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Validation interne des

mthodes
danalyses/dessais






DI.L.03-Version 0- Septembre 2007



Guide des laboratoires candidats laccrditation







Rf.


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SOMMAIRE



PARTIE I : ETUDE THEORIQUE...........................................................................................................................4
1 PREAMBULE............................................................................................................................................................4
2 PRESENTATION......................................................................................................................................................4
3 CONTENU DUN DOSSIER DE VALIDATION DUNE METHODE DANALYSE OU DESSAI.........4
4 LES CRITERES DE VALIDATION......................................................................................................................5
4.1 Spcificit...........................................................................................................5
4.1.1 Essai ou analyse............................................................................................6
4.1.2 Dosage..........................................................................................................6
4.1.3 Produit fini.....................................................................................................6
4.2 Linarit, exactitude, fidlit...............................................................................6
4.2.1 Dfinitions .....................................................................................................6
4.2.2 Conditions prliminaires (hypothses)...............................................................7
4.2.3 Linarit et exactitude .....................................................................................7
4.2.3.1 Etude statistique ...................................................................................7
4.2.4 Fidlit ........................................................................................................14
4.2.4.1 Introduction.........................................................................................14
4.2.4.2 Protocole de dtermination des critres de fidlit.............................15
4.2.4.2 Algorithmes de calcul des critres de fidlit......................................16
2.4.2.3 Formules pratiques de calcul ..............................................................20
4.2.4.3 Analyse statistique dcrite en termes doprations successives.........24
4.2.5 Vrification de la cohrence des erreurs de fidlit et dexactitude.....................25
4.2.5.1 Introduction...............................................................................................25
4.2.5.2 Comparaison des variances S
R
et S
E
...........................................................25
4.2.5.2.1 Critre utilis....................................................................................25
4.3 Sensibilit.........................................................................................................26
4.3.1 Dfinition.....................................................................................................26
4.3.2 Principe de la dtermination...........................................................................26
4.4 Seuil de dtection et seuil de quantification.....................................................29
4.4.1 Introduction..................................................................................................29
4.4.2 Seuil de dtection..........................................................................................29
4.4.2.1 Dfinition.............................................................................................29
4.4.2.2 Protocole destimation du seuil de dtection......................................29
4.4.2.3 Seuil de quantification........................................................................30
4.5 Robustesse......................................................................................................32
4.5.1 Introduction..................................................................................................32
4.5.2 Dfinition....................................................................................................32


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4.5.3 Conditions exprimentales et paramtres opratoires ........................................32
4.5.4 Choix des paramtres opratoires....................................................................33
4.5.5 Lintrt de ltude de la robustesse................................................................33
4.5.6 Plans dexprience ........................................................................................33
4.5.6.1 Test quatre essais ou analyses........................................................33
4.5.6.2 Test huit essais ou analyses............................................................36
4.5.6.3 Test seize essais ou analyses .........................................................39
4.5.7 Exploitation des rsultats ...............................................................................40
5 ANNEXE...................................................................................................................................................................42
PARTIE II : ETUDE DU CAS..................................................................................................................................44
1 VALIDATION DE LA METHODE DE DOSAGE............................................................................................44
1.1 Introduction......................................................................................................44
1.2 Description des conditions opratoires retenues .............................................44
1.2.1 Matriel .......................................................................................................44
1.2.2 Ractifs........................................................................................................44
1.2.3 Conditions opratoires...................................................................................45
1.3 Description de la validation..............................................................................45
1.3.1 Vrification de la linarit..............................................................................45
1.3.2 Vrification de lexactitude et de la rptabilit................................................45
1.3.3 Vrification de la reproductibilit interjour ......................................................46
1.4 Rsultats..........................................................................................................46
1.4.1 Linarit de la gamme de dosage ....................................................................46
1.4.2 Exactitude des mesures..................................................................................46
1.4.3 Rptabilit et reproductibilit interjour ..........................................................47
1.5 Conclusion.......................................................................................................47
















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PARTIE I : ETUDE THEORIQUE

1 Prambule

Valider en interne une mthode danalyse ou dessai cest dfinir ses caractristiques
(linarit, exactitude, fidlit, sensibilit, seuils de dtection et de qualification, robustesse) au
sein du laboratoire. Puis une analyse/un essai inter laboratoire permet de valider en externe.

Ce guide a t labor dans le but daider les responsables des laboratoires valider leurs
mthodes dessais et danalyse en vue de loctroi dune accrditation. Les critres de
validation des mthodes savoir la linarit, lexactitude, la fidlit, la sensibilit, les seuils
de dtection et de qualification, ainsi que la robustesse dune mthode danalyse/dessai sont
traits dans ce document. Lexploitation statistique des donnes brutes et la mise en uvre
dun protocole exprimental appropri permettent doptimiser le nombre danalyses/dessais
raliser pour satisfaire ces critres.
2 Prsentation

Une mthode dessai ou danalyse nest valide que si elle satisfait les critres de validation
dcrites ci-dessous. Il est noter que chaque mthode danalyses ou dessais ncessite un
ensemble de critres bien dfinis pour tre valide.

On fournira ici un protocole opratoire commun pour ltude de la fidlit, de la linarit et de
lexactitude.

Lobjet de ce document est de :

- proposer un traitement statistique suffisamment ouvert pour couvrir la plupart des cas
auxquels lanalyste pourra tre confront,
- optimiser les analyses/essais raliser, cest dire viter de multiplier les prises
danalyses/dessais conduisant un nombre important danalyses/dessais,

3 Contenu dun dossier de validation dune mthode danalyse ou
dessai

3.1 Une description dtaille, selon le plan normalis ISO 78-2, de la mthode permettant
toute personne comptente de lutiliser sans difficult majeure. Ce plan comporte :

Titre
Avertissement et prcautions de scurit


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Introduction
Objet et domaine dapplication
Rfrences normatives
Dfinitions
Principe
Ractifs et produits
Appareillage
Echantillonnage et prparation des chantillons
Mode opratoire dtaill
Expression des rsultats
Cas particuliers
Remarques
Rapport danalyses
Bibliographie
Annexes

3.2 Des archives concernant les donnes brutes et les rsultats de lvaluation servant
caractriser la mthode :

Spcificit
Linarisation
Exactitude
Fidlit
Seuils de dtection, de quantification et de sensibilit
Robustesse

Les mesures individuelles sont supposes indpendantes, de caractres alatoires et de
distribution normale. La vrification de la normalit repose sur des tests prliminaires. Les
tudes de linarit, dexactitude (ou de justesse) et de fidlit sont ralises simultanment
partir de solutions pures de lanalyte et de ses ajouts dans la matrice tudier selon la mme
dmarche afin de minimiser le nombre dessais ou danalyses raliser.

Ces tudes impliquent des rptitions sur plusieurs jours. Les solutions dtalonnage et de
rptabilit seront prpares chaque jour pour tenir compte de la variabilit inter laboratoire.

4 Les critres de validation

4.1 Spcificit

Une mthode dessais ou danalyse est dite spcifique lorsquelle permet de mesurer
quantitativement un paramtre physico-chimique ou un groupement fonctionnel dune ou de
plusieurs substances dans lchantillon.



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Cette caractristique est essentiellement une fonction du principe de mesure mais elle peut
varier en fonction de la classe du compos analyser ou de la matrice.
4.1.1 Essai ou analyse

Lorsquil sagit dessais ou danalyses, la spcificit reprsentera la garantie que toutes les
mthodes danalyses et / ou dessais excutes permettent une valuation de la teneur en
impurets de la substance analyser,
4.1.2 Dosage

Pour un dosage (teneur ou activit), la mthode sera dite spcifique lorsquelle permet
daffirmer que le signal mesur provient seulement de la substance analyser.

La spcificit peut sexprimer comme le degr de biais sur les rsultats, engendr par
lanalyse dchantillons comportant des impurets intentionnellement rajoutes, ou des
produits de dgradation, ou de substances structures chimiques proches, par rapport aux
rsultats obtenus sur des chantillons ne comportant pas ces additifs.
4.1.3 Produit fini

La spcificit reprsente ici la mesure du degr dinterfrences provenant dautres substances
prsentes dans la matrice complexe que peut reprsenter un produit fini.

4.2 Linarit, exactitude, fidlit
4.2.1 Dfinitions

Linarit : la linarit dune mthode danalyse ou dessai est sa capacit, lintrieur dun
certain intervalle, dobtenir des rsultats directement proportionnels la concentration
(quantit) en substance examiner dans lchantillon.
Justesse ou Exactitude : par abus de langage, on utilise parfois le mot exactitude au
lieu de justesse . Nous en rappelons ci-dessous les dfinitions normatives :

Lexactitude exprime ltroitesse de laccord entre la valeur qui est accepte soit comme une
valeur conventionnellement vraie, soit comme une valeur de rfrence accepte et la valeur
trouve obtenue en appliquant la mthode danalyse ou dessai un certain nombre de fois.

