en la biocatlisis ambiental El citocromo c es una protena que se encuen- tra como un componente de la cadena mito- crondrial de transporte de electrones. Su fun- cin biolgica es la de transportar electrones entre los complejos membranales citocromo c reductasa y citocromo c oxidasa. Sin embargo, esta protena ha sido utilizada como catalizador biolgico en diversas reacciones de oxidacin de compuestos txicos. Su actividad cataltica es similar a la de las hemoperoxidasas, en tanto que requiere de la presencia de perxido de hi- drgeno, contiene tambin un grupo hemo en su estructura como sitio cataltico, se inactiva por perxido en ausencia de un sustrato reduc- tor y, fnalmente, su ciclo cataltico est basado en los estados de oxidacin del tomo de Fe del grupo prosttico hemo. Los citocromos c son molculas de protenas muy pequeas, constituidas por 103-112 ami- nocidos, con pesos moleculares de alrededor de 12 000 Da y puntos isoelctricos bsicos (pI 10). Presentan una alta conservacin en la secuencia de aminocidos, as como de su es- tructura terciaria. Se ha determinado la conser- vacin de 21 residuos en 91 secuencias de cito- cromos c de origen eucarionte. Tambin se ha demostrado un contenido de -hlices superior a 30% para el citocromo de levadura. Una carac- terstica importante es que en el citocromo c, el grupo hemo se encuentra unido covalentemen- te a la apoprotena por medio de dos enlaces tioter, y el tomo de Fe se encuentra coordi- nado axialmente por dos ligandos, la His18 y la Met80. En la figura 1 se muestra la estructura secundaria del citocromo c de levadura. Aunque no se ha descrito una actividad ca- taltica del citocromo c en los organismos vivos, se ha reportado su participacin en la peroxida- cin de lpidos y en el rompimiento de hidrope- rxidos. Esto sugiere la participacin de estas protenas en procesos celulares involucrados con el estrs oxidativo, en los cuales la oxida- cin de biomolculas en presencia de perxido de hidrgeno puede realizarse mediante un me- canismo de radicales libres, similar al que llevan a cabo los sistemas enzimticos del citocromo P450. Recientemente, el citocromo c se ha utili- zado in vitro como biocatalizador en reacciones de oxidacin de compuestos de estructura qu- mica diversa y que representan un problema de contaminacin ambiental. En la tabla 1 se enlis- tan algunos ejemplos de sustratos y productos generados por biotransformaciones mediadas por esta hemoprotena. Es importante resaltar que el citocromo c es activo catalticamente en mezclas de reaccin que contienen solventes orgnicos en proporciones que van desde 10 hasta el 90%; adems, presenta actividad en el rango de valores de pH de 2 a 11. Ambas propie- dades en esta protena son interesantes, ya que facilitan el uso del citocromo c en condiciones de reaccin extremas. La posibilidad de utilizar solventes orgni- cos como medios de reaccin, permite disolver una mayor cantidad de sustrato. Frecuente- mente se han utilizado mezclas de solventes miscibles en agua sin provocar un efecto de inactivacin severo al citocromo c. En estos sistemas de reaccin, se ha logrado oxidar di- ferentes compuestos organoazufrados que constituyen parte de los petrleos crudos pe- sados. Los compuestos azufrados presentes en los combustibles son agentes causantes de la lluvia cida, ya que se libera dixido de azufre a la atmsfera como producto de la combustin de los motores. En general, dos terceras partes de las emisiones de dixido de azufre son libe- rados por las plantas