UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Microbiologa I

VAS ALTERNATIVAS DE PRESENTACIN DE ANTGENOS DEL VIRUS VACCINIA POR MHC DE CLASE I
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR

Silvia Lzaro Garca Bajo la direccin de los doctores Margarita del Val Latorre Salvador Iborra Martn

Madrid, 2013
Silvia Lzaro Garca, 2013

UNIVERSIDADCOMPLUTENSE MADRID FacultaddeMedicina DepartamentodeMicrobiologaI

Vasalternativasde presentacindeantgenos delvirusVacciniaporMHC declaseI

SILVIALZAROGARCA

TESISDOCTORAL MADRID2012

UNIVERSIDADCOMPLUTENSE MADRID FacultaddeMedicina DepartamentodeMicrobiologaI

Vasalternativasde presentacindeantgenos delvirusVacciniaporMHC de claseI

SILVIALZAROGARCA

TESISDOCTORAL MADRID2012


EstaTesisDoctoralhasidorealizadaenlaUnidaddeInmunologaViraldel Centro Nacional de Microbiologa del Instituto de Salud Carlos III y en el Centro de Biologa Molecular Severo Ochoa bajo la direccin de la Dra. MargaritadelValLatorreydelDr.SalvadorIborraMartn. Tutor:Dr.EduardoMartnezNaves

 Portada: Jonathan W. Yewdell, Eric Reits & Jacques Neefjes. Making sense of mass destruction: quantitating MHC class I antigen presentation. Nature Reviews Immunology3,952961(December2003)doi:10.1038/nri1250.


AmihermanoJavier

ndice

ndice
1.Abreviaturas...........................................................................................................6 2.Introduccin...........................................................................................................8
2.1.ProcesamientodeantgenospresentadosporMHCdeclaseIaCTL..............................8 2.1.1.Elproteasoma.................................................................................................................. 9 2.1.2.Aminopeptidasasyendopeptidasascitoslicasimplicadasenprocesamiento antignico........................................................................................................................ 12 2.1.3.Transportadoresdeantgenos....................................................................................... 15 2.1.3.1.Transportadorasociadoaprocesamientodeantgeno,TAP...................................15 2.1.3.2.MecanismosviralesdeinhibicindeTAP................................................................16 2.1.3.3.VasalternativasdetransportedepptidospresentadosporMHCdeclaseI.......17 2.1.3.4.AminopeptidasasdeREasociadasalprocesamientodeantgeno..........................18 2.1.4.Carboxipeptidasasdelavasecretoriaasociadasalprocesamientodeantgenos.......21 2.1.5.Endoproteasasvesicularesimplicadasenprocesamientoendgenodeantgenos. .....21 2.1.6.MolculasdelcomplejoprincipaldehistocompatibilidaddeclaseI............................24 2.1.7.Elcomplejodecarga...................................................................................................... 26 2.2.CaractersticasdelosligandosdeMHCdeclaseIindependientesdeTAP..................... 26 + 2.3.ActivacindelinfocitosTCD8 ..................................................................................... 28 2.4.Elvirusvaccinia............................................................................................................ 30 2.4.1.Elcicloreplicativodelvirus............................................................................................ 30 2.4.2.RespuestainmunefrenteaVACV.................................................................................. 33 2.4.3.EptoposdeVACVpresentadosporMHCdeclaseIalinfocitosTCD8+........................34 2.4.4.LosVACVrecombinantes(rVACV)enelestudiodelarespuestainmunecelulary comovectorvacunal................................................................................................................ 35

3. Objetivos............................................................................................................38 4. Materialesymtodos.........................................................................................40
4.1.Reactivos..................................................................................................................... 40 4.1.1.Mediosdecultivo........................................................................................................... 40 4.1.2.Productosqumicos........................................................................................................ 40 4.1.3.Productosinmunoqumicos........................................................................................... 42 4.1.4.Pptidos......................................................................................................................... 42 4.1.5.Lneascelularesyclulasprimarias............................................................................... 43 4.1.6.Virusvaccinia. ................................................................................................................. 44 4.2.Permeabilizacinreversibledeclulasconestreptolisinaoysaponina........................ 44 4.3.Infeccionesvirales........................................................................................................ 45 4.3.1.Produccin,purificacinytitulacindevirus................................................................45 4.3.2.Infeccionesviralesycoinfecciones................................................................................ 45 4.4.Inmunizacinderatones.............................................................................................. 46 4.5.LinfocitosT................................................................................................................... 46 + 4.5.1.PurificacindelinfocitosTCD8 apartirdeesplenocitosobtenidosexvivo................46