Justesse exprime ltroitesse de laccord entre la valeur moyenne obtenue partir de larges
sries de rsultats danalyse ou dessai et une valeur de rfrence accepte.
Lexactitude est le % de recouvrement entre la pese (ou concentration) retrouve et la pese
(ou concentration) introduite. Lutilisation de matriaux de rfrence (certifis) de mme
matrice est aussi un moyen de vrifier la justesse de ses mesures.



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Fidlit : la fidlit de la mthode danalyse ou dessai exprime ltroitesse de laccord entre
une srie de mesures provenant de multiples prises dun mme chantillon homogne dans
des conditions prescrites.
4.2.2 Conditions prliminaires (hypothses)

Les mesures individuelles y
ij
sont supposes tre indpendantes, de caractre alatoire et de
distribution normale.

Il est possible de raliser des tests a posteriori. En outre, les variances des mesures
individuelles lintrieur des groupes sont supposes former un ensemble homogne.
4.2.3 Linarit et exactitude

Effectuer N peses x
ij
rparties en k groupes de n, de telle sorte quelles soient peu diffrentes
lintrieur dun groupe mais quil existe entre eux, autant que possible une progression
arithmtique.
Les peses du groupe mdian doivent tre proches de la pese qui sera utilise en routine. A
chacune des peses correspond une observation y
ij
. Il est recommand de faire au minimum
cinq groupes de trois peses.

4.2.3.1 Etude statistique

Raliser, selon ce protocole, deux gammes :

-
une gamme dont D
1
est la droite de rgression linaire dquation :


y = b
1
x + a
1

- une gamme dont D
2
est la droite de rgression linaire dquation :

y = b
2
x + a
2


4.2.3.1.1 Linarit

Etude statistique et estimation dune droite de rgression linaire

Cette tude doit tre ralise sur les deux gammes. La droite est dtermine partir des
couples (x
ij
, y
ij
).
Soit y = Bx + A lquation de la droite de rgression relle inconnue. B est sa pente, A est son
ordonne lorigine. Les estimations recherches a et b de A et B correspondent une droite
dquation y = bx + a, qui est lestimation de la droite relle inconnue.


a- Calcul de la pente


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Lestimation de b sobtient en appliquant la mthode des moindres carrs : le but est de rendre
minimale la somme des carrs des carts (y
ij
y
ij
) entre les valeurs exprimentales y
ij
et les
valeurs estimes y
ij


b =




k
j
nj
i
k
j
nj
i
x xij
y yij x xij
1 1
1 1
) (
) .( ) (



Soient b
1
et b
2
les coefficients de rgression respectifs des droites D
1
et D
2

b- Calcul de lordonne lorigine (a)

Selon la mthode des moindres carrs, la droite de rgression linaire passe par le point de
coordonnes x et y , donc lquation suivante est vrifie :

a = y - b. x

Soient a
1
et a
2
les ordonnes lorigine des droites D
1
et D
2
.




c- Calcul du coefficient de corrlation (r)

Bien que les informations fournies par le coefficient de corrlation soient limites, sa
dtermination est aise. Soient :

-
Sx
ij
et Sy
ij
les carts types respectifs des variables x
ij
et y
ij
-

Sx
ij
y
ij
la covariance des variables x
ij
et y
ij



4Calcul de la covariance :



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Sx
ij
y
ij
=
) 1 (
) ).( (
1 1




N
y yij x xij
k
j
nj
i



4Calcul de coefficient de corrlation respectifs des droites D
1
et D
2
.


( )
j
i ij
j
i
j
i
Sy Sx y x S r . /


Soient r1 et r2 les coefficients de corrlation respectifs des droites D
1
et D
2
.



d- Tests de comparaison de lordonne lorigine avec 0

Soit Sa lcart type de lordonne lorigine, on vrifie lingalit :


) 2 ; ( N
t
Sa
a

p



avec t
( ; N-2)
lu dans le table de Student. Si cette ingalit est vrifie, on peut affirmer que
lordonne lorigine nest pas significativement diffrente de 0 au seuil de probabilit de
p = 1 - .

Soient Sa
1
et Sa
2
les carts types respectifs des ordonnes lorigine des droites D
1
et D
2
.


e- Comparaison des pentes des droites D
1
et D
2


Soient Sb
1
et Sb
2
les variances respectives des pentes b
1
et b
2
des droites D
1
et D
2
. La
comparaison des pentes b
1
et b
2
seffectue avec un test t :

t =
2 1 2 1
a S a S a a +


Si t <t ( ; N
1
+ N
2
4) lu dans le table de Student, on peut conclure que les ordonnes
lorigine des droites D
1
et D
2
ne sont pas significativement diffrents au risque .


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f- Analyse de la variance

f-1 Changement de variable

Ltude statistique qui suit ncessite le changement de variable suivant :

X
j
=
j
nj
i
ij
n
x

1


Y
ij
= b. (X
j
x
ij
) + y
ij


f-2 Test dhomognit des variances

Le test de Cochran est appliqu aux variances des Y
ij
pour vrifier lhomognit des
variances constitutives de lerreur exprimentale.


Le critre utiliser est :

C =

k
j
j
S
S
1

max

S
j
= variance du groupe suivante est vrifie : C < C
( ;k ;n-1)
, lensemble des variances des
diffrents groupes j peut tre considr comme homogne au risque .

f-3 Test de lexistence dune pente significative (Tableau 1)

Ce test consiste comparer les variations dues la rgression et aux erreurs (exprimentales
et dajustement) :

F
1
=
) 2 ; ; (
2
1

>
N k
F
S
S





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Si F
1
est significatif, on conclut lexistence dune pente, donc une dpendance linaire au
seuil de probabilit considr.

Tableau 1 - Test de lexistence dune pente significative.

Variations DDL Somme des carrs Variances F calcul
Variation totale N-1

,
_


k
j
nj
i
ij
Y Y T
1 1


Variation due
la rgression
1

,
_


k
j
j j
X X n b I
1

I S
I

Variation
rsiduelle
N-2

I T R ( )

2 / N R S
R

R I
S S F / 1


f-4 Test de validit de la droite de rgression (Tableau 2)

Ce test permet de comparer les erreurs dajustement (S
L
) et exprimentale (S
E
) :

F
2
=
) ; 2 ; (

k N k
E
L
F
S
S

f


Si F
2
nest pas significatif, lajustement est considr comme valide au seuil de probabilit
considr.







Tableau 2 Test de validit de la droite de rgression

Variations DDL Somme des carrs Variances F calcul
Erreur
exprimentale
N-k
( )



k
j
nj
i
j ij
Y Y E
1 1

( )

k N E S
E
/
Erreur de la
rgression
k-2

E R L ( )

2 / k L S
L

E L
S S F /
2



Mthodes de linarisation



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Il arrive que lon puisse utiliser le modle de rgression linaire simple. La reprsentation
graphique de couples dobservations peut suggrer un modle autre que le modle linaire
simple.

Dans la plupart des cas, on peut linariser ces modles laide de simples transformations sur
les variables.

Les modles suivants peuvent tre linariss :

- modles de forme exponentielle par une transformation logarithmique ;
- modles de forme rciproque avec :



y = 1/y

ou :

x = 1/x


4.2.3.1.2 Exactitude

Etude statistique

Considrer les recouvrements entre les peses retrouves grce au systme de rfrence
considr et les peses introduites.







Systmes de rfrence

a- Systme de rfrence considr : droite D
2


Effectuer le changement de variable suivant :

Y
ij
=
100 .
.
) (
2
2
ij
j i
x b
a y


Nous disposons ainsi de N valeurs y
ij
rparties en k groupes de n valeurs.


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b- Systme de rfrence considr : talon 100%

Soient x
100
et y
100
respectivement la pese et lobservation correspondant la solution de
rfrence. Effectuer le changement de variable suivant :

Yij = 100 100
. . y x x y
j i i
j


Cette mthode permet dvaluer lexactitude dans les conditions de dosage routinires.

Les tests suivants seffectuent quel que soit le systme de rfrence considr.

c- Vrification de lhomognit des variances lies : Test de Cochran

Effectuer le test de Cochran en considrant les valeurs Y
ij
pour vrifier lhomognit des
variances des diffrents groupes j. Le critre utiliser est :

k
j
j
S
S
C
1

max


S
j
= variance du groupe j ; Smax = variance la plus leve des k groupes j.

Si lingalit suivante est vrifie : C < C
( ; k-1; N-k)
, lensemble des variances des diffrents
groupes j peut tre considr comme homogne au risque .

d- Test de validit des moyennes (Tableau 3)

Ce test consiste comparer les erreurs intergroupes et intra-groupes


) , 1 , ( 3

k N k
E
c
F
S
S
F


p


Si F
3
nest pas significatif, on peut dire, au risque considr, que les variations des
observations entre les diffrents groupes sont dues aux erreurs exprimentales.

