IVELIZE BABICZ

PRODUO DE DIACILGLICEROIS VIA HIDRLISE ENZIMTICA DO LEO DE PALMA

EQ/UFRJ 2009

PRODUO DE DIACILGLICERIS VIA HIDRLISE ENZIMTICA DE LEO DE PALMA

Ivelize Babicz

EQ/UFRJ M.Sc.

Selma Gomes Ferreira Leite, D.Sc. Octvio Augusto Ceva Antunes, D.Sc.

RIO DE JANEIRO RJ BRASIL MAIO DE 2009

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PRODUO DE DIACILGLICERIS VIA HIDRLISE ENZIMTICA DE LEO DE PALMA

Ivelize Babicz

DISSERTAO SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA ESCOLA DE QUMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSRIOS PARA A OBTENO DO GRAU DE MESTRE EM CINCIAS EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUMICOS E BIOQUMICOS.

Aprovada por: ____________________________________ Orientadora Prof. Selma Gomes Ferreira Leite D.Sc. ____________________________________ Orientador Prof. Octvio Augusto Ceva Antunes, D. Sc ____________________________________ Prof. Paula Adamis, D. Sc. ____________________________________ Prof. Dbora de Oliveira, D. Sc ____________________________________ Prof. Andra Medeiros Salgado, D. Sc

RIO DE JANEIRO RJ BRASIL MAIO DE 2009 iii

Ficha Catalogrfica

Babicz, Ivelize. PRODUO DE DIACILGLICEROIS VIA HIDRLISE ENZIMTICA DE LEO DE PALMA / iVELIZE bABICZ dos Santos. Rio de Janeiro, 1988. xi, 95 f.: il. Dissertao (Mestrado em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos) Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, Escola de Qumica EQ, 2009. Orientador: Selma Gomes Ferreira Leite 1. Hidrlise enzimtica. 2. Imobilizao de enzimas 3. Bioqumica - Teses. I. Leite, Selma Gomes Ferreira (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Escola de Qumica. III. Produo de diacilglicerol via hidrlise enzimtica do leo de palma.

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DEDICATRIA

Aos meus pais Vilson e Cledes e a minha irm Aniassana pela compreenso e pacincia nos momentos mais difceis.

E de repente olhamos para trs e nos perguntamos: Quantos passos foram dados at aqui? quando percebemos que tudo no seria possvel se no fosse pela existncia de uma seqncia, nem sempre lgica, de

acontecimentos e aes provocados por si ou outros, ou justificados pelo acaso. A Deus.

AGRADECIMENTOS
A minha me Cledes por lutar comigo, pelo estmulo na horas difceis, pela pacincia nos meus momentos de estresse e pelo imenso amor que a fonte da minha fora. Ao meu pai Vilson, que sempre me deu todo seu apoio, suporte, e principalmente seu amor, a tudo que me destinei a fazer at ento. minha irm Aniassana pelo apoio, conselhos e carinho durante mais essa etapa. Aos meus orientadores Selma e Octvio, pela oportunidade de realizar este trabalho, pelas sugestes, crticas, orientao e aprendizado neste trabalho de pesquisa. Pelo carinho, pacincia, compreenso e conselhos dispensados neste perodo. Ao Rodrigo e a Andrea por toda ajuda, apoio e orientao no

desenvolvimento do trabalho. s meninas do grupo das enzimas Karen, Ingrid, Jane, Flvia e Aline pela amizade, companheirismo, discusses e experincias trocadas ao longo do trabalho. A todas as minhas queridas amigas que mesmo de longe sempre me deram fora. As amigas Chaline, Samanta, Luana por toda ajuda, pela amizade, carinho e palavras de incentivo. funcionria Leonice do Departamento de Qumica Inorgnica do Instituto de Qumica de UFRJ pelas anlises de Infravermelho. Ao Professor Donato Aranda, por permitir que as anlises

cromatogrficas fossem realizadas no laboratrio GREENTEC, LADEQ 215, e em especial a Cristiane por fazer as anlises. A todos do Laboratrio 641 do Instituto de Qumica da UFRJ pela agradvel convivncia e pelos bons momentos de descontrao e alegria. Enfim, a todos que de alguma forma contriburam para o desenvolvimento deste trabalho, meus sinceros agradecimentos. A FINEP, FAPERJ, AGROPALMA, CAPES e CNPq pelo financiamento da pesquisa. vi

RESUMO
Resumo da dissertao apresentada EQ/UFRJ como parte dos requisitos necessrios para a obteno do grau de Mestre em Cincias (M.Sc.)

PRODUO DE DIACILGLICERIS VIA HIDRLISE ENZIMTICA DE LEO DE PALMA

Ivelize Babicz Maio de 2009

Orientadores: Selma Gomes Ferreira Leite Octvio Augusto Ceva Antunes

Programa: Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos O uso de diacilgliceris na alimentao como substituto dos

triacilgliceris, presente em leos e gorduras vegetais, comeou na dcada de 80. Seu uso foi baseado em dois importantes benefcios sade: o primeiro refere-se supresso da elevao ps-prandial dos triglicerdeos no soro e a segunda a supresso do acmulo de gordura corprea. Sendo assim, o leo de diacilglicerol pode ser classificado como um alimento nutracutico. O principal objetivo deste trabalho foi investigar a produo de diacilglicerois (DAG) por via enzimtica utilizando a lipase de Thermomyces lanuginosus . As reaes foram catalisadas pela lpase comercial imobilizada Lipozyme TL IM, realizadas com agitao magntica, mecnica, em reator de vidro acoplado a um banho termostatizado e em banho de ultra-som. As variveis testadas foram temperatura (40, 50 e 60C), agitao (1300, 1000, 700 e 400 rpm), tempo de reao (at 24 horas). Os resultados quantitativos foram determinados pela anlise das amostras em CG/MS. Dentre as reaes em banho termostatizado o melhor resultado para diacilglicerois foi obtido em vii

temperatura de 60C, 700 rpm, 2% (p/p) de enzima e 24 horas de reao, o qual ficou entre 26 e 30% de diacilgliceris Obteve-se um mximo 47,8% de rendimento de DAG na reao realizada em banho de ultra-som com

temperatura controlada (30C) e agitao de 150 rpm. Em busca de alternativas para aumentar o rendimento de DAG e diminuir custos, avaliou-se a imobilizao por adsoro, da lipase Lipozyme TL100L em carvo ativado e em polianilina, sintetizada em laboratrio. A imobilizao que apresentou melhor atividade hidroltica real foi em carvo ativado realizada em agitador, 146,38UH/g. As imobilizaes realizadas em agitador orbital e com agitao magntica foram aplicadas nas reaes de hidrlise em banho termostatizado e em banho de ultra-som. A reao que apresentou maior rendimento de DAG 17%, foi aquela em que a imobilizao utilizada teve maior atividade hidroltica.

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ABSTRACT
Abstract of Thesis presented to EQ/UFRJ as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science (M.Sc.)

Ivelize Babicz

May of 2008

Advisors: Selma Gomes Ferreira Leite Octvio Augusto Ceva Antunes Department: Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos

The use of diacilglycerol, in the feed, instead of triacilglycerol, present in oil and fatty vegetables begins in 1980. The use was established because of two important benefits to health: the reduction of both postprandial levels of triglyceride and fatty accumulation, making this diacylglycerol oil to be classified as food nutraceutics. The main purpose of this work is to produce diacylglicerol (DAG) by enzymatic catalysis, using the lipase of Thermomyces lanuginosus. The reactions were carried on with catalytic amounts of the commercial lipase Lipozyme TL IM, under magnetic and mechanical stirring in a glass reactor coupled to a thermostatizied bath or under ultrasound irradiation. Several variables were tested: temperature, stirring, catalyst loading and reaction time. The best results for diacylglycerol production in thermostatized bath were obtained at temperature of 60C, 700 rpm, 2% of enzyme and 24 hours of reaction, which lead to a yield between 26 and 30% of diacylglicerol. At ultrasonic bath, with controlled temperature (30C) and 500 rpm, a yield of 47,8% could be obtained. In search to an alternative system to increase the yield of DAG and decrease the cost of the process, we start to work with the absorption immobilization of Lipozyme TL100L in activated charcoal and ix

polyaniline, synthetized in the laboratory. The immobilization which presented the best hydrolytic activity (146,38UH/g) was the one carried out on activated charcoal. The enzyme Lipozyme TL100L immobilized on activated charcoal and polianiline were used in the hydrolysis reaction in thermostatic bath and ultrasound irradiation. The results in thermostatic bath shows that the immobilized enzyme in activated charcoal gave better results than the immobilized enzyme in polianiline. The reaction carried under ultrasound irradiation didnt show significant results.

LISTA DE SIGLAS
AA cido Araquidnico AG cido graxo AGL cidos graxos livres AGPI - cidos graxos poliinsaturados AGPICL - cidos graxos poliinsaturados de cadeia longa AL - cido linolico ALA - cido alfa-linolnico AOCS American Oil Chemists Society CA Carvo Ativado CMC Concentrao Crtica Micelar DAG Diacilgliceris DHA cido Docosahexaenico DPA cido Docosapentaenico EPA cido Eicosapentaenico MAG Monoglicerdeos PANI Polianilina POS-PVA - Polissiloxano-lcool polivinlico SFC teor de slidos TAG Triacilglicerois TIL Lpase de Thermomyces lanuginosus

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SUMRIO
AGRADECIMENTOS .......................................................................................vi RESUMO......................................................................................................... vii ABSTRACT ...................................................................................................... ix LISTA DE SIGLAS ...........................................................................................xi SUMRIO........................................................................................................ xii LISTA DE FIGURAS....................................................................................... xiv LISTA DE GRFICOS.....................................................................................xv LISTA DE CROMATOGRAMAS..................................................................... xvi LISTA DE TABELAS ..................................................................................... xvii Introduo.......................................................................................................... 2 1. Objetivos........................................................................................................ 4 2. Reviso Bibliogrfica .....................................................................................5 2.1 leos e Gorduras ........................................................................................5 2.1.1 leo de Palma ..............................................................................10 2.1.2 Diacilglicerol..................................................................................12 2.2 Lipases.......................................................................................................14 2.2.1 Caractersticas Gerais ..................................................................14 2.2.2 Reaes de hidrlise catalisada por lipases .................................17 2.2.3 Lipozyme TL 100L e Lipozyme TL IM .......................................17 2.3 Imobilizao de enzimas..............................................................................18 2.3.1 Mtodos de imobilizao ...............................................................19 2.3.2 Suportes ........................................................................................21 2.4 Ultrassom ....................................................................................................25 2.4.1 Irradiao por ultrassom em reaes orgnicas ...........................25 2.4.2 Irradiao por ultrassom em reaes enzimticas ........................29 3. Materiais e Mtodos ......................................................................................31 3.1 Materiais .....................................................................................................31 3.1.1 Substratos......................................................................................31 3.1.2 Enzimas ........................................................................................31 3.1.3 Suportes para imobilizao...........................................................31 xii

3.1.4 Outros materiais ............................................................................32 3.2 Metodologias analticas...............................................................................32 3.2.1 Determinao da atividade hidroltica .......................................... 32 3.2.2 Determinao da concentrao de protenas................................33 3.2.3 Anlise de acidez em cido palmtico ...........................................34 3.2.4 Anlise Cromatogrfica .................................................................34 3.2.5 Anlise de Infravermelho de Transmisso .....................................36 3.2.6 Mtodo BET (Brunauer-Emmett-Teller) .........................................37 3.3 Imobilizaes da Lipozyme TL 100L .........................................................37 3.3.1 Imobilizao em carvo ativado ....................................................37 3.3.2 Imobilizao em polianilina ...........................................................38 3.3.3 Imobilizao em carvo ativado e em polianilina no ultrassom ....38 3.3.4 Parmetros de imobilizao ..........................................................38

3.4 Hidrlise do leo de palma com Lipozyme TL IM e Lipozyme TL 100 L imobilizada em carvo ativado e em polianilina ................................................40 3.4.1 Reaes de hidrlise em reator de vidro .......................................40 3.4.2 Reaes de hidrlise em banho de ultrassom ...............................40 4. Resultados e Discusso ...............................................................................42 4.1 Testes preliminares .....................................................................................42 4.2 Reaes de hidrlise com Lipozyme TL IM ..............................................42 4.2.1 Banho Termostatizado ..................................................................44 4.2.2 Banho de Ultrassom .....................................................................51 4.3 Imobilizaes da lipase Lipozyme TL 100 L .............................................54 4.4 Reaes de hidrlise com Lipozyme TL 100 L imobilizada neste trabalho ...........................................................................................................................58 5. Concluses ...................................................................................................63 6. Referncias ...................................................................................................64

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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Converso de cidos graxos poliinsaturados (AGPI), cido alfa-

linolico (ALA) e cido linolico (AL) em cidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (AGPI CL) do tipo mega-3 e mega-6......................................... 7 Figura 2: Estrutura qumica do cido olico, cido linolico e -linolnico........ 8 Figura 3: Exemplo de cidos graxos de ocorrncia natural............................... 8 Figura 4: Estrutura qumica do triacilglicerol.................................................... 10 Figura 5: (1) 1,3-DAG; (2) 2,3-DAG e (3) 1,2-DAG.......................................... 13 Figura 6: Reaes qumicas catalisadas por lipases....................................... 16 Figura 7: Classificao dos principais mtodos de imobilizao de

enzimas.(Kennedy, White e Mello, 1988)......................................................... 21 Figura 8: Principais grupos qumicos na superfcie do carvo ativado............ 23 Figura 9: Banho de ultrassom e transdutor Piezoeltrico................................ 27 Figura 10: Esquema das reaes de hidrlise em banho de ultra-som........... 41 Figura 11: Formao de produto em relao ao tempo da lipase Lipozyme TL IM. .................................................................................................................... 43 Figura 12: Perfil do acompanhamento da reao de hidrlise pela lipase LipozymeTL IM: rendimento de DAG em relao ao tempo. .......................... 51 Figura 13: Espectro de infravermelho da polianilina........................................55

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LISTA DE GRFICOS
Grfico 1: Velocidade inicial da lipase imobilizada Lipozyme TL IM. .............. 44 Grfico 2: Grfico de velocidade inicial da reao de hidrlise com leo de oliva usando-se a enzima livre LipozymeTL100L contendo 0,07 mg de protenas. ............................................................................................................... ..........56 Grfico 3: Grfico de velocidade inicial da reao de hidrlise com leo de oliva, usando-se a enzima livre LipozymeTL100L contendo 4,36 mg de protenas ........................................................................................................56

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LISTA DE CROMATOGRAMAS
Cromatograma 1: Cromatograma do leo de palma refinado. ......................... 42 Cromatograma 2: Cromatograma da reao realizada a 60C, 2% de enzima, 24 horas de tempo reacional e agitao de 700 rpm. ...................................... 47 Cromatograma 3: Cromatograma da reao realizada a 50C, 2% de enzima, 24 horas de reao e agitao de 400 rpm. ..................................................... 48 Cromatograma 4: Cromatograma da reao realizada a 40C, 2% de enzima, 24 horas de reao e agitao de 1300 rpm. ................................................... 49 Cromatograma 5: Cromatograma da reao com melhor rendimento, Experimento 2, Tabela 15. ............................................................................... 53 Cromatograma 6: Cromatograma Experimento 3, Tabela 18 .... .............. .. ....61

