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Correlaci on de los compuestos vol atiles con el perl sensorial de materiales promisorios de cacao.

Laura Marcela Noguera Mu noz


Escuela de Qu mica Universidad Industrial de Santander Directora: Janeth Aid e Perea Villamil

Propuesta de investigaci on para obtener el t tulo de Master en Qu mica (Ms) Julio de 2012

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Indice general
Lista de guras Indice de tablas 1 Informaci on general de la propuesta 2 Resumen 3 Descripci on de la propuesta 3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema . . . . . . . 3.1.1 3.1.2 Planteamiento del problema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Marco te orico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.2.1 3.1.2.2 3.1.2.3 3.1.2.4 3.1.2.5 3.2 Compuestos polifen olicos en el cacao . . . . . . . . . . . Compuestos vol atiles y semivol atiles identicados en productos derivados del cacao . . . . . . . . . . . . . . T ecnicas de extracci on, muestreo y an alisis de los compuestos del aroma. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M etodos de cuanticaci on de los compuestos vol atiles del cacao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T ecnicas empleadas para identicar los compuestos del aroma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 3.2.2 3.3 Objetivo principal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Objetivos espec cos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 29 29 29 30 30 25 20 15 v vii 1 3 5 5 5 7 13

Metodolog a . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3.1 Caracterizaci on de la composici on vol atil de los licores de cacao.

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INDICE GENERAL

3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.4 3.5 3.6 3.7

Cuanticaci on de los compuestos vol atiles responsables del aroma del cacao. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cuanticaci on de polifenoles totales, metilxantinas y avonoides. Correlaci on de los compuestos vol atiles con el perl sensorial realizado por el panel de catadores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 34 35 35 36 37 31 32

Cronograma de actividades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Resultados/Productos esperados y potenciales beneciarios . . . . . . . Impactos esperados a partir del uso de los resultados . . . . . . . . . . . Conformaci on y trayectoria del grupo de investigaci on . . . . . . . . . .

Bibliograf a

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Lista de guras
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Cacao criollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cacao forastero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Cacao trinitario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fermentaci on en caja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Caja para hacer la fermentaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Extracci on con solvente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tostador, molino y licor de cacao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fibra de microextracci on en fase s olida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rampas de calentamiento en el horno de GC-MS . . . . . . . . . . . . . (rojo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 8 8 10 10 21 30 31 32 35

3.10 Perl ortonasal de semillas de cacao criollo sin tostar (azul) y tostado

LISTA DE FIGURAS

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Indice de tablas
3.1 3.2 Compuestos identicados como odorantes claves en licor de cacao . . . . Cronograma de actividades . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 34

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INDICE DE TABLAS

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GENERAL DE LA PROPUESTA 1. INFORMACION

Informaci on general de la propuesta


T tulo: Identicaci on y cuanticaci on de los compuestos vol atiles responsables del aroma de 21 genotipos de cacaos comerciales: 11 introducidos y 10 regionales promisorios. Nombre del estudiante: Laura Marcela Noguera Mu noz C.C 1.098.640.497 Correo electr onico: laura.nogueram@gmail.com Director: Janeth Aid e Perea Villamil C.C 51.614.131 Correo electr onico: aideperea@hotmail.com Tel efono: 6550804 Grupo de Investigaci on: Centro de Investigaci on en Ciencia y Tecnolog a de Alimentos (CICTA) Direccion de correspondencia: Km 2 Via al Refugio Sede UIS Guatiguar a. Codirector : Adriana Soto C.C: Correo electr onico: adrianasm1@hotmail.com Tel efono: 6344000 Grupo de Investigaci on: Centro de Investigaci on en Ciencia y Tecnolog a de Alimentos (CICTA) Direcci on de correspondencia: Km 2 V a al Refugio Sede UIS Guatiguar a L nea de Investigaci on: Alimentos Nombre hasta 3 investigadores expertos en el tema de su propuesta y que estn en capacidad de evaluar proyectos en esta temtica y que no pertenezcan a las entidades proponentes Nombre: Tel efono: Email: Universidad: Nombre: Tel efono: Email: Universidad: Nombre: Tel efono: Email: Universidad: Costo del Proyecto: Duracion del Proyecto:

Resumen
La gran popularidad del aroma y del sabor del chocolate se explica fundamentamente a partir de su fracci on vol atil, siendo estos, los factores m as importantes a tener en cuenta en la evaluaci on de la calidad del chocolate. El aroma y el sabor del chocolate, se relacionan entre otros, con par ametros como el genotipo del cacao, y Colombia actualmente posee una alta diversidad gen etica tanto de materiales (clones) como materiales introducidos, algunos de los cuales han sido caracterizados parcialmente en cuanto a sus propiedades f sico qu micas y morfol ogicas; sin embargo, su perl sensorial y funcional no est a establecido. Por otra parte, el cacao tradicionalmente ha sido sometido a un proceso de fermentaci on y de secado con el n de generar los compuestos precursores que posteriormente durante el tostado dan lugar al aroma caracter stico a cacao. Durante estas etapas sin embargo, hay una p erdida apreciable de compuestos fen olicos que act uan como antioxidantes naturales y que han hecho del cacao hoy en d a, un alimento de gran aceptabilidad por el efecto positivo que su consumo puede tener en la salud. Tambin es importante mencionar que un alto contenido de polifenoles en los licores de cacao conduce a un avor demasiado amargo y astringente. Por tal raz on, en este proyecto se propone correlacionar el contenido de polifenoles en el cacao en verde, los compuestos vol atiles y el perl sensorial de licores de cacao. La correlaci on se establecer a teniendo en cuenta el perl sensorial determinado para cada material de cacao, los compuestos voltiles del licor de cacao y la teobromina, cafena, catequina, epicatequina, procianidina B1 y procianidina B2.

2. RESUMEN

Descripci on de la propuesta
3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema
Planteamiento del problema

3.1.1

El cacao es una materia prima de gran importancia para la industria de chocolater a y conter a, cosm eticos, productos farmac euticos y m as recientemente de compuestos bioactivos como los avonoides que presentan propiedades antioxidantes ben ecas para la salud, por lo que sus posibilidades de desarrollo son amplias (1). Colombia actualmente posee la m as alta diversidad gen etica tanto de materiales (clones), introducidos, como regionales. Los clones que se est an sembrando poseen mejor calidad que los h bridos que hoy generan el grano producido, debido a su sabor, aroma, tama no del grano y porcentaje de cascarilla. Algunos de estos materiales han sido caracterizados parcialmente por FEDECACAO y la UIS con el apoyo del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural en cuanto a sus propiedades f sicas ( ndice de grano, ndice de mazorca, contenido de cascarilla, pH), su composici on en macronutrientes (ceniza, grasa, bra, prote na) y micronutrientes (hierro, zinc, magnesio, sodio, potasio y f osforo) (2, 3); sin embargo, la caracterizaci on en cuanto al contenido de compuestos bioactivos y compuestos vol atiles que determinan el aroma y sabor y perles sensoriales de los mismos, no han sido reportados. En el mercado mundial, los granos o almendras de cacao, se clasican usualmente en dos grandes categor as: La primera, es la de los denominados cacaos corrientes, utilizados para elaborar manteca de cacao, art culos para la cosmetolog a y productos

DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

para los que se requiere gran cantidad de materia prima. La segunda clasicaci on contempla los granos que dan caracter sticas espec cas de sabor, aroma y color en chocolates nos, en revestimientos o coberturas, en el polvo que da sabor a recetas dom esticas y en la prepraraci on de diversos alimentos y bebidas que se consiguen en el mercado. Este tipo de granos se denomina cacao no en Europa y avor beans (granos de aroma) en Estados Unidos. El cacao no de aroma tiene una caracter stica principal que es su gen etica y de all se detectan matices de nueces, ores, panela malta, etc. La anterior clasicaci on corresponde totalmente al aspecto comercial sin tener en cuenta distingos geogr acos, climatol ogicos o de post-cosecha, solo atendiendo a las caracter sticas concretas que presente el grano (4, 5). En el area de an alisis sensorial, se cuenta s olo con informaci on generada en evaluaciones espor adicas realizadas por expertos extranjeros provenientes de Ecuador y de Venezuela en eventos desarrollados por FEDECACAO. No se cuenta en el pa s con un grupo de materiales que hayan sido evaluados en sus cualidades de sabor y aroma y que le permita a lo productores su comercializaci on y la b usqueda de nuevos mercados y exportaci on. Todo esto, a pesar de la gran importancia que tiene el aroma y el sabor en la calidad nal del producto (6). Por lo anterior y si se pretende lograr un mejor posicionamiento en los diversos mercados internacionales existentes para el grano, como el cacao no y de aroma, entre otros productos, se requiere la caracterizaci on organol eptica, sensorial y funcional de los cacaos que m as se comercializan actualmente y de los que han sido considerados promisorios por el Consejo Nacional Cacaotero. En este trabajo se identicar an y cuanticar an los compuestos vol atiles y semivol atiles, el contenido de polifenoles, avonoides y metilxantinas. Estos compuestos se correlacionar an con el perl sensorial de los materiales de cacao y asi establecer un perl caracter stico con respecto al aroma, sabor, funcionalidad y los componentes vol atiles de cada material evaluado.