Tableau 3 Test de validit des moyennes



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Variations DDL Somme des carrs Variances F calcul
Variation totale N-1

,
_


k
j
nj
i
ij
Y Y T
1 1

( )

1 / N T S
T


Variation intra-
groupe
N-k
( )



k
j
nj
i
j ij
Y Y E
1 1

( )

k N E S
E
/

Variation inter-
groupe
k-1

E T C ( )

1 / k C S
C

E C
S S F /
3


e- Estimation du recouvrement moyen

Aprs avoir vrifi le test prcdent, il est possible de calculer la valeur de recouvrement
moyen et son intervalle de confiance I
Rm
pour t lu dans le table de Student au risque choisi :


nj
i
ij
k
j
j
Y
kn
Y
1 1
)
1
(


N
S t
Y I
t N
Rm
.
) 1 ; (
t



avec t
( ;N-1)
lu dans le table de Student.
4.2.4 Fidlit

4.2.4.1 Introduction

Les essais effectus sur des produits identiques, ne conduisent gnralement pas des
rsultats identiques. Cela est d lexistence derreurs caractre alatoire, inhrents toute
mthode dessai. Les facteurs susceptibles dinfluer sur le rsultat dun essai ne peuvent pas,
en effet, tre tous contrls. Dans linterprtation pratique des rsultats dun essai, il est
ncessaire de tenir compte de cette variabilit.

De nombreux facteurs (en dehors des erreurs de type systmatique) peuvent contribuer la
variabilit dune mthode dessai, comportant :

a- loprateur ;
b- lquipement utilis ;
c- ltalonnage de lquipement ;
d- lenvironnement (temprature, humidit, pollution de lair, ect.) ;
e- le temps;


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f- les ractifs
Cette variabilit est plus grande lorsque les essais comparer ont t effectus par des
oprateurs diffrents et / ou avec des instruments diffrents, que lorsquils ont t obtenus par
le mme oprateur utilisant le mme quipement.

La fidlit est un terme gnral sappliquant la variabilit entre des essais et / ou des
analyses rpts. Elle exprime ltroitesse de laccord (degr de dispersion) entre une srie de
mesures provenant de multiples prises dun mme chantillon homogne dans des conditions
dfinies.

Elle fournit une indication sur les erreurs dues au hasard. La fidlit sexprime par la mesure
de la reproductibilit et de la rptabilit. Ces deux mesures extrmes de la variabilit sont
suffisantes pour convenir la plupart des cas courants.

La rptabilit se rapporte des essais de la mme grandeur effectus dans des conditions
aussi stable que possible et des courts intervalles de temps dans un mme laboratoire, par un
mme oprateur employant le mme quipement. Tandis que la reproductibilit a trait des
essais effectus dans des conditions fortement variables, des jours diffrents, dans diffrents
laboratoires, avec des oprateurs diffrents et un quipement diffrent.

Lorsquon est dans des conditions de rptabilit, les facteurs a- et f- numrs plus haut sont
considrs comme constants et ne contribuent pas la variabilit, tendis que, dans les
conditions de reproductibilit, ces facteurs varient et contribuent la variabilit des rsultats
dessai et / ou danalyses.

La rptabilit et la reproductibilit sont donc deux extrmes, le premier mesurant la
variabilit minimale des rsultats et le second la variabilit maximale des rsultats.

4.2.4.2 Protocole de dtermination des critres de fidlit

Ltude peut tre ralise sur une forme reconstitue ou partir dune masse homogne du
produit fini.


4.2.4.1.1 Plan exprimental

Le plan exprimental recommand est reprsent dans le tableau 4.

On doit effectuer au moins k groupes de n essais et / ou analyses.

Tableau 4

Groupes dessais et/ ou danalyses
1 2 3 k
y
11
y
12
y
13
y
1k


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Essais et / ou
analyses
y
21
y
31
.
.
.
y
n1


y
22
y
32
.
.
.
y
n2

y
23
y
33
.
.
.
y
n3

y
2k
y
3k
.
.
.
y
nk



4.2.4.1.2 Conditions de rptabilit

A lintrieur de chaque groupe, les n essais et / ou analyses rpondent aux conditions de
rpitabilit, dans lesquelles les rsultats dessais et / ou danalyse sont obtenus avec la mme
mthode sur un chantillon initial homogne soumis lessai et / ou lanalyse dans le mme
laboratoire, par le mme oprateur utilisant le mme quipement, dans un court intervalle de
temps.

4.2.4.1.3 Conditions de reproductibilit

Les k groupes dessais rpondent aux conditions de reproductibilit, dans lesquelles les
rsultats dessais sont obtenus avec la mme mthode sur un chantillon initial homogne
soumis lessai et / ou lanalyse dans diffrents laboratoires, et / ou par diffrents oprateurs,
et / ou utilisant un quipement diffrent, des jours diffrents.

4.2.4.2 Algorithmes de calcul des critres de fidlit

4.2.4.2.1 Donnes manquantes, redondantes, aberrantes

a- Il peut arriver que dans un (ou plusieurs) groupe(s), un (ou plusieurs) rsultat(s) dessai et
/ ou danalyse soi(ent) manquant(s), par exemple par suite de la perte dun chantillon,
dune ngligence dans lexcution de lessai, etc.


b- A linverse, il peut arriver quun groupe comporte un nombre de rptitions dpassant les
n initialement prvues.

c- Enfin, lexprience montre que les valeurs aberrantes ne peuvent pas toujours tre vites
parmi les n rsultats dun groupe

4.2.4.2.2 Algorithmes

a- Transformations des donnes brutes en pourcentage de recouvrement

a.1 Systme de rfrence considr : droite D1


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a.1.1 Transformations des donnes brutes en quantits retrouves :

1
1
b
a y
X
j i
ij



a
1
et b
1
sont respectivement lordonne lorigine et la pente de la droite de rgression D
1
,
calcules prcdemment.

a.1.2 Dtermination des pourcentages de recouvrement :


ij
ij
ij
x
100



a.2 Systme de rfrence considr : talon 100%

a.2.1 Transformations des donnes brutes en quantit retrouves :


2
b
y
ij
ij



b
2
est la pente de la droite de rgression D
2
calcule prcdemment .

a.2.2 Dtermination des pourcentages de recouvrement :


ij
ij
ij
x
100 .



b- Moyennes des groupes

La moyenne m
j
des n
j
rptitions lintrieur du groupe j est donne par :


j
nj
i
ij
j
n
m

1
(1)


Rf.


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c- Dispersions lintrieur des groupes de mesures

La variance des rptitions lintrieur du groupe j est donne par :

1
) (

j
nj
i
j ij
j
n
m
S (2)

Nombre de degrs de libert NDL
j
= n
j
1. Lcart type lintrieur du groupe j est donn par
Sj.

d- Variance de rptabilit

d.1 Sous rserve que les variances des k groupes de mesures un ensemble homogne, on peut
calculer la variance de rptabilit par:


( ) [ ]
k n
S n
Sr
k
j
j
k
j
j j

,
_

1
1
. 1
(3)

Nombre de degrs de libert = ( k n
k
j
j

)
1

Cet algorithme est relatif au cas gnral, pour lequel les groupes nont pas le mme nombre de
mesures n
j
.


d.2 Lorsque tous les groupes ont le mme nombre de mesures n :

k
S
Sr
k
j
j

(3)

Nombre de degrs de libert = k (n - 1)

e- Variance intergroupes



Rf.


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e.1 Cas gnral (le nombre de mesures est diffrent dans chaque groupe) : on peut calculer
une variance intergroupes Sg qui traduit la dispersion existant entre les moyennes m
j
des
groupes :

[ ]
n
Sr
k
m m n
Sg
k
j
j j

1
) (

(4)

Dans cette relation, mest la moyenne des moyennes des groupes, que lon peut calculer par :

k
j
j
k
j
j j
n
m n
m
1
1
) . (
(5)
Enfin, n est le nombre moyen de valeurs par groupe, donn par :

( )
1
1
1
1
]
1

1
]
1

k
j
k
j
j
k
j
j
j
n
n
n
k
n
1
1
1

1
1


e.2 Cas particulier o tous les groupes ont le mme nombre de mesures n :

( )
n
Sr
k
m m
Sg
k
j
j

(4)


k
m
m
k
j
j

1
(5)


n n

f- Variance de reproductibilit

Elle est donne par :



Rf.


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Sg Sr SR + (6)

Il peut arriver que la valeur calcule pour Sg soit ngative. Ce cas peut se produire lorsque la
variabilit intergroupes nest pas significative vis--vis de la variance de rptabilit. Dans ce
cas, on remplace par zro la valeur ngative trouve.

g- Habituellement, on exprime les erreurs de rptabilit et de reproductibilit sous forme de
coefficients de variation.

g.1 Rptabilit :

m Sr CVr / 100

mest tir de (5) ou (5), Sr est tir de (3) ou (3).


g.2 Reproductibilit :

m SR CV
R
/ 100

mest tir de (5) ou (5), SR est tir de (6).