generadoras de energa elctrica, como consecuencia del uso de com- bustibles como el diesel, el combustleo o el carbn. Algunos estudios sealan que, en la ciudad de Mxico, los vehculos automotores contribuyen con ms del 90 por ciento de las emisiones de partculas en general, por lo que muchas de las estrategias ambientales estn dirigidas a ese sector. Aparte de la corrosin de monumentos y edifcios, la lluvia cida es cau- sante del empobrecimiento de nutrientes en los ecosistemas acuticos y terrestres debido a que la acidez provoca la precipitacin de mine- rales y otros nutrientes de los que depende la biota de los ecosistemas. Existe una correlacin Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 348 11/14/07 5:04:21 PM | 349 Figura 1. Representacin esquemtica de la estructura cristalogr- fca del citocromo c de Sacharomyces cereviciae, tomado del PDB YCC2. Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 349 11/14/07 5:04:23 PM 350 | directa entre el contenido de azufre de los com- bustibles y la emisin de partculas y dixido de azufre a la atmsfera. Con el fn de evitar estas emisiones, actualmente la tendencia mundial ha establecido como lmite mximo el 0.05% de contenido de azufre en el diesel. Los compuestos aromticos azufrados han sido oxidados por las hemoprotenas no enzi- mticas, como el citocromo c y la hemoglobina, en condiciones de reaccin moderadas, como temperatura ambiente, presiones atmosfricas y con un contenido de solventes de 10-20%. Sol- ventes como la dimetilformamida o el acetoni- trilo son adecuados para disolver los compues- tos organoazufrados presentes en el diesel, como el dibenzotiofeno, tiantreno, dibencilsul- furo y otros ms, de los cuales sus estructuras qumicas y de los productos de reaccin, que son principalmente sulfonas, se ejemplifcan en la figura 2. Estas reacciones se llevan a cabo en presencia de 1 mM de perxido de hidrge- no como donador de electrones. En el mismo sistema de reaccin, el citocro- mo c y la hemoglobina tambin han sido uti- lizados como biocatalizadores en la oxidacin de hidrocarburos policclico aromticos. Como productos de la reaccin se generan las qui- nonas correspondientes, de la misma manera como se ha descrito para las enzimas peroxida- sas (figura 3). Esto sugiere que el mecanismo de reaccin es similar para estos biocatalizadores. La oxidacin enzimtica, seguida de la adicin de microorganismos endgenos, puede ser una estrategia de remediacin efectiva de suelos contaminados, debido a que la biodegradacin de los hidrocarburos policclicos y sus metabo- litos incrementa con su estado de oxidacin. Adicionalmente, las quinonas resultantes son signifcativamente menos mutagnicas. Por ejemplo, el benzo(a)pireno, un potente carcin- geno, mostr una concentracin mnima mu- tagnica de 14 ng/ml, mientras que ninguna de sus quinonas fue mutagnica. Esto nos indica que una transformacin enzimtica de los hi- drocarburos policclicos aromticos es sufcien- te para reducir su impacto ambiental. Los hidrocarburos policclicos aromticos son componentes del petrleo crudo, la creo- sota y el carbn. Este tipo de compuestos est ampliamente distribuido en el ambiente como Tabla 1. Biotransformaciones con citocromo c (Vzquez-Duhalt, R., en J. Mol. Catal. B: Enzymatic, 7, 1999). Sustratos Productos Hidrocarburos aromticos policclicos Antraceno 9,10-Antraquinona Benceno Fenol Benzo(a)pireno 1,6-Benzo(a)pirenodiona Pireno 1,8-Pirenodiona Compuestos organoazufrados y heterocclicos Benzotiofeno Sulfxido de benzotiofeno