3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema

3.1.2

Marco te orico

Desde el punto de vista bot anico, la planta del cacao (Theobroma cacao L.), se clasica en tres grandes grupos de cultivares: Criollo, Forastero y Trinitario.

Figura 3.1: Cacao criollo - Cacao Criollo de la Sierra Nevada de Santa Martha de Colombia

El Cacao Criollo, (Ver gura 3.1) evolucion o en el norte de Suram erica y Centro Am erica. Se caracteriza por presentar fruto alargado, con punta pronunciada, doblada y aguda; la supercie es generalmente rugosa, delgada, de color verde frecuentemente con salpicaduras de rojo a p urpura oscuro y la supercie est a dividida en 5 surcos profundos y 5 suaves, tambi en se encuentran algunos con supercie lisa y con lomos y surcos superciales como los materiales denominados porcelana. Adicionalmente, las ramas terminales presentan colores verde claro, con alg un grado de pubescencia y el dosel de los arboles es ligeramente m as oscuro que los h bridos o clones cl asicos, con hojas de textura cori acea (gruesa). Las almendras son grandes, rollizas, de secci on transversal redondeada, con los cotiledones frescos de color blanco o ligeramente pigmentados. Los criollos son materiales de bajo rendimiento y muy susceptibles a enfermedades. Son materiales nos, con mayor suavidad y aroma en comparaci on con los forasteros. De el se obtiene el chocolate de m as alta calidad. El Cacao Forastero, (Ver gura 3.2) corresponde a materiales provenientes de la Cuenca Amaz onica, con dos subgrupos bien denidos. Por un lado el subgrupo de los materiales provenientes de la parte alta de la cuenca amaz onica, r os Caquet a, Napo y Putumayo, con frutos de diversas formas y con diferentes tama nos de almendras de

DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

Figura 3.2: Cacao forastero -

color violeta oscuro y por otro los materiales de la regi on del bajo Amazonas cuyos frutos son de forma amelonada, corta, de color verde y amarillo cuando alcanzan su madurez, con una supercie lisa, de corteza gruesa y dif cil de cortar. Los granos son peque nos y m as o menos aplanados, con un color que var a entre p urpura claro y oscuro. Este tipo de cacao forma un grupo complejo, tanto en sus formas silvestres como cultivadas. Dada su alta productividad y las siembras masivas en africa y Brasil, el cacao de tipo forastero domina la producci on mundial.

Figura 3.3: Cacao trinitario -

3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema

El Cacao Trinitario (Ver gura 3.3)es altamente variable dado su origen h brido por cruces naturales o dirigidos, algunos son poblaciones segregantes que se originaron por hibridaci on natural entre Forastero (amelonado) del bajo Amazonas y Criollos. En el comercio es conocido como cacao no y de aroma y su sabor puede deberse en parte a su herencia criolla; a este grupo pertenecen todos los materiales ICS que se conocen en el mundo (ICS 1, 6,39, etc.). A partir de 1945 en Trinidad y 1955 en Colombia, dada la urgencia de producir semilla h brida para evitar el ataque de Escoba de Bruja, fue necesario incrementar los cruzamientos dirigidos entre materiales Amaz onicos y Trinitarios, originando la semilla h brida comercial que condujo a ampliar la diversidad de formas y colores del fruto, conservando las caracter sticas de cacao no y de aroma como herencia Trinitaria (7). El genotipo inuencia tanto la calidad como la intensidad del aroma y sabor del chocolate, probablemente al determinar las cantidades de los precursores y la actividad de las enzimas y as contribuye a la formaci on del sabor. Reineccius concluy o que las diferencias en las variedades se deb an, inicialmente, a diferencias cuantitativas en los precursores del aroma y en el contenido de polifenoles. Sin embargo, los procesos post-cosecha y tostado tienen inuencia en el aroma nal (8, 9). Las diferencias en el sabor y el aroma pueden ser descritas como variaciones en la composici on del grano seg un su origen bot anico, ubicaci on de crecimiento y condiciones de cultivo. Las variedades de masa dominan mezclas, mientras que las de grado no, usadas en menores cantidades, son seleccionadas por hacer contribuciones espec cas al perl total del aroma. Cada variedad de granos tiene un u nico car acter potencial del avor. Pero las condiciones de crecimiento tales como el clima, la cantidad y el tiempo de sol y de lluvia, las condiciones del suelo, la madurez y el tiempo de cosecha, el tiempo entre cosecha y fermentaci on de los granos todos contribuyen a variaciones en la formaci on nal del aroma (10). El cacao de masa t picamente muestra caracter sticas fuertes del sabor, y los cacaos nos son percibidos como arom aticos o m as suaves, notando diferencias consistentes en los atributos del aroma y del sabor, espec camente la intensidad total del sabor de cacao, acido, agrio, amargo y astringente. Los licores de cacao dieren en car acter sensorial. Los grupos de Africa Occidental son generalmente considerados fuentes de sabor de cacao est andar con un car acter de cacao balanceado pero pronunciado, con matices de nuez desde sutil hasta moderado. Los licores de Cameroon son reconocidos

DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

por su amargura y los de Ecuador por las notas oral-especiado. Los rangos de las variedades americanas y de Las Indias Occidentales var an desde notas arom aticas y de vino en el cacao de la Trinidad hasta el oral o de uvas pasas y frutal del Ecuador, haciendo u nicas contribuciones a las mezclas. Los granos de Asia y Ocean a exhiben un rango de perles del sabor que va desde sutiles notas de nuez/dulce en granos de Java hasta las intensas notas acidas y fen olicas del Malasio (11). El aroma atractivo a cacao tostado es el resultado de un proceso tecnol ogico sosticado aplicado a las semillas del cacao. Durante este proceso, tratamientos como la fermentaci on, el secado y el tostado se emplean para mejorar las caracter sticas de los productos nales. Fermentaci on

Figura 3.4: Fermentaci on en caja -

Figura 3.5: Caja para hacer la fermentaci on -

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3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema

La fermentaci on es un proceso de reacci on de m ultiples etapas que utiliza, naturalmente, las levaduras y las bacterias para crear los principales precursores del sabor y los cambios de color en los granos de cacao Despu es de la cosecha de la mazorca, los granos y la pulpa adherida se transeren a pilas, cajas o cestas para la fermentaci on con una duraci on de 5 a 6 d as para los granos de Forastero, pero para los criollos s olo 1-3 d as. La fermentaci on t pica de cacao en caja es como se muestra en las guras 3.4 y 3.5 (12). En el primer d a, con el aumento constante de la temperatura, la pulpa adherida al grano se lic ua y se drena. Al tercer d a, la masa del grano se calienta por lo general alrededor de 45o C, manteni endose entre 45-50o C hasta que se completa la fermentaci on (8). La sacarosa y los constituyentes prote nicos son parcialmente hidrolizados en la fermentaci on, los compuestos fen olicos se oxidan y la glucosa se convierte en alcoholes y se oxida a acido ac etico y l actico durante la fermentaci on. Los granos posteriormente sufren una fase anaer obica hidrol tica, seguida por condensaci on aer obica. El tiempo, la secuencia de los acontecimientos y el grado de hidr olisis y oxidaci on var an entre las fermentaciones. La concentraci on de los precursores de aromas depende de mecanismos enzim aticos. Los cambios de color tambi en se producen con la hidr olisis de compuestos fen olicos por glicosidasas acompa nados por el blanqueo, que inuyen en car acter de sabor nal (13, 14). Entre los precursores nitrogenados del sabor, formados durante las fases anaer obicas, dominan los amino acidos y p eptidos. Los cuales est an disponibles para reacciones no oxidativas de condensaci on amino-carbonilo promovidas en las fases de temperaturas elevadas, tales como la fermentaci on, secado, tostado y molido. Aunque degradada a los precursores de aromas, la prote na residual disminuye tambi en por las interacciones prote na-fenol. Durante las fases aer obicas, se producen reacciones mediadas por el ox geno, tales como la oxidaci on de complejos prote napolifenol formados anaer obicamente. Estos procesos reducen la astringencia y la amargura: los polifenoles oxidados inuyen en las reacciones posteriores de degradaci on (15). El m etodo de la fermentaci on determina la calidad nal de los productos, especialmente el sabor. Importantes compuestos activos del sabor producidos durante la

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DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

fermentaci on incluyen etil-2-metilbutanoato, tetrametilpirazina y determinadas pirazinas. Notas amargas son evocadas por la teobromina y la cafe na, junto con dicetopiperazinas formadas a partir del tostado a trav es de descomposici on t ermica de las prote nas. Otros compuestos precursores del sabor derivados de amino acidos liberados durante fermentaciones incluyen 3-metilbutanal, fenilacetaldeh do, 2-metil-3-furano (metilditio), 2-etil-3 ,5-dimetil-y 2,3-dietil-5 metilpirazina (9).