2.4.2.3 Formules pratiques de calcul

Les algorithmes (3) et (4) peuvent avantageusement tre remplacs par les formules suivantes,
dun usage plus pratique.






a- Cas gnral o le nombre de mesures est diffrent pour chaque groupe

a.1 On calcule les variables intermdiaires suivantes :

k
j
j j
m n T
1
. 1


Rf.


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( ) [ ]

k
j
j
k
j
j
k
j
j
k
j
j j
S nj T
n T
n T
m n T
1
1
1
1
. 1 5
4
3
. 2


a.2 On en dduit :
( )
3 / 1

4 3
) 1 ( 3
.
) 1 ( 3
1 3 . 2

3
5

T T m
Sg Sr SR
T T
k T
Sr
k T
T T T
Sg
k T
T
Sr

+
1
]
1

1
]
1


b- Cas particulier o le nombre de mesures est le mme pour tous les groupes

b.1 On calcule les variables intermdiaires :

k
j
j
k
j
j
k
j
j
S T
m T
m T
1
1
1
3
2
1


b.2 On en dduit :



Rf.


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( )
k T m
Sg Sr SR
n
Sr
k k
T kT
Sg
k T Sr
/ 1

) 1 (
1 2

/ 3



4.2.4.2.4 Vrification des hypothses de base

a- Conditions prliminaires

a.1 Les valeurs individuelles Y
ij
sont supposes tre indpendantes, alatoires, de distribution
normale.

a.2 Dautre part, on ne peut calculer la variance de rptabilit que dans la mesure o il
nexiste que de lgres diffrences entre les variances internes aux k groupes de mesures.
Lexprience montrant quil nen est pas toujours ainsi, un test est propos pour vrifier la
validit de cette hypothse.

b- Test dhomognit des variances lintrieur des groupes

Dans la pratique, plusieurs tests sont susceptibles dtre utiliss cet effet, savoir :
- le test dhomognit de Bartlett,
- le test de la variance maximale de Cochran

Dans le prsent document, on sen tiendra lutilisation du test de Cochran, qui convient bien
dans la majorit des cas rencontrs et qui, en outre, est simple dutilisation.

Test de Cochran

Les lments importants sont les suivants :

ce test ne sapplique quaux chantillons tirs de populations normales ou voisines de la
normale,

le critre utiliser est :

k
j
j
S
S
C
1

max



Rf.


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Smax : plus grande des variances S
j
des k groupes de mesures,

le critre ne sapplique strictement que lorsque toutes les variances sont calcules partir
du mme nombre de rptitions ; en pratique, ce nombre peut lgrement varier en raison des
donnes manquantes, redondantes ou aberrantes ; dans le prsent document, on admet
cependant que, dans un essai et /ou une analyse correctement organis, de telles variations
dans le nombre de rptitions sont limits et peuvent tre ignores, le critre de Cochran tant
alors appliqu en prenant pour n la moyenne arrondie des nombres dobservations n
j
des k
groupes ;
Le critre calcul C peut se trouver dans lun des trois cas de figure suivants :

- C est infrieur la valeur critique de la table au seuil de 5%, le test de Cochran nest pas
significatif, lensemble des variances peut tre considr comme homogne ;
- C est compris entre les valeurs critiques de la table aux seuils de 5 et 1%, la valeur la plus
leve des variances est dite suspecte ,
- C est suprieur la valeur critique de la table au seuil 1%, la valeur la plus leve des
variances est dite aberrante .

Lorsquon se trouve dans lun des deux derniers cas de figure, il y a lieu, avant toute chose, de
vrifier si la variance suspecte ou aberrante nest pas la consquence de la prsence
dans le groupe de mesures correspondant dune valeur elle-mme suspecte ou
aberrante .

c- Test de recherche des mesures aberrantes

c.1 Tests les plus courants

Dans la pratique, deux tests sont susceptibles dtre utiliss cet effet :

Le test de Dixon,
Le test de Student

Dans le prsent document, on sen tiendra lutilisation du test de Dixon, qui convient bien
aux petites sries (n compris entre 4 et 10).

c.2 Test de Dixon

On commence par classer les observations par ordre croissant : Y
1
, Y
2
, Y
3
, Y
4
,Y
n
. La
mesure incrimine est soit Y
1
, soit Y
n
. Parmi ces deux valeurs, on choisit celle qui scarte le
plus de mdiane. On rappelle que la mdiane dune srie de mesures est obtenue comme suit :

- Lorsque le nombre des mesures individuelles est impair, la mdiane correspond la valeur
centrale des donnes classes,


Rf.


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- Lorsque le nombre des mesures individuelles est pair, la mdiane correspond la
moyenne arithmtique des deux valeurs centrales des donnes classes.

c.2.1 Le critre utiliser est :

-
1 1 2
/ Y Y Y Y Q
n
, si la mesure incrimine est Y
1
;
-
1 1
/ Y Y Y Y Q
n n n


, si la mesure incrimine est Y
n
.



c.2.2 Le critre calcul Q peut se trouver dans lun des trois cas figure suivants :

- Q est infrieur la valeur critique de la table au seuil 5% , le test de Dixon nest pas
significatif ; aucune observation ne peut tre suspecte ;
- Q est compris entre les valeurs critiques de la table aux seuil 5 et 1% ; dans ce cas, la
valeur incrimine est dite suspecte
- Q est suprieur la valeur critique de la table au seuil 1% dans ce cas, la valeur incrimin
est dite aberrante .

c.2.3 Dans le cadre de lessai visant estimer les critres de fidlit, le test Q de Dixon ne
devrait tre appliqu que lorsque le test de Cochran sur les variances a dj indiqu une
anomalie sur lune dentre elles.

d- Stratgie rsultant de lutilisation simultane des tests de Cochran et Dixon

Dans la pratique, on applique donc la dmarche suivante :

d.1 on applique le test de Cochran, qui teste la plus grande de k variances des groupes de
mesures (cest dire S) ;

d.2 si le test de Cochran nest pas significatif au seuil de 5% ny a pas lieu de suspecter cette
variance ;

d.3 si la valeur C de Cochran est comprise entre les valeurs critiques de la table aux seuils 5 et
1%, la variance S max est considre comme provisoirement suspecte ; de la mme
manire, si la valeur C de Cochran est suprieure la valeur critique au seuil 1% , la variance
Smax est considre comme provisoirement aberrante ; dans ces deux derniers cas, il
convient dexaminer les valeurs individuelles du groupe correspondant Smax ;



4.2.4.3 Analyse statistique dcrite en termes doprations successives

Indiquer lobjectif de lessai,



Rf.


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Donner toutes les informations concernant :
- le plan exprimental utilis (que reprsentent exactement les groupes de mesures :
laboratoires et / ou oprateurs et / ou quipement) ;
- la prparation des chantillons ;
- la mthode danalyse.

Rassembler tous les rsultats dessais obtenus dans un tableau de donnes transformes, en
explicitant le nombre de rptitions par groupe k et le nombre de rptitions par groupe n.

Etablir le tableau des moyennes.

Etablir le tableau des variances
Appliquer le test de Cochran : relever les valeurs critiques de la table de Cochran pour k et n
moyen aux seuils 5 et 1%

Appliquer le test de Dixon au groupe associ la plus grande variance.

Dnombrer le nombre de mesures limins dans chaque groupe et au total

calculer les paramtres de fidlit Sr, Sg, SR, calculer galement la moyenne gnrale m et
le nombre moyen de dterminations par groupe n.

4.2.5 Vrification de la cohrence des erreurs de fidlit et dexactitude
4.2.5.1 Introduction

Les modles statistiques utiliss pour la fidlit et lexactitude conduisent respectivement
une estimation de la variance de reproductibilit S
R
et de lerreur exprimental SE. Il
convient de vrifier que les deux estimations S
R
et S
E
sont cohrentes.
4.2.5.2 Comparaison des variances S
R
et S
E


On utilise le test de Fisher

4.2.5.2.1 Critre utilis

On calcule
E
R
S
S
Fcal



n
1
= NDL
R
degrs de libert
n
2
= NDL
E
degrs de libert



Rf.


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4.2.5.2.2 Hypothse teste

Le test est bilatral

a- Lhypothse nulle H
0
(galit des variances) est accepte si :

( ) [ ] [ ] 2 ; 1 ; 2 ; 1 ; 1 n n F Fcale n n F p p

avec : [ ] 2 ; 1 ; n n F valeur de la table de Fisher au seuil =0.025 ; ( ) [ ] 2 ; 1 ; 1 n n F valeur
de la table de Fisher au seuil 1- = 0,975.