Carbazol Desconocido Dibenzotiofeno Sulfxido de dibenzotiofeno Sulfuro de dibencilo Sulfxido de dibencilo Sulfuro de difenilo Sulfxido de difenilo N-methyl carbazol N-Hidroximetil carbazol Tiantreno Disulfxido de tiantreno Tioanisol Metilfenil-sulfxido Otros sustratos ABTS ABTS (radical catinico) Guayacol Tetraguayacol cido linolnico Perxido de linoleato Luminol Quimioluminiscencia Metionina Etileno Estilbeno Epxido de estilbeno Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 350 11/14/07 5:04:23 PM | 351 I I I I I I I I I I Ybehef[hen_ZWiW b_]d_def[hen_ZWiW Y_jeYheceY ^[ce]beX_dW ? ) F ) 9> ( I9> ( 9> ( I9> ( E E E E E E Figura 2. Estructuras moleculares de los compuestos organoazu- frados y los productos de reaccin en la biocatlisis con hemoprotenas. Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 351 11/14/07 5:04:23 PM 352 | E E E E E E Y_jeYheceY ^[ce]beX_dW b_]d_def[hen_ZWiW cWd]Wd[ief[hen_ZWiW Y_jeYheceF*+& ? ) F ) Figura 3. Oxidacin de hidrocarburos policclicos aromticos con di- ferentes hemoprotenas. Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 352 11/14/07 5:04:24 PM | 353 consecuencia del uso extensivo de los combus- tibles derivados del petrleo. Su persistencia en el ambiente se debe a su alta hidrofobicidad y baja solubilidad en agua, lo que hace muy len- ta su biodegradacin. Muchos de ellos tienen propiedades txicas, mutagnicas o carcinog- nicas, por lo que es prioritaria su remocin del ambiente. La biocatlisis con el citocromo c ha sido mejorada por mutaciones sitio dirigidas. Se han diseado y obtenido variantes estables a la inactivacin por perxido de hidrgeno a travs de la mutacin de los residuos suscepti- bles de oxidacin en la protena. Se obtuvo una variante del iso-1 citocromo c de Sacharomyces cereviciae con las sustituciones: n52I, W59F, Y67F, K79A, F82G, la cual, conserv la capacidad cataltica de la protena parental, pero mostr un incremento de 15 veces en el nmero total de recambio en la reaccin de oxidacin del colorante cloruro de pinacianol. Esta protena variante est siendo estudiada como biocatali- zador de la oxidacin de compuestos fenlicos de diferente potencial redox. Por otro lado, se han modificado qumica- mente los grupos amino de la superficie de la molcula del citocromo c de corazn de caballo, con compuestos anfiflicos como el polietilenglicol y en los grupos carboxilo con radicales metilo, los cuales otorgan mayor hi- drofobicidad en el sitio activo como son los propionatos del grupo hemo. La doble mo- dificacin qumica (pegilacin en la superfi- cie y metilacin del grupo hemo) mejor las propiedades biocatalticas del citocromo c en los sistemas de reaccin con solventes org- nicos. El citocromo doblemente modificado (PEG-Cyt-MET) fue capaz de oxidar 16 de 20 compuestos ensayados, mientras que el ci- tocromo no modificado fue capaz de oxidar slo ocho de estos compuestos (tabla 2). De tal manera, la modificacin qumica de pro- tenas puede ser una herramienta importan- te para disear nuevos biocatalizadores que puedan aplicarse para resolver problemas de contaminacin ambiental. Otros biocatalizadores muy poderosos: las enzimas ligninolticas de hongos Los hongos ligninolticos sintetizan un sistema enzimtico extracelular muy particular y no es- pecfco. El mecanismo de estos sistemas res- ponsables de degradar la lignina est basado en la formacin de radicales libres, lo cual hace que estas enzimas sean activas catalticamen- te sobre una gran diversidad de sustratos org- nicos. Debido a esto, los