ndice

II

4.5.2.ObtencinymantenimientodelneasdeCTLpoliclonalesmonoespecficasde eptopos...................................................................................................................................47 4.5.3.EnsayosfuncionalesdepresentacindeantgenoaCTL..............................................47 4.5.3.1.EnsayodeICSconlinfocitosTobtenidosexvivoyconlneasdeCTL.....................48 4.5.3.2.Ensayosdecitotoxicidad.......................................................................................... 48 4.6.Anlisisestadsticosybasesdedatos........................................................................... 49

5.Resultados.............................................................................................................50
5.1.InhibicindeTAPmedianteICP47............................................................................... 50 5.1.1.PermeabilizacindeclulasconestreptolisinaOysaponina.......................................50 5.1.2.EfectodelainhibicindeTAPenlapresentacinantignicaempleandounrVACV queexpresaICP47.................................................................................................................... 52 5.1.3.EfectodelainhibicindeTAPenlapresentacindeuneptopopropiodeVACV empleandoelrVACVqueexpresaICP47................................................................................. 54 5.2.IdentificacinycuantificacindelapresentacinindependientedeTAPdeantgenos deVACV............................................................................................................................. 56 + 5.2.1.RespuestaprimariaespecficadelinfocitosTCD8 deficientesenTAPfrenteaclulas infectadasporVACV................................................................................................................ 56 5.2.2.RespuestaprimariaespecficadelinfocitosTCD8+silvestresfrenteaclulas deficientesenTAPeinfectadasporVACV............................................................................... 57 5.2.3.CuantificacinglobaldelapresentacindirectaeindependientedeTAPde antgenosdeVACV................................................................................................................... 62 5.3.IdentificacindeloseptoposdeVACVquesepresentandeformaindependiente deTAP................................................................................................................................. 63 + 5.3.1.RespuestaprimariadelinfocitosTCD8 especficosfrenteaeptoposindividualesde VACV. ........................................................................................................................................63 5.3.2.EstablecimientoinvitrodelneasdeCTLespecficasfrenteaeptoposdeVACV derivadasderatonesC57BL/6yreconocimientodeBMDCinfectadas..................................67 5.3.3.ReconocimientodeclulasinfectadasporlneasdeCTLespecficasfrenteaeptopos deVACVderivadasderatonesC57BL/6.................................................................................. 70 5.3.4.EstablecimientoinvitrodelneasdeCTLespecficasfrenteaeptoposdeVACV derivadasderatonesdeficientesenTAPyreconocimientodeBMDCinfectadas..................72 5.4.CaracterizacindelasvasdeprocesamientoantignicodeloseptoposdeVACV....... 74 5.4.1.Papelglobaldelproteasomaenelprocesamientoantignicoenclulasinfectadas porVACV..................................................................................................................................74 5.4.2.PapelglobaldelaTPPIIenelprocesamientoantignicoenclulasinfectadaspor VACV. ........................................................................................................................................75 5.4.3.IdentificacinyanlisisdeloseptoposdeVACVresistentesaLC................................76 5.4.4.CaracterizacindelprocesamientodeloseptoposdeVACVindependientesdeTAP enclulasdeficientesenTAP.Efectodedistintosinhibidores................................................79 5.5.AnlisisdelascaractersticasdeloseptoposdeVACV................................................. 83 5.5.1.Caractersticasdelasprotenasdeorigendeloseptopos............................................83 5.5.2.HidrofobicidaddeloseptoposdeVACV....................................................................... 86 5.5.3.MotivosdeanclajepreferencialesaMHCdeclaseI.....................................................88 5.5.4.Localizacindeloseptoposenlasprotenasdeorigen................................................89