En revanche, si [ ] 2 ; 1 ; n n F Fcale f , on doit admettre que la variance provenant du modle
fidlit est plus grande que la variance provenant du modle linarit ; et si
( ) [ ] 2 ; 1 ; 1 n n F Fcale p , on doit admettre que la variance provenant du modle fidlit est
plus petit que la variance provenant du modle linarit. Dans lun ou lautre de ces cas, on
devra interprter cette anomalie .

b- Remarque

En gnral, la table de Fisher ne donne pas directement la valeur de ( ) [ ] 2 ; 1 ; 1 n n F . On
pourra nanmoins facilement lobtenir partir de la relation suivante :

( ) [ ] [ ] 1 ; 2 ; / 1 2 ; 1 ; 1 n n F n n F


4.3 Sensibilit
4.3.1 Dfinition

La sensibilit est la capacit de la mthode danalyse denregistrer de faibles variations de la
concentration. Variation minimale quil faut imposer la grandeur X dterminer pour
obtenir une variation significative du signal mesur y.

4.3.2 Principe de la dtermination

Soient deux concentrations X
1
et X
2
auxquelles correspond deux valeurs vraies Y
1
et Y
2
du
signal . Ces deux signaux sont estims par des valeurs mesures y
i
et y
j
. Il est possible
dcrire :

4.3.2.1 pour une valeur donne de :

X = X
1
correspond une valeur mesure du signal y
i
= Y
1
+ e = f (X
1
) + e
X = X
2
correspond une valeur mesure du signal y
j
= Y
2
+ e = f (X
2
) + e


Rf.


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e et e sont des termes alatoires qui reprsentent les fluctuations des mesures du signal ;

On suppose quils sont distribus normalement :

- de moyenne m = 0 sil ny a pas derreur systmatique, cest dire quen moyenne y
donne Y ;
- et dcart type qui traduit la plus ou moins grande prcision de la mesure ou lamplitude
des fluctuations ;

4.3.2.2 la diffrence observe entre deux mesures y
i
et y
j
est donn par lexpression :

y
i
y
j
= (Y
1
Y
2
) + (e- e)

dautre part :

Y
1
- Y
2
= b (X
i
X
2
) (diffrence vraie)

B : pente de la droite de rgression.
La diffrence e e est distribue normalement :

- de moyenne m = 0 ;
- dcart type 2 .
Remarque : il est suppos lgalit des variances
1
et
2
des deux termes alatoires ; la
variance de la distribution normale de la diffrence e - e est gale
1
+
2
= 2 .

Les diffrences des valeurs des signaux mesurs (yi yj) sont distribues normalement :

- de moyenne : Y
1
Y
2
= b (X
1
X
2
)
- dcart type gal 2 .

La loi de distribution de la diffrence des valeurs mesures y
i
et y
j
, ainsi dfinie, va permettre
de dterminer limportance de lcart observ partir duquel les valeurs X
1
et X
2
sont
diffrentes.

4.3.2.3 Risque sur la conclusion

- Risque de premire espce fix = 0,05 (5 %) : dclarer que lcart observ y
i
y
j
correspond des concentrations X
1
et X
2
diffrentes alors que dans la ralit elles sont
gales.
- Risque de deuxime espce fix = 0,05 (5%) : dclarer que lcart observ y
i
y
j

correspond des concentrations X
1
et X
2
gales alors que dans la ralit elles sont
diffrentes.



Rf.


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Supposons X
1
= X
2
Y
1
Y
2
= 0 Y
1
= Y
2



Les diffrences des valeurs des signaux mesurs (y
i
y
j
) sont distribues normalement :

- de moyenne m = 0 ;
- dcart type gal 2 .


On utilisant la variable rduite ( ) 2
j i
y y , nous savons que pour un risque bilatral
donn, les signaux fluctuent dans lintervalle :

y = ( ) 2 2 / 1

Sachant que : Y/ X = b X = ( ) ( ) b / 1 2 2 / 1

Pour = 0,05 ( ) 96 , 1 2 / 1

Supposons X
1
X
2
Y
1
Y
2
0 Y
1
Y
2


Les diffrences des valeurs des signaux mesurs (y
i
y
j
) sont distribus normalement :
- de moyenne Y
1
Y
2
= b (X
1
X
2
) ;
- dcart type gal 2 .

La diffrence d que nous pouvons mettre en vidence entre deux signaux Y
1
Y
2
(d = Y
1

Y
2
) pour un risque (bilatral) et un risque (unilatral) est :

( ) ( ) [ ] 2 1 2 / 1 2 1 + Y Y

Sachant que :

Y/ X = b X = ( ) ( ) [ ] ( ) b / 1 . 2 / 1 2 / 1 +

Pour = 0,05 (1 - /2) = 1,96
Pour = 0,05 (1 - ) = 1,64

Lcart type et la variable rduite doivent tre remplacs respectivement par des valeurs
estimes S
E
et t :

- S
E
est la racine carre de la variance exprimentale calcule dans lAnvar de la linarit ;
- T (1 - /2) et (1 - ) dpendent du nombre de degrs de libert (Anvar de la linarit) et de
la valeur des risques choisis ( = 0,05 bilatral et = 0,05 unilatral)


Rf.


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Formule propose pour la sensibilit :

( ) ( ) [ ] ( ) b S t t X X
E
/ 1 . 2 1 2 / 1
2 1
+

Si lcart type S
E
a t estim partir de n = 10 mesures, les valeurs de t sont les suivantes :

- t = 2,262 ( = 0,05) bilatral ;
- t = 1,833 ( = 0,05) unilatral.

4.4 Seuil de dtection et seuil de quantification

4.4.1 Introduction

Les seuils de dtection et de quantification sont des critres de validation pour les essais de
teneur en impurets. Pour quelque un, Le seuil de dtection est requis pour les tests limites
des impurets ou des produits de dgradation, et le seuil de quantification est requis pour le
dosage des impurets ou des produits de dgradation.

4.4.2 Seuil de dtection

4.4.2.1 Dfinition

Cest la plus petite quantit dune substance examiner dans un chantillon pouvant tre
dtecter, mais non quantifi comme une valeur exacte. Le seuil de dtection est gnralement
un paramtre des essais limites.

Le seuil de dtection est exprim soit en concentration, soit en quantit, et drive de la plus
petite quantit x qui puisse tre dtecte avec une certitude suffisante pour une procdure
danalyse.

Suivant le type de procdure analytique, deux mthodes sont proposes :

- la mthode analytique fournit un enregistrement graphique ; le seuil de dtection est
estim partir du bruit de fond de lenregistrement ;
- la mthode analytique ne fournit pas denregistrement graphique, mais seulement des
valeurs chiffres ; le seuil de dtection est estim partir de ces valeurs.

4.4.2.2 Protocole destimation du seuil de dtection

Examen de lenregistrement



Rf.


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Effectuer un enregistrement de blanc danalyse, en suivant la procdure complte danalyse
sur un chantillon contenant lensemble des constituants, lexception de la substance
rechercher. Dterminer lamplitude maximale h
max
du signal sur une distance gale vingt
fois la largeur mi-hauteur du pic correspondant la substance rechercher.

Le seuil de dtection SD est estim par : SD = 3. h
max
.R
R tant le facteur de rponse quantit / signal (exprim en hauteur).

Exploitation de valeurs chiffres

Effectuer n mesures de blancs danalyse indpendants, sur des chantillons contenant
lensemble des constituants lexception de la substance rechercher. Calculer lcart type
S
blanc
. Le seuil de la substance est estim par :

SD = 3. S
blanc


Remarque

- Le facteur multiplicatif de 3 correspond un risque de 0,13 de conclure la prsence de la
substance recherche alors quelle est absente (faux positif, risque du premier genre risque
) ; le risque inverse de conclure faussement labsence de la substance alors quelle est
prsente est important (50 % risque du deuxime genre ou risque ); si on dsire abaisser
le risque, il faut utiliser un facteur suprieur 3 ;
- La formule gnrale du seuil de dtection est : SD = m
blanc
+ (3. S
blanc
); la moyenne des
mesures des blancs est m
blanc
; pratiquement, m
blanc
= 0 si le blanc est dduit de chaque
mesure (auto-zro).

4.4.2.3 Seuil de quantification

Dfinition

Cest la plus petite quantit dune substance examiner pouvant tre dose dans les
conditions exprimentales dcrites avec une fidlit et une exactitude dfinies.

Protocole de dtermination

a- Examen denregistrement

Le seuil de quantification est estim par :

SQ = 10. H
max
.R

b- Exploitation de valeurs chiffres

Le seuil de quantification est estim par :


Rf.


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SQ = 10 . S
blanc




c- Fidlit et exactitude

Le protocole est identique dans tous les cas. Prparer n chantillons indpendants (n 6)
contenant la substance quantifier la concentration SQ et effectuer la procdure analytique
sur chaque chantillon.

c.1 Fidlit

La fidlit (rptabilit) est reprsente par le coefficient de variation :

avec
( )
1

100 .

n
m y
S
m
S
CV
i


m tant la moyenne des valeurs. Si la valeur de CV obtenue est considre comme trop
importante, on peut refaire une srie de mesures un niveau k.S
blanc
, k tant suprieur 10.

c.2 Exactitude

Au taux de recouvrement moyen R
m
peut tre associ lintervalle de confiance :

( )
n
t CV
R I
n
m m R
1
.

t

avec :

SQ
m
R
m
100 .



Domaine de quantification

SQ reprsente la limite suprieure du domaine possible de quantification. Ltude de ce
domaine peut tre ralise selon les rgles gnrales de validation dune mthode de dosage.



Rf.


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4.5 Robustesse
4.5.1 Introduction

Ltude de la robustesse permet de dfinir les variations admissibles de chacun des paramtres
opratoires critiques qui sont sans effet tudis indpendamment les uns des autres ou
regroups.

La robustesse ne serait rien dautres quune mesure de la reproductibilit des rsultats obtenus
dans des conditions opratoires normales, de laboratoire laboratoire, et mme dun analyste
lautre. On peut , alors, comparer cette reproductibilit la rptabilit de cette mme
mthode danalyse appliqu dans des conditions opratoires normales, la diffrence
reprsentant en quelque sorte la robustesse.

Ces considrations conduisent sintresser la stabilit dune mthode danalyse ou dessai
qui pourrait, alors, se dfinir par :

- linsensibilit de la mthode la prsence dautres composants constituant la matrice
(large slectivit) ;
- linsensibilit de la mthode lie la constance des rsultats lintrieur du domaine de
variations admissible de chaque paramtre opratoire critique par rapport sa valeur
nominale.
4.5.2 Dfinition

La robustesse dune mthode danalyse ou dessai est sa capacit rendre des rsultats exacts
en prsence de faibles changements de conditions exprimentales susceptibles de se produire
dans lutilisation de cette mthode.
4.5.3 Conditions exprimentales et paramtres opratoires

On entend par faible changement de conditions exprimentales tout cart dun paramtre
opratoire par rapport sa valeur nominale telle que dfinie dans la mthode danalyse ou
dessai . Les paramtres opratoires peuvent tre trs varis : pH du milieu, composition du ou
des ractif(s), conditions dextraction, tempratures, composition de la matrice, etc.
Lnumration nest pas exhaustive.

Les seuls paramtres opratoires considrer sont les paramtres quantifiables dont lcart
par rapport la valeur nominale est susceptible dinfluer sur le rsultat final. La complexit de
la mthode danalyse ou dessai augmente gnralement le nombre de ces paramtres.

Pour valuer la robustesse dune mthode danalyse et / ou dessai, on applique celle ci sur un
chantillon homogne en faisant varier les paramtres retenus. Si on utilise la technique
classique constituant faire varier chacun des paramtres, tout en maintenant les autres
constants, lopration est rapidement irralisable en raison du nombre des essais ou danalyses


Rf.


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effectuer. Il faut utiliser la technique des plans factoriels, qui fait varier plusieurs
paramtres en mme temps. Cette mthode permet de diminuer de faon importante le
nombre des essais ou danalyses. Il permet, en plus, ltude des interactions entre paramtres,
cest dire dpend de la modification simultane de deux ou plusieurs paramtres.
4.5.4 Choix des paramtres opratoires

A laide de ces plans, quatre essais permettront de tester deux paramtres, huit essais, trois ou
quatre paramtres et seize essais quatre ou cinq, tout en calculant les interactions des
paramtres entre eux.
Le premier paramtre introduit sera toujours la teneur en substance analyser, cause de ses
interactions possibles avec les autres paramtres. Ltude de reproductibilit permet dorienter
le choix des paramtres opratoires tudier grce aux carts observs. Ltude de ces carts
prcisera la valeur de lcart admissible de ces paramtres inclure dans les essais des plans
factoriels.
4.5.5 Lintrt de ltude de la robustesse

Outre la mise en vidence des qualits de stabilit dune mthode danalyse et / ou dessai en
prsence des changements de la matire doser ou de faibles changements des conditions
opratoires, lintrt majeur de la connaissance de la robustesse rside dans laide procure
lanalyste pour affiner un mode opratoire au niveau de certains paramtres opratoires
dterminants ou pour optimiser une mthode danalyse et / ou dessai au cours de son
dveloppement.

Les rsultats de lexploration de la robustesse dune mthode danalyse et / ou dessai,
lorsquils figurent dans un rapport de validation, apportent une aide lanalyste qui cherchera
valider un rsultat obtenu par lapplication de cette mthode ayant incidemment prsent
une variation sur un paramtre opratoire.
4.5.6 Plans dexprience

- Test quatre essais ou analyses
- Test huit essais ou analyses
- Test seize essais ou analyses






4.5.6.1 Test quatre essais ou analyses

Etude prliminaire



Rf.


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Ce test ne permet ltude que de deux facteurs, soit la teneur en substance doser, plus un
autre. Nous donnerons chacun des deux facteurs deux valeurs, placs symtriquement par
rapport la valeur nominale dans le dosage. Pour le premier facteur, nous utiliserons les
teneurs minimales et maximale en substance doser utilises pour la validation.

Les deux niveaux du deuxime facteur seront les maximales, en moins ou en plus, quil peut
subir accidentellement. Par exemple sil sagit dune dure de raction normalement gale
10 min, nous pourrons prendre 8 et 12 min.
Pour reprsenter les essais ou les analyses, on convient de symboliser par (-1) le niveau bas de
chaque facteur et par (+1), le niveau haut. Il est alors possible de rassembler tous les lments
de lexprimentation dans le tableau que lon appelle matrice dexprience ou matrice des
essais ou analyses (tableau 5).

Le plan factoriel, appel 2
2
, est rsum par le tableau 5. A est le premier facteur (la teneur de
la substance doser), B le deuxime et AB leur interaction.

Tableau 5

Numro dosage Facteur 1
A
Facteur 2
B
Interaction
AB
1
2
3
4
-
+
-
+
-
-
+
+
+
-
-
+

Le signe contenu dans les colonnes A ou B est celui de la dviation du facteur par rapport sa
valeur nominale. Celui de la colonne AB est le produit algbrique des signes des colonnes A
et B. Chaque ligne reprsente un essai ou analyse.

La composition des essais ou des analyses est symbolise dans la partie du tableau nomme
Facteur . Pour le premier essai ou analyse, les deux facteurs sont maintenus au niveau bas
(- -). Pour le deuxime, le premier facteur est au niveau haut et le deuxime au niveau bas
(+ -). Cest linverse pour lessai ou lanalyse 3 (- +). Le quatrime, enfin, a les deux facteurs
au niveau haut (+ +).

Les quatre essais ou analyses excuts en effectuant, sur un mme chantillon, quatre dosage
selon les modalits ci-dessus. La mesure analytique de chacun des dosages sera note y
1
, y
2
,
y
3
et y
4
.



Formule gnrale des effets

Nous rappelons y
1
, la rponse de lessai ou de lanalyse 1, y
2
, la rponse de lessai 2, etc.


Rf.


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Au niveau haut du premier facteur, il y a deux rponses, y
2
et y
4
. La moyenne des rponses au
niveau haut du premier facteur + y vaut :


( )
4 2
2
1
y y y + +


Au niveau bas du premier facteur, il y a galement deux rponses, y
1
, et y
3
, la moyenne des
rponses au niveau bas du premier facteur y est :

( )
3 1
2
1
y y y +


Leffet moyen du premier facteur A est, selon la dfinition, la moiti de la diffrence de ces
deux moyennes,

( )
4 3 2 1
4
1
y y y y A + +


On montrerait de mme que leffet du deuxime facteur B est donn par lexpression :

( )
4 3 2 1
4
1
y y y y B + +


Leffet de linteraction AB, cest dire leffet subi par mesure analytique lorsque A et B
varient simultanment, est

( )
4 3 2 1
4
1
y y y y AB + +


Leffet est gale la moyenne des rponses y, chacune tant munie du signe figurant dans le
tableau, lintersection de colonne correspondant leffet calcul et de la ligne ayant numro
de la rponse considre.


Nous calculons, ensuite, les limites de confiance des effets des paramtres et de leurs
interactions. Par exemple, pour leffet de B :



Rf.


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n
S
t B
D exp
t


et pour linteraction AB :

n
S
t AB
D exp
t


D
S
exp
est lcart exprimental des mesures, t est le coefficient de Student pour une probabilit
de 2 / 1 et le nombre de degrs de libert de
D
S
exp
et, enfin, n est le nombre dessais du test,
ici quatre (leffet est la moyenne de n rsultats individuels).

Si lintervalle de confiance de leffet dun facteur ou dune interaction contient zro, leffet de
ce facteur ou de cette interaction est considr comme nul. Si zro est lextrieur de
lintervalle, le rsultat de la mesure est influenc par la variation des facteurs en cause.

Si aucun effet (autre que celui de la teneur en substance doser) ne diffre significativement
de zro, la mthode tudie est stable vis--vis des variations des facteurs envisags, dans le
domaine de variation considr.

Si des facteurs, ou des interactions de facteurs, produisent un effet diffrent de zro, ces
facteurs devront tre fixs de faon prcise par le protocole de lanalyse.

Ces conclusions ne sont valables que si leffet des facteurs tudis est linaire par rapport
leur variations. Cest, en gnral, le cas pour un domaine de variation troit. Si le facteur
examin tait susceptible de varier dans un large domaine, il faudrait utiliser un plan
quadratique.

4.5.6.2 Test huit essais ou analyses

Ce test va nous permettre de dvelopper lusage des plans factoriels avec utilisation
d aliases . Le tableau 6 reprsente un plan 2
3
. Nous voyons quil permet de tester trois
paramtres, A, B et C, ainsi que leurs interactions deux deux. Linteraction des trois facteurs
entre eux, ABC, est aussi teste.





Tableau 6




Rf.


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Facteurs Interactions Numro
dEssai ou de
lanalyse
A B C AB AC BC ABC
1
2
3
4
5
6
7
8
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
-
+
-
+
+
+
-
-
-
-
+
+
-
+
+
-
+
-
-
+


Si lon na que trois facteurs tester, cest dire la teneur en substance doser, A, et deux
autres facteurs, on procde exactement comme pour le test quatre essais ou analyses. Huit
dosages sont effectus selon les modalits fournies par les colonnes paramtres du tableau
et les effets des facteurs et de leurs interactions sont calculs.

Par exemple :, leffet du facteur B :

( )
8 7 6 5 4 3 2 1
8
1
y y y y y y y y B + + + +


Puis leurs limites de confiances sont ensuite tablies. Par exemple, pour B :

8
exp D
S
t B t


Les conclusions tires du test sont les mmes que pour le test quatre essais ou analyses.

Les interactions du troisime ordre, telles que ABC, se produisent rarement ou, si elles
existent, sont habituellement ngligeables. Nous allons pouvoir utiliser la colonne
correspondante pour y placer un nouveau facteur. Cest la technique des aliases .
Lavantage du procd est de tester un facteur de plus sans augmenter le nombre des essais ou
des analyses. Linconvnient, cest que les interactions de ce nouveau facteur avec les
prcdents se retrouvent dans les autres colonnes.

Dans le cas du test huit essais ou analyses, si nous affectons un facteur D la colonne ABC,
les interactions seront les suivantes :

- colonne AB : interactions AB + CD ;
- colonne AC : interactions AC + BD ;
- colonne BC : interactions BC + AD ;


Rf.


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Si le test produit un effet significatif dans lune de ces colonnes, nous ne saurons pas sil faut
lattribuer lune ou lautre interaction, ou aux deux. Afin dviter ces ambiguts, le facteur
D sera choisi de telle faon quil nait pas, a priori, dinteraction avec les autres facteurs, ce
qui est souvent possible.

Pour prciser la mthode, donnons un exemple appliqu un dosage en chromatographie
liquide haute pression, aprs drivation de la substance doser.

Nous envisagerons quatre facteurs susceptibles de modifier la surface du pic
chromatographique : A, la teneur en substance doser ; B, la concentration en ractif ; C, la
dure de raction. Le quatrime facteur sera le pourcentage en mthanol dans le solvant
dlution. Linfluence de ce pourcentage sur la surface du pic parasite voisin et ne peut,
manifestement, interagir avec les autres facteurs. D sera donc affect la colonne ABC.

Nous ferons varier les facteurs dans un domaine correspondant aux variations accidentelles
plausibles. La concentration en ractif variera de t 10%, la dure de raction de t 1 min et le
pourcentage de t 3%. Les deux niveaux de la teneur en substance doser seront les teneurs
minimale et maximale utilises prcdemment.

Le tableau 7 reprsente ce plan factoriel. Le contenu de la colonne D est celui de la
prcdente ABC.

Tableau 7

Facteurs Interactions Numro
Essai ou
analyse
A B C D AB AC BC
1
2
3
4
5
6
7
8
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
-
+
-
+
+
+
-
-
-
-
+
+

On peut aliaser aussi les interactions du deuxime ordre, ce qui nous permet de tester
jusqu sept facteurs pour huit essai ou analyses mais, alors, les interactions deviennent
inextricables.


Nanmoins, nous donnons ci-dessous (tableau 8) le tableau dun tel test, avec les facteurs et
les interactions correspondant chaque colonne. La colonne D correspond, en plus,
linteraction du troisime ordre ABC.


Rf.


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Tableau 8

Facteurs A B C D E F G

Interactions
BE
CF
DG
AE
CG
DF
AF
BG
DE
AG
BF
CE
AB
CD
FG
AC
BD
EG
BC
AD
EF
Essai 1
Essai 2
Essai 3
Essai 4
Essai 5
Essai 6
Essai 7
Essai 8
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
-
+
-
+
+
+
-
-
-
-
+
+

Ce plan peut tre utile pour une premire tentative dapprciation de la robustesse. Si aucun
effet nest significatif, lexception de la teneur en substance doser, un deuxime plan
factoriel pourra, alors, mettre en vidence dautres facteurs ou interactions pouvant influer sur
lexactitude du rsultat.

4.5.6.3 Test seize essais ou analyses

Nous donnons une version de ce test utilisant un seul aliase correspondant linteraction de
quatrime ordre ABCD, attribue au facteur E. Les interactions de E avec les autres facteurs,
AE, BE, CE et DE se prouvent automatiquement aliases aux interactions du troisime
ordre, respectivement BCD, ACD, ABD et ABC, qui sont considres a priori comme nulles.

Le test permet donc la vrification de cinq variables et de toutes leurs interactions du
deuxime ordre, ce qui est en gnral satisfaisant dans la plupart des cas. Le plan factoriel est
reprsent dans le tableau 9.

On effectue seize dosages selon les modalits indiques par les signes de la colonne
facteur et dont les mesures analytiques sont y
1
, y
2
, y
3
, , y
16
.

Les effets des facteurs sont calculs selon le mme procd que prcdemment. Par exemple,
pour leffet du paramtre B :

( )
16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
16
1
y y y y y y y y y y y y y y y y B + + + + + + + +

Les effets des interactions sont galement calculs. Les limites de confiance des effets sont,
pour le facteur B par exemple :



Rf.


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16
exp D
S
t B t


Tableau 9

Facteurs Interactions Numro
Essais ou
Analyses

A B C D E

AB AC AD AE BC BD BE CD CE DE
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
-
+
+
-
-
+
+
-
+
-
-
+
+
-
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+

Les effets dont lintervalle de confiance contient zro sont considrs comme nuls.
4.5.7 Exploitation des rsultats

En dsignant par n le nombre des facteurs retenus, par A, B, , I leur dsignation, et par A,
B, , I leur cart respectif par rapport leur valeur nominale, on peut tablir
lorganigramme reprsent figure 1.









Rf.


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Procdure analytique X
Liste des facteurs opratoires
Facteurs opratoires retenus (n)
Facteur A : Teneur en
substance analyser
n = 2 n = 3 n = 4
Facteur B
Facteur B et C Facteur B, C et D
Dtermination
cart B
Dtermination
cart B C
Dtermination
cart B C D
Dtermination A = cart par
rapport la valeur nominale
Etablissement plan dexprience n
facteurs
Manipulation (2
n
essais ou analyses)
Calcul effet des facteurs et
interactions
Calcul limite de confiance des effets
des facteurs et interactions
Le rsultat de la mesure
est influenc par le
variation du facteur ou
de linteraction
Intervalle de
confiance du
facteur ou dune
interaction
contient zro
Effet du facteur ou
dune interaction
considre comme
nul
NON
OUI


Rf.


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5 Annexe
r : coefficient de corrlation,
x
ij
: valeur brute indpendante,
y
ij
: valeur brute dpendante,
h
max
: amplitude maximale du signal,
SD : seuil de dtection,
SQ : seuil de qualification,
R : facteur de rponse (qualit /hauteur du signal),
S
blanc
: cart type des mesures du blanc,
m
blanc
: moyenne des mesures du blanc,
S : cart type estim de n valeurs,
n
j
: nombre dobservations du groupe j,
m
j
: moyenne de n
j
valeurs du groupe j,
: risque de premire espce,
: risque de deuxime espce,
e : erreur de type alatoire,
Rm : taux de recouvrement moyen,
I
rm
: intervalle de confiance du recouvrement moyen Rm,
k : nombre de groupes,
NDL : nombre de degrs de libert,
N DL
j/
: nombre de degrs de libert du groupe j,
m : moyenne des moyennes des groupes,
n : nombre moyen de valeurs par groupe,
CV : coefficient de variation,
j : indice de groupe,
i : indice des valeurs individuelles dans le groupe j,
S
2
: variance
S
2
max : plus grande des variances,
N : nombre total dobservations y
ij
dans lensemble des k groupes,
Y
ij
: transforme de y
ij
,
X
j
: moyenne des valeurs x
ij
du groupe j,
Y
j
: moyenne des observations Y
ij
dans chaque groupe j,
x : moyenne gnrale des valeurs x
ij
des k groupes,
y : moyenne gnrale des observations y
ij
des k groupes,
X : moyenne des valeurs Xj des k groupes,
Y : moyenne des valeurs Y
j
des k groupes,
t : test de Student,
F : test de Fisher,
C : test de Cochran,
Q : test de Dixon,
y
1
,y
2
y
n
: mesures analytiques de dosages,


Rf.


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A, B : paramtres opratoires critiques,
AB, AC, BC : interactions entre deux paramtres A et B, A et C, B et C
ABC : interaction entre les trois paramtres A, B et C.
b : pente de la droite de rgression,
a : ordonne lorigine de la droite de rgression,








































Rf.


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PARTIE II : ETUDE DU CAS

Validation dune mthode analytique par CLHP / Test de robustesse et
validation de la mthode
P.Chaminade, S.Feraud, A.Baillet et D.Ferrier
Laboratoire de chimie analytique III, Centre de recherche et dtudes
pharmaceutiques.


1 Validation de la mthode de dosage

1.1 Introduction

Une procdure analytique de dosage peut tre valide par lintermdiaire des critres de
validation, qui sont :

- la spcificit,
- la linarit de la droite dtalonnage,
- lexactitude des rsultats fournis,
- la fidlit de la mthode qui rend compte de la rptabilit et de la reproductibilit,
- la sensibilit de la mthode

1.2 Description des conditions opratoires retenues

1.2.1 Matriel

- Pompe HPLC isocratique Jasco PU980.
- Colonne : Lichrospher C8 Select B 15 cm x 4,6 mm, particule de 5m.
- Dtecteur UV : Shimatzu SPD-SA (signal envoy 0,0005 AUFS).
- Intgrateur : HP3395 (Hewlett Packard).
- Balance Mettler lectronique AT100, sensibilit t 0,1mg.
- Verrerie de laboratoire classe A.

1.2.2 Ractifs

- Diactylcystinate de mthyle cristallis (Isochem, n de lot 18 M2163).
- Eau dminralise systme (Merck, rfrence 1462795).
- Mthanol Prolabo Normapur.


Rf.


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1.2.3 Conditions opratoires

- Phase mobile : mlange 20/80 de mthanol / solution de KH2PO4 4 g/l.
- Colonne : Lichrospher Select B 15 cm x 4,6 mm, particule de 5m.
- Dbit : 1ml/min.
- Longueur donde de dtection : 230 nm.
- Volume dinjection : 20 l.
- Prparation de lchantillon : craser soigneusement dans un mortier quatre comprims
provenant dun chantillon homogne, jusqu ce que le diamtre des particules soit
infrieur au millimtre. Introduire une prise dessai de 150 mg environ, exactement pess
au dixime de milligramme prs, dans une fiole jauge classe A de 100 ml. Dissoudre la
prise dessai dans du mthanol. Complter au trait de jauge par ce mme solvant,
homogniser et laisser dcanter les particules en suspension. Diluer cette solution au
3/25
e
dans une fiole jauge de 25 ml classe A avec la phase mobile prpare le jour
mme.
- Temps dquilibre de la colonne suprieur 3 h.

1.3 Description de la validation

- Cinq points de concentration croissante sont raliss, 0,5, 0,7, 1, 1,25 et 1,50 mg de
diactylcystinate de mthyle par millilitre. Les solutions talons sont obtenues par pese
dune masse de matire premire dissoute en fiole jauge de 100 ml dans du mthanol.
Une dilution au 3/25
e
est ensuite ralise dans de la phase mobile prpare le jour mme.
Les concentrations finales des solutions injectes sont de 0,06, 0,09, 0,12, 0,15, et 0,18
mg/ml.
- Trois injections conscutives sont ralises par point de gamme.

1.3.1 Vrification de la linarit

Cette vrification se fait sur des gammes de dosage ralises sur cinq jours. Une rgression
multiple est effectue sur tous les points de la gamme, et les tests de Fischer et Student
permettent dapprcier la linarit de la droite dtalonnage et la dpendance entre les deux
variables (signal en fonction de concentration).

1.3.2 Vrification de lexactitude et de la rptabilit

Cette vrification seffectue sur dix injections successives dun tmoin de concentration
provenant dun lot homogne de quatre comprims contenant du diactylcystinate de
mthyle, raison de 200 mg/comprim.




Rf.


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1.3.3 Vrification de la reproductibilit interjour

Cette vrification portera sur quatre jours dessais, durant lesquels, matin et aprs-midi, seront
injects trois fois un tmoin et un chantillon provenant de comprims.

1.4 Rsultats

1.4.1 Linarit de la gamme de dosage

Cinq gammes de dosage ont t ralises pendant cinq jours conscutifs, selon le protocole
dcrit dans le paragraphe 2.2. Sur chaque gamme, ont t tests :

- la dpendance entre le signal et la concentration (test de Fischer k-2, n-k degrs de
liberts),
- la linarit (test de Fischer k-2, n-k degrs de liberts),
- la comparaison de lordonne lorigine (test de Student n-2 degrs de libert).

Il est apparu, aprs des reprsentations graphiques, que la trs faible dispersion des points
obtenus pour une mme concentration faussait le test statistique. A chaque concentration
correspondait trois injections ralises dans un intervalle de temps infrieur 25 min, mais
plus de 2 h sparaient le premier point de la gamme du dernier, sans que cet cart de temps
ninflue sur la linarit de la gamme. En consquence, le premier test danalyse de variances
(variance de rgression / variance rsiduelle) tait satisfaisant, tandis que la comparaison de
lerreur exprimental et de lerreur dajustement concluait un dfaut de linarit.

Pour saffranchir de cette difficult statistique, la validation a t effectue sur lensemble des
cinq gammes, en prenant comme rponse par concentration la moyenne des trois signaux
obtenus. On obtient ainsi une gamme cinq points de concentration, analyss cinq jours
diffrents, pour laquelle tous les tests statistiques sont valides.

1.4.2 Exactitude des mesures

Les tests statistiques ont t effectus sur les diffrences entre les masses retrouves au
moyen du signal issu de la mthode de dosage et les masses rellement peses.

Deux tests sont effectus : une vrification de lhomognit des moyennes entre les
diffrents groupes de mesures, la comparaison de leur diffrence avec zro, et le calcul de
lintervalle de confiance accorder pour une masse trouve.

Les essais sur la matire premire valident lexactitude des mesures. Les essais concernant
lchantillon de comprims conditionns dans le blister PVC/aluminium prsentent une
variabilit intragroupe trs faible, qui peut expliquer la non validit de la concordance entre
les valeurs obtenues par les calculs partir des hauteurs de pics.


Rf.


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1.4.3 Rptabilit et reproductibilit interjour

Les calculs ont t effectus non pas sur les rsultats bruts, mais sur les facteurs de rponse,
puisque toutes les peses ntaient pas quivalentes.

Les coefficients de variation de rptabilit comme ceux de reproductibilit sont infrieurs
5%.

1.5 Conclusion

Cette mthode de dosage du diactylcystinate de mthyle par chromatographie liquide haute
performance prsente donc des critres analytiques valides.

Il semble, au vu des rsultats prcdents, quil est prfrable de travailler avec des surfaces
des pics plutt quavec des hauteurs.
































Rf.


DI.L.03
Version N 0

VALIDATION INTRENE DES
METHODES DANALYSES/DESSAIS Page 48 / 48



ANNEXE (Bibliographie)


(1) Guide de validation analytique Rapport dune commission SFSTP - I.Mthodologie-
Prsidents : J. Caporal- Gautier - S.T.P PHARMA PRATIQUES2 (4) 205 226- 1992

(2) Validation dune mthode analytique de dosage par CLHP Test de robustesse et
validation de la mthode S.T.P PHARMA PRATIQUES 5(1) 17-35 1995 par P.
Chaminade, S. Feraud, A. Baillet et D. Ferrier

(3) Guide de validation analytique Rapport dune commission SFSTP Exemples
dapplication Prsidents : J. Caporal- Gautier - S.T.P PHARMA PRATIQUES 2(4)
2276239 - 1992

(4) Validation dune mthode de dosage par chromatographie liquide D.Lecompte -
S.T.P PHARMA 2 (n hors srie) 843-849- 1986

(5) Validation dune mthode de recherche et dvaluation des impurets dun principe
actif - M.Gachon - S.T.P PHARMA 2 (n hors srie) 837-839- 1986

(6) La mthode des plans dexpriences Optimisation du choix des essais et de
linterprtation des rsultats Jacques GOUPY.

(7) ISO 5725-1 : 1994, Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats des mthodes de
mesure - Partie 1 : Principes gnraux et dfinitions.

(8) ISO 5725-2 : 1994, Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats des mthodes de
mesure - Partie 2 : Mthodes de base pour la dtermination de la rptabilit et de la
reproductibilit d'une mthode de mesure normalise.

(9) ISO 5725-4 : 1994, Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure
- Partie 4 : Mthode de base pour la dtermination de la justesse d'une mthode de
mesure normalise.