hongos ligninolticos poseen un uso potencial muy atractivo en la biorremediacin de ambientes contaminados con mezclas complejas de contaminantes pe- ligrosos. Estos hongos tienen la capacidad de mineralizar completamente a CO 2 los contami- nantes muy recalcitrantes, como los bifenilos policlorados, los explosivos aromticos, los hi- drocarburos policclico aromticos, los plagui- cidas clorados y organofosforados. Asimismo, pueden decolorar efuentes contaminados con colorantes de origen industrial. Todo esto resal- ta la versatilidad de los sistemas enzimticos de los hongos ligninolticos, ya que son enzi- mas de poca especifcidad que pueden recono- cer sustratos con estructuras moleculares muy diversas. En la literatura pueden encontrarse muchos ejemplos de tratamientos de contaminantes por medio del uso de hongos degradadores de lig- nina o sus sistemas enzimticos. Se ha demos- trado la oxidacin de efuentes derivados del blanqueo del papel con Phanerochaete chrysos- porium, cuya manganeso peroxidasa es la enzi- ma responsable. De la misma manera, las lacasas de Trametes versicolor se han identifcado como enzimas muy efcientes en la decoloracin de estos efuentes. Las peroxidasas dependientes de manganeso obtenidas de Bjerkandera adusta y de Pleurotus eryngii, as como las isoenzimas de lacasas de Coriolopsis gallica, han sido utilizadas en la degradacin de colorantes sintticos tipo azo, o de diversos colorantes industriales. Por otro lado, se ha observado la mineralizacin de 2,4-diclorofenol, 2,4,6-triclorofenol, guayacoles policlorados, diversas vainillinas policloradas y Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 353 11/14/07 5:04:24 PM 354 | pentaclorofenol por el hongo P. chrysoporium, pero tambin se ha observado que los fenoles policlorados son sustratos de las peroxidasas extracelulares de este hongo, como la lignino peroxidasa y la manganeso peroxidasa. La lig- nino peroxidasa y la manganeso peroxidasa de P. chrysoporium as como la cloroperoxidasa de Caldariomyces fumago son enzimas capaces de catalizar la deshalogenacin en la posicin 4 del anillo aromtico del pentaclorofenol. Debido a que esta deshalogenacin da lugar a la quinona, este proceso se denomina deshalogenacin oxi- dativa, obtenindose la tetraclorobenzoquinona como producto fnal (figura 4). La combinacin de la accin de estas enzimas con el sistema intracelular reductor en P. chrysoporium ha per- mitido la deshalogenacin completa del penta- clorofenol. Los hongos ligninolticos tambin poseen un sistema enzimtico intracelular, el sistema de monoxigenasa citocromo P450. Estos siste- mas enzimticos llevan a cabo la degradacin de compuestos xenobiticos como el fenantre- no, el benzo(a)pireno o el DDT en cultivos de P. chrysoporium. El citocromo P450 de Pleurotus ostreatus fue capaz de transformar tres pla- guicidas organofosforados: Fosmet, Terbufos y Azinfos-metlico, adems de otros plaguici- das como el paratin, malatin y triclorfn. En estos estudios se analiz una coleccin de 18 cepas de hongos, las cuales degradaron in vivo al parathion adicionado en los cultivos con un tiempo de incubacin de 96 horas. Tres cepas mostraron una elevada actividad degradativa, Bjerkandea adusta, Pleurotus ostreatus y Pha- nerochaete chrysosporium. La efciencia de de- Tabla 2. Oxidacin de compuestos contaminantes por el citocromo c modifcado qumicamente (Tinoco y Vzquez-Duhalt, en Enzyme Microb. Technol., 22, 1998). Actividad especfca (min- 1 ) Compuesto aromtico no modifcado PEG-Cyt-Met 