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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Principais cidos graxos conhecidos na natureza ............................... 9 Tabela 2: Contedo de acilgliceris em leos comestveis de vrias origens. (Adaptado da fonte: Katsuragi, Y., et. al., Diacylglycerol Oil) ......................... 13 Tabela 3: Propriedades Fsico Qumicas do leo refinado, Agropalma. ....... 31 Tabela 4: Volumes das solues adicionadas para medir as concentraes. 36 Tabela 5: Concentraes obtidas para os padres. ........................................... 36 Tabela 6: Resultados quantitativos das reaes com agitao magntica...... 44 Tabela 7: Resultados obtidos das reaes realizadas com 1% de enzima, agitao mecnica, 24 horas e 1300 rpm. ........................................................... 45 Tabela 8: Resultados obtidos nas reaes com 1% de enzima, 60C, 24 horas e variao na agitao........................................................................................... 46 Tabela 9: Resultados obtidos nas reaes com 0,5% de enzima, 60C, tempo de reao de 24 horas e variao na agitao. .................................................. 46 Tabela 10: Rendimento das reaes realizadas 60C, 2% de enzima, tempo de reao de 24 horas e variao na agitao. .................................................. 47 Tabela 11: Rendimento das reaes realizadas 50C, 2% de enzima, tempo de reao de 24 horas e variao na agitao. .................................................. 48 Tabela 12: Rendimento das reaes realizadas 40C, 2% de enzima, tempo de reao de 24 horas e variao na agitao. .................................................. 49 Tabela 13: Resultados quantitativos do acompanhamento da reao de hidrlise. .................................................................................................................. 50 Tabela 14: Resultados das reaes realizadas no ultrassom com 2% de enzima a 700 rpm e com variao do tempo reacional. .................................................. 52 Tabela 15: Resultados das reaes no ultrassom, 150 rpm e temperatura controlada (30C). .................................................................................................. 53 Tabela 16: Resultados dos parmetros avaliados nas imobilizaes. ............. 57 Tabela 17: Resultados da anlise BET dos catalisadores................................. 58 Tabela 18: Reaes com Lipozyme TL 100L imobilizada em carvo ativado em agitador. ............................................................................................................ 59 Tabela 19: Resultados quantitativos das reaes em banho termostatizado, com suporte imobilizado em banho de ultrassom............................................... 59

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Tabela 20: Resultados das reaes de hidrlise realizadas em banho de ultrassom, com lipase imobilizada em carvo ativado em agitador orbital. ..... 60 Tabela 21: Resultados das reaes em banhos termostatizados com a lipase imobilizada em PANI com agitao magntica. .................................................. 61 Tabela 22: Resultados das reaes de hidrlise realizadas em banho de ultrassom, com lipase imobilizada em PANI com agitao magntica............. 62

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Introduo
A tecnologia enzimtica e a biocatlise so ferramentas promissoras para sntese de compostos de alto valor agregado. Dentre as principais enzimas utilizadas em biocatlise destacam-se as lipases, que so enzimas de interface que apresentam capacidade de catalisar reaes tanto em meio aquoso como em meio orgnico, onde o teor de gua restrito. Entre os processos de maior interesse industrial esto as reaes de hidrlise, sntese e interesterificao de lipdeos por meio das lipases. As razes do enorme potencial biotecnolgico dessa enzima incluem fatos relacionados com: i) sua alta estabilidade em solventes orgnicos; ii) no requerem a presena de co-fatores; iii) possuem uma larga seletividade pelo substrato e, por isso, iv) exibem uma alta enantiosseletividade (CASTRO et al., 2004). As lpases verdadeiras (triacilglicerol acilidrolases E.C.3.1.1.3) so enzimas que catalisam a hidrlise total ou parcial de triacilglicerol (TAG) fornecendo diacilglicerol (DAG), monoacilglicerol (MAG), glicerol e cidos graxos livres. Estas enzimas apresentam uma capacidade nica de agir apenas na interface leo/gua (CASTRO et al., 2004). Estas enzimas encontram-se largamente distribudas na natureza em animais, vegetais e microorganismos. Apresentam peso molecular entre 4050KDa com cerca de 300 resduos de aminocidos. So glicoprotenas nas quais a parte glicosilada hidrofbica circunda o stio ativo. As lipases provenientes de microrganismos so as mais utilizadas industrialmente porque alm de apresentarem procedimentos mais simples de isolamento a partir do caldo fermentativo so, geralmente, mais estveis e com propriedades bem mais diversificadas que as lipases de outras fontes. So, em sua maioria, extracelulares, favorecendo sua extrao, isolamento e purificao. O interesse em utilizar estes biocatalisadores na modificao estrutural de leos e gorduras tem recebido bastante ateno devido, em especial, sua especificidade em relao ao substrato (CASTRO et al., 2004). Nos ltimos anos tm aumentado o interesse dos consumidores por alimentos funcionais, aqueles que apresentam potencial de prevenir doenas, promover a sade e reduzir os custos dos cuidados com a sade. 1

De forma clssica, todos os alimentos podem ser considerados funcionais, visto que proporcionam sabor aroma ou valor nutritivo. Contudo, o termo funcional tem adotado uma conotao diferente, aquela de propiciar um efeito fisiolgico benfico alm das necessidades nutricionais bsicas (CASTRO et al., 2004). Nas duas ltimas dcadas foi dada muita ateno aos efeitos negativos causados sade, associados com o consumo excessivo de certos leos e gorduras. Recentemente, contudo, tem sido verificado que o consumo de determinados leos e gorduras causa efeitos positivos sade, porque eles contm compostos que so essenciais para o crescimento, manuteno da sade e preveno de doenas. Este o caso de leos ricos em diacilgliceris. Estudos em animais e humanos tm mostrado os benefcios do diacilglicerol para a sade. Embora o diacilglicerol tenha digestibilidade similar e valor energtico ao

triacilglicerol, ele tem a capacidade de diminuir o nvel de lipdios psprandial. O consumo de diacilglicerol tambm apresenta reduo de peso corporal e da acumulao de gordura visceral abdominal (CHEONG et al., 2007). Devido crescente necessidade do desenvolvimento de novas tecnologias em qumica orgnica, que implicaram em reaes em gua, ou em ausncia de solvente, surgiram novas e eficientes formas de transferncia de energia. No presente fez-se uso do ultrassom, onde efeitos fsicos devem ser considerados como o aumento da temperatura local, a transferncia de massa e a cavitao. O uso de ultrassom em processos enzimticos mostrou ser efetivo no aumento da atividade de enzimas. Este efeito parece ser especfico para cada enzima e dependente das condies de sonicao usados. A aplicao de ultrassom pode produzir um efeito positivo na atividade enzimtica, embora dependendo da intensidade, possa causar desnaturao

(MARTINEZ et al., 2000).

Em todo o texto, o termo diacilglicerol refere-se a um leo vegetal comestvel de qualquer origem contendo um teor mnimo de 80% de diacilgliceris.

1. Objetivos
Com base nos aspectos relacionados anteriormente, o objetivo geral deste trabalho foi desenvolver metodologias para produo de diacilglicerol via catlise enzimtica do leo de palma, utilizando Lipozyme TL100L e LipozymeTL IM. Como objetivos especficos podem-se citar: - comparar o rendimento de diacilglicerol em banho termostatizado e em banho de ultrassom utilizando a lpase comercial LipozymeTL IM como catalisador. - comparar o rendimento de diacilglicerol em diferentes condies, variando temperatura, velocidade de agitao e quantidade de enzima adicionada ao meio reacional. - desenvolver metodologia para imobilizao da lipase livre Lipozyme TL100L em dois suportes: carvo ativado e polianilina por adsoro; - utilizar a lpase imobilizada anteriormente como catalisador na hidrlise de leo de palma.

2. Reviso Bibliogrfica
2.1 leos e Gorduras
Cerca de dois teros da produo mundial de leos e gorduras so destinados ao consumo humano e animal, sendo o restante usado em uma ampla variedade de aplicaes industriais. Recentemente, tem surgido um grande interesse na transformao biotecnolgica de leos e gorduras, visando a utilizao destas matrias-primas na produo de compostos de alto valor agregado, de uso potencial na indstria farmacutica, de alimentos, oleoqumica, entre outras (CASTRO et al., 2004). Os leos e gorduras so substncias hidrofbicas (insolveis em gua) que pertencem classe qumica dos lipdeos, podendo ser de origem animal, vegetal ou microbiana. Os lipdeos so uma classe abundante na natureza, sendo constituda por uma mistura de diversos compostos qumicos, sendo os mais importantes os cidos graxos livres e seus derivados, como triacilglicerdeos e fosfatdeos ( CARVALHO et al., 2003). A diferena entre leos e gorduras reside exclusivamente na sua aparncia fsica, sendo as gorduras slidas ou pastosas e os leos, lquidos na temperatura ambiente. Esta diferena deve-se principalmente ao fato de os leos serem mais ricos em resduos de cidos graxos insaturados do que as gorduras (XU, 2000) O Conselho Nacional de Normas e Padres para Alimentos define a temperatura de 20 C como o limite inferior para o ponto de fuso das gorduras, classificando como leo quando o ponto de fuso situa-se abaixo desta temperatura (RDC N. 270, de 22 de setembro de 2005). As gorduras animais tendem a ser gorduras saturadas, e so slidas temperatura ambiente. Manteiga, banha, sebo e a gordura da carne so gorduras saturadas. As gorduras insaturadas so lquidas temperatura ambiente. Costumam ser de origem vegetal, embora os leos de peixe tambm possam ter grande quantidade de cidos graxos poli-insaturados. Os leos vegetais (insaturados) podem ser endurecidos via hidrogenao.

Normalmente os leos hidrogenados so usados na fabricao de margarinas e gorduras vegetais. 4

O esqueleto de leos e gorduras formado por cadeias de cidos orgnicos lineares, denominados cidos graxos, que diferem pelo nmero total de tomos de carbono na cadeia e tambm pela presena de insaturaes (duplas ligaes entre os tomos de carbono) em sua cadeia hidrofbica. Os cidos graxos que contm apenas ligao simples entre carbonos so denominados cidos graxos saturados. Os que possuem dupla ligao entre carbonos so chamados de cidos graxos insaturados, sendo que os que apresentam mais de uma ligao dupla so conhecidos como poliinsaturados. cidos graxos insaturados e poliinsaturados podem diferir entre si pela posio da dupla ligao ao longo da cadeia carbnica. Estas duplas ainda podem gerar ismeros cis ou trans . Cabe destacar que na natureza dificilmente so encontrados cidos graxos ou seus derivados em isomeria trans . Estes compostos largamente reconhecidos como prejudiciais sade so produzidos durante o processamento dos leos, como por exemplo na hidrogenao de poliinsaturados para a fabricao de margarinas (NICHOLS et al, 2003). Os cidos graxos (AG) essenciais so o cido -linolnico e o cido linoleicolinoleico. O uso do termo essencial refere-se ao fato de que estes AG desempenharem importantes funes e no poderem ser sintetizados pelo organismo por meio de precursores (HASLER, 2002). Pela falta de AG essenciais podem ocorrer srias deficincias orgnicas, como problemas dermatolgicos, neurolgicos e visuais (RDC N. 270, de 22 de setembro de 2005). Estes cidos graxos -linolnico e linoleico devem ser obtidos a partir da dieta, pois so sintetizados apenas por vegetais. A designao de mega tem relao com a posio da primeira dupla ligao, contando a partir do grupo metil final da molcula de cido graxo. Os cidos graxos mega-3 apresentam a primeira dupla ligao entre o terceiro e o quarto tomo de carbono, enquanto os cidos graxos mega-6 tm a primeira dupla ligao entre o sexto e o stimo tomo de carbono. Os principais cidos graxos mega-3 so o cido linolnico 18:3, o cido eicosapentaenico (EPA) 20:5 e o cido docosahexaenico (DHA) 22:6, enquanto os principais n-6 so o cido linoleico 18:2 e o cido araquidnico 20:4 (NICHOLS et al, 2003 e MORETTO et al., 1989). 5

Os cidos mega-6 e mega-3 representam cada um uma famlia dos cidos graxos poliinsaturados (AGPI), o cido linoleico (C18:2, LA, famlia mega-6) e o cido -linolnico (C18:3, ALA, famlia mega-3), que por sua vez, do origem a outros cidos essenciais de cadeias mais longas, chamados de cidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, conforme apresentado na Figura 1.

AGPI

MEGA-3 ALA18:2

MEGA-6 AL 18:3

EPA 20:5 cido Eicosapentaenico DHA 22:6 AGPI CL cido Docosahexaenico DPA 22:5 cido Docosapentaenico

AA 20:4 cido Araquidnico

Figura

1: Converso de cidos graxos poliinsaturados (AGPI), cido -

linoleico (ALA) e cido linoleico (AL) em cidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (AGPI CL) do tipo mega-3 e mega-6.

Os principais representantes desse grupo so o mega-3 (cido linolnico), o mega-6 (cido linoleico e cido araquidnico) e o mega-9 (cido olico), representados na Figura 2 (COVINGTON, 2004).