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3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema

Secado El desarrollo del sabor del cacao en grano durante el secado contin ua con el desarrollo del color marr on caracter stico. Despu es de la fermentaci on, los granos se retiran de las pilas o cajas y se secan al sol en plataformas elevadas cubiertas con esteras (guras 2.13 y 2.14) o en el suelo (Figura 2.15) hasta que est en completamente secos (de 7-8 d as de sol) . Durante el proceso, las principales reacciones oxidantes polifenoles son catalizadas por oxidasas polifenoles, dando lugar a nuevos componentes de sabor, y la p erdida de integridad de la membrana, induciendo la formaci on de color marr on. El uso de secado articial puede aumentar la temperatura de cotiledones, causando caso endurecimiento. Dimick y la g. 2.13 Los agricultores de cacao secado en plataformas elevadas. Tradicionalmente, el secado del cacao fermentado es realizado por exposici on al sol. En esta etapa, el desarrollo del sabor y el proceso de amarronamiento contin ua y la astringencia, amargura y acidez son reducidas. El proceso de secado termina cuando el contenido de humedad en las semillas es menor del 8%. El secado al sol es considerado el mejor m etodo para obtener el m aximo desarrollo del avor. Sin embargo, este m etodo presenta desventajas como sus largos tiempo y las labores requeridas para producir cacao con calidad heterog enea durante el tiempo de lluvias (16). Tostado El tostado de las semillas fermentadas cumple principalmente dos prop ositos: la remoci on de compuestos no deseados con bajos puntos de ebullici on, tales como acido ac etico, y la formaci on de los odorantes t picos del cacao dulce y tostado. El tratamiento t ermico inicia reacciones entre los az ucares reductores y los amino acidos o p eptidos de cadena corta, consecuentemente conduce a una signicativa reducci on en la concentraci on de amino acidos y az ucares reductores. Durante el tostado se forman compuestos como son alcoholes, eteres, furanos, tiazoles, pirroles, acidos, esteres, iminas, aminas, oxazoles y pironas (17, 18). 3.1.2.1 Compuestos polifen olicos en el cacao

El cacao es una materia prima de gran importancia para la industria de chocolater a y contera, de cosm eticos, productos farmac euticos y m as recientemente de productos

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DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

bioactivos como los antioxidantes. En el pa s, el cacao se ha caracterizado por ser uno de los principales productos agr colas y aunque su cultivo se realiza a nivel de peque nos agricultores, este trae grandes benecios para el campesino ya que constituye una alternativa econ omica y sostenible para la explotaci on agr cola del tr opico colombiano. El cacao tiene un gran contenido de macronutrientes como grasa, prote na, bra; de micronutrientes como potasio, hierro, zinc, f osforo, magnesio, adem as de otros compuestos como los polifenoles, sustancias de gran relevancia por su comportamiento como antioxidantes (19). La grasa del cacao su componente mayoritario es adem as rica en acido este arico, un acido graso neutro no aterog enico y en acido linoleico, un acido graso esencial. Este producto es particularmente un alimento rico en polifenoles, su semilla fresca contiene aproximadamente del 6% al 8% de su peso en base seca (Zumb e, 1998). Estos compuestos adem as de los alcaloides representados por la teobromina y la cafe na y diferentes aldeh dos y cetonas tienen incidencia sobre el aroma y sabor de cacao d andole un avour a amargo, astringente, aroma a cacao, aroma frutal y nota verde entre otros. El avour depende del tipo de grano y de las condiciones de fermentaci on y secado, as como de los tratamientos a los que se expone el grano durante su transformaci on industrial (20) Los compuestos fen olicos constituyen uno de los grupos de sustancias m as numerosas en la naturaleza, con m as de 8000 estructuras ampliamente conocidas (21), por su estructura b asica se dividen en 10 clases entre las que sobresalen los avonoides que constituyen el grupo m as importante porque inuyen en la aceptabilidad y estabilidad de los alimentos ya que act uan como colorantes, antioxidantes y saborizantes (11). Los avonoides, especialmente los avan-3-ols catequina, epicatequina, galactocatequina y epigalctocatequina, son los constituyentes monom ericos de los taninos condensados. Recientemente se ha evidenciado que los avonoides del cacao y sus derivados como la catequina, epicatequina y sus olig omeros las procianidinas participan en la prevenci on de enfermedades cardiovasculares y degenerativas, ya que estas sustancias act uan como antioxidantes que protegen las c elulas frente a la acci on de los radicales libres y frente a especies degenerativas, previniendo as la oxidaci on de las lipoprote nas de baja densidad (LDL) (22), lo que ha permitido considerar al cacao y sus productos derivados como alimentos funcionales.

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3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema

3.1.2.2

Compuestos vol atiles y semivol atiles identicados en productos derivados del cacao
Compuestos vol atiles identicados en el licor de cacao Compuestos Alcoholes 1-Pentanol 2-Pentanol Benzil-alcohol 3,7-Dimetil-1,6-octadien-3-ol 3-Metil-1-butanol 2-Feniletanol 2-Heptanol Fenilmetanol 2-Metoxifenol Aldeh dos 2-Metilpropanal 3-Metilbutanal 2-Metilbutanal 2-Metil-2-butenal 3-(Metiltio)propionaldeh do Heptanal Benzaldeh do Fenilacetaldeh do Nonanal 2-Fenil-2-butenal (E,E)-2,4-nonadienal 2-Fenil-5-metil-2-hexenal Esteres Etilbenzoilformato Etilbenzoato Etiloctanoato 2-Feniletilacetato Etil-2-metilpropanoato Etil-2-metilbutanoato Etil-3-metilbutanoato Sabor descrito

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Floral C trico Floral Ahumado

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Chocolate, malta Chocolate, malta Chocolate, malta Papa

Floral, miel Cacao, dulce, tostado, ron

22 23 24 25 26 27 28

Floral

29 30 31 32 33 34 35 36 37

Furanos Dihidro-2-metil-3(2h)-furanona Furancarboxaldeh do (furfural) Furfuril alcohol (furfurol) 1-(2-furanil)etanona (acetilfurano) 5-Metil-2-furancarboxaldeh do 2-Eteniltetrahidro-,,5-trimetil-cis-2-furanmetanol ( oxido de linalool) 2-Metil-3-(metilditiofurano) 3-Fenilfurano 4-Hidroxi-2,5-dimetil-3(2H)-furanona Hidrocarburos Metilbenceno (Tolueno) Cetonas 2,3-Butanodiona 2-Heptanona 1-Octen-3-ona Compuestos nitrogenados Benzonitrilo

Carne Cacao, verde, menta Caramelo

38

39 40 41

Mantequilla

42

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DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

Compuestos vol atiles identicados en el licor de cacao No. Compuestos Piranos 3,4-dihidro-8-hidroxi-3-metil-1H-2-benzopiran-1-ona Pirazinas Pirazina Metilpirazina 2-Etil-3,5-dimetilpirazina 2-Etil-3,6-Dimetilpirazina 3-Isobutil-2-metoxipirazina 2,5-Dimetilpirazina Etilpirazina 2,3-Dimetilpirazina Etenilpirazina 2-Etil-5(o 6)-metilpirazina Trimetilpirazina 2-Etil-3-metilpirazina 2-Etenil-6-metilpirazina 3(o 2),5-Dimetil-2-(o 3)-etilpirazina Tetrametilpirazina 2-Isopropil-3-metoxipirazina 2,3-Dietil-5-metipirazina 3,5(o 6)-dietil-2-metilpirazina 2,5(o 6)-Dimetil-3-(2-metilpropil)pirazina 2,3,5-Trimetilpirazina 2,5-Dimetil-3-(3-metilbutil)pirazina Piridinas Piridina 2-Metilpiridina 1-(2-piridinil)-1-propanona Pirroles 2-Carboxaldeh do-1H-pirrol 1-(1H-pirrol-2-il)etanona (acetilpirrol) 3-Etil-2,5-dimetil-1H-pirrol 1-(2-furanilmetil)-1H-pirrol (furfurilpirrol) 2-Acetil-1-pirrolina 1H-indola Azufrados Dimetiltrisulfuro acidos cido ac a etico acido propanoico acido butanoico acido 2 y 3-metilbutanoico Sabor descrito Referencias

43

(23)

44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64

Avellana, verde Tierra Tierra Pimienta Verde, eter, ron Avellana, tostado

(23) (23)

Cacao, tostado, verde Avellana, tostado Tostado, ahumado, pralina, ron Caf e de leche, moca, tostado, verde Guisantes, verde, avellana Tierra Cacao, chocolate, ron, dulce, tostado Avellana Tierra Tostado, dulce, verde

(23) (23) (23) (23) (23) (23) (23) (23) (23) (23) (23) (23) (23) (23) (17) (23)

65 66 67

(23) (23) (23)

68 69 70 71 72 73

Cacao, chocolate, avellana, tostado Cacao, avellana, caf e, tostado Tostado, chocolate, verde

(23) (23) (23) (23) (23)

74

Sulfuroso

(17)

75 76 77 78

acido Rancio Sweaty Rancio

(17) (17) (17) (17)

Tabla 3.1: Compuestos identicados como odorantes claves en licor de cacao

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3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema

En la tabla 3.1 se muestran algunos de los compuestos vol atiles m as importantes reportados en muestras de cacao, cubriendo desde aldeh dos, pirazinas, acidos, esteres, furanos, cetonas, fenoles, pirroles, alcoholes, y tambi en compuestos reportados con altos factores de diluci on del aroma, entre ellos fenil acetaldeh do, 2-etil-3,5-dimetilpirazina, 2-y 3-metilbutanoico acido, dimethyltrisulde, 4-hidroxi-2,5-dimetil-3(2H)-furanona, fenilacetaldeh do, y 3-4-hidroxi-dimetil-2 (5H) - furanona (17, 20, 23). Los aldeh dos hacen parte de los principales compuestos formados a partir del proceso de tostado en la fabricaci on de chocolate (24). Varios aldeh dos han sido reportados como compuestos esenciales del sabor del cacao, incluyendo el chocolate de masa, contes y cacao en grano, entre estos el (S)-2-nonenal, (S)-2-octenal, 2-furaldeh do, 2-metilbutanal, 2-metilpropanal, 3-metilbutanal, 5-metil-2-fenil-hexenal, acetaldeh do, benzaldeh do, hexanal, y fenilacetaldeh do (20, 23, 25).Algunos de estos aldeh dos importantes contribuyen a la nota de chocolate fuerte, por ejemplo 3-metilbutanal, 2 metilpropanal, 2-metilbutanal, acetaldeh do, isobutiraldeh do, benzaldeh do, fenilacetaldeh do, 5-metil-2-fenil-2-hexenal, y 2-7-furaldehyde. El 3-metilbutanal se ha reportado como un vol atil muy importante en los granos de cacao, cacao en polvo, pasta de cacao, chocolate negro y chocolate de leche (20, 23, 25). Se observ o tambi en que la mezcla de disulfuro y 3-metil metilbutanal contribuye con un olor a cacao en los granos de cacao tostado (26). El 5-metil-2-fenil-2-hexenal fue identicado por primera vez en el cacao en grano tostado, y se describe como un profundo sabor amargo persistente del cacao (26). Otros aldeh dos reportados como compuestos principales presentaban altas actividades de olor o un alto factor de diluci on del sabor, as el (E)2-nonenal, (E)-2-octenal, hexanal en chocolate de masa, (E, E) -2, 4 nonadienal, (E, E) -2, 4-decadienal, (Z)-2-Decenal identicados en chocolate de leche mediante an alisis de diluci on del aroma (20). El fenilacetaldeh do y el 3-(metiltio)propionaldeh do se perciben fuertemente en el puerto de inhalaci on de chocolate de leche. El fenilacetaldeh do tambi en fue reportado como un compuesto activo en el olor del chocolate negro (20, 25). Las pirazinas corresponden a uno de los grupos principales formados en la reacci on de Maillard durante el tostado. En una quinta parte de los 525 compuestos vol atiles identicados en cacao en grano tostado, predominan las fracciones pirazina (20). Cinco pirazinas han sido identicados como compuestos arom aticos importantes en estudios anteriores (3.1). El 2-etil-3,5-dimetilpirazina hab a sido reportado como factor de alto

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DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

sabor de olor activo y alta diluci on al contribuir con un sabor de tierra y patatas, importante en el cacao en polvo, cacao de masa, y chocolate de leche (20, 25). La 2metoxi-3-isopropilpirazina y la 2, 3-dietil-5-etilpirazina fueron identicadas como compuestos importantes, debido a sus actividades olor altos y los factores de diluci on del sabor de la masa de cacao, as como el chocolate de leche (20). La 3 ( o 2), 5-dimetil2-etilpirazina, 3, 5 ( o 6)-dietil-2-metilpirazina, y trimetilpirazinas fueron reportadas como contribuyentes al sabor pralin e y chocolate, y la presencia de un grupo etilo en las dos primeras pirazinas indica la importancia de la alanina y su aldeh do de Strecker, acetaldeh do, en la s ntesis de sabor a chocolate. Las tetrametilpirazinas fueron las pirazinas m as abundantes en el chocolate oscuro, y proporcionaron un sabor de caf e moca tostado (23). El acido ac etico es un compuesto importante que tiene un efecto signicativo sobre el aroma de chocolate, ya que puede proporcionar un sabor indeseable, como el del vinagre. El acido ac etico es de los olores m as abundantes en el chocolate (25). Los acidos vol atiles pueden ser eliminados mediante el procesamiento, tales como el conchado. (27). Se supone que el acido ac etico se produce a partir de la oxidaci on de aldeh dos y alcoholes y es liberado a partir de esteres por mecanismos mec anicos y/o t ermicos durante el proceso. Tambi en se han reportado otros compuestos importantes, aunque no tanto como los aldeh dos, las pirazinas y el acido ac etico. Entre estos est an acidos, esteres, furanos, cetonas, fenoles y pirroles. Los acidos 2-metilbutanoico, y 3 metilbutanoico- acido fueron identicados como compuestos importantes debido a su alta intensidad de olor en el chocolate de masa (20). Ellos son la forma acida de 2-metilbutanal y 3 metilbutanal, que son aldeh dos clave en el sabor de chocolate. Aparte de los acidos mencionados anteriormente, el butanoico, el acido pentanoico, el acido hexanoico, el acido fenilac etico, el acido propanoico y acido metilpropanoico se reportaron como mayor a de compuestos activos al olor en chocolate de leche, granos de cacao y cacao en polvo (17, 20, 25). El 2-metil-3-(metilditio) furano es un odorizante clave en masa de cacao (20). Counet et. al., empleando cromatograf a de gases acoplada a espectroscop a de masas y cromatograf a de gases - olfatometr a, identicaron 60 compuestos en 2 chocolates oscuros, principalmente, heterociclos de nitr ogeno y de carbono, aldeh dos y cetonas, esteres, alcoholes, hidrocarburos, nitrilos y sulfuros. Ellos concluyeron, a partir

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3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema

de los an alisis por cromatograf a de gases olfatometr a, que solamente algunos compuestos vol atiles en niveles por partes por mill on surg an como odorantes claves. Entre estos, incluyeron los aldeh dos, 2-metilpropanal, 2 y 3-metilbutanal y fenilacetaldeh do. Los primeros tres, con notas fuertes de chocolate, tienen probablemente un mayor impacto en el sabor del chocolate. El 3-propionaldeh do es otro aldeh do fuertemente percibido, a pesar de baja concentraci on en niveles de partes por bill on, mostrando un sabor a mosto y papas. Otro compuesto reportado por Counet et. al. es el trimetilsulfuro, con su caracter stico sabor a cebolla. Otros compuestos fueron los heterociclos de nitr ogeno: 3( o 2),5-dimetil-2( o 3) etilpirazina, 3,5 ( o 6)-dietil-2-metilpirazina, acetilpirrol y furfurilpirrol, los cuales aportaron el sabor a chocolate y a almendra garapi nada. Por otra parte, compuestos como la 2,3-dimetilpirazina, trimetilpirazina y tetrametilpirazina y 2-isopropil-3-metoxipirazina fueron identicados como responsables del sabor a avellanas los dos primeros y a caf e moca tostado el u ltimo. El alcohol m as abundante, el 2-feniletanol mostr o una nota oral, t pica del chocolate oscuro. Tambi en la 2,5-dimetil-4-hidroxi-3(2H)furanona, la 2,3-butanodiona, el 2-metoxifenol y el 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeh do fueron identicados como importantes compuestos del olor, mostrando cada uno notas a caramelo, mantequilla, humo y vainilla respectivamente (23). Frauendorfer y Schieberle aplicaron un an alisis de diluci on del extracto del aroma sobre cacao tostado, el cual revel o 42 compuestos del aroma y entre estos los m as importantes. El 2 y 3-metilbutanal mostraron notas del aroma a malta, con los factores de diluci on m as altos, seguidos por los acidos 2 y 3-metilbutanoico, los cuales presentaron un olor rancio. A continuaci on, con un aroma a miel, reportaron el fenilacetaldeh do, al cual le siguieron el 2-feniletanol y la 3-hidroxy-4,5-dimetil-2(5H)-furanona, con aroma oral y sazonante, respectivamente. Otros importantes compuestos del olor tambi en fueron el acido ac etico con su sabor acido, el 2-heptanol (c trico), el trimetildisulfuro (sulfuroso), las pirazinas (tierra), el acido butanoico (humedad, sudor), y el acido fenilac etico (miel) (17).

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DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

3.1.2.3

T ecnicas de extracci on, muestreo y an alisis de los compuestos del aroma.

Los granos del arbol de Theobroma cacao son una materia prima muy compleja que a un desconcierta a los fabricantes de chocolate y los qu micos encargados de su estudio. Actualmente, m as de 500 compuestos del sabor y del aroma han sido encontrados a partir de productos de cacao, y la identicaci on de la fuente de cada uno de estos sabores ha sido una ciencia en si mismo (28). Para realizar la identicaci on de los compuestos del aroma y del sabor del cacao se han empleado diferentes formas de extracci on, las cuales van desde la cl asica extracci on con solvente (10, 17, 23, 25) hasta modernas t ecnicas tales como microextracci on en fase s olida (16, 29, 30). El an alisis de los compuestos del aroma comienza con la selecci on del tipo de producto de cacao que contiene los compuestos del perl sensorial. Aculey et. al. emplearon polvo de cacao molido (31), Ducki et. al. partieron de polvo de cacao natural sin alcalinizar y de polvo de chocolate conchado (29), mientras que Li et. al. utilizaron polvo de cacao comercial (30). Todos los autores coinciden en emplear el cacao molido para realizar la extracci on de los vol atiles. Hay muchos m etodos usados para extraer o concentrar los compuestos del aroma de las comidas previo al an alisis (32). Entre ellos est an: Extracci on con solvente. La simple extracci on con solvente seguida de concentraci on bajo nitr ogeno o en un evaporador rotatorio fue uno de los primeros m etodos usados para recuperar los compuestos del avor de los alimentos. Sin embargo, los bajos niveles de estos compuestos en los alimentos mas el nivel de componentes de la matriz extra dos simult aneamente generalmente han limitado la aplicaci on de la extracci on directa. Sin embargo, sigue siendo u til para algunas muestras (por ejemplo, pan). Alto vac o, la destilaci on a baja temperatura o sublimaci on generalmente tiene ventajas para la recuperaci on de un amplio espectro de compuestos vol atiles. La destilaci on de vapor proporciona un medio sencillo para la recuperaci on de los componentes vol atiles de los productos alimenticios, pero por desgracia conduce a artefactos de descomposici on t ermica (33). Sin embargo, hay dicultades pr acticas asociadas con su uso y la baja presi on que el equipo tiene en el lado del solvente, lo cual hace que sea dif cil mantener el solvente en el aparato. Se han realizado algunas modicaciones pero no se ha podido eliminar por completo esa

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3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema

dicultad (34). Se han reportado problemas en la baja recuperaci on de compuestos que tienen una alta volatilidad, adem a de las p erdidas de analito con formaci on de artefactos y la oxidaci on de los componentes de sabor que no se encuentran por aislamiento con destilaci on al alto vac o (35).

Figura 3.6: Extracci on con solvente -

A pesar de su sencillez, (ver gura 3.6) la tendencia moderna es reemplazar la extracci on por otras t ecnicas, porque se necesitan disolventes de alta pureza para el an alisis de trazas y debido a la necesidad de reducir los riesgos ambientales y de salud asociados con su manipulaci on. Por otra parte, la normatividad no permite aplicar extracci on l quido-l quido a muestras vivas. Schnermann et. al. emplearon esta t ecnica para extraer los compuestos vol atiles de polvo de cacao. Cortaron el chocolate en trozos los cuales fueron congelados en nitr ogeno l quido y luego se molieron por medio de un Mezclador comercial (Moulinette, Quelle, Nrenberg, Alemania). El polvo de chocolate se extrajo durante 8 horas a 40o C con eter diet lico (800 ml) en un aparato Soxhlet. El extracto fue concentrado a 200ml mediante el uso de una columna Vigreux (50 cm x 1cm de di ametro interno). Para retirar el material no vol atil, el concentrado se destil o a continuaci on usando el equipo descrito recientemente. Por tratamiento del destilado con bicarbonato de sodio acuoso, se obtuvo una fracci on de los acidos vol atiles (fracci on AV) y otra de los compuestos vol atiles neutros/b asicos (fracci on VNB). Despu es de secar sobre Na2 SO4 , ambas fracciones se concentraron a 200l (cf. Schieberle, 1991) y los compuestos activos de olor se evaluaron por AEDA (20).

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DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

Counet et. al. realizaron la extracci on de los vol atiles de 300g de polvo de chocolate negro empleando destilaci on al vac o. Las trampas se enfriaron con nitr ogeno l quido. La temperatura del ba no de agua se mantuvo en 35o C para evitar formaci on de nuevos aromas. Despu es de 3 horas de destilaci on, los 400ml de condensado se guardaron a 4o C durante toda la noche. El condensado acuoso se ajust o a pH 13 con NAOH y entonces se extrajo diclorometano. La primera fracci on fue la fracci on neutra/b asica. La fase acuosa fue entonces ajustada a pH 5 con HCl al 37% y se extrajo con diclorometano. Esta segunda fracci on org anica fue la fracci on vol atil acida. Ambas fracciones fueron concentradas hasta 0.25ml a 46o C empleando una columa Snyder-Kuderna. Un total de 60 compuestos fueron identicados en la fracci on b asica de dos chocolates negros, mientras que en la fracci on acida solo se identicaron 18 compuestos (23). Extracci on con di oxido de carbono. La extracci on con di oxido de carbono es otro tipo de extracci on con disolvente, que utiliza di oxido de carbono a alta presi on, en condiciones de uido supercr tico para extraer tanto aceites esenciales como oleorresinas. El CO2 supercr tico y el l quido pueden ser utilizados como solventes muy inertes e inocuos. El CO2 l quido se ajusta a los requisitos en cuanto a su habilidad como solvente y bajo punto de ebullici on. Tambi en es no inamable, inerte, barato, y tiene baja toxicidad. Como disolvente, el CO2 l quido es altamente selectivo, en particular hacia los esteres, aldeh dos, cetonas, alcoholes y compuestos representativos del aroma (36). La extracci on con CO2 l quido y baja temperatura, produce extractos que se parecen m as al aroma de los materiales vegetales originales que cualquier proceso que incluya el calentamiento de los materiales vegetales. Algunos ejemplos de extracci on comercial con CO2 l quido son los siguientes: an s de estrella, cardamomo, semillas de apio, brotes de clavo, caf e, semillas de cilantro, jengibre jamaicano, el jengibre nigeriano, jengibre desterpenado, aceite de l upulo, bayas de enebro al 20%, maza, nuez moscada, pimienta aceite negro, baya pimiento morr on y extracto puro de vainilla. En contraste con CO2 l quido, el poder disolvente del uido supercr tico es altamente dependiente de la temperatura y la presi on. La ventaja del m etodo, por supuesto, es que no queda residuo de disolvente, ya que a temperatura y presi on normal, el CO2 simplemente se vuelve a un gas y se evapora. Sin embargo, cuando el CO2 supercr tico se utiliza para producir sabores y aromas, algunas ceras no deseadas, resinas y pigmentos se presentan simult aneamente. Algunos ejemplos

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3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema

de la extracci on con CO2 supercr tico comercial son las siguientes: apio, aceite de jengibre, extracto puro de jazm n, aceite de massoia, sabor y color de piment on, aceite de pimienta, romero, salvia y extracto puro de vainilla (37, 38). La mayor parte de los inconvenientes encontrados en los procedimientos convencionales mencionados en la extracci on con solvente son eludidos mediante CO2 supercr tico como agente de extracci on. Entre las ventajas de este m etodo relativamente nuevo se podr a mencionar que no se presentan disolventes residuales t oxicos, no hay degradaci on t ermica debido a la temperatura de trabajo a corto y medio ambiente inerte de CO2 , ahorro de energ a en la regeneraci on de disolventes, una mejor vida u til debido a la co-extracci on de antioxidantes y la eliminaci on del ox geno disuelto, el CO2 es un solvente no inamable y no tiene riesgo ambiental, se pueden realizar cambios en las condicones de la extracci on para obtener en un u nico disolvente por peque nas variaciones de los par ametros del proceso, tales como presi on y temperatura, o un agente de arrastre, por lo que es un disolvente exible, vers atil, y multiproducto, extracci on r apida y alta recuperaci on de los extractos, adem as que se obtienen excelentes caracter sticas de mezcla de los extractos. En la explotaci on del cacao como materia prima, se ha prestado mucha importancia a la producci on de manteca de cacao. El empleo de disolventes org anicos ha mostrado algunos inconvenientes importantes, como la eliminaci on del disolvente nal, que es generalmente costoso y consume tiempo. Los uidos supercr ticos, con menos resistencia a la transferencia de masa de los disolventes l quidos convencionales, se han utilizado ampliamente como disolventes para reacciones enzim aticas de interestericaci on de manteca de cacao con lipasas en solventes org anicos (39, 40, 41). Adem as, la solubilidad de la mayor a de los compuestos org anicos en los uidos supercr ticos es mayor que en la fase gaseosa y es comparable con disolventes l quidos. Entre los uidos supercr ticos, el SC-CO2 ha sido especialmente ventajoso debido a la baja toxicidad, la viscosidad, el coste, la tensi on supercial y alta difusividad cuyo impacto sobre el medio ambiente es despreciable (18, 42). M etodos de espacio de cabeza (headspace HS) Los m eritos del muestreo del espacio de cabeza para recuperar los compuestos vol atiles asociados con el aroma han sido reconocidos (43). El procedimento original de HS involucr o recuperaci on est atica, en la cual la muestra era equilibrada en un

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DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

contenedor sellado a una temperatura controlada y el espacio de cabeza de la muestra era extra do a trav es de un septum. Las aplicaciones de muestreo de headspace est atico eran limitadas por un n umero de factores que inclu an baja sensibilidad. Otro tipo de procedimiento de extracci on de espacio de cabeza, es el llamado Headspace Din amico, HD. El procedimiento din amico (llamado purga y trampa) involucra pasar un gas inerte a trav es de la muestra y recolectar los constituyentes vol atiles en una trampa. El equilibrio entre la muestra y el espacio de cabeza es constantemente removido resultando en una mejora de la sensibilidad. Los detalles dieren en el tipo de trampa, la carga y descarga de la trampa con m etodos que incluyen atrapamiento criog enico, absorci on sobre un lecho de absorbente, en columna, trampas de vapor por crio-atrapamiento en toda la columna. Las trampas de fr o tienen la desventaja de que el agua es recogida con el material vol atil. Las trampas absorbentes que utilizan carb on o pol meros porosos son comunes. La desorci on t ermica permite que esta t ecnica se utilice para una amplia gama de compuestos, sin embargo, puede causar cambios moleculares en las mol eculas sensibles. Emplear un disolvente para la desorci on es una t ecnica m as suave pero los compuestos muy vol atiles se pierden o se ocultan. El circuito cerrado de arrastre y la uni on del agua con sulfato de sodio en exceso aumenta la efectividad del espacio de cabeza din amico de alto ujo para el aislamiento de compuestos vol atiles solubles en agua (44). Dirinck et al. (45) sugiere que el an alisis HS tiene en cuenta la liberaci on de compuestos vol atiles en la matriz del alimento, lo cual es m as signicativo que el an alisis de vol atiles totales para la correlaci on de un an alisis qu mico con el juicio sensorial. Esto permite realizar an alisis m as r apidos y analizar los compuestos vol atiles sin destruir la muestra. Los extractos obtenidos por HS son generalmente de contenido m as limpio, con menos compuestos que en los obtenidos por extracci on con disolvente o los m etodos de destilaci on (46). Owusu et. al. emplearon HD para extraer los compuestos vol atiles de dos muestras de chocolate negro. Usaron trampas Tenax y desorci on t ermica. La t ecnica se aplic o sobre 20g de muestra, los cuales se purgaron con un ujo de nitr ogeno a 200ml/min durante una hora a 30o C. Estos autores reportan 64 y 58 compuestos vol atiles en las muestras de chocolate analizadas (47). Las t ecnicas de extracci on tales como la extracci on l quido-l quido y m etodos de extracci on de vapor de destilaci on requieren consumo de disolventes org anicos costosos y t oxicos, el tiempo, y la necesidad de eliminaci on de disolvente (Pawliszyn & Arthur,

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3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema

1990). La extracci on din amica en fase s olida puede eliminar los disolventes por completo, sin embargo esta t ecnica requiere de una amplia modicaci on de la cromatograf a de gases, inyector o la adici on de un m odulo de desorci on (Pawliszyn & Arthur, 1990). La microextracci on en fase s olida (SPME) elimina los problemas asociados con la extracci on de fase s olida din amica manteniendo las ventajas. Los disolventes se eliminan por completo y el tiempo de extracci on se puede reducir a unos pocos minutos (Pawliszyn & Arthur, 1990). La t ecnica de microextracci on en fase s olida en el espacio de cabeza (Headspace Solid Phase Microextracction HS-SPME) ha sido usada con prop ositos cuantitativos en compuestos vol atiles de diferentes productos, tales como bebidas alcoh olicas, caf e, leche, jugos y granos de cacao (48, 49). Esta t ecnica ha sido reportada por ser econ omica, libre de solvente, r apida y tambi en alta reproducibilidad (29, 50, 51). En la extracci on de compuestos vol atiles y/o del aroma y sabor del cacao la t ecnica de HS-SPME ha sido ampliamente utilizada (16, 29, 30, 52). Se han realizado variaciones en cuanto al tiempo de acondicionamiento y de exposici on de la bra al espacio de cabeza, temperatura de acondicionamiento, peso y volumen del espacio de cabeza de la muestra. Tambi en se han empleado diferentes tipos de bras tales como DVB/CAR/PDMS, PDS/DVB, CAR-PDMS, PDMS y PDM-DVB. Ducki et. al. examinaron la eciencia de extracci on y la sensibilidad de las anteriores bras y concluyeron que la bra DVB/CAR-PDMS logr o la mayor eciencia de extracci on de compuestos tanto vol atiles como semivol atiles. Rodr guez-Campos et. al. extrajeron los compuestos vol atiles de muestras de cacao, a partir de 2g, usando la t ecnica de HS-SPME y empleando una bra de 50/30 m de divinilbenceno/carboxeno/polidimetilsiloxano (DVB/CAR/PDMS) proporcionada por Supelco para extraer los vol atiles. Se identicaron un total de 58 compuestos, entre los cuales se encontraron esteres, alcoholes, acidos, aldeh dos, cetonas y pirazinas. 3.1.2.4 M etodos de cuanticaci on de los compuestos vol atiles del cacao

Ducki et. al. realizaron la cuanticaci on de los compuestos vol atiles por el m etodo de los est andares externos, el cual requiere una curva de calibraci on de cada compuesto. Tambi en usaron el m etodo del est andar interno, en el que varios radios entre la respuesta de los compuestos individuales y el est andar interno pueden ser usados. El tolueno fue usado como est andar interno. La cantidad optima de tolueno agregada al analito

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DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

fue ajustada a 50g para evitar la saturaci on del detector y tambi en para evitar el enmascaramiento de picos de inter es. La subsecuente determinaci on semi-cuantitativa fue realizada con referencia al est andar interno, 45 compuestos fueron determinados en polvo de cacao (29). Por otra parte, Li et. al. emplearon hexanotriol como est andar interno. 50g de hexanotriol en 1ml de etanol fueron agregados a 2g de muestra (30). En la determinaci on cuantitativa de compuestos vol atiles del aroma del te Wang et. al. emplearon etil octanoato como est andar interno (53), mientras que Coleman et. al. emplearon ciclohexanona para realizar la cuanticaci on de los compuestos vol atiles extra dos del avors articiales (54). Otros autores han empleado el m etodo del est andar interno para determinar la concentraci on de los compuestos vol atiles en polvo y licor de cacao (10, 17, 23) 3.1.2.5 T ecnicas empleadas para identicar los compuestos del aroma

An alisis sensorial Un compuesto puede presentar m as de un umbral de reconocimiento y en diferentes concentraciones generar diferentes avores. Tambi en existen compuestos llamados antagonistas, los cuales intereren con la capacidad de detectar el avor hasta casi desaparecerlo. Otra clase de compuestos son los llamados sinergistas, estos potencian la capacidad de detectar el avor. Es perfectamente conocido que muchos de los grandes picos de los cromatogramas en fase gaseosa de los alimentos no se correlacionan con el aroma. Por ejemplo, el limoneno, el principal componente en peso del aceite esencial de los c tricos, s olo tiene un d ebil aroma. Aunque los hidrocarburos como el limoneno no tienen mucho aroma, act uan como disolventes de las sustancias muy olorosas. Un disolvente vol atil tiene que permitir que el agente oloroso se evapore con gran eciencia y contribuir a su transporte, a trav es del aire, hasta la nariz, de igual modo que lo hace el vapor cuando la apetitosa sopa se hierve a fuego lento(55). Para determinar el aroma de los alimentos se debe realizar tanto un an alisis qu mico como un an alisis sensorial. El an alisis sensorial se dene como una disciplina cient ca utilizada para evocar, medir, analizar e interpretar las reacciones a aquellas caracter sticas de los alimentos y otros materiales como son percibidas

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3.1 Marco te orico, estado del arte y planteamiento del problema

por los sentidos de la vista, el olfato, el gusto, el tacto y el o do (56). La evaluaci on sensorial considera el alimento como un todo, es muy reproducible y usualmente el an alisis se realiza utilizando la media de las respuestas individuales de jueves expertos (57). Cromatograf a de gases - Olfatometr a An alisis de la diluci on del extracto. Este m etodo se basa en diluciones sucesivas del aroma de un extracto hasta que ning un olor sea percibido por los panelistas. Las series de la diluci on del aroma del extracto original son evaluadas y los odorantes claves son ordenados seg un su potencia. Este procedimiento es usualmente realizado por un n umero reducido de evaluadores. Es el m etodo de GC-O m as frecuentemente reportado en investigaciones del avor. M etodos de intensidad-tiempo. Los m etodos de intensidad de tiempo, se basan en la grabaci on inmediata de la intensidad como una funci on del tiempo movi endose en el eje de una variable de resistencia. M etodo de frecuencia de detecci on. El m etodo de detecci on de frecuencia usa el n umero de evaluadores que detectan un compuesto activo del olor en el euente del cromat ografo de gases como una medida de su intensidad. En este m etodo la GC-O se realiza con un panel numeroso de evaluadores sin entrenamiento. De 8 a 10 evaluadores se considera como un buen acuerdo entre la poca variaci on de los resultados y el tiempo de an alisis. Debe agregarse que los resultados obtenidos no se basan en intensidades realis sino en escalas de medidas limitadas. M etodo de intensidad posterior Otra t ecnica GC-O, el m etodo de intensidad posterior, propone la medici on de la intensidad del olor de un compuesto y su posterior puntuaci on en una escala previamente determinada. Este registro posterior de la intensidad percibida puede causar una variaci on considerable entre los asesores. Los resultados obtenidos pueden ser generalmente bien correlacionado con los resultados del m etodo de detecci on de frecuencia, y en menor medida, con los m etodos de diluci on.

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DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

Nariz electr onica Se ha desarrollar tecnolog as que puedan detectar y reconocer olores y avores utilizando los llamados sentidos articiales, cuya funci on es reproducir los sentidos humanos utilizando sensores y sistemas de modelos de reconocimiento. El primer sistema creado para medir olores fue la nariz electr onica (electronic nose e-nose ), cuyo nombre se deriva del hacho que su principal tarea es imitar el olfato humano. El sistema est a basado en la combinaci on de un gas-sensor de arraste con patrones de selectividad amplios y superpuestos y an alisis de datos multivariado (multivariate data analysis MVDA). Los mecanismos no separativos son usados para representar un olor percibido o avor como una huella global. Un sistema m as ampliamente extendido en la industria de alimentos es la lengua electr onica (e-tongue o sensor del sabor), basado en los conceptos similares a la e-nose, pero en soluci on acuosa. Mientras que las e-nose s se relacionan con el olfato, las e-tongue s se relacionan con el sentido del sabor.

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3.2 Objetivos

3.2
3.2.1

Objetivos
Objetivo principal

Correlacionar las cualidades de sabor y aroma con los compuestos vol atiles y los polifenoles, avonoides y metilxantinas encontrados en los licores de 21 genotipos de cacao, para direccionar los posibles usos de cada material.

3.2.2

Objetivos espec cos

Caracterizar la composici on vol atil de los licores de 21 genotipos de cacaos comerciales. Relacionar los compuestos vol atiles reportados en la bibliograf a como responsables del aroma del cacao con los compuestos con los compuestos encontrados por cromatograf a de gases-masas. Cuanticar los compuestos vol atiles responsables del aroma del cacao. Cuanticar el contenido de polifenoles totales, de avonoides y metilxantinas presentes en el cacao en verde. Correlacionar los compuestos vol atiles, los polifenoles, avonoides y metilxantinas con el perl sensorial realizado por el panel de catadores.

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DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

3.3
3.3.1

Metodolog a
Caracterizaci on de la composici on vol atil de los licores de cacao.

Los granos de cacao, fermentados y secos, ser an proporcionados por Fedecacao. Se tostar an a 112o C durante 12 minutos en un horno tostador de cacao marca Quantik Lab Sample Roaster TC-150R/G . Los licores de cacao se preparar an en un molino Retsch a 5500 rpm durante 8 minutos y se almacenar an en frascos de 250ml a una temperatura 4o C, hasta su posterior uso (Ver gura 3.7).

Figura 3.7: Tostador, molino y licor de cacao -

Para hacer la extracci on de los compuestos vol atiles, se utilizar a la metodolog a empleada por Ducky et. al (29). Se pesar an 2g de licor de cacao en un vial de 10ml y el vial se acondicionar a a 60o C por 20 minutos. Se har a la extracci on usando la t ecnica de micro-extracci on en fase s olida en el espacio de cabeza (Solid Phase Microextraction in the Headspace SPME-HS) y se emplear a la bra 50/30 m divinil benceno/carboxen/polidimetilsiloxano, proporcionada por Supelco. La temperatura y el tiempo de extracci on de los compuestos vol atiles ser a 60o C y 15 minutos, respectivamente (Ver gura 3.8). La separaci on e identicaci on de los compuestos presentes en las muestras se realizar a en un cromat ografo de gases (GC) 7890A (Agilent Technologies, Palo Alto, California, EE.UU), acoplado a un espectr ometro de masas (MSD) (Agilent Technologies Modelo 5975). La selecci on de la polaridad de la fase estacionaria est a condicionada por el tipo de muestra. Para las mezclas complejas, como las presentes en el aroma del cacao, que contienen componentes tanto polares, como apolares, se requiere llevar a cabo su an alisis en dos columnas, de polaridad ortogonal (58), es por esto que se emplear an dos columnas.

30

3.3 Metodolog a

Figura 3.8: Fibra de microextracci on en fase s olida -

La primera, una columna capilar con f.e apolar 5%-fenil poli(metilsiloxano) (HP5MS, J& W Scientic, Folsom, CA, EE.UU.) de 30m x 0.25 mm, D.I. x 0.25 m, df. La temperatura del inyector ser a de 250o C, modo de inyecci on splitless durante 5 minutos. El GC correr a con un ujo constante de 1.0ml/min (helio), la temperatura del horno se programar a para empezar en 30o C (5 min) - (10o C/min) - 200o C - (25o C/min)-280o C (5 min) (29). La segunda, una columna capilar con f.e polar polietilenglicol (DB-WAX, J& W Scientic, Folsom, CA, EE.UU.) de 30m x 0.25 mm, D.I. x 0.25 m, df. La temperatura del inyector ser a de 240o C, modo de inyecci on splitless durante 5 minutos. El GC correr a con un ujo constante de 0.5ml/min (helio), la temperatura del horno se programar a para empezar en 40o C por 5 minutos, increment andose hasta 200o C a una velocidad de 10o C/min y nalmente se mantendr a en 200o C por 30 minutos (Ver gura 3.9) (16). La l nea de transferencia del MSD estar a en 280o C. Dos muestras id enticas se preparar an por cada an alisis y el promedio de sus resultados ser a reportado. Los compuestos ser an identicados comparando los espectros de masas de cada compuesto con los espectros de masas de la librer a Wiley 8 y por comparaci on con los ndices de retenci on reportados por la literatura.

3.3.2

Cuanticaci on de los compuestos vol atiles responsables del aroma del cacao.

La cuanticaci on de los compuestos presentes en las muestras se realizar a por el m etodo del est andar externo, con sustancias de referencia de los compuestos mayoritarios correlacionados por la literatura como responsables del aroma del cacao y por el m etodo

31

DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

Figura 3.9: Rampas de calentamiento en el horno de GC-MS -

del est andar interno para los compuestos menos representativos del aroma del cacao. Se efectuar a en un cromat ografo de gases (GC) 7890A (Agilent Technologies, Palo Alto, California, EE.UU), acoplado a un detector de ionizaci on en llama (Flame Ionization Detector FID). Para ello se utilizar a una columna capilar con f.e apolar 5%-fenil poli(metilsiloxano) (HP-5MS, J& W Scientic, Folsom, CA, EE.UU.) de 60m x 0.25 mm, D.I. x 0.25 m, df. La temperatura del inyector ser a de 250o C, modo de inyecci on splitless durante 5 minutos. El GC correr a con un ujo constante de 1.0ml/min (helio), la temperatura del horno se programar a para empezar en 30o C y se variar a hasta 280o C, siguiendo la misma programaci on usada para el an alisis por GC-MS. La temperatura del detector ser a de 280o C .

3.3.3

Cuanticaci on de polifenoles totales, metilxantinas y avonoides.

Los extractos polifen olicos de las diferentes muestras se preparar an por duplicado, las muestras previamente homogenizadas se desengrasar an con n-hexano en ba no ultras onico y posteriormente se extraer an usando Etanol/Agua 80:20. Los extractos obtenidos se almacenar an en frascos ambar bajo refrigeraci on por un tiempo no superior a 5 d as (59). Los an alisis para la cuanticaci on de los polifenoles se realizar an en el Laboratorio de Cromatograf a de la Universidad Industrial de Santander usando el m etodo de est andar externo desarrollado por Cala y V asquez (2008) y por Belzcak (60). Las condiciones del m etodo cromatogr aco ser an: fase m ovil 18% metanol, 82% agua: acido ac etico (100:0.1), temperatura 35o C, ujo de 1 mL/min, volumen de inyecci on de 20 L y longitud de onda DAD de 210 nm .

32

3.3 Metodolog a

3.3.4

Correlaci on de los compuestos vol atiles con el perl sensorial realizado por el panel de catadores.

Se evaluar an los siguientes atributos del olor y del aroma: cacao, acidez, amargor y astringencia y los sabores espec cos oral, frutal, nuez, caramelo, malta, entre otros. Los resultados obtenidos, se examinar an mediante un an alisis de varianza ANOVA, previamente se les aplicar an pruebas de normalidad y homogenidad de varianza para saber si los datos son o no param etricos y posteriormente si se encuentran diferencias signicativas se realizar a una prueba a posteriori tipo Tukey; la signicancia estad stica ser a < 0.05, con el n de establecer si hay diferencias signicativas entre los clones. Los resultados obtenidos se presentar an en histogramas y gr acos ortogonales.

33

DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

3.4

Cronograma de actividades
Actividad Revisi on bibliogr aca Caracterizaci on de la composici on vol atil de los licores de cacao Cuanticaci on de los compuestos vol atiles responsables del aroma del cacao Correlaci on de los compuestos vol atiles con el perl sensorial realizado por el panel de catadores Informe nal Desde 1 8 13 17 18 Hasta 24 12 17 16 24 Tiempo Meses Meses Meses Meses Meses

N umero 1 2 3 4 5

Tabla 3.2: Cronograma de actividades

34

3.5 Resultados/Productos esperados y potenciales beneciarios

3.5

Resultados/Productos esperados y potenciales beneciarios

Figura 3.10: Perl ortonasal de semillas de cacao criollo sin tostar (azul) y tostado (rojo) -

El aroma del chocolate es una de las caracter sticas m as importantes que determinan su calidad, depende del genotipo y origen del arbol de cacao que ha producido los granos, y de como los granos han sido fermentados (28). Con la consecuci on de este proyecto, se lograr a la caracterizaci on organol eptica, sensorial y funcional de los cacaos que m as se comercializan actualmente y de los que han sido considerados promisorios por el Consejo Nacional Cacaotero. Se espera identicar clones con cualidades de sabor y aroma que les permita estar dentro del grupo de los llamados materiales nos de sabor y aroma y/o clones con alto contenido de polifenoles que puedan ser direccionados para la elaboraci on de productos funcionales. Este desarrollo facitilar a a los productores de cacao su exportaci on, comercializaci on y la b usqueda de nuevos mercados.

3.6

Impactos esperados a partir del uso de los resultados

Colombia es un pa s rico en recursos gen eticos de cacao, especialmente en cacaos nos y de aroma. La identicaci on y cuanticaci on del perl el aroma del cacao, de los compuestos polifen olicos y de aquellos que generan el sabor, ser an insumos esenciales

35

DE LA PROPUESTA 3. DESCRIPCION

para poder utilizar y posicionar estos materiales, ya sea en mercados de chocolater a na o en mercados de productos funcionales. Adicionalmente, la correlaci on de los compuestos vol atiles con el perl de aromas, servir a para determinar si un cacao es no y de aroma, realizando u nicamente el an alisis de los compuestos vol atiles de licor de cacao, mediante la t ecnica de SPME-HS y GC-FID.

3.7

Conformaci on y trayectoria del grupo de investigaci on

El Grupo de Investigaci on en Ciencia y Tecnolog a de Alimentos desarrolla sus actividades en la Sede UIS -Guatiguar a, Piedecuesta y es coordinado por la Dra. Janeth Aid e Perea Villamil, adscrita a la Escuela de Qu mica (aperea@uis.edu.co). Actualmente cuenta entre sus integrantes con tres investigadores con doctorado, una estudiante de maestr a y diez estudiantes de pregrado. Hasta la fecha se han ejecutado en el grupo 22 proyectos y actualmente se desarrollan 5, contando entre sus fuentes de nanciaci on m as frecuentes el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, Colciencias, Universidad Industrial de Santander. Como resultado de este trabajo el grupo ha publicado 18 art culos y 59 publicaciones en eventos y ha graduado 37 estudiantes, 25 de pregrado, 11 de Maestr a y 2 de doctorado. Dentro de la l nea de investigaci on en cacao, el grupo ha realizado 5 proyectos de investigaci on relacionados con el proceso de benecio del grano, efecto del procesamiento del cacao sobre su contenido de antioxidantes y caracterizaci on f sico qu mica de los clones cultivados en el pa s. Este u ltimo, enmarcado en el proyecto de Alianza Temporal FEDECACAO-CORPOICA 2008 (Ministerio de Agricultura). Como resultado de estos proyectos, se han realizado 14 ponencias en eventos y congresos nacionales e internacionales, 10 tesis de grado, 5 art culos en revistas indexadas y un libro.

36

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Declaration

I herewith declare that I have produced this paper without the prohibited assistance of third parties and without making use of aids other than those specied; notions taken over directly or indirectly from other sources have been identied as such. This paper has not previously been presented in identical or similar form to any other German or foreign examination board. The thesis work was conducted from XXX to YYY under the supervision of PI at ZZZ.

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