7,12-Dimetilbenzantraceno 24.59 ( 1.52) 80.33 ( 3.83) 1,2:3,4-Dibenzantraceno nR 16.60 ( 2.24) Azuleno 2.26 ( 0.29) 14.32 ( 0.57) 3-Metilcolantreno 1.88 ( 0.07) 10.96 ( 0.54) 7-Metilbenzo(a)pireno nR 7.56 ( 0.42) 1,2:5,6-Dibenzantraceno nR 5.70 ( 0.31) Trifenileno nR 5.27 ( 1.05) Dibenzotiofeno 0.67 ( 0.06) 4.73 ( 0.05) Antraceno 0.33 ( 0.06) 3.09 ( 0.32) Tiantreno 0.49 ( 0.06) 1.41 ( 0.08) Pireno 0.51 ( 0.05) 0.97 ( 0.03) Fluoroantreno nR 0.65 ( 0.09) Acenafteno nR 0.40 ( 0.01) Benzo(a)pireno 0.22 ( 0.02) 0.39 ( 0.06) Fluoreno nR 0.22 ( 0.01) Fenantreno nR 0.17 ( 0.02) Criseno nR nR 9,10-Dimetilantraceno nR nR naftaleno nR nR Bifenilo nR nR nR: no se detect la reaccin enzimtica. Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 354 11/14/07 5:04:24 PM | 355 f[djWYbehe\[deb j[jhWYbeheX[dpegk_dedW C`#DeFf:cG E 9b 9b 9b 9b 9b E> 9b 9b 9b 9b E Figura 4. Deshalogenacin oxidativa del pentaclorofenol por las lig- nino, manganeso o cloro peroxidasas de hongos. Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 355 11/14/07 5:04:24 PM 356 | CH 2 O CH 2 O S CH 2 S CH 2 O CH 2 O S O = N N N CH 2 O = N N N H HO HO O N H N N O CH 2 O CH 2 O S CH 2 S " + CH 2 O CH 2 O COOCH 2 CH 2 COOCH 2 CH 2 S H C S CH 2 O CH 2 O COOCH 2 CH 2 C S H C OH S O CH 2 O CH 2 O S CH 2 S CH 2 CH 2 O CH 2 CH 2 O S S C(CH 2 ) 2 CH 2 S CH 2 O CH 2 O CH C C C C O OH CH 2 O CH 2 O C C C C H O O + CH 2 CH 2 O CH 2 CH 2 O SH S S C(CH 2 ) 2 CH 2 O N C C H O O N C C O CH 2 O CH 2 O S O = N N N CH 2 S ^zncs ncLcc csncL MaaLn Tcrhucs Trccrn 2,2dccrclccLcna cL, dncLcsLcr dc acdc csrcc acdc dcL cscrcdLccc acdc huLancdccc O,O,SLrncL dLccsaLc 2,2dncL2LchuLanc 4ccLchcnzcLracna Landa 2,2dhdrcxl,2,2hcnzcLracn4cna azncsncL cxcn O,O,SLrncL dLccsaLc " Figura 5. Biotransformacin de plaguicidas por el sistema de mo- noxigenasa citocromo P450 de Pleurotus ostreatus (Jure- gui et al., en Biodegradation, 14, 2003). Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 356 11/14/07 5:04:25 PM | 357 gradacin fue en el rango de 50 a 96% en 96 horas. En la figura 5 se muestran las estructu- ras moleculares de los plaguicidas que fueron transformados por estos sistemas de monoxi- genasas y los productos de la biocatlisis, estos ltimos, identifcados por espectrometra de masas acoplada a cromatografa de gases. Es- tos estudios pudieron comprobar que los pro- ductos de la degradacin de los plaguicidas son menos txicos, ya que no inhibieron la activi- dad de acetilcolinesterasa in vitro, como sucede con los plaguicidas originales. Al igual que los sistemas enzimticos extracelulares, el sistema de monoxigenasa citocromo P450 es inespec- fco y puede reconocer sustratos de una amplia diversidad de estructuras moleculares. Otro grupo de compuestos de inters am- biental son los colorantes industriales. La complejidad y la diversidad de sus estructu- ras qumicas difcultan ms los procesos para su biotransformacin. El problema es mayor cuando se considera que los efuentes conta- minados contienen siempre mezclas complejas de colorantes industriales. Se ha estudiado la decoloracin in vivo en laboratorio de 27 co- lorantes de uso textil, por 15 diferentes cepas de hongos de los gneros Pleurotus, Trametes, Phanerochaete, Caldaromyces, Bjerkandera, Trametes y Sporotrichum. La capacidad para decoloracin de estas cepas se increment considerablemente cuando se cultivaron en condiciones ligninolticas, es decir, cuando se cultivaron en material lignocelulsico como la cascarilla de granos de avena. Tambin se ob- serv que los