HO OH

cido olico 18:1 ; cido cis-9-octadecaenico

HO OH

cido linoleico 18:2 ;cido cis -9-cis-12 octadecadienico

O HO

cido -linolnico 18:3 3. cido cis -9-cis-12-cis-15-octadecatrienico Figura 2: Estrutura qumica do cido olico, cido linoleico e -linolnico. Existem diversos cidos graxos de ocorrncia natural, sendo alguns exemplificados na Figura 2 e Figura 3 e os mais importantes listados na Tabela 1.
O

HOOH

HO OH

cido Palmtico (C16:0)

cido Esterico (C18:0)

Figura 3: Exemplos de cidos graxos de ocorrncia natural

Tabela 1: Principais cidos graxos conhecidos na natureza

cido Graxo Butrico Caprico Caprlico Cprico Otusilico Caproleico Lurico Lauroleico Lindrico Mirstico Miristoleico Tsuzuico Palmtico Palmitoleico Esterico Petroselnico Olico Eldico Vaccnico Linoleico Nome Sistemtico Butanico Hexanico Octanico Decanico cis-4-decenico cis-9-decenico Dodecanico cis-5-lauroleico cis-4-dodecenico Tetradecanico cis-9-tetradecenico cis-4-tetradecenico Hexadecanico cis-9-hexadecenico Octadecanico cis-6-octadecenico cis-9-octadecenico trans-9-octadecenico cis-11-octadecenico cis,cis -9 -12octadecadienico Linolnico cis,cis ,cis -9,12,15octadecatrienico Ricinoleico 12-hidroxi-cis-9octadecenico Araqudico Gadoleico Gadico Araquidnico Eicosanico cis-9-eicosenico cis-11-eicosenico cis,cis ,cis ,cis -6,9,12,15eicostetraenico Behnico Cetoleico Ercico Lignocrico Nervnico Docosanico cis-11-docosenico cis-13-docosenico Tetracosanico Cis-15-tetracosenico C22 ou C22:0 C22:1(n11) C22:1(n13) C24 ou C24:0 C24:1(n15) C22H44O2 C22H42O2 C22H42O2 C24H48O2 C24H46O2 C20 ou C20:0 C20:1(n9) C20:1(n11) C20:4(n6,9,12,15) C20H40O2 C20H38O2 C20H38O2 C20H32O2 C18:1(n9):OH(n12) C18H34O3 C18:3(n9,12,15) C18H30O2 Smbolo C4 ou C4:0 C6 ou C6:0 C8 ou C8:0 C10 ou C10:0 C10:1(n4) C10:2(n9) C12 ou C12:0 C12:1(n5) C12:1(n4) C14 ou C14:0 C14:1(n9) C14:1(n4) C16 ou C16:0 C16:1(n9) C18 ou C18:0 C18:1(n6) C18:1(n9) C18:1(tn9) C18:1(n11) C18:2(n9,12) Frmula C4H8O2 C6H12O2 C8H16O2 C10H20O2 C10H18O2 C10H18O2 C12H24O2 C12H22O2 C12H22O2 C14H28O2 C14H26O2 C14H26O2 C16H32O2 C16H30O2 C18H36O2 C18H34O2 C18H34O2 C18H34O2 C18H34O2 C18H32O2

cidos graxos so encontrados na natureza na forma no associada, sendo assim conhecidos como cidos graxos livres, ou associados formando outras classes de compostos qumicos como fosfatdeos e glicerdeos. Os triacilgliceris (Figura 4) consistem em uma forma altamente eficiente de armazenamento de energia metablica, pois so menos oxidados que os carboidratos e as protenas e tambm no absorvem muita gua, por sua condio apolar. Desta forma, ocupam um volume menor no organismo, diferente do glicognio, outra fonte de energia importante, que se liga gua em uma quantidade quase duas vezes o seu peso (RDC N. 270, de 22 de setembro de 2005). Os leos vegetais so constitudos principalmente por glicerdeos de cidos graxos vegetais e podem conter fosfolipdeos, cidos graxos livres e constituintes insaponificveis. Suas caractersticas fsicas variam com a estrutura e distribuio dos cidos graxos nos triacilgliceris presentes.
CH2 OCOR1 R 2OCOCH CH2 OCOR3

R1, R2 e R3 = resduos de cidos graxos.

Figura 4: Estrutura qumica do triacilglicerol. Os leos tm um papel fundamental na alimentao, pois so importantes fontes de cidos graxos essenciais, veculo para as vitaminas lipossolveis, e participam da sntese de muitas substncias endgenas, entre outras. Contudo, seu consumo excessivo est diretamente relacionado a doenas cardiovasculares, obesidade e resistncia insulina.

2.1.1 leo de Palma

A palma pertence ao gnero Elaeis , um cultivo perene, o qual comea a produzir frutos a partir de 3 anos depois de semeada. Tem uma vida econmica entre 20 a 30 anos. O gnero Elaeis compreende duas espcies E. guineensis e E. oleifera (SUDRAM).

O leo de palma o segundo leo vegetal mais importante do mundo. A origem do leo, freqentemente, d uma indicao de identidade e caractersticas. Atualmente, a maior produo do mundo do leo de palma vem do Sudeste da sia, em particular Malsia e Indonsia (POMPIA, 2002). As reas produtoras no Brasil so encontradas no Par, Amazonas, Amap e Bahia, sendo o Par o maior produtor de leo de palma do Brasil e onde se concentra mais de 80% da rea plantada. Este cultivo o nico que produz dois tipos de leos. Da polpa do mesocarpo produz o leo de palma que tem finalidade principalmente alimentcia, e a semente produz leo da semente de palma (o palmiste), o qual tem larga aplicao na indstria oleoqumica (KINSELLA, 1990). Sendo semislido, o leo de palma apresenta propriedades fsicas necessrias para mltiplos usos em alimentos. Sua consistncia favorece seu emprego na formulao de produtos gordurosos slidos. O leo de palma, a olena e a estearina so amplamente utilizados na fabricao de gordura vegetais, shortenings (Ghotra, Dyal & Narine, 2002), margarinas e vanaspati (produto gorduroso alternativo manteiga animal usado em

pases asiticos), e tambm na indstria de frituras em todo o mundo. Uma vez que este leo no contm poliinsaturados, seu uso em margarinas e shortenings no requer um processo prvio de hidrogenao, o que o faz economicamente atrativo. Alm disso, evita-se a formao de cidos graxos trans, formados durante a hidrogenao parcial. Como outros leos vegetais, apresenta baixos nveis de colesterol, sendo facilmente digervel, assimilvel e utilizvel como fonte energtica. Seu alto contedo em antioxidantes naturais (tocoferol) e sua estabilidade a temperaturas elevadas o convertem em um meio adequado para frituras, conferindo aos produtos uma vida de prateleira mais longa, alm de ressaltar o sabor natural dos alimentos (SUDRAM). Como em todos os leos, os triacilglicerdeos (TAGs) so os maiores constituintes do leo de palma. Cerca de 95% do leo de palma consiste de uma mistura de TAGs, isto , molculas de glicerol, cada uma ligada com trs cidos graxos. Durante a extrao do leo do mesocarpo, a hidrofobicidade dos TAGs atraem outros componentes celulares solveis. Os 10

componentes minoritrios do leo de palma so fosfatdeos, esteris, pigmentos, tocoferol e traos de metal. Outros componentes no leo de palma so os metablitos da biossntese de TAGs e produtos da atividade lipoltica. Estes incluem os monoacilglicerois (MAGs), diacilgliceris (DAGs) e cidos graxos livres (AGL) (SIMOPOULOS, 2001). Por seu alto teor de triglicerdeos saturados de alto ponto de fuso este produto slido a temperatura ambiente. Devido as suas caractersticas fsicas peculiares o leo de palma substitui com vantagens diversas gorduras hidrogenadas na indstria de alimentos (MATAIX, 2002). Os leos de palma e de palmiste, este extrado da amndoa do fruto da palmeira, so livres de grandes quantidades de cidos graxos altamente insaturados como o linolnico,e, portanto, tm poucos problemas de reverso de flavor. O leo contm aproximadamente iguais quantidades de cidos graxos saturados e insaturados: insaturados incluem 39% de cido oleico e 10% de cido linoleico; saturados incluem 44,3% de cido palmtico, 38,7% de cido olico, 10,5% de cido linoleico, 4,6% de cido esterico, 1,0% de cido mirstico, 0,1% de cido lurico e 0,1% de cido palmitolico (SANTOS et al., 1998). A composio qumica deste leo importante, pois dos cidos graxos que o formam so determinadas s propriedades fsicas essenciais, como viscosidade, ponto de fuso, estabilidade trmica, ndice de cetano, permitindo prever o comportamento, a susceptibilidade decomposio e o melhor mtodo de manuseio (SUDRAM).

2.1.2 Diacilglicerol
O uso de diacilglicerol ao invs de triacilglicerol, presente em leos e gorduras vegetais, comeou na dcada de 80. Seu uso foi baseado em dois importantes benefcios sade: o primeiro refere-se supresso da elevao ps-prandial dos triglicerdeos no soro e a segunda a supresso do acmulo de gordura corprea (SUDRAM) Diacilgliceris (Figura 5) so steres de glicerol que possuem dois grupos hidroxila esterificados por cidos graxos, podendo existir em duas formas estereoqumicas conhecidas como sn-1,2-DAG (ou 2,3) e sn-1,3DAG cuja relao isomrica natural de 3:7 em funo da migrao do 11

grupo acil durante o processo de refino do leo (SAMBANTHAMURTHI et al., 2000). A isoforma 1,2-DAG considerada como um intermedirio metablico que formado aps a ingesto de triacilglicerol. A 1,3-DAG responsvel pelo efeito benfico, pois metabolizado por uma via diferente do TAG e do 1,2-DAG.
CH 2OCOR1 HOCH CH2 OCOR 3
CH 2OH R2 OCOCH CH2 OCOR 3

CH 2OCOR1 R2 OCOCH CH2 OH

(1)

(2)

(3)

Figura 5: (1) 1,3-DAG; (2) 2,3-DAG e (3) 1,2-DAG. O Diacilglicerol um componente natural em vrios leos e gorduras, em torno de 10%, como demonstrado na Tabela 2.

12

Tabela 2: Contedo de acilgliceris em leos comestveis de vrias origens.

(Adaptado da fonte: Katsuragi, et. al., Diacylglycerol Oil)

DAG leo TAG Total DAG 1.0 5.8 9.5 2.8 2.1 5.5 2.9 4.1 7.6 5.8 81.4 1,21,3DAG DAG (g/100g) 1 ND ND1 ND1 ND1 ND1 1.5 1.2 ND1 1.0 1.2 2.4 2.1 28.4 ND1 2.9 2.7 ND1 1.9 2.9 5.2 3.7 53.0 MAG Outros

Soja Palma Algodo Milho Aafro Oliva Canola Gergelim Arroz

97.9 93.1 87.0 95.8 96.0 93.3 97.1 95.2 92.4

0.0 <LD2 0.2 <LD2 <LD2 0.2 <LD2 0.8 <LD2 <LD2 1.2

1.1 1.1 3.3 1.4 1.9 2.3 ND1 ND1 ND1 ND1 ND1

Uva 94.2 DAG comercial 17.3 1 No detectado 2 Abaixo do Limite de Deteco

O diacilglicerol muito usado como emulsificante e estabilizante nas indstrias alimentcia, cosmtica e farmacutica. Tambm tem sido utilizado no Japo e nos Estados Unidos como leo para cozinhar, em funo de suas propriedades, recentemente descobertas, de reduzir os nveis de lipdeos, peso e de acmulo de gordura (AGROPALMA, 2008). O leo comercial foi introduzido no Japo em 1999 com nome comercial de Econa. Nos Estados Unidos, foi registrado como Enova oil aps 15 anos de pesquisas, estudos clnicos e experimentos realizados pela Kao Corporation (KASAMATSU, 2005). Enova contm aproximadamente 20% de triacilgliceris e 80% de diacilgliceris, sendo 56% na isoforma sn-1,3-DAG. Suas aplicaes incluem o uso como leo de cozinha para o preparo de molhos e temperos e para produtos a base de leos e gorduras. Segundo estudos clnicos nos Estados Unidos e Japo, o peso e a massa gorda podem ser reduzidos com a substituio de 10 a 20 gramas dos leos convencionais da dieta por diacilglicerol (YASUKAWA et al., 2004).

13

O DAG produzido por glicerlise, hidrlise ou esterificao qumica de leos e gorduras. Esses processos normalmente usam altas temperaturas e/ou catalisadores txicos. Tais condies implicam em baixas seletividades e alto gasto energtico, o que aumenta o custo do processo (GIESE, 1996) e leva a alteraes no sabor e na colorao do leo. Tcnicas por via enzimtica apresentam inmeras vantagens em relao a processos qumicos, dentre eles o aumento da seletividade, o aumento da pureza do produto, a utilizao de temperaturas mais brandas e a gerao de efluentes mais facilmente tratveis. Para estes fins, o uso de lipases vem sendo amplamente estudado CHENGELIS et al., 2006). (YASUKAWA et al., 2004 e

2.2 Lipases
2.2.1 Caractersticas Gerais
Lipases so enzimas classificadas como hidrolases (glicerol ster hidrolases E.C. 3.1.1.3), que so capazes de catalisar reaes de hidrlise e sntese de grupos steres de diversos compostos. As lipases so amplamente encontradas na natureza. Podem ser obtidas a partir de microrganismos naturais ou geneticamente modificados e tambm a partir de fontes animais e vegetais. A principal forma de produo de lipases tem sido atravs de culturas de microrganismos, pois estes processos apresentam maior facilidade de controle, maior capacidade produtiva e custo de obteno reduzido (MONTEIRO et al., 2001 e YASUKAWA et al., 2004). As reas nas quais a aplicao das lipases vm tendo maior destaque so: (KASAMATSU, 2005, CHENGELIS et al., 2006 e BALCO et al., 1996). Farmacutica sntese de intermedirios de frmacos (ex. ibuprofeno e naproxeno, frmacos com atividade anti-

inflamatria); resoluo de misturas racmicas (ex. sntese de atenolol, frmaco anti-hipertensivo); Alimentos sntese de aromas (ex. maturao de queijos); sntese de edulcorantes (ex. aspartame); Detergentes remoo de manchas de gorduras dos tecidos; Agroqumica sntese de inseticidas e pesticidas;

14

 Tratamento de efluentes reduo do teor de gorduras em efluentes da indstria de laticnios; Oleoqumica hidrlise e interesterificao de leos e gorduras.

Lipases catalisam reaes de substratos insolveis em gua (PANDEY et al., 1999) e a hidrlise de acilgliceris para cidos graxos, diacilgliceris, monoacilgliceris e glicerol ( LEAL et al., 2002). Sob certas condies, elas tambm catalisam reaes de esterificaes,

transesterificaes (acidlise, interesterificao, alcolise), aminlise e tiotransesterificaes em solventes orgnicos, sistemas bifsicos e em suspenses micelares. O deslocamento do equilbrio na reao, no sentido direto (hidrlise) ou inverso (sntese), controlado pela quantidade de gua presente na mistura reacional. A Figura 6 ilustra as principais reaes catalisadas por lipases (PANDEY et al., 1999).

15

HIDRLISE
R1 C O OR2 R1 + H2O C O OH + R2 OH

SNTESE DE STER
R1 C O OH + R2 OH R1 C O OR2 + H 2O

ACIDLISE
R1 C O OR2 R3 + C O OH R3 C O OR2 R1 + C O OH

INTERESTERIFICAO
R1 C O OR2 + R3 C O OR4 R3 C O OR2 + R1 C O OR4

ALCOLISE
R1 C O OR2 + R3 OH R1 C O OR3 + R 2 OH

AMINLISE
R1 C O OR2 + R3 NH2 R1 C O NHR3 + R 2 OH

Figura 6: Reaes qumicas catalisadas por lipases. Os principais substratos das lipases so os triglicerdeos de cadeia longa (com mais de 10 tomos de carbono), no entanto, estas enzimas atuam sobre uma gama de substratos no-naturais (steres no-lipdicos) de diversos tamanhos. Essa versatilidade das lipases sugere que sua espinha dorsal polipeptdica seja flexvel e que possa adotar diferentes conformaes dependendo das caractersticas fsico-qumicas do meio, o que dificulta a modelagem e a previso de interaes estereoqumicas entre enzima e substrato (BARON, 2003). 16

Em geral, a maior atividade cataltica de lipases ocorre na interface gua/lipdeo, atravs do fenmeno chamado de ativao interfacial e tanto a qualidade quanto a rea interfacial tm papel importante na atividade cataltica dessas enzimas (WAKABAYASHI, 2004 e BALCO et al., 1996). A ocorrncia da ativao interfacial juntamente com a existncia de uma tampa polipeptdica (parte da protena que recobre o stio ativo) j foi utilizada como parmetro de distino entre lipases verdadeiras e esterases. O fenmeno da ativao interfacial foi proposto por Sarda e Desnuelle (1958) aps verificar diferena no comportamento das cinticas entre enzimas. Os autores verificaram que a atividade de esterases era funo da concentrao do substrato de acordo com o modelo clssico de Michaelis e Menten, no qual a velocidade mxima ocorria antes do limite de solubilidade do substrato ser atingido e da formao de agregados e/ou interfaces. J a atividade das lipases, se caracterizou por manter-se constante at que a concentrao micelar crtica (CMC) do substrato no sistema fosse alcanada, e aumentando a partir desse ponto. A este fenmeno de aumento de atividade enzimtica quando h formao de interfaces, denominou-se ativao interfacial (DALLA-VECCHIA, 2004).

