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Introduccin Inseminacin artificial Superovulacin / Transferencia de embriones Produccin de embriones in vitro Micromanipulacin Criopreservacin Transgnesis
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Conclusiones Referencias
Inseminacin artificial
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Oviducto
102
Vagina Cervix tero Unin tero-tubal
Sitio de fertilizacin
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
107
105
103
Gradiente en el nmero de espermatozoides viables despus del servicio en el tracto genital de la hembra
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Control de enfermedades venreas Eliminacin de costos asociados al toro Uso de machos incapacitados Transporte y conservacin prolongada de material gentico Utilizacin de semen sexado
Regin frica Norteamrica Sudamrica Lejano Oriente Oriente Medio Europa Total
Dosis producidas congeladas 1.484.850 43.270.500 5.917.269 63.938.027 2.559.640 115.176.785 232.347.071
Menor fertilidad
- Dosis de inseminacin reducidas (2x106) - Espermatozoides con reducida fertilidad
- Test de progenie - Aumento de la presin de seleccin - Asociado con otras tecnologas (superovulacin y transferencia de embriones, fertilizacin in vitro)
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
La superovulacin y transferencia de embriones permite incrementar la tasa reproductiva de hembras de alto valor gentico
Donante Receptoras Cras de la donante
Hormonas utilizadas:
Gonadotrofinas extradas de la hipfisis de porcinos u ovinos (pFSH y oFSH) - Relacin FSH/LH variable - Vida media corta, mltiples aplicaciones - Riesgo de Encefalopata Espongiforme Bovina (EEB) Gonadotrofina de yegua preada (eCG) - Vida media larga, anticuerpos anti-eCG Gonadotrofina de la menopausia humana (hMG) - Alto costo FSH y LH recombinante - Alto costo
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Da 1
Da 6-8
Morfologa embrionaria
Embriones bovinos da 4 Embriones bovinos da 8
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Bsqueda de embriones
A A B
Interaccin patgenoembrion
zona pelcida
C
patgeno
Lavado de embriones
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Embriones no aceptables
Algodn
Aire
Medio de cultivo
Medio de cultivo
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Fertilizacin in vitro
Cultivo in vitro
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Lavado de ovarios
Complejos cmulus-ovocito
Reinicio de la meiosis
Vesicula germinal 10-12 h Metafase I 10-12 h Metafase II
CP
Inhibidor de la meiosis
Inhibidor de la meiosis
MPF
MAPKinasa
Vescula Ruptura de la germinal vescula germinal
Pico preovulatorio de LH Remocin del ovocito del folculo
Ovulacin Fertilizacin
Fertilizacin in vitro
Gradiente de Percoll
Antes de la centrifugacin Despus de la centrifugacin
90% Percoll
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Proncleos
2do CP 1er CP
1er y 2do CP
1er CP
Espermatozoide que no penetr la zona pelcida Proncleos
Estadio pronuclear
Embrin de 2 clulas
Embrin de 4 - 8 clulas
Mrula
Blastocisto expandido
Blastocisto protrudo
2004
2005
2006
TE
Total
Los embriones producidos in vitro son menos viables que los producidos in vivo
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
- Menor tasa de preez despus de la transferencia - Mayores prdidas fetales durante la gestacin
Bomba de vaco
Ecgrafo
Transductor
Mango
Aguja 19-G
Conector de acero
Tubo de silicona
Tubo de acero
Transductor
Aguja
Pared rectal
Cervix
Investigacin bsica: - Produccin de embriones en diferentes estadios de . desarrollo a bajo costo a partir de ovarios de animales . sacrificados para consumo Aplicaciones comerciales: - Produccin de mayor nmero de embriones - Menor intervalo generacional por uso de animales . prepberes (OPU) - Obtencin de embriones de vacas preadas (OPU) - Obtencin de embriones de vacas que no pueden ser . superovuladas y/o con problemas reproductivos (OPU) - Obtencin de embriones de animales muertos
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Base para el desarrollo y/o aplicacin . de otras tcnicas: - Clonacin - Produccin de animales transgnicos
Micromanipulacin
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Unidad de micromanipulacin
Biopsia y sexado
Blastmero
PCR
Micropipeta
Inyeccin pronuclear
Ovocito fecundado
Micropipeta
Proncleo
Transplante nuclear
Ovocito en MII Enucleacin
Clula donante
Transplante nuclear
Blastocisto
Micropipeta
Clulas inyectadas
Criopreservacin
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Congelamiento gradual
Seeding
Vitrificacin
- No hay formacin de cristales de hielo - Alta concentracin de crioprotector: mayor . probabilidad de dao osmtico y por toxicidad - Bajo costo: enfriamiento directo en N2 lquido
Refrigeracin
- Enfriamiento a 4 oC por 24 a 72 h
Termo de nitrgeno lquido
Crioprotectores permeables:
- Glicerol - Dimetilsulfxido (DMSO) - Propilenglicol - Etilenglicol
Crioprotectores impermeables:
- Sacarosa - Trealosa - Glucosa - Rafinosa
Africa Amrica del Norte Amrica del Sur Asia Europa Oceana Total
73.952
45.166
46.630
2.040
48.670
- Recuperacin mas eficaz de individuos exticos y razas en . peligro de extincin - Conservacin in vitro por tiempo indefinido de una amplia . variedad de especies mamferas
Micromanipulacin
- Produccin de mellizos idnticos para investigacin o aumentar . la eficiencia de los programas de transferencia de embriones - Clonacin por transferencia nuclear, inyeccin pronuclear o . produccin de quimeras para generar organismos transgnicos Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Referencias
1. Palma, G.A. Biotecnologa de la Reproduccin. Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA, Argentina), 2001. 2. Stringfellow, D.A. and Seidel, S.M. Manual of the International Embryo Transfer Society, IETS, 1998.