extractos extracelulares de cepas de P. ostreatus y de T. hispida obtenidos por fer- mentacin en estado slido, provocaron la ma- yor actividad decolorante para los compuestos Azul reactivo Oriosol 185, Azul cido 185 y el negro cido 194. Estos estudios condujeron a la conclusin de que las lacasas producidas por estas cepas son las responsables de la activi- dad de decoloracin. Las lacasas de T. hispida y de Coriolopsis gallica han sido ampliamente utilizadas para llevar a cabo biotransformacio- nes de efuentes contaminados generados por la industria textil. La peroxidasa verstil obtenida de Bjerkan- dera adusta tambin es capaz de catalizar la de- coloracin de estos compuestos. Esta enzima presenta ambas actividades de lignino peroxi- dasa y de manganeso peroxidasa. En la tabla 3 se muestran las velocidades de decoloracin de 27 compuestos que son colorantes artifciales. Se estudi la actividad de la enzima en dos di- ferentes condiciones de reaccin: en presencia de manganeso y condiciones reportadas como ptimas para su actividad de manganeso pe- roxidasa y la otra en ausencia de manganeso y bajo las condiciones de lignino peroxidasa. La capacidad de decoloracin de esta enzima se increment al adicionar intermediarios en la re- accin. Los intermediarios en estas reacciones son compuestos orgnicos pequeos de origen natural como el alcohol veratrlico, la acetosin- gona o el siringaldehdo. A pesar de la imperiosa necesidad de de- sarrollar procesos ms limpios y efcientes, la utilizacin de enzimas como catalizadores in- dustriales se ha rezagado por dos importantes razones: inicialmente por la falta de las activi- dades idneas, y en algunos casos en los que se cuenta con la enzima apropiada, por la inesta- bilidad intrnseca de las protenas a las condi- ciones industriales de reaccin. Existen de mo- mento tres poderosas estrategias integradoras encaminadas a resolver estas limitaciones: la bioprospeccin, la evolucin in vitro y la modi- fcacin sobre diseo. Muchas lneas de evidencia, desde la mi- croscopa ptica hasta el anlisis de cidos nucleicos, indican que las tcnicas de cultivo existentes descubren solamente una minscu- la fraccin (menos de 1%) de la microfora de un suelo normal, que puede llegar a contener de 5000 a 10 000 diferentes especies bacte- rianas. El universo de actividades enzimticas por descubrir es todava ms basto si conside- ramos que del milln y medio de especies de hongos predichas, solamente se han descrito 72 000. Las limitaciones de la microbiologa han conducido a que solamente 3000 activi- dades enzimticas hayan sido caracterizadas a la fecha, mientras que se prev existen por Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 357 11/14/07 5:04:25 PM 358 | Tabla 3. Velocidad de decoloracin de diferentes colorantes industriales por la peroxidasa verstil de Bjerkandera adusta. (Tinoco R. et al., 2007 J. Mol. Catal. B: Enzymatic 46: 1-7) Velocidad de decoloracin (DA min -1 mmol -1 ) Colorante (C.I.) Absmax p H 4 sin Mn(II) pH 3 con Mn(II) Acid black 194 570 2.05(0.19) 0.19(0.14) Acid blue 185 620 12.98(0.55) 12.5(0.74) Acid red 51 525 1.17(0.09) nR Direct black 22 485 0.31(0.02) 0.43(0.05) Direct blue 199 620 25.64(0.81) 6.90(0.13) Direct blue 2 570 2.14(0.11) 2.57(0.09) Direct green 6 620 1.24(0.14) 0.19(0.07) Direct orange 26 495 1.76(0.21) 1.93(0.05) Direct red 23 510 3.79(0.14) 1.55(0.09) Direct yellow 58 415 0.08(0.01) nR Disperse blue 79 560 0.21(0.01) nR Disperse red 60 535 0.01(0.003) nR Reactive black 5 595 5.36(0.26) 5.95(0.50) Reactive blue 18 605 2.19(0.26) 1.17(0.10) Reactive blue 19 590 1.81(0.19) 3.05(0.17) Reactive blue 38 20 10.78(0.07) 20.57(0.86) Reactive blue 72 665 0.47(0.07) 1.43(0.14) Reactive blue 198 625 2.67(0.05) nR Reactive green 19 610 1.05(0.12) 0.69(0.05) Reactive orange 16 485 0.27(0.01) nR Reactive red 4 540 1.35(0.08) nR Reactive red 141 540 1.02(0.12) nR Reactive red 180 540 0.52(0.04) nR Reactive yellow 2 400 0.14(0.02) nR Reactive yellow 84 410 0.07(0.01) nR Reactive violet 5 555 2.25(0.03) 2.87(0.21) Vat blue 7 605 0.03(0.00)
Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 358 11/14/07 5:04:25 PM | 359 lo menos otras 10 000 esperando ser identif- cadas. En estos momentos, el reto a vencer es cmo tener acceso a esta rica fuente de recur- sos naturales. Dada la impredecible diversidad de especies que habitan un sitio en particular, la alternativa ms explorada a la fecha se fun- damenta en la amplifcacin masiva de cidos nucleicos a partir de muestras ambientales, lla- mada bioprospeccin. Algunos casos exitosos que han aplicado esta estrategia son el aisla- miento de genes que codifcan para nuevos an- tibiticos, la identifcacin de actividades enzi- mticas con nuevas propiedades, por ejemplo -amilasas ms termoestables, la utilizacin de sustratos novedosos, o inclusive la recupe- racin de vas metablicas completas. Como alternativa al uso de la biodiversidad natural, se han desarrollado mtodos in vitro que permiten la generacin acelerada de va- riantes sobre una secuencia en particular. Es- tos mtodos se basan en simular la evolucin Darwiniana en un tubo de ensayo, e involucran la generacin y seleccin de una biblioteca mo- lecular con sufciente diversidad como para que la funcin alterada requerida se encuentre re- presentada. Esta diversidad molecular se pue- de crear tpicamente mediante mutagnesis al azar. Aquellas variantes funcionalmente mejo- radas son identifcadas de manera preliminar mediante mtodos de seleccin o de escrutinio de alto desempeo y entonces utilizadas como padres de la siguiente ronda de evolucin. La gran ventaja de la evolucin in vitro es que so- lamente requiere de la secuencia del gene que codifca para la enzima de inters y no de la re- solucin de su estructura tridimensional, aun- que un conocimiento ms profundo del me- canismo de reaccin permite tomar mejores decisiones sobre la estrategia de seleccin. El diseo racional de protenas est emer- giendo como la tcnica idnea para estudiar los principios generales que rigen la estructura y la funcin de las protenas. La meta de muchos de estos estudios ha sido la generacin de protenas con nuevas funciones, incluyendo el aumento de la tasa cataltica de algunas reacciones. De ma- nera muy especial, la habilidad para disear una enzima para llevar a cabo una reaccin qumica especfca tiene potenciales aplicaciones am- bientales. La utilizacin de las herramientas mo- leculares para el diseo de biocatalizadores ms efcientes en la degradacin de compuestos con- taminantes ha abierto un nuevo panorama en la aplicacin ambiental de las enzimas. La mutacin sitio dirigida de algunos residuos especfcos del citocromo c ha permitido aumentar la efciencia cataltica en la degradacin de hidrocarburos aro- mticos policclicos (tabla 4). Dos factores limitan la aplicacin a gran es- cala de las enzimas: su actividad y sobretodo, su estabilidad en condiciones de proceso. Las peroxidasas y en general la hemoprotenas se Tabla 4. Constantes cinticas del citocromo c de levadura nativo y variantes en la oxidacin del pireno (Vzquez-Duhalt, en J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 7, 1999). Variante k cat K M,app k cat /K M,app (s -1 ) (s -1 ) (s -1 M -1 ) Ala87;Thr102 0.39 3.9 99 Ala52;Thr102 0.18 4.7 39 Ala73;Thr102 0.28 7.5 38 Ala86;Thr102 0.17 4.0 33 Ala72;Thr102 0.13 4.0 33 Ala79;Thr102 3.28 101.8 32 Phe82;Cys102 (nativa) 0.31 9.7 32 Phe67;Thr102 0.10 3.3 32 Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 359 11/14/07 5:04:25 PM 360 | inactivan en la presencia de un exceso de su sustrato, el perxido de hidrgeno, o en ausen- cia de un sustrato reductor (por ejemplo un contaminate). Por medio de un diseo racional y mutaciones sitio especfcas se ha podido ob- tener un biocatalizador estable a las condicio- nes de reaccin (tabla 5). Finalmente, muchos aspectos de nuestras vidas han sido mejorados gracias a la industria qumica. Uno de los ms importantes es el au- mento en la esperanza de vida, que pas de 47 aos en 1900, a 75 aos en 2000. Gran parte de este aumento se debe a la mejora en los ser- vicios de salud, incluyendo el desarrollo y uso de medicinas. Tambin la industria qumica ha contribuido a tener acceso, en general, a agua y comida de mejor calidad. Cada una de las acti- vidades humanas se ha hecho ms efciente y ms segura. Sin embargo, no hay que olvidar que la industria qumica tambin es responsable del deterioro ambiental, el cual ha llegado en nuestros das a niveles que claramen- te pueden afectar la salud del planeta y del ser humano. Como se ha analizado en estas pginas, una de las prioridades del ingenio humano es continuar con el desarrollo tecno- lgico y con la mejora de las condiciones de vida pero sin alterar el ambiente. En nuestro pas an abundan pobladores que no tiene acceso a los satisfactores mnimos que todo habitante de este siglo debera tener. Esto implica que an tenemos que producir una gran cantidad de satisfactores adicionales para esa parte de la poblacin. El reto estar en incrementar nuestra produccin industrial sin incrementar el impacto de esta actividad sobre el ambiente. Por otro lado, si bien el petrleo y en gene- ral los combustibles fsiles han sido el motor de este cambio dramtico de la forma de vida, estas fuentes energticas no son renovables e inexorablemente se agotarn. Tendremos que producir una gran cantidad de productos que ahora dependen de la disponibilidad del pe- trleo como materia prima, y adems producir aquellos que no necesitan del petrleo como materia prima, pero que dependen de l como fuente de energa. Las dos grandes fuerzas promotoras e in- ductoras para el cambio tecnolgico en los prximos aos son la energa y el ambiente. Sin duda la biocatlisis ambiental tiene un nicho importante en este inevitable cambio. Tabla 5. Estabilidad cataltica e integridad del hemo de variantes del citocromo c de levadura en presencia de 1 mM de perxido de hidrgeno. Variante de citocromo c de levadura Estabilidad catalti- ca. Tiempo de vida media (min) Banda Soret. Tiempo de vida media(min) kcat (seg-1) KM H2O2 (M) Efciencia cataltica (kcat/KM) WT 16 (T-5A, C102T) 8.3 17.2 11.4 6.97 x 10 -2 163 Y46F, Y48F, Y67F, Y74F, Y97F 0.7 45.5 8.7 5.50 x 10 -3 1592 n52I, Y67F 0.5 estable 0.01 2.76 x 10 -3 6 n52I, Y67F, M80A 12.1 40.0 0.19 3.91 x 10 -2 5 n52I, W59F, Y67F 0.4 estable 8.6 8.14 x 10 -3 1062 n52I, W59F, Y67F, F82G 91.3 estable 8.4 4.12 x 10 -2 205 n52I, W59F, Y67F, K79A, F82G estable 170 10.1 7.26 x 10 -2 139 Biocatlisis ambiental Biotecnologia V14 CS3.indd 360 11/14/07 5:04:26 PM