2.2.2 Reaes de hidrlise catalisada por lipases

A palavra hidrlise significa decomposio pela gua, mas so raros os casos em que sob condies ambientes pode-se realizar uma hidrlise completa. Para isto necessrio operar a temperaturas e presses elevadas. Para que a reao seja rpida e completa sempre indispensvel a presena de catalisadores qumicos, em geral cidos ou bases, ou enzimas (ALVAREZ-MACARIE et al., 1999). As enzimas, catalisadores orgnicos, so de grande importncia em processos vitais, animais e vegetais, especialmente na digesto de alimentos, sendo que muitas das reaes catalisadas por enzimas so hidrolitcas (MAHADIK et al., 2002).

2.2.3 Lipozyme TL 100L e Lipozyme TL IM

As lipases utilizadas neste trabalho, Lipozyme TL100L livre e LipozymeTL IM, esta ltima imobilizada em slica, so lipases do fungo 17

Thermomyces lanuginosus (TlL) produzidas em fermentao submersa de um microrganismo Aspergillus oryzae, contendo que codifica a sntese enzima-lipase de Thermomyces lanuginosus (TlL) Lipozyme TL100 L uma preparao lquida da lipase microbiana (EC 3.1.1.3) de Thermomyces lanuginosus.Destinada para a hidrlise de gorduras, modificao de triglicerdeos e produo de mono e diacilglicerois. mais ativa na faixa de temperatura entre 20-50C e na faixa de pH entre 6 11 (COSTA et al., 1999). A lipase de Thermomyces lanuginosus imobilizada em slica, tambm chamada de Lipozyme TL IM, uma lipase 1,3-especfica. Essa lipase vem ganhando ateno na indstria de alimentos, principalmente em pesquisas com lipdeos (SARDA et al., 1958). Apresenta uma estrutura tridimensional estabilizada por trs ligaes dissulfeto e contm quatro triptofanos, um dos quais localizado na tampa, e tem se mostrado importante para a hidrlise eficiente. TlL tem uma preferncia por hidrolisar triglicerdeos de cadeias mdias (C10-C12) e tem uma alta estabilidade trmica. Devido a estas caractersticas, tem encontrado importantes aplicaes na indstria como um detergente de lavar roupas em p facilitador na remoo de manchas de gordura (DARIO, 2006).

2.3 Imobilizao de enzimas

Enzimas imobilizadas so aquelas que se encontram confinadas ou localizadas em uma regio definida do espao com reteno de sua capacidade cataltica, e que podem ser utilizadas repetidas ou

continuamente (BARCZA, 2008). O objetivo principal da imobilizao de enzimas para a indstria o reuso destas para muitos ciclos de reaes, alm de melhorar as caractersticas das mesmas, atravs de protocolos simples de imobilizao (NOVOZYMES). Devido s propriedades funcionais (atividade, seletividade e

especificidade) as enzimas podem catalisar desde processos qumicos mais complexos at experimentos sob circunstncias mais suaves (COSTA et al.,

1999).

18

A implementao em larga escala de enzimas na catlise industrial exige a utilizao multidisciplinar de muitas tcnicas diferentes: (1) a seleo de enzimas com propriedades adequadas; (2) a melhoria de propriedades das enzimas atravs de tcnicas de biologia molecular; (3) a melhoria das propriedades das enzimas atravs das tcnicas de imobilizao; (4) e a melhoria das propriedades das enzimas atravs das reaes e da engenharia dos reatores. Uma melhoria bemsucedida das propriedades das enzimas uma das solues para o desenvolvimento de uma indstria qumica mais sustentvel que possa sintetizar compostos mais complexos e teis com um melhor custo-benefcio (COSTA et al, 1999). A tecnologia de imobilizao de enzimas teve incio nos anos 50, quando foram pela primeira vez produzidas preparaes enzimticas imobilizadas por incluso em matrizes polimricas e por ligao em suportes (YANG et al., 2003). Desde ento numerosos mtodos de imobilizao em diferentes materiais foram desenvolvidos.

2.3.1 Mtodos de imobilizao

A imobilizao de enzimas consiste no confinamento das mesmas em um determinado material. Este processo pode ocorrer de diferentes maneiras. No caso de lipases, numerosos mtodos de imobilizao so viveis, cada um envolvendo diferentes graus de complexidade e eficincia. Os vrios mtodos usados podem ser subdivididos em duas categorias principais: mtodo qumico quando ligaes covalentes so formadas com a enzima, e o mtodo fsico, quando interaes no-covalentes, geralmente mais fracas, ou retenes mecnicas so formadas. No mtodo qumico, a lipase fixada no suporte por ligao covalente e h a formao de ligao cruzada quando usado um agente de ligao em que uma enzima se liga a outra, induzindo a auto-reticulao das enzimas. No mtodo fsico a lipase pode ficar retida ou micro-encapsulada no interior de um gel insolvel, fibras porosas ou materiais adsorventes (MAHADIK et al., 2002, PANDEY et al., 1999 e MOGENSEN et al., 2004). Uma forma de classificar as enzimas imobilizadas : (a) enzimas modificadas a forma insolvel em gua por tcnicas convenientes, (b) enzimas solveis usadas em reatores equipados com membranas de 19

ultrafiltrao no permanente que retm as enzimas dentro do reator e (c) enzimas com mobilidade restrita por ligao outra macromolcula. A forma como elas estaro imobilizadas depende da tcnica a ser aplicada (Figura 7) (KRISHNA et al., 2002). Neste trabalho iremos focar na tcnica de imobilizao por adsoro, pois esta mais simples e envolve interaes fsicas enzima-suporte menos especficas, o que leva, geralmente, a preparaes enzimticas com atividades catalticas elevadas e rendimentos de imobilizaes tambm elevados. A principal desvantagem da imobilizao por adsoro se deve a possveis perdas de enzima, que podero ocorrer durante a utilizao da preparao enzimtica no meio reacional, (GUISAN, 2006) o que pode ocasionar perda de atividade no reciclo. A lipase livre LipozymeTL 100 L j foi imobilizada em partculas de polissiloxano-lcool polivinlico (POS-PVA) por Freitas et al (2007), no qual a atividade hidroltica foi de 730 U/g. Esta mesma lipase, de Thermomyces lanuginosus, foi adsorvida em polipropileno poroso (Accurel EP-100) por SALIS et al (2003) e a atividade hidroltica enconrada para esta imobilizao foi de 2780 x 103 U/g.i CHRISTENSEN et al (2003) observaram a imobilizao da lipase Thermomyces lanuginosus em materiais como slica e celulose com diferentes granulometrias. Segundo os autores, o uso industrial de lipases imobilizadas exige diferentes qualidades e caractersticas do biocatalisador em funo da sua aplicao especfica.

20

Mtodos de Imobilizao de Enzimas

Enzimas Insolveis

Enzimas Solveis

Ligao

Ocluso Gis

Sem derivao

Com derivao

Ligao a Suportes Adsoro

Ligao Cruzada Intermolecular

Ultrafiltrao Fibras Fibras ocas Microcpsulas

Ligao inica Ligao covalente Ligao metlica ou quelao Figura 7: Classificao dos principais mtodos de imobilizao de enzimas (KENNEDY et al., 1988).

2.3.2 Suportes
Os suportes utilizados para a imobilizao podem ser constitudos de vrios tipos de materiais. Uma forma de classific-los como suportes orgnicos e suportes inorgnicos. Os suportes orgnicos podem ser naturais (celulose, agar, quitina, amido, colgeno, etc) ou sintticos (polistirenos, poliacrilatos, polivinlicos, nylon, etc). Os inorgnicos por sua vez dividem-se em minerais (areia, bentonita, argilas, etc) e fabricados (vidro, cermica e slica de porosidade controlada, xido de ferro, xido de nquel, etc).ii (KENNEDY et al., 1988). A escolha do mtodo de imobilizao e do tipo de suporte depende essencialmente de dois fatores, das caractersticas peculiares da enzima e das condies de uso da enzima imobilizada. Dada a variabilidade desses 21

fatores, pode-se afirmar que no existe um mtodo geral de imobilizao e nem um suporte que possa ser considerado de aplicao universal (KENNEDY et al., 1988). Para este trabalho dois suportes foram utilizados para imobilizao por adsoro da lipase: carvo ativado e polianilina.

Carvo ativado Os carves microporosos pertencem a uma classe de materiais importantes, conhecido como carvo ativado (CA) sendo de larga aplicao atravs de sua reconhecida produo mundial de aproximadamente 400.000 ton/ano (SAAD, 2005). O carvo ativado utilizado como adsorvente, catalisador ou suporte de catalisador. Na rea de tratamento de efluentes usado na adsoro em fase lquida, por exemplo, na adsoro de molculas orgnicas que causam sabor, odor e toxicidade. Os carves ativados so materiais porosos que apresentam uma forma microcristalina, no graftica, que sofreram um processamento para aumentar a porosidade interna. Uma vez ativado o carvo apresenta uma porosidade interna comparvel a uma rede de tneis que se bifurcam em canais menores e assim sucessivamente. Esta porosidade diferenciada classificada segundo o tamanho em macro-, meso- e microporosidades (FREITAS et al., 2007). A caracterstica incomparvel do carvo a grande superfcie interna localizada dentro da rede de poros estreitos, onde a maior parte do processo de adsoro toma lugar e cujo tamanho e forma dos poros tambm influenciam na seletividade da adsoro atravs do efeito de peneira molecular (RODRIGUEZ REINOSO et al., 1998). O carvo ativado comercializado em forma de p ou granulado. As propriedades texturais dos carves ativados se fundamentam em duas caractersticas importantes que so: tamanho de poro e a rea superficial A interao adsorvato/adsorvente na adsoro fsica uma funo da polaridade da superfcie do slido e da adsortividade. O carter no polar da superfcie no carvo ativado fator preponderante na adsoro de molculas no polares por um mecanismo no especfico, podendo ser incrementada 22

pela adequada modificao da natureza qumica da superfcie do carvo (por exemplo: oxidao), desde que este produza um incremento na interao superfcie-adsorvato (GONALVES, 1996). As propriedades do carvo ativado dependem das estruturas porosas e dos grupos qumicos presentes em sua superfcie. As propriedades fsicas da superfcie so descritas pela rea superficial especfica e porosidade, enquanto que as propriedades qumicas dependem da presena ou ausncia de grupos cidos ou bsicos sobre sua superfcie (SALIS et al., 2003). De acordo com a temperatura na qual o carvo exposto ao oxignio, so formadas superfcies cidas e bsicas (CHRISTENSEN et al., 2003). A superfcie cida formada quando uma soluo oxidante colocada em contato com o carvo em temperaturas em torno de 300 a 400C; esta superfcie caracteriza o carvo-L. As superfcies cidas so caracterizadas pela presena de grupos funcionais como: grupos

carboxlicos, grupo fenol, grupo carbonilo, grupo anidrido carboxlico, grupo ciclo perxido. Por outro lado, a superfcie bsica formada em atmosfera inerte em temperaturas acima de 700C; esta superfcie caracteriza o carvoH.iii A superfcie bsica caracterizada pela presena de grupos funcionais pirano, e a funo cida por fenis, por exemplo, conforme ilustrado na Figura 8.

Grupo Fenol

Grupo Lactona

Grupo Pirano

OH O

O
Grupo Carboxlico

O
Grupo Dioxina

O C

OH

Grupo Amina

HO

O O

C O C O
Grupo Anidrido Carbonico

Grupo Perxido

Figura 8: Principais grupos qumicos na superfcie do carvo ativado.iv Polianilina 23

A polianilina e polmeros derivados da anilina tm recebido grande ateno nos ltimos anos pela sua estabilidade qumica em condies ambientais, processabilidade, facilidade de polimerizao e dopagem, baixo custo e suas propriedades nicas. Estas vantagens viabilizam vrias aplicaes tecnolgicas que j vm sendo desenvolvidas inclusive

industrialmente (VALENCIA, 2007). As polianilinas representam uma classe de polmeros, cuja

composio qumica na forma de base (no dopada) dada por uma frmula geral do tipo:

H N

H N

1-y x

Composta por y e por (1-y) unidades repetitivas das espcies reduzidas e oxidadas respectivamente. O valor de y pode variar continuamente entre 1 para o polmero completamente reduzido (contendo somente nitrognios amina) e zero, no caso do polmero completamente oxidado (contendo somente nitrognios imina). A polianilina (PANI) pode ser sintetizada na forma de p utilizando-se um oxidante qumico apropriado, ou na forma de filmes finos pela oxidao eletroqumica de monmeros sobre eletrodos de diferentes materiais inertes. O baixo custo do monmero aliado facilidade de sntese e de dopagem da PANI faz com que esse polmero seja economicamente vivel, j sendo inclusive comercializado por algumas indstrias, para aplicaes especiais num primeiro estgio. A sntese qumica convencional da PANI tem a grande vantagem de produzir um polmero de alto peso molecular e de elevada pureza, que pode ser obtido diretamente no estado dopado, em grandes quantidades, na forma de um p verde. Por outro lado a sntese eletroqumica da PANI leva a algumas vantagens sobre a sntese qumica: no necessita de agente oxidante e catalisador, facilidade de caracterizao in situ por tcnicas

espectroscpicas; e o polmero obtido diretamente na forma de filmes finos. No entanto, para o estudo das propriedades fsicas e aplicaes 24

tecnolgicas a sntese qumica tem sido mais utilizada (BRENNAN et al., 2001). Na polimerizao qumica vrios cidos protnicos, tais como cido clordrico, sulfrico, tolueno sulfnico, entre outros, tm sido usados em combinao com diversos agentes oxidantes, como o dicromato de potssio, perxido de hidrognio e persulfato de amnio (MORENO CASTILLA et al., 2004). A sntese eletroqumica se d pela oxidao eletroqumica da anilina em meio cido, sob a aplicao de uma certa corrente ou potencial eltrico. Polianilinas com substituies no anel ou no tomo de nitrognio amina podem ser facilmente sintetizadas e dopadas em uma grande variedade de nveis, com conseqente variao nas suas propriedades eltricas e fsicoqumicas (MUSSATTO et al., 2004). Tal versatilidade tem despertado enorme atrao na comunidade cientfica, uma vez que as polianilinas detm caractersticas nicas, como a simplicidade no processo de dopagem, sua excelente reciclabilidade redox e suas propriedades pticas, eltricas e eletroqumicas. Alm disso, a alta estabilidade ambiental e facilidade na preparao candidatam fortemente as polianilinas a aplicaes na rea da engenharia bioqumica, como um suporte potencialmente atrativo para imobilizao de enzimas, visto que apresentam propriedades semelhantes aquelas esperadas do suporte ideal (GUILARDUCI et al., 2006). Adicione-se a tais caractersticas o fato de que as polianilinas so polmeros de sntese extremamente barata e com excepcional rendimento. No entanto, o uso de polianilinas quimicamente sintetizadas, visando explorar suas propriedades como suporte, em funo de suas caractersticas de estabilidade ambiental e reatividade nos processos de ativao, tem sido restrito, surgindo a necessidade de um estudo sistemtico sobre as caractersticas e propriedades das polianilinas quimicamente sintetizadas, bem como a sua aplicao como suporte para imobilizao de enzimas (BRENNAN et al., 2001).

2.4 Ultrassom

25

A utilizao de ultrassom em reaes de hidrlise pode ser uma ferramenta simples e importante no controle de agregao e/ou disperso de partculas. A utilizao do ultrassom tem se tornado cada vez mais comum em laboratrios qumicos de pesquisa e de produo para limpeza de materiais, homogeneizao de emulses e suspenses e reaes qumicas entre outras. Quando esses materiais ou substncias so submetidos ao banho de ultrassom, possveis reaes qumicas podem ser iniciadas acarretando em transformaes do sistema. Em reaes enzimticas o ultrassom uma boa ferramenta a ser utilizada, podendo perturbar ligaes fracas e induzir a mudanas conformacionais na estrutura das protenas (MATTOSO, 1996).

2.4.1 Irradiao por ultrassom em reaes orgnicas

As ondas sonoras so ondas mecnicas produzidas por deformaes provocadas pela diferena de presso em um meio elstico ou deformvel como ar, metais, isolantes, gua, entre outros. Estas ondas necessitam de um meio para se propagar, isto , no se propagam no vcuo. O ultrassom s foi descoberto em 1880 por Curie enquanto estudava o efeito piezeltrico e 14 anos depois Thornycroft e Barnaby observaram que, na propulso de msseis, uma fonte de vibrao era gerada causando imploso de bolhas e cavidades na gua, fenmeno que ficou conhecido como cavitao. Entretanto, somente em 1912 quando Langevin desenvolveu o SONAR (Sound Navigation And Ranging), um aparelho capaz de medir a profundidade do mar, que as ondas na freqncia de ultrassom foram aplicadas comercialmente. Em 1927, os efeitos destas ondas foram observados em sistemas qumicos e biolgicos e em 1950 os primeiros aparelhos geradores de ultrassom foram comercializados (MAIA et al., 2000). A partir de ento, diversas pesquisas comearam a ser desenvolvidas e o estudo da influncia das ondas ultrassonoras sobre sistemas qumicos passou a ser chamado de sonoqumica e a aplicao de sonicao passou a ser diversificada. A regio do ultrassom pode ser dividida em duas principais reas: alta potncia e baixa potncia. As ondas sonoras de alta potncia (1-10 MHz) 26

causam permanente mudana fsica e qumica porque produzem cavitao e microfluxos nos lquidos, aquecimento e ruptura nos slidos e instabilidade na superfcie da interface de sistemas lquido-lquido e lquido-gs. A aplicao das ondas sonoras de alta potncia se d nas reas da Biologia (homogeinizao, rompimento de clulas), Engenharia (limpeza de metal, soldagem, refinamento de metal, perfurao), Geologia (localizao do mineral, depsito de leo), Industrial (filtrao, desgaseificao, cristalizao, disperso de slidos, emulsificao, etc), Medicina (esterilizao, fisioterapia, inalaes), Fsica (cavitao, fenmeno de ondas acsticas, velocidade do som) e Polmeros (polimerizao, despolimerizao, degradao do peso molecular) (MARTINEZ et al., 2000). As ondas sonoras de baixa potncia , com freqncia maior que 20KHz so usadas em campos da cincia, engenharia e medicina para testes e diagnsticos tcnicos. Estas ondas ultrassonoras so empregadas em exames de feto, inspees de solda, medidas de espessuras. Tambm so usadas por morcegos, pssaros noturnos e animais marinhos, para sua localizao atravs do eco. Cabe destacar que a sensibilidade do ouvido humano encontra-se na faixa de 16 Hz a 16KHz (BARBOSA et al., 1992). Existem dois tipos, basicamente, de aparelhos geradores de ondas ultrassonoras: o banho e a sonda. Onde a fonte de energia ultrassonora uma cermica piezoeltrica disposta entre duas chapas metlicas, este sistema constitui o transdutor piezoeltrico, (Figura 9).

Gerador de Frequncia Chapas Metlicas

Cermica Piezoeltrica

Ppiesoeltrica
Banho Transdutor Piezoeltrico Figura 9: Banho de ultrassom e transdutor Piezoeltrico

O gerador de freqncia transmite um sinal cermica piezoeltrica, que transforma ondas eltricas em ondas mecnicas; as chapas metlicas

27

amplificam estes sinais; o transdutor transmite os impulsos ultra-sonoros ao meio reacional. No banho, o transdutor diretamente preso no fundo da cuba do aparelho e a energia ultrassonora transmitida atravs de um lquido, normalmente gua. Neste caso, h muita disperso de energia ultrassonora, e consequentemente, menor influncia nos sistemas reacionais

(SINISTERRA, 1992). A propagao das ondas ultrassnicas um fenmeno fsico e ocorre por meio de um corpo vibrando que transmite seu movimento s molculas adjacentes e estas transmitem s outras ao seu redor antes de retornarem sua posio de equilbrio. Desta forma, mantendo este movimento, ocorre a criao de ciclos de compresso e expanso (SINISTERRA, 1992). Quando em meios lquidos, este ciclo gera cavidades que aumentam durante a expanso, pois os gases adsorvidos no lquido e os prximos cavidade evaporam promovendo aumento de tamanho. Quando atinge um tamanho crtico, a cavidade implode-se liberando calor e presso muito elevados em intervalos curtos de tempo e em locais especficos do lquido. Tal efeito o conhecido fenmeno de cavitao (KORN et al. 2003). imprescindvel destacar que, na cavitao, dois tipos de bolhas so formados: as estveis e as transitrias. As primeiras oscilam no meio e seu volume cresce com a penetrao de gs dissolvido no lquido, na fase de descompresso. Elas precisam de vrios ciclos de expanso e compresso para atingirem o volume crtico e podem tornar-se transitrias, que so as bolhas com tempo de vida curto, de poucos ciclos, que implodem na fase de compresso, sendo, ento, responsveis pela cavitao (SINISTERRA, 1992). Em casos de partculas slidas presentes no lquido, na etapa de compresso os gases so adsorvidos para o interior da partcula, de onde saem somente na etapa de expanso (BARBOSA et al., 1992). Tendo em vista, o colapso cavitacional ocasionando pelas ondas ultrassonoras, proporcionando presso e temperatura em regies

determinadas, muitos estudos comearam a ser desenvolvidos, iniciando-se uma nova rea da qumica conhecida como sonoqumica. Esta consiste em estudar reaes homogneas e heterogneas sob ao do ultrassom. 28

Estudos em sistemas homogneos indicam que existem duas regies de reatividade. A primeira corresponde fase gasosa dentro da bolha, denominada ponto quente, onde inicia-se a imploso cuja eficincia depende da volatilidade do solvente. J a segunda, trata-se de uma fina camada lquida em volta da bolha (SINISTERRA, 1992). Em sistemas heterogneos, a destruio da bolha ocorre

assimtricamente originando um jato de lquido em direo superfcie slida, podendo causar eroso localizada. Mas existem tambm microfluxos de lquidos que acabam por favorecer o transporte de massa entre a fase lquida e a superfcie slida, acelerando algumas reaes qumicas. Quando em sistemas com lquidos imiscveis, este colapso das microbolhas pode promover uma eficiente agitao. Com o aumento na velocidade de formao de gotculas microscpicas, com aumento da superfcie de contato e das foras coesivas podem ser formadas ainda micro-emulses. conformacionais Espcies reativas e a induo de mudanas

na estrutura de protenas tambm podem ocorrer

(SINISTERRA, 1992).

2.4.2 Irradiao por ultrassom em reaes enzimticas

A irradiao por ultrassom um mtodo alternativo para reduzir as limitaes da transferncia de massa substrato-enzima, assim como pode proporcionar mudanas conformacionais na estrutura de protenas. O efeito fsico do ultrassom em processos biotecnolgicos consiste principalmente na alterao da temperatura e presso do micro-ambiente em funo do efeito cavitacional. Mas, suas freqncias de irradiao podem promover a formao de radicais livres que alteram clulas e enzimas presentes no meio. No caso de protenas globulares, freqncias entre 0-100 kHz so fortemente absorvidas e podem levar a hidrlise. J para protenas lineares essa absoro depende do contedo de -hlice. O fator limitante mais comum para o uso de ultrassom nas reaes bioqumicas o aumento na temperatura promovido pela irradiao, uma vez que enzimas podem ser inativadas termicamente. Contudo, este no de 29

todo um fator negativo j que a inativao trmica de enzimas de muita importncia em alguns processos biotecnolgicos, sendo a pasteurizao ultrassnica um deles. preciso destacar que a inativao no ocorre em todos os casos, pois o efeito do ultrassom pode ser destrutivo ou construtivo dependendo da intensidade das ondas. Shah e Gupta (2008) demonstraram que a irradiao com freqncia de 40kHz no alterou a estrutura secundria da lipase, mas promoveu uma perturbao em regies com resduos tirosina e triptofano e na estrutura terciria da enzima. Estas mudanas estruturais promoveram a ativao da lipase (SHAH et al., 2008). Outro fator a ser considerado em reaes com enzimas em ultrassom o solvente que est sendo utilizado. A presena de muitas molculas de gua pode aumentar a inativao, pois ocorre aumento da energia cintica do meio, induzido pelas ondas ultrassonoras, ocasionando mudanas conformacionais. O uso de solventes orgnicos ou sistemas bifsicos funciona como um mecanismo de proteo porque as molculas de gua encontram-se em torno da enzima, desta forma no so facilmente movidas pelo ultrassom (MARTINEZ et al., 2000). Outro fator que influenciado pelo solvente a transferncia de massa. Sabendo-se que o ultrassom em baixas intensidades aumenta o movimento do meio, favorecendo o fluxo de reagentes para o stio ativo da enzima, um solvente mais voltil aumenta o efeito cavitacional, podendo favorecer a reao. Entretanto, a intensidade e/ou o tempo de irradiao pode levar inativao da enzima via colapso cavitacional.

30

3. Materiais e Mtodos
3.1 Materiais
3.1.1 Substratos
leo de palma refinado utilizado como substrato nas reaes foi doado pela Agropalma. A Tabela 3 apresenta as propriedades fsico-qumicas do leo de palma refinado, utilizado neste trabalho. Tabela 3: Propriedades Fsico Qumicas do leo refinado, Agropalma.
Propriedades Fsico Qumicas (AOCS) Atributos Acidez (% Resultados 0,034 Limites 0,05 Atributos SFC 10C 0 1,0 SFC 20C 2,0
1

Resultados 48,97

Limites 50 + 3

Palmtico) . Perxidos (mEq/Kg) Cor (Lovibond Red 5 /4 Ponto de 35,0 36 + 2 4,0

20,12

21 + 3

SFC 25C

13,09

12,5 + 2

SFC 30C

6,71

8+2

Fuso (C) ndice de 52,67 51 55 9 8

SFC 35C SFC 40C

4,25

5+2

Iodo (wijjs) Sabor

2,11

2,5 + 2

Temp. Embarque (C)

SFC 45C

3.1.2 Enzimas

As lipases imobilizadas e livres comerciais Lipozyme TL IM e LipozymeTL 100 L foram cedidas por Novozymes (antiga Novo Nordisk, Dinamarca). 31

3.1.3 Suportes para imobilizao

- Carvo ativado

- Polianilina (PANI)
A polianilina usada para a imobilizao foi sintetizada adicionando-se volume a volume uma soluo 0,61 mol L-1 do agente oxidante persulfato de amnio ((NH4)2S2O8 ) a uma soluo 0,44 mol L-1 de anilina (C6H5NH2), ambas preparadas em HCl 2,0 mol L-1, de forma a manter uma razo entre o agente oxidante e a anilina (z) igual a 0,9 calculada segundo a Equao 1

Z = 2,5 . nan Ne . nox nan = nmero de mol da anilina nox = nmero de mol de persulfato de amnio

(1)

ne = nmero de eltrons necessrios para reduzir uma molcula do agente oxidante =2.

A reao de polimerizao se processou pela adio gota--gota da soluo de persulfato de amnio sobre a soluo de anilina, com leve agitao, por um perodo mnimo de 2 h, mantendo-se as solues numa faixa de temperatura que variava entre -5 e -10 C. Finda a adio do agente oxidante, a mistura obtida permanecia sob agitao por 30 min, seguidos por 2 h de repouso de finalizao da reao. O precipitado foi separado da mistura por filtrao a vcuo em funil de Bchner e ento lavado exaustivamente com HCl 2,0 mol L-1. Finalmente, o polmero obtido foi seco sob vcuo contnuo, temperatura ambiente, at se alcanar massa constante.

3.1.4 Outros materiais

Os outros materiais e reagentes empregados nesta pesquisa foram adquiridos da Vetec, Merck e Tedia, e usados sem qualquer tratamento prvio

32

3.2 Metodologias analtica

3.2.1 Determinao da atividade hidroltica
Foi utilizado como substrato para a dosagem lipsica, azeite de oliva (5% p/v) emulsionado por trs minutos com goma arbica (10% p/v) em tampo fosfato de sdio 100 mM pH 7,0. Em um erlenmeyer de 250 mL foram adicionados 19 mL desta emulso e 0,1g da enzima, agitando-se em shaker por 5 minutos a 37C e 150 rpm. Decorrido o tempo, a reao foi interrompida extraindo-se os cidos graxos com adio de 20 mL de uma soluo de acetona/etanol (1:1 v/v). Os cidos foram ento titulados com uma soluo de NaOH (0,05 mol) at pH 11. Os brancos reacionais foram preparados com 19 mL de emulso e aps decorrido o tempo de agitao foram adicionados 20 mL de soluo acetona/etanol (1:1 v/v) e 0,1g de enzima. Estes tambm foram titulados com a soluo de NaOH (0,05 mol ) at pH 11 (PINHEIRO, 2006). Uma unidade de atividade de hidrlise (UH) definida como a quantidade de enzima que libera 1 mol de cido graxo por minuto nas condies descritas acima, que pode ser determinada atravs da Equao 2 (LEAL, 2000). (2) AH = (Va Vb).N.1000 E.t

Onde : AH a atividade hidroltica (mol/min.g ou mol/min.mL); e Va e Vb correspondem ao volume de soluo de NaOH (mL) gasto na titulao da amostra e do branco, respectivamente; N a normalidade da soluo de NaOH (mEq/mL); E a quantidade de enzima (g); e t o tempo de reao (min).

3.2.2 Determinao da concentrao de protenas

A dosagem de protenas do extrato bruto e das guas residuais das imobilizaes conduzidas ao longo desse processo foram feitas de acordo com o mtodo de Bradford (BRADFORD, 1976). Este mtodo utiliza o corante Coomassie brilliant blue BG-250 para a determinao de protenas 33

totais. O BG-250 interage com protenas que contenham aminocidos com cadeias laterais aromticas ou bsicas no pH da reao, a interao entre a protena e o corante BG-250 leva o corante para a forma aninica, que absorve a 595 nm. As leituras dos valores de absorbncia foram efetuadas em espectrofotmetro CARY 1E UV-visible, Spectrophotometer, VARIAN, e a concentrao de protenas foi calculada a partir de uma curva de calibrao com o padro soro-albumina bovina (BSA, Sigma).

3.2.3 Anlise de acidez em cido palmtico

A acidez foi determinada no leo refinado de palma antes das reaes e em cada amostra aps as reaes. Utilizou-se o peso molecular do cido palmtico, devido a este ser o cido que se apresente em maior quantidade no leo de palma. Pesou-se 0,5 gramas de amostra, que foi diluda com 50 ml de uma soluo 1:1 de etanol:ter, adicionou-se 4 a 5 gotas de fenolftalena. A titulao foi feita com uma soluo de hidrxido de sdio 0,05 N, at uma colorao rsea. O ndice de acidez foi calculado seguindo a Equao 3,

Acidez em cido palmtico% = V . N . f . 0,2564 . 100 P Sendo que: V = volume em ml da soluo de NaOH gasto na titulao; N = normalidade da soluo de NaOH; f = fator de correo da normalidade; P = peso em gramas da amostra.

(3)

3.2.4 Anlise Cromatogrfica

A anlise cromatogrfica realizada no laboratrio GREENTEC, LADEQ 215, foi feita para determinar a quantidade de MAG, DAG, TAG e AGL formados no meio reacional e o rendimento calculado a partir da

34

comparao com o padro interno. O rendimento obtido foi corrigido atravs do ndice de acidez da amostra. O objetivo do experimento a separao e quantificao de glicerol e glicerdeos em leo, usando como base o mtodo de referncia _ Draft:prEN 14105. O princpio dessa anlise consiste na transformao do glicerol, mono- e diacilgliceris em compostos mais volteis atravs da derivatizao na presena de piridina e N-metil-N-trimetisililtrifloroacetamina (MSTFA), e usando como padro interno 1,2,4 butanotriol (para determinao do glicerol) e 1,2,3, tricapoilglicerol (tricaprina) (para determinao dos glicerdeos). As substncias de referncia para a anlise foram: glicerol, 1-monooleilglicerol (monolena), 1,3-dioleilglicerol (diolena) e 1,2,3-trioleilglicerol (triolena). A anlise dos derivatizados foi feita atravs do cromatgrafo de gs com injetor on-column, forno com temperatura programvel e detector de ionizao por chama (FID) CG2010 Shimadzu. Utilizou-se uma coluna capilar resistente a altas temperaturas (400C) com: 100% dimetilpolisiloxano ou 95% dimetil-5 difenilpolisiloxano; 10 m, dimetro interno: 0,32 mm, espessura do filme: 0,1mm Gs Carreador: H2 Presso = 35,5 KPa Vazo = 4,23 mL/min Velocidade linear = 80.03 cm/sec Purga = 5,0 ml/min Volume de injeo = 1 L Temperatura do detetor = 380C Tempo de anlise 42,14 min Preparo da soluo estoque N1 - pesar 50 mg de 1,2,4 butanotriol em balo volumtrico de 50mL; avolumar com piridina. Preparo da soluo estoque N2 - pesar 80 mg de 1,2,3 tricaproilglicerol em balo volumtrico de 10mL; avolumar com piridina. Preparo da soluo estoque N3 - pesar 50 mg de 1,2,4 butanotriol e 400 mg de1,2,3 tricaproilglicerol em balo volumtrico de 50mL; avolumar com piridina

35

Preparo da soluo estoque de glicerol - pesar 50 mg de glicerol em balo volumtrico de 10mL; avolumar com piridina; transferir 1 mL dessa soluo para balo de 10mL; avolumar com piridina. Preparo da soluo estoque de glicerdeos - pesar 50 mg cada glicerdeo de referncia em balo volumtrico de 10mL; avolumar com piridina. Solues Padro - em 4 vials numerados de 1 a 4, ou frascos de capacidade para 10mL, transferir com microseringa, os volumes de soluo, conforme tabelas abaixo: Tabela 4: Volumes das solues adicionadas para medir as concentraes
Seringas Soluo glicerol L Soluo monoolena L Soluo diolena L Soluo triolena L Soluo Padro Butanotriol L 1 2 3 4 10 40 70 100 50 120 190 250 10 40 70 100 10 30 60 80 80 80 80 80 Soluo Padro Tricaprina L 100 100 100 100

Tabela 5: Concentraes obtidas para os padres.

% glicerol (p/v) % monoolena (p/v) % diolena (p/v) % triolena (p/v) % Soluo Padro Butanotriol (p/v) 1 2 3 4 0,019231 0,04878 0,061404 0,070423 0,096154 0,146341 0,166667 0,176056 0,019231 0,04878 0,061404 0,070423 0,019231 0,036585 0,052632 0,056338 0,153846 0,097561 0,070175 0,056338 % soluo Padro Tricaprina (p/v) 0,192308 0,121951 0,087719 0,070423

Preparo da amostra em frascos mbar, pesou-se 0,1 g de leo; adicionou-se 100 L de soluo estoque N 3, 100 L de MSTFA. Aps repouso por 15 min, adicionou-se 8 mL de heptano; transferiu-se para vial. Deste vial a amostra foi coletada com seringa e injetada no GC.

36

3.2.5 Anlise de Infravermelho de Transmisso

A anlise foi feita em espectrofotmetro por transformada de Fourier Nicolet Magna-IR760, utilizando-se amostras de enzimas imobilizadas em PANI recm sintetizadas, na forma de pastilhas de KBr, na faixa de comprimento de onda que vai de 400 a 4000 cm-1.

3.2.6 Mtodo BET (Brunauer-Emmett-Teller)

Este mtodo prescreve a determinao da rea superficial, volume de microporos e rea de mesoporos. As amostras so, primeiramente, calcinadas a 600 10C e, em seguida, degasadas a 300C por 1 hora. A isoterma de adsoro de nitrognio medida na faixa de presses relativas (p/po) entre 0,06 e 0,35. A rea superficial multiponto-BET calculada dos dados da isoterma na faixa de p/po = 0,06 - 0,20 o volume de microporos (MiPV) e rea de mesoporos (MSA) so calculados na anlise da curva t entre 3,3 e 5,4 (p/po = 0,06 - 0,35), onde t a espessura da monocamada de nitrognio gasoso adsorvido. A aparelhagem utilizada para realizar este testes consiste de: - um analisador de rea superficial TriStar Micromeritics; - uma balana analtica com preciso de 0,1 mg, calibrada; - um forno mufla 600 10C calibrado para pr-tratamento da amostra. Os reagentes utilizados foram: Nitrognio lquido; Nitrognio gasoso A.P ou UP e Hlio gasoso,A.P ou UP. As amostras de PANI e carvo ativado antes das imobilizaes foram pesadas em cadinhos de porcelana e introduzidos na Mufla 600C, onde foram calcinadas por 1 hora. Aps a calcinao, as amostras foram transferidas para o dessecador. Aps 15 minutos as amostras foram

transferidas, para um tubo de vidro previamente tarado. O tubo com as amostra foram transferidos a para estao de tratamento e procedido o tratamento 300C sob vcuo.

37

3.3 Imobilizaes da Lipozyme TL 100 L

3.3.1 Imobilizao em carvo ativado
A imobilizao em carvo ativado foi realizada colocando em contato com 1 g de carvo ativado p (Limpatex), 30 mL de uma soluo tampo fosfato pH 7,0 , 25mM contendo 0,225 ml* da lipase Lipozyme TL 100 L. A mistura foi mantida em agitador orbital (150 rpm) a temperatura de 25C por duas horas e meia (RODRIGUES, 2002). Em seguida, separou-se o sobrenadante por filtrao a vcuo. O derivado foi lavado com tampo fosfato e liofilizado por aproximadamente 1 hora. A atividade de hidrlise foi determinada no derivado, no sobrenadante e na soluo inicial de enzima.

3.3.2 Imobilizao em Polianilina

Em contato com 1 grama de suporte colocou-se 50 mL de tampo fosfato 0,1 mol, pH 6,0 com 0,225 ml de enzima. A mistura foi colocada sob agitao (agitao magntica) leve por 2 horas a aproximadamente 4C (banho de gelo). Aps, a mistura foi filtrada a vcuo, o suporte foi lavado com tampo fosfato pH 6,0 e liofilizado por aproximadamente 1 hora (ANDRADE et al., 2008). A atividade de hidrlise foi determinada no derivado, no sobrenadante e na soluo inicial de enzima.

3.3.3 Imobilizao em carvo ativado e em polianilina no ultrassom

Nas imobilizaes realizadas em banho de ultrassom, as quantidades de suporte, enzima, tempo de imobilizao e temperatura foram idnticos aos realizados anteriormente, sendo a nica diferena estarem sob ultrassom.

a quantidade de lipase adicionada foi calculada pela quantidade de protena do extrato bruto (22,23 mg de protena por ml). Assim, usou-se 5 mg de protena para cada grama de suporte imobilizado.

38

3.3.4 Parmetros de imobilizao

Os parmetros carga de protenas adsorvidas, atividade imobilizada terica, atividade imobilizada real, reteno de atividade e eficincia de imobilizao foram empregados para avaliar a imobilizao de lipase comercial (Lipozyme TL 100 L). A definio destes parmetros, encontra-se a seguir (FREIRE et al., 1990).

Carga de Protenas adsorvidas Definida com sendo a diferena entre a quantidade de protenas inicialmente colocadas em contato com o suporte e a quantidade de protenas ao final da imobilizao dividida pela massa de suporte empregado, Equao 4.

C arg a _ ads [ Ptn ]t 0.Vsoluo [ Ptn ]tf .Vsoluo m sup orte

(4)

Onde: Carga_ads a carga de protenas adsorvida (mg/g); [Ptn]t0 e [Ptn]tf correspondem concentrao de protenas no incio e ao fim do processo de imobilizao, respectivamente (mg/mL); V o volume da soluo de enzimas (mL); m a massa de suporte (g).

Atividade imobilizada terica A atividade hidroltica imobilizada terica foi definida como sendo a diferena entre a atividade da soluo enzimtica em contato com o suporte no incio e ao trmino do processo de adsoro dividida pela quantidade de suporte empregada, equao 5.

Aterico AH

t0

AH t f

(5)

m sup orte

39

Onde : Aterico atividade imobilizada terica (UH/g);

AH t 0 e

AH t f

correspondem atividade hidroltica no incio e ao fim do processo de imobilizao, respectivamente (mg/mL); msup orte a massa de suporte (g). Atividade imobilizada real A atividade imobilizada real (Areal) foi determinada utilizando o suporte imobilizado e a metodologia descrita no item 3.2.3. Reteno de atividade A reteno de atividade foi definida como a relao percentual entre as atividades hidrolticas imobilizadas real e terica, Equao 6.
Rativ Areal . 100 Aterica

(6)

Onde: Rativ a reteno de atividade (%); Aterica e Areal correspondem atividade hidroltica terica e real, respectivamente (UH/g). Eficincia de imobilizao

A Eficincia de imobilizao foi definida como sendo a relao percentual entre a concentrao de protenas do sobrenadante no incio e ao final do processo de imobilizao, Equao 7. Eimob [ Ptn ]t 0 [ Ptn ]tf . 100 [ Ptn ]t 0 (7)

Onde: Eimob a Eficincia de imobilizao (%); [PTN]t0 e [PTN]tf correspondem concentrao de protenas no incio e ao fim do processo de imobilizao, respectivamente (mg/mL)

40

3.4 Hidrlise do leo de palma com Lipozyme TL IM e

Lipozyme TL 100 L imobilizada em carvo ativado e em polianilina

3.4.1 Reaes de hidrlise em reator de vidro
As reaes de hidrlise foram feitas adicionando-se a um reator de vidro encamisado 5g do leo de palma. A quantidade de enzima utilizada variou entre 1, 2 e 3% em peso da enzima e 0,25 mL de gua. Todas as reaes foram deixadas sob agitao por um perodo de at 24 horas e mantidas a temperatura constante atravs de um banho termostatizado. Aps este tempo, foi adicionado ao meio reacional 10 mL de n-hexano e a soluo lavada sucessivamente com gua e soluo saturada de Cloreto de Amnio. A fase orgnica foi concentrada em um evaporador rotatrio. O amostra obtido foi analisado por GC (CHEONG et al., 2007). Reaes preliminares foram realizadas com agitao magntica dentro dos reatores de vidro, utilizando a mesma metodologia.

3.4.2 Reaes de hidrlise em banho de ultrassom

As reaes de hidrlise foram feitas adicionando-se a um balo, 5g do leo de palma. A quantidade de enzima utilizada variou entre 1, 2 e 3% em peso da enzima e 0,25 mL de gua. Todas as reaes foram deixadas sob agitao, com agitador mecnico, por um perodo de at 6 horas e mantidas a temperatura do banho de ultrassom (aproximadamente 58C), Figura 10. Aps este tempo, foi adicionado ao meio reacional 10 mL de n-hexano e a soluo lavada sucessivamente com gua e soluo saturada de cloreto de amnio. A fase orgnica foi concentrada em um evaporador rotatrio e a amostra obtida foi analisada por CG.

41

Agitador mecnico

Reao

Banho de ultrasom

Figura 10: Esquema das reaes de hidrlise em banho de ultrassom.

42

4. Resultados e Discusso
Neste captulo sero apresentados e discutidos os resultados obtidos na produo de diacilglicerol a partir da hidrlise enzimtica de leo de palma utilizando a lipase imobilizada comercial Lipozyme TL IM e lipase livre Lipozyme TL100L imobilizada por adsoro, em carvo ativado e em polianilina.

4.1 Testes Preliminares

O leo de palma refinado utilizado como substrato, foi analisado por CG/EM, o cromatograma obtido pode ser observado no Cromatograma 1.

Cromatograma 1: Cromatograma do leo de palma refinado. possvel observar, no Cromatograma 1, na rea marcada, a presena de maior quantidade de triacilglicerol. Quantitativamente a anlise revelou 94,05% de triacilglicerol, 5,74% de diacilglicerol e 0,17% de monoacilglicerol. A acidez encontrada para o leo refinado foi de 0,034%, estando assim, de acordo com as especificaes apresentadas pela indstria fornecedora do leo, Tabela 3 (Item 3.1.3, pg 34). A cintica para a lipase comercial imobilizada LipozymeTL IM, na reao de hidrlise do leo de oliva, conforme metodologia descrita no item3.2.1 encontra-se a seguir na Figura 11. A formao de produtos que foi determinada nos tempos de 1 a 20 minutos, para clculo da velocidade inicial da reao.

43

600 500 400

[Produto]

300 200 100 0 0 5 10 Tempo (min) 15 20 25

Figura 11: Formao de produto em relao ao tempo da lipase Lipozyme TL IM. Como a velocidade inicial da reao determinada pela faixa linear da formao de produtos, possvel observar no Grfico 1, que o perfil cintico da reao de hidrlise do leo de oliva catalisada pela Lipozyme TL IM imobilizada,revelou que at 10 minutos a reao ainda estava em condies de velocidade inicial, e que, portanto, a titulao da reao em 5 minutos era representativa da atividade hidroltica. Assim a atividade hidroltica encontrada para a lipase comercial imobilizada Lipozyme TL IM em 5 minutos foi de 1192,78 UH/g. A atividade hidroltica da lipase manteve-se em torno deste valor, durante o seu uso nas reaes de hidrlise.

44

600 500

[Produto]

400 300 200 100 0 0 2 4 6 8 10 12

y = 48,21x R = 0,993
2

Tempo (min)

Grfico 1: Velocidade inicial da lipase imobilizada Lipozyme TL IM.

4.2 Reaes de hidrlise com Lipozyme TL IM

4.2.1 Banho Termostatizado
Comeamos ento o estudo da reao de hidrlise do leo de palma. Utilizando a lipase comercial imobilizada Lipozyme TL IM em reaes preliminares foram realizadas sob controle de temperatura de banhos termostatizados utilizando agitao magntica e variando a porcentagem de enzima. A Tabela 6 apresenta de forma quantitativa os resultados obtidos destas primeiras reaes. Tabela 6: Resultados quantitativos das reaes com agitao magntica Experimentos 1 2 Enzima (% p/v) 2 3 % Acidez 24 26 % MAG 1,5 1,2 % DAG 25 26 % TAG 48 46

possvel observar que utilizando a mesma temperatura e variando a quantidade de enzima adicionada na reao, no observado uma grande variao no rendimento de DAG, pode-se dizer que quantitativamente os resultados apresentados na Tabela 6, esto prximos, levando em considerao possveis pequenos erros de anlise.

45

Tendo em vista que, numa escala maior a agitao magntica tornase difcil de ser utilizada. Decidiu-se avaliar o comportamento do sistema reacional com agitao mecnica. As reaes a seguir, apresentadas na Tabela 7, foram realizadas a 1300 rpm, utilizando 1% de enzima e variando somente a temperatura. Como os resultados anteriores (Tabela 6) foram bons optou-se por diminuir a quantidade de enzima empregada, para observar se os resultados seriam satisfatrios. Passou-se a usar, ento, nas reaes a seguir, 1% de enzima em relao a quantidade de leo. Tabela 7: Resultados obtidos das reaes realizadas com 1% de enzima, agitao mecnica, 24 horas e 1300 rpm. Experimentos 1 2 3 4 Temperatura 40C 50C 55C 60C % Acidez 36 5 15 25 % MAG 0,5 0,3 1 0,6 % DAG 15 7 16 14 % TAG 48 88 68 61

A partir dos primeiros resultados obtidos com a agitao mecnica, possvel observar que ocorre formao de DAG com a utilizao de 1 % de enzima (Experimentos 2 a 4, Tabela 7). A reao a 40C de difcil reproduo devido a alta viscosidade do leo e deve ser desconsiderada. O aumento de temperatura leva a formao de DAG at aproximadamente 15% (Tabela 7). Na busca de um resultado quantitativo de DAG, continuou-se a utilizar 1% de enzima nos prximos ensaios variando a agitao e mantendo a temperatura de 60C e o tempo de reao de 24 horas constantes e os resultados quantitativos destas reaes podem ser observados na Tabela 8. A temperatura de 60C porque a partir desta temperatura o leo de palma encontra-se totalmente na forma lquida.

46

Tabela 8: Resultados obtidos nas reaes com 1% de enzima, 60C, 24 horas e variao na agitao. Experimentos 1 2 3 4 Agitao (rpm) 1300 1000 700 400 % Acidez 25 19 16 13 % MAG 0,6 1 0,3 0,3 % DAG 14 18 16 16 % TAG 61 62 68 70

Baseado nos resultados da Tabela 8, observar que a agitao menos vigorosa influenciou em alguns aspectos das reaes. Nota-se uma diminuio na acidez com uma agitao menos vigorosa, e um ligeiro aumento no rendimento de DAG. Buscando ainda uma otimizao da quantidade de enzima utilizada, foram realizadas reaes com 0,5% de enzima 60C e tempo de reao de 24 horas, com variao na agitao (Tabela 9).

Tabela 9:Resultados obtidos nas reaes com 0,5% de enzima, 60C, tempo de reao de 24 horas e variao na agitao. Experimentos 1 2 3 4 Agitao (rpm) 1300 1000 700 400 % Acidez 31 20 17 13 % MAG 0,3 1 0,7 0,5 % DAG 14 19 17 15 % TAG 54 59 65 72

Novamente pode-se observar que a agitao influenciou o ndice de acidez, provocando uma diminuio do ndice de acidez com a diminuio da agitao. Tambm observou-se como na reaes anteriores (Tabela 8), um ligeiro aumento no rendimento de DAG com agitao em torno de 1000 rpm. Aps esta avaliao inicial, onde buscou-se observar o efeito da concentrao relativa de enzima, da agitao e da temperatura do sistema reacional na reao de hidrlise do leo de palma, optou-se por utilizar 2% de enzima (Experimentos 1, Tabela 6) para a realizao dos experimentos j que . esta concentrao leva, relativamente a rendimentos ligeiramente maiores. 47

Os experimentos foram realizados variando a temperatura e a agitao, e os resultados encontram-se nas Tabelas 10, 11 e 12 a seguir. Tabela 10: Rendimento das reaes realizadas 60C, 2% de enzima, tempo de reao de 24 horas e variao na agitao Experimentos 1 2 3 4 . Com base nos resultados da Tabela 10 possvel estabelecer que as reaes tendem a um rendimento em torno de 25% de DAG. A concentrao relativa de TAG foi a menor quando a agitao foi de 700 rpm (Experimento 4). Portanto, para esta temperatura, concentrao de enzima e tempo reacional, 700 rpm foi a agitao que conduziu a melhores resultados. O Cromatograma 2 da reao que apresentou maior rendimento de DAG, Experimento 3 da Tabela 10, encontra-se abaixo. Agitao (rpm) 1300 1000 700 400 % Acidez 25 18 25 22 % MAG 0,6 0,7 1 1,5 % DAG 23 18 26 25 % TAG 49 63 47 50

DAG

TAG

Cromatograma 2: Cromatograma da reao realizada a 60C, 2% de enzima, 24 horas de tempo reacional e agitao de 700 rpm. Na rea marcada em vermelho observam-se os picos de diacilglicerois e na rea marcada em preto possvel observar os picos de triacilglicerois, sendo estes ainda em maior quantidade. Observa-se que em relao ao cromatograma do leo de palma refinado apresentado no Cromatograma 1, na pgina 41, houve um aumento nos picos de DAG e uma diminuio nos picos de TAG. 48

Os resultados apresentados a seguir (Tabela 11) so de reaes realizadas em temperatura de 50C, 2% de enzima, 24 horas de reao e variao na agitao. Tabela 11: Rendimento das reaes realizadas 50C, 2% de enzima, tempo de reao de 24 horas e variao na agitao. Experimentos 1 2 3 4 Agitao (rpm) 1300 1000 700 400 % Acidez 31 30 22 36 % MAG 0,5 0,5 0,4 0,7 % DAG 16 15 16 15 % TAG 52 53 62 47

Nas reaes realizadas a 50C, pode-se dizer que independente da agitao empregada ocorreu baixa variao no rendimento de DAG. Considerando o fato de que o leo est parcialmente slido, os rendimentos so razoveis e situam-se em torno de 15%. Embora salientando que o Experimento 4 no deva ser muito reprodutvel, sob uma menor agitao, 400 rpm, a quantidade de TAG foi a menor, 47%. O Cromatograma 3, apresenta o resultado do Experimento 4 da Tabela 11.

Cromatograma 3: Cromatograma da reao realizada a 50C, 2% de enzima, 24 horas de reao e agitao de 400 rpm.

Este cromatograma nos apresenta picos bem menores de DAG, comparados aos apresentados pelo cromatograma da Figura 14, devido a este decrscimo no rendimento de DAG, observado entre o Experimento 3, Tabela 10, 26% e o Experimento 4, Tabela 11, 15%.

49

A temperatura de 40C tambm foi testada, embora com reservas devido aos problemas resultantes da transferncia de massa devido a alta viscosidade do substrato e presena de slidos (Tabela 12). Tabela 12: Rendimento das reaes realizadas 40C, 2% de enzima, tempo de reao de 24 horas e variao na agitao. Experimentos 1 2 3 4 Agitao (rpm) 1300 1000 700 400 % Acidez 27 26 23, 24 % MAG 1,5 1 0,7 0,8 % DAG 23 15 15 16 % TAG 48 57 61 59

Na Tabela 12 pode-se verificar uma tendncia a estabilizao do rendimento de DAG em torno de 15%. Sob maiores agitaes possvel que tenha havido uma melhor transferncia de massa (Experimento 1).

Cromatograma 4: Cromatograma da reao realizada a 40C, 2% de enzima, 24 horas de reao e agitao de 1300 rpm. Os resultados discutidos acima mostram que a condio que apresentou melhor rendimento de DAG foi o Experimento 3, Tabela 10, onde 26% foi obtido com uma agitao de 700 rpm e 60C. Outras condies tambm apresentaram bons rendimentos como o Experimento 1 das Tabelas 10 e 12 e o Experimento 4 da Tabela 10. O resultado obtido (Experimento 3, Tabela 10) foi ento tomado como ponto de partida para as prximas etapas do trabalho. Os resultados obtidos at o momento esto de acordo com trabalhos similares da literatura. Por exemplo, ZANGH et al (2001) utilizaram esta mesma lipase para a produo de gordura de margarina em sistemas livres 50

de solventes. Os autores obtiveram seus melhores resultados a 60C e 700 rpm (ZHANG et al., 2001). Visto que at o momento no havamos modificado a varivel tempo, realizamos o acompanhamento da reao, na qual reaes de hidrlise com a lipase LipozymeTL IM, eram isoladas a cada trs horas at o tempo mximo de 24 horas. As condies reacionais utilizadas foram agitao de 700 rpm e 60C. Os resultados obtidos nestas reaes podem ser observados na Tabela 13. Tabela 13: Resultados quantitativos do acompanhamento da reao de hidrlise. Experimento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tempo 3h 6h 9h 12 h 15 h 18 h 21 h 24 h 48 h % Acidez 22 20 19 14 19 17 19 19 19 % MAG 0,8 0,6 0,6 2 2 0,8 0,6 2,6 2,5 % DAG 12 16 17 22 22 20 16 30 32 % TAG 66 63 63 62 57 62 63 48 47

Os resultados obtidos na Tabela 13 mostram que o rendimento em DAG aumenta com o tempo de reao. O tempo de reao de 24 horas (Experimento 8) pode ser considerado o de melhor rendimento de DAG. Apesar de o tempo de 48 horas apresentar um ligeiro acrscimo no rendimento de DAG, este aumento de no justifica o ligeiro incremento de rendimento obtido. Operacionalmente, a partir de 6 horas de reao observase pouca variao na quantidade de DAG. Entre 12 e 18 horas (Experimentos 4, 5 e 6) os rendimentos de DAG se mantiveram constantes, apresentando baixas variaes. O acompanhamento da reao de hidrlise com o tempo pode ser observado melhor na Figura 12.

51

40 35
Rendimento DAG (%)

30 25 20 15 10 5 0 0 10 20 30 Tempo (horas) 40 50 60

Figura 12: Perfil do acompanhamento da reao de hidrlise pela lipase LipozymeTL IM: rendimento de DAG em relao ao tempo.

4.2.2 Banho de ultrassom

O efeito do ultrassom em meio aquoso e bifsico aumenta o rendimento e a velocidade das reaes (SILVA et al., 2005). Os efeitos fsicos do ultrassom que devem ser considerados em processos

biotecnolgicos so o aumento da temperatura, a melhor transferncia de massa, a cavitao estvel e a transitria. A cavitao deve ser considerada como um tpico complexo e a questo de como a cavitao leva a alta energia qumica de primordial importncia para se obter o mximo proveito de sua aplicao. A cavitao transitria indesejvel em processos biotecnolgicos, uma vez que causa um aumento da temperatura e presso que certamente desintegraria as clulas ou desnaturaria as enzimas. A cavitao estvel, na qual bolhas oscilam de um modo regular induzindo ao seu redor uma micro correnteza que afeta algumas partculas diminuindo o estresse, deve ser analisado visando sua aplicao em bioqumica e biotecnologia (SINISTERRA, 1992). A literatura traz relatos de que a utilizao do ultrassom em reaes qumicas possui algumas vantagens, entre elas: reduo do tempo de reao; reduo da quantidade de reagentes; aumento de rendimento;

52

seletividade; favorecimento de reaes que normalmente no ocorrem em condies normais (MARTINEZ et al., 2000). Para avaliar o efeito do ultrassom nas reaes de hidrlise do leo de palma catalisada pela lipase LipozymeTL IM, alguns ensaios foram efetuados. Mantendo a agitao mecnica (700 rpm) dentro do frasco de vidro, e este dentro do ultrassom. A temperatura do banho foi fixada em 58C. Para avaliar o efeito da irradiao de ultrassom nas reaes de hidrlise do leo de palma catalisada pela enzima LipozymeTL IM, foram utilizadas as melhores condies encontradas anteriormente. Na Tabela 14 possvel observar os resultados quantitativos das reaes realizadas sob ultrassom, utilizando 2% de enzima e variando-se o tempo de reao.

Tabela 14: Resultados das reaes realizadas no ultrassom com 2% de enzima a 700 rpm e com variao do tempo reacional. Experimentos 1 2 3 4 5 6 Tempo 1h 1h 30 min 2h 3h 4h 30 min 6h % Acidez 14 29 18 27 27 19 % MAG 3 2 3 2 1 1 % DAG 35 26 25 18 16 14 % TAG 47 42 52 53 55 66

Observa-se que o rendimento de DAG no ultrassom foi maior no tempo de 1h. Os resultados obtidos aqui esto de acordo com avaliaes similares da literatura como o trabalho de Liu et al (2008), onde os pesquisadores concluram que na hidrlise do leo de soja em sistema livre de solvente o rendimento das reaes foram aumentados em 94% (1 h), 64% (2 h), 58% (3 h), 41% (4 h) e 34% (5 h) a mais do que nas condies de agitao em banho termostatizado, devido ao ultrassom induzir a uma melhor disperso e diminuir a aglomerao da enzima (LIU et al., 2008).

53

O aumento do tempo da reao no ultrassom levou a uma diminuio no rendimento de DAG. Este resultado de difcil interpretao. Provavelmente este sistema desnatura a enzima e sob as condies de ultrassom haja uma tendncia ao equilbrio qumico. Porm, estes efeitos no foram explorados neste trabalho. Ainda avaliando o efeito da irradiao de ultrassom, foram feitos testes controlando a temperatura do banho com a adio de gelo e mantendo-a aproximadamente 30C e diminudo a agitao para 150 rpm, Tabela 15. Tabela 15: Resultados das reaes no ultrassom, 150 rpm e temperatura controlada (30C). Experimentos 1 2 3 4 5 6 Tempo 1h 1h 30 min 2h 3h 4h 30 min 6h % Acidez 21 33 23 28 26 27 % MAG 3 9 3 1 1 1 % DAG 34 48 44 22 24 20 % TAG 41 9 29 49 49 51

Novamente os melhores rendimentos em DAG foram obtidos em menores tempos de reao. Abaixo esta apresentado o Cromatograma 5 da reao com melhor rendimento de DAG.

54

Cromatograma 5: Cromatograma da reao com melhor rendimento, Experimento 2, Tabela 15.

WEN et al (2006) usaram ultrassom para acelerar a esterificao do cido palmtico com vitamina C na presena de cido sulfrico para obter palmitato de L-ascorbila e reduziram o tempo de reao de 36 horas para 2 horas aumentando o rendimento de 85% para 93%. Os autores concluiuram que a acelerao da reao com o uso do ultrassom se deve ao fenmeno de cavitao, pois este acelera a transferncia de massa e refora o contato entre os reagentes. Ainda relata que a temperatura da reao controlada pela gua que circula em torno do reator, e a energia de cavitao transferida para o reator atravs da gua e que a temperatura entre 30 e 35C seria a melhor para o mximo de cavitao em gua (WEN et al., 2007). Portanto, o melhor rendimento de DAG ter sido em banho de ultrassom com temperatura controlada, pode ser explicado pelo fato de a intensidade da cavitao, ser favorecida pelas temperaturas baixas. O aumento da temperatura reduz a intensidade do colapso, isto pode ser devido ao aumento da presso de vapor e difuso de vapor para o interior da bolha (INCE et al., 2001).

4.3 Imobilizaes da lipase Lipozyme TL 100 L

O desenvolvimento de tcnicas de imobilizao tem sido importante para a obteno de biocatalisadores com atividade e estabilidade que no sejam afetadas durante o processo em comparao sua forma livre. As lipases so muito utilizadas em sntese orgnica devido sua grande 55

disponibilidade e baixo custo, condies suaves de sntese, facilidade de uso porque no necessitam cofatores e ampla especificidade para substratos (DALLA VECCHIA, 2004). Com o intuito de tornar o processo mais barato com o uso do biocatalisador, foram feitos testes com a lipase comercial de Thermomyces lanuginosa, imobilizada no laboratrio, nas reaes de hidrlise do leo de palma. Dois suportes foram utilizados na imobilizao: carvo ativado e polianilina (sintetizada no laboratrio). Na Figura 13 mostrado o espectro de infravermelho obtido para o polmero sintetizado. Hagiwara et al (1988) e Tang et al (1988) analisando espectros de infravermelho desses polmeros (polianilinas), destacam as bandas 3444 cm-1 referente ao estiramento N-H, a 1588 cm-1 relacionada a estrutura quinide, 1544 cm-1 relacionadas ao estiramento de anel benzeno e a banda a 1140 cm-1 relacionada ao grau de protonao (ZHANG et al., 2001 e SILVA et al., 2005).
28 26 24 22
707 642 595 881 1597 1306 1244

20
%Transmittance

18 16 14 12 10 8 6 4 4000 3500
3409 3236

3000

2500

2000

1500

1501

1150

1000

818

500

Wavenumbers (cm-1)

Figura 13: Espectro de infravermelho da polianilina. A PANI sintetizada para este trabalho encontra-se em estado de oxidao intermedirio, apresentando todas as caractersticas do composto p-polifenilenoaminaimina, na sua forma de sal, amplamente conhecida como 56

505

cloridrato de poliesmeraldina. Este composto tem a unidade repetitiva 50% oxidada e 50% reduzida (WEN et al., 2007). O carvo ativado utilizado para este trabalho encontrava-se na forma de p. A quantidade de protena da preparao comercial da lipase livre de origem microbiana Thermomyces lanuginosus tambm foi determinada. A preparao continha 22,23 mg de protena por mL. Antes de partir para as imobilizaes, determinou-se o perfil cintico

da reao de hidrlise do leo de oliva catalisada pela Lipozyme TL 100L, com quantidades diferentes de protenas (0,07 e 4,36 mg/ml) revelando que at cerca de 7 minutos a reao ainda estava em condio de velocidade inicial e que portanto a titulao da reao em 5 minutos era representativa da atividade enzimtica, Grficos 4 e 5.
200
[Produto]

150 100 50 0 0 2 4 Tempo (min) 6 8 y = 23,793x R2 = 0,986

Grfico 2: Grfico de velocidade inicial da reao de hidrlise com leo de oliva usando-se a enzima livre LipozymeTL100L contendo 0,07 mg de protenas.

57

600 500
[Produto]

400 300 200 100 0 0 2 4 Tempo (min) 6 8 y = 73,967x R2 = 0,9974

Grfico 3: Grfico de velocidade inicial da reao de hidrlise com leo de oliva, usando-se a enzima livre LipozymeTL100L contendo 4,36 mg de protenas.

Partiu-se para as imobilizaes por adsoro em carvo ativado e em polianilina. O procedimento de adsoro de protenas muito simples e um dos mtodos mais utilizados. A enzima imobilizada em um suporte slido por ligaes de baixa energia, tais como interaes de van der Waals ou hidrofbicas, ligaes de hidrognio e inicas, entre outras (DALLA VECCHIA, 2004). A imobilizao em carvo ativado foi realizada a temperatura de 25C em agitador orbital e em banho de ultrassom, sendo que os tempos de contato entre a soluo de enzima e o suporte foram os mesmos em ambos os casos, agitador e ultrassom. Assim, como a imobilizao em polianilina foi realizada sob agitao magntica e em banho de ultrassom. Os resultados das imobilizaes podem ser observados na Tabela 16.

58

Tabela 16: Resultados dos parmetros avaliados nas imobilizaes.

Imobilizaes Carga adsorvida mg/g Atividade imobilizada terica UH/g Reteno atividade real % Eficincia imobilizao PTN % Atividade imobilizada real UH/g PANI * PANI ultrassom Carvo** Carvo ultrassom 5,51 4,78 4,73 4,48 118,12 158 289,27 198,5 92,54 45,56 50,60 51,57 99,29 90,01 98,99 99,65 109,32 72 146,38 102,38

* polianilina imobilizada sob agitao magntica ** carvo imobilizado em agitador orbital.

A PANI imobilizada sob agitao magntica foi o suporte que apresentou melhor desempenho, observando a carga de protena adsorvida e a reteno de atividade, pois a atividade hidroltica real ficou bem prxima da atividade hidroltica terica. Porm, quando o suporte usado foi o carvo ativado imobilizado em agitador orbital, observa-se uma maior atividade hidroltica do suporte, sendo possvel dizer que nesta imobilizao a lipase apresentou melhor atividade. Considerando que na soluo inicial de enzima havia em torno de 5 mg de ptn por grama de suporte utilizado na imobilizao, observa-se que em todas as imobilizaes houve uma adsoro de praticamente toda a protena oferecida, por isso a eficincia da imobilizao com relao as protenas adsorvidas, mostrou-se muito boa neste sentido, ficando prxima de 100% em todos os casos. Os catalisadores so materiais altamente complexos. Um problema bsico em Catlise consiste em correlacionar o comportamento cataltico de um material e as suas propriedades. Por isso neste trabalho determinou-se a rea superficial, volume de microporos e rea de mesoporos dos catalisadores utilizados (polianilina e carvo ativado), seguindo o mtodo de BET, descrito no item 3.3.8. Os resultado obtidos esto expressos na Tabela 17.

59

Tabela 17: Resultados da anlise BET dos catalisadores. Suporte rea rea do poro rea Superficial m2/g superfcie BET m2/g externa m2/g Polianilina Carvo ativado 360.4821 531.6092 264.0794 354.7960 96.4027 176.8132

Volume de poro cm3/g 0.123383 0.169662

Observa-se que o carvo ativado apresenta uma rea superficial bem maior do que a polinanilina. Provavelmente, esta maior rea est relacionada a uma maior eficincia de imobilizao.

4.4 Reaes de hidrlise com Lipozyme TL 100 L imobilizada neste trabalho

Com as enzimas imobilizadas neste trabalho, foram realizados testes nas reaes de hidrlise do leo de palma. Na Tabela 18, os resultados das reaes de hidrlise com o suporte carvo ativado, podem ser observados. Os parmetros para estas reaes foram definidos a partir dos melhores resultados com a enzima comercial LipozymeTL IM, apresentados anteriormente. A quantidade de suporte imobilizado adicionado a reao variou entre 1, 2, 5 e 10% em relao a quantidade de leo e foram utilizadas as agitaes de 1300 e 700 rpm. Tabela 18: Reaes com Lipozyme TL 100L imobilizada em carvo ativado em agitador.
Experimentos ESup (p/V) 1 2 3 4 5 1 1 2 5 10 24 h 24 h 24 h 24 h 24 h 1300 700 700 700 700 Tempo Agitao % Acidez 8 10 13 4 5 % MAG 0,41 0,7 0,5 0,5 0,3 % DAG 10 16 17 20 20 % TAG 81 73 69 77 74

quantidade de enzima suportada.

60

De acordo com os resultados obtidos na Tabela 18, observar que os ndices de acidez nestas reaes mostraram-se bem inferiores em relao s reaes mostradas anteriormente com a lipase comercial imobilizada. A agitao de 1300 rpm (Experimento 1) no contribuiu de forma positiva no rendimento de DAG, quando comparada com a agitao de 700 rpm. Assim, como nas reaes com a enzima comercial, a quantidade de 2% de enzima mostrou um aumento no rendimento de DAG. Testes com 5 e 10% de enzima em relao quantidade de leo tambm foram feitos, estes mostraram uma aumento para 20% de DAG, o que demonstra o efeito do aumento da concentrao real de enzima. As reaes com a enzima imobilizada em carvo ativado no banho de ultrassom foram testadas em reatores de vidro com banho termostatizado a 60C, e somente com 1 e 2% (Tabela 19).

Tabela 19: Resultados quantitativos das reaes em banho termostatizado, com suporte imobilizado em banho de ultrassom.
Experimentos Enzima Tempo Agitao % Acidez 1 2 1% 2% 24 h 24 h 700 700 4 5 % MAG 0,3 0,4 % DAG 9 12 % TAG 87 82

Observa-se que os resultados para DAG foram maiores nas reaes em que o suporte carvo ativado foi imobilizado em agitador orbital (Tabela 18). Como para a enzima comercial LipozymeTL IM, os resultados das reaes realizadas em banho de ultrassom foram superiores a aqueles obtidos nas reaes sob aquecimento, aplicamos a melhor condio para reaes de hidrlise com o suporte imobilizado carvo ativado em agitador orbital. As seguintes reaes apresentadas na Tabela 20 foram feitas com base nas condies apresentadas na Tabela 15, Experimento 1.

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Tabela 20: Resultados das reaes de hidrlise realizadas em banho de ultrassom, com lipase imobilizada em carvo ativado em agitador orbital.
Experimentos Enzima (% p/v) 1 1 1h 30 min 2 2 1h 30 min 3 5 1h 30 min 4 10 1h 30 min 150 rpm 13 1,4 26 59 150 rpm 12 1,4 23 64 150 rpm 1,6 0,2 5 93 150 rpm Tempo Agitao % Acidez 0,4 % MAG 0,1 % DAG 4 % TAG 95

Pode observar que com cargas de 5 e 10% os rendimentos de DAG situam-se na faixa de 23 a 26%, o que um excelente resultado considerando o baixo custo do suporte. A avaliao da lipase imobilizada em PANI com agitao magntica. Nas reaes de hidrlise, foram realizadas em reatores de vidro, acoplados a um banho termostatizado, utilizando a temperatura de 60C.

Tabela 21: Resultados das reaes em banhos termostatizados com a lipase imobilizada em PANI com agitao magntica.
Experimentos Enzima (% p/v) 1 2 3 4 5 6 1 1 2 2 5 10 24 h 6h 24 h 6h 24 h 24 h Tempo Agitao rpm 700 700 700 700 700 700 % Acidez 0,9 0,7 1 2 2,5 % MAG 0,2 0,2 0,3 0,4 0,3 0,3 % DAG 5, 5 5 4 8 8 % TAG 94 94 93 94 92 90

A enzima imobilizada em PANI mostrou atravs dos resultados obtidos (Tabela 21) no ser eficiente na produo de DAG.

62

Observa-se que os rendimentos de DAG ficaram entre 3 e 8%, muito abaixo do que foi observado com carvo. Abaixo pode-se observar o Cromatograma 6, do Experimento 3, Tabela 21, como exemplo.

DAG

TAG

Cromatograma 6: Cromatograma Experimento 3, Tabela 18.

Tambm foi testada a enzima imobilizada sob agitao magntica em reaes sob ultrassom, com temperatura controlada, para reproduzir o mesma condio utilizada na reao que se obteve melhor rendimento de DAG, Tabela 15, Experimento 1. Tabela 22: Resultados das reaes de hidrlise realizadas em banho de ultrassom, com lipase imobilizada em PANI com agitao magntica.
Experimentos Enzima (% p/v) 1 1 1h 30 min 2 2 1h 30 min 3 5 1h 30 min 4 10 1h 30 min 700 rpm 0,2 4 96 700 rpm 0,2 7 93 700 rpm 3 0,3 7 90 700 rpm Tempo Agitao % Acidez 4 % MAG 0,3 % DAG 7 % TAG 89

Embora ainda muito baixos, de acordo com os resultados obtidos na Tabela 22, e comparando-os com os resultados da Tabela 21, novamente as 63

reaes realizadas em banho de ultrassom mostraram um rendimento superior aquelas realizadas em banho termostatizado. Neste caso, a concentrao de enzima no causou uma variao nos resultados como pode ser observado, Experimento 1, 2 e 3, Tabela 22.

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5. Concluses
Tendo como perspectiva a utilizao das lipases na modificao de leos e gorduras um estudo preliminar das reaes de hidrlise sob diferentes condies foi realizado. Como apresentado no captulo anterior, este estudo permitiu a comparao da reao de hidrlise do leo de palma com o uso de uma lpase comercial e de uma lpase imobilizada no laboratrio. De acordo com o estudo realizado neste trabalho algumas concluses podem ser apresentadas: - Para 2% de enzima Lipozyme TL IM 60C, 700 rpm os melhores rendimentos em DAG, foram obtidos chegando a 29%. - O uso do ultrassom mostrou ser eficiente, aumentando o rendimento de DAG e diminuindo o tempo de reao. Obteve-se 48% do rendimento em DAG em 1h e 30 min. - Na imobilizao da lipase livre Lipozyme TL100L os melhores resultados foram encontrados quando esta foi imobilizada em carvo ativo em agitador orbital, sendo que, neste caso, a atividade hidroltica real do imobilizado foi de 146,38 UH/g, reteno de atividade real de 50,6%, eficincia da imobilizao de 98,99% e protenas adsorvidas 4,72 mg/g. - Nas reaes com as enzimas imobilizadas, a imobilizao em carvo ativo apresentou os melhores resultados em rendimento de DAG (16%), sendo aquele que tambm apresentou maior atividade hidroltica.

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