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III

5.5.5.CaractersticasdeloseptoposdeVACVindependientesdeTAPasociadasala inmunodominanciaenratonesdeficientesenTAP.................................................................91 5.6.EstudiodelarespuestainmuneydelcontroldelainfeccinporVACVtrasla vacunacinenelmodelomurinodeficienteenTAP............................................................. 93 5.6.1.LainmunizacincondospptidosquesepresentandeformaindependientedeTAP aumentlarespuestaespecficadelinfocitosTCD8+frenteaunainfeccinposteriorcon VACVderatonesC57BL/6odeficientesenTAP...................................................................... 93 5.6.2.LavacunacinconlospptidosquesepresentandeformaindependientedeTAP controllainfeccinposteriorconVACVenratonesC57BL/6odeficientesenTAP. .............95

6.Discusin...............................................................................................................96
6.1.SistemadeinhibicindeTAPmedianteICP47.............................................................. 96 6.2.AnlisisglobaldelapresentacindeantgenosdeVACVporvasalternativas............ 97 6.3.IdentificacinycaracterizacindeloseptoposdeVACVquesepresentanporvas alternativasalinfocitosTCD8+............................................................................................ 98 6.3.1.Identificacinycaracterizacindelprocesamientoantignicoalternativodelos eptoposdeVACV..................................................................................................................... 98 6.3.1.1.EptopospresentadosporlavaclsicadependientedelproteasomaydeTAP....98 6.3.1.2.EptoposcuyapresentacinesdependientedeTAPperoresistenteainhibidores delproteasoma................................................................................................................... 100 6.3.1.3.EptopospresentadosindependientementedeTAP.............................................100 6.3.1.4.EptoposcuyapresentacinesindependientedeTAPperomediadaporel proteasoma......................................................................................................................... 103 6.3.2.AnlisisdelascaractersticasdeloseptoposdeVACVquesiguenvasalternativasde procesamientoypresentacinantignica............................................................................. 105 6.3.3.AnlisisdelascaractersticasdelasprotenasdeVACVdelasquederivanlos eptopos.................................................................................................................................107 6.4.RelevanciafisiolgicadelapresentacinindependientedeTAP................................114 7. Conclusiones................................................................................................................116 8. Bibliografa...................................................................................................................124

Agradecimientos

AGRADECIMIENTOS
EnprimerlugarquieroagradeceralaDra.MargaritadelValquedesdeelprimerdame animaseavenirmeaMadridydarmelaoportunidadderealizarmitesisdoctoralbajosu direccin, por darme libertad en la realizacin de los experimentos y por su comprensin en los momentos difciles durante estos 6 aos. Quiero agradecer enormemente la codireccin de Salvador Iborra, que me ayudado diariamente en el diseo y en la realizacin de los experimentos, por cederme tus ideas, por aportarme nuevas ideas cada da y por ensearme que sin esfuerzo no se consiguen resultados. GraciasporvacunaryprotegeramisratonesfrentealainfeccinporVACV. QuieroagradeceralaDraGabrielleNiedermannquenoscedieralosfmuresderatones deficientes en TPPII. Agradecer al Servicio de Protemica del ISCIII la sntesis de los pptidos de VACV y en especial a Mercedes por resolver mis dudas. Gracias a la Unidad de Inmunobiologa del ISCIII por el mantenimiento de los citmetros de flujo hacindomeposiblemitrabajodiario.Yenlaltimaetapadeescritura,agradeceraUgo Bastolla del Servicio de Bioinfrmatica del CBM su ayuda con cuestiones un poco hidrofbicas. Gracias a Carmen Mir, a Susana Snchez y a Yolanda La por su apoyo tcnico y por tener siempre a punto todo aquello que era necesario en la realizacin de los experimentos. Agradezco a Daniel Lpez, a Luis Antn y a Manuel Ramos sus continuas aportacionesenlosseminarios. En general, gracias a todos mis compaeros de Inmunologa Viral y de Presentacin de Antgeno; aquellos que han pasado por all durante estos 6 aos y a los que todava estn por aqu, sin vuestro trabajo no habra sido posible realizar esta tesis. Ms importante an, quiero agradeceros profundamente a cada uno de vosotros que seis misamigosyquehayiscompartidoconmigotodosesosmomentosqueslovosotrosy yosabemos:

Agradecimientos

Mil gracias por cuidar de m a diario a Carmen, a Susana, a Alicia y a Yoli. Gracias a Carmen por purificar mis stocks virales y purificar mi mente con todos tus consejos tanto laborales como personales. En especial, quiero agradecer a Susana las continuas titulaciones virales y el mantenimiento de mis lneas de CTL y de nuestra amistad durante estos aos compartiendo juntas tantas y tantas cosas. A Alicia, gracias por aportarme nuevas miras en el anlisis y diseo de datos y resolverme siempre todas las dudasentrerisas.A Yoli,porestarpendientedemiscosasy ensearmeaverlasdeotra forma. A Salva, gracias ser mi amigo, preocuparte por mis cosas y hacer que todo vaya sobre ruedas. Muchas gracias a David Molina por ayudarme a organizar mis ideas y por tu compaerismo y tu amistad dentro y fuera del laboratorio. Gracias a Carolina por ser la primera persona que me ense a infectar las clulas y a escribir esos protocolos tan elaborados a la vez que pasbamos las tardes juntas, y a Manu por esas tardes en Majadahonda en las que me escuchabas mientras yo no paraba de hablarte. Muy especialmente dar las gracias a mi nuevo compaero David Gamarra por tus diseos grficos,portusinvestigacionesatravsdelosvaloresquehandadounnuevosentidoa mis datos y a la vez por escucharme durante horas. Sin ti esta tesis no sera la misma, desdelaportadahastalosltimosresultados. Y agradecer a otros muchos compaeros del ISCIII los ratos pasados juntos durante esta tesis, muchos de ellos en cafetera, gracias a Eva, a Paco, a Yolanda Campos,aElena,aRuth,aDavid,aAndrsyaJose. A mis compaeros de la Universidad de Salamanca por acompaarme en aquellos aosdeclasesyprcticasquedesembocaronenlarealizacindeestatesis:Juan,Fedra, Mara, Bea y Ruth. En especial a Juan, por ser un buen profesor y ensearme tantas cosasyportuamistaddesdeelprimeraodecarrerahastaahora. A todos mis amigos desde que bamos juntos al instituto: ngela, Blanca, Maria Jose, Begoa, Curro y Matas por alegrarme todos aquellos momentos fuera del trabajo diariodeestastesis. A mis padres, por vuestro amor incondicional y vuestra comprensin. Por la educacin recibida tanto a nivel acadmico como a nivel tico y moral. Por darme libertad en la eleccin de mis opciones en la vida a pesar de que eso suponga estar separados.Porestarsiempreah,entodomomento.

Agradecimientos

A mi hermano mayor, Javier, por cuidar de m desde que era un beb. Por animarme a emprender estos caminos desde que era una nia a la que le encantaban laspelculassobrepandemiasqueamenazabanelmundo.Porcreer,poranimarme,por confiar,porapostarpormsiempreyportuapoyoincondicionaltededicoestatesis. GraciasJavi

Abreviaturas

1. ABREVIATURAS
aa ACE ADN APC ARN(m) ATP BFA BH BMDC CEV CMV CTL d.p.i. DC decRVKRcmk DRiPs DTT E:D EBV EDTA EEV EGTA ERAD ERAP ERGIC Fsig GFP GMCSF h H2 HIV HLA HSV1 i.p. ICS IDE IEV IFN IL2 IMV IRAP Aminocido Enzimacarboxidipeptidasaconvertasadeangiotensina cidodesoxirribonucleico Clulaspresentadorasdeantgeno cidoribonucleico(mensajero) Adenosintrifosfato BrefeldinaA Bleomicinahidrolasa Clulasdendrticasderivadasdemdulasea(Bonemarrowdendriticcells) Virinenvueltoasociadoalaclula(Cellassociatedenvelopedvirus) Citomegalovirus LinfocitoTcitotxicoCD8+ Dastraslainfeccin Cluladendrtica Decanoilpeptidilclorometilcetona Productosribosomalesdefectivos Ditiotreitol Efector:diana VirusdeEpsteinBarr Acidoetilendiaminotetraactico Virinenvueltoextracelular(Extracellularenvelopedvirus) cidoetilenglicoltetraactico DegradacinasociadaalRE AminopeptidasadelRE CompartimentointermedioentreREyGolgi ProtenaFdeRSVquecarecedelasecuenciaseal. Protenaverdefluorescente(Greenfluorescentprotein) Factorestimulantedecoloniasdegranulocitosymacrfagos horas Complejoprincipaldehistocompatibilidadenelratn (Histocompatibilidad2) Virusdelainmunodeficienciahumana Antgenoleucocitariohumano(Humanleukocyteantigen) VirusherpessimplextipoI Intraperitoneal Ensayodetincinintracelulardecitoquinas Enzimadegradadoradeinsulina(Insulindegradingenzyme) Virinenvueltointracelular(Intracellularenvelopedvirus) Interfern Interleuquina2 Virinmadurointracelular(Intracellularmaturevirus) Aminopeptidasareguladaporinsulina