Agrobiotecnologa
Biotecnologa en reproduccin animal
Laboratorio
Biotecnologa Animal Facultad de Agronoma-UBA
Transformar un organismo Transformar el zigoto Transformar clulas madres para que colonicen la lnea germinal del embrin.
Blastocisto
Micropipeta
Clulas inyectadas
Transformar el zigoto
Eficiencia Eficiencia en en la la produccin produccin de de animales animales Transgnicos Transgnicos por por microinyeccin microinyeccin
Cigotas microinyectadas Sobreviven la microinyeccin
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Transformar clulas
Transgenesis transiente. - Transgenesis estable. Electroporacin
Lipofection
CaCl2
Transformar clulas
Seleccin:
Materiales y mtodos
selection
FUSION CELULAR
.
Tratamiento n Cliv (%) Blast (%) Implantes Pr (%) Nac. 16 56 30 102 5(31) 25(44.6) 16(53.3) 46 1 7 6 14
No transfectado 197 122(62) 33(16.7) Transfectado 646 476(74) 128(19.8) Transf. roscovitina 228 191(84) 51(22.3) Total 1071 789 212
Pampita
Effect of different sources of donor cells calf recloning on embryo and fetal survival. Salamone et al. (IETS, Portland 2004)
Recipientes Implantados Preg. 60d(%)
Tratamiento
Blast (%)
Preg.30d (%)
Nac
966
213(22)a
145
63(43)a
36(25)a
680
119(18)b
101
24(24)b
3(3)b
93 1739
14(15)b 346(19)
7 253
3(43)a 90(36)
2(29)a 46(18)
1 11
Exprecin de HC recombinante humana en leche Daniel Salamone et al. (Copenahen, Dinamarca, 2005, 2006)
70 60 50 40 30 20 10 0
hGH g / day
10
20
30
40
50
60
70
80
90
U$S 15.000/da
INITIATION OF PREGNANCIES IN SOUTH AFRICAN RIVERINE RABBIT BY INTERSPECIES NUCLEAR TRANSFER USING ADIPOSE-DERIVED SOMATIC CELLS
M. J. Sansinena1, D. Owiny2, R. S. Denniston3, D. Salamone1, D. Barry2,3
Introduccin
Se usa a los espermatozoides como vectores para la entrega del DNA exgeno
SBTE 2007
Transfection sperm
Esperamatozoa
Plasmids
Laboratorio de Biotecnologa Animal, FA-UBA
0.5 ug of the DNA construction/million spermatozoa for 5 min at 0C, in Na citrate at 2.8% with 100 mM EDTA
SBTE 2007
Results
57%
SBTE 2007
Results
3%
Under blue ligth.
SBTE 2007
Results
60%
Under blue ligth.
SBTE 2007
Results
29%
SBTE 2007
Results
6%
SBTE 2007
Results
16%
SBTE 2007
Ovine embryos
Transgnesis en cerdos
Se han transformado cerdos con el gen de la Green Fluorescent Protein mediante transfeccin de clulas somticas en cultivo y posterior clonado. Xenotransplante:
- La eliminacin de genes para la alfa 1-3 galactosil transferasa permitira obtener cerdos que no posean el residuo galactosa en su endotelio y, por lo tanto, sean menos proclives al rechazo agudo.
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Universidad de Missouri-Colombia Immerge BioTherapeutics Inc
Recombinacin homloga
Cupido y Diana, primeros corderos producidos por la tcnica de gene targeting
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
X
Recombinacin homloga
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
ARNm
Transcripcin
ADN
Silenciamiento gnico
La introduccin de secuencias cortas (22pb) de ARNs homlogos de doble cadena desencadena un proceso que degrada al ARNm blanco y conduce a la supresin de la protena respectiva
Agrobiotecnologa
Animales transgnicos
Transcripcin
ADN
Recombinacin homloga
- Afecta al ADN (suprime el gen) - Requiere dos generaciones para obtener el fenotipo deseado - La supresin es total - Protenas candidatas: PrP, lactoglobulina
Proyecto de transgnicos
Gen Hormona del crecimiento IGF1 Oleasa desaturasa de las plantas Lactoferrin tejido todos Msculo todos los tejidos glndula mamaria Efecto Mejorar crecimiento crecimiento muscular mejorar el valor nutricional Resistencia de los credos ala infeccin mejoramiento del crecimiento de los lechones glndula salivar
-Lactalbumina glndula mamaria (Wheeler et al, 2001) Fitasa(Golovan et al, reducir el fsforo en 2001) las material fecal
Bovinos genticamente modificados para mejorar la produccin lctea Incremento beta y Kappa caseina (Brophy et al., 2003)
PCR 3___ +
PCR2 _ +
Cutinasa
500 250
Transgnesis en cabras
La empresa Nexia (Canad) ha logrado producir cabras que expresan fibrona (protena de la tela de araa) en su leche.
Agrobiotecnologa
Tomado de: Keefer et al., Biol. Reprod., 2001.
Animales transgnicos
Animales Transgnicos
Pasado
Las Vacunas: Primer ejemplo de la utilidad de los animales de granja en la salud humana.
1796 Edward Jenner, descubre de la vacuna antivarilica. Viruela: Causante en el Siglo XVIII de 60 millones de muertes Siglo XX: En Mayo de 1980, la OMS declara oficialmente la erradicacin mundial de la viruela humana
Animales Transgnicos
Presente
Fermentador como bioreactor para producir vacunas y protenas recombinantes para la salud humana
Animales Transgnicos
Futuro