 IV kD LAP LC LCMV LPS m.o.i. mAb MHC min MVA Ova PBS PC7 PECs PSA RE ROC RSV rVACV SBF SEM SLO SP SPP TAP TAP/ TAP+/+ TCR TM TOP TPPII u.f.p. VACV WR 2m B8R

Abreviaturas

Virininmaduro(Immaturevirus) Kilodalton Leucnaminopeptidasa Lactacistina Virusdelacoriomeningitislinfoctica Lipopolisacridobacteriano Multiplicidaddeinfeccin Anticuerpomonoclonal Complejoprincipaldehistocompatibilidad minutos CepanoreplicativadeVACV(ModifiedvirusAnkara) Ovoalbmina Solucinsalinatamponadaconfosfato Proproteinconvertasa7 Clulasdellavadoperitoneal Aminopeptidasasensibleapuromicina Retculoendoplasmtico Anlisisestadstico"ReceiverOperatingCharacteristic" Virusrespiratoriosincitial Virusvacciniarecombinante Suerobovinofetal Errorestndardelamedia EstreptolisinaO Peptidasaseal Peptidasadelpptidoseal Transportadorasociadoaprocesamientodeantgeno RatonesoclulasdeficientesenTAP RatonesoclulasqueexpresanTAP,habitualmentedeorigenC57BL/6 ReceptordeclulasT Transmembrana Oligopeptidasathimet TripeptidilpeptidasaII Unidadformadoradeplaca Virusvaccinia Cepasilvestredevaccinia(Westernreserve) 2microglobulina VirusVACVquenotieneelgenB8R

Introduccin

2. INTRODUCCIN
2.1. LoslinfocitosTcitotxicosCD8+(CTL)exploranlasuperficiedetodaslasclulasdel cuerpo para detectar un tumor o la infeccin por un patgeno y eliminarlo. Su receptor de clulas T (TCR) reconoce pptidos que son presentados en la superficie de cualquier clula por molculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I. Estos pptidos proceden del procesamiento proteoltico de protenas endgenas propias y extraas o protenas exgenas, en el caso de la presentacin cruzada por clulas presentadoras de antgeno profesionales (APC). Estos pptidos presentan un tamao medio de 9 aminocidos (aa) y frecuentemente derivan de precursores ms largos que requieren un recorte proteoltico previo a su unin a molculas de MHC de clase I. El reconocimiento especfico de los complejos MHC/pptido por el TCR de los CTL provoca su activacin y proliferacin, promoviendo la eliminacin de la clula infectadaotumoralporsuaccincitotxicaoporlaliberacindecitocinas. En la va clsica de procesamiento antignico (Figura 1), los pptidos antignicos derivan de la degradacin en el citosol de protenas endgenas o de productos defectivos de la traduccin (DRIPs) por el proteasoma. Los productos del proteasoma son principalmente pptidos de menos de 8 aa, pero tambin se generan pptidos de 8 o ms aa que pueden incluir eptopos o sus precursores. Estos precursores pueden presentar extensiones de varios residuos en el extremo amino que pueden ser recortadas por aminopeptidasas citoslicas. Los pptidos generados son transportados al retculo endoplasmtico (RE) a travs del transportador asociado a procesamiento de antgeno (TAP). En el retculo endoplasmtico pueden ser sustrato de otras aminopeptidasascomolasaminopeptidasasdelRE(ERAP).Lospptidossoncargadosen un complejo formado por la cadenapesada naciente de MHC de clase I y la protena 2 microglobulina (2m). El complejo estable MHC/pptido es transportado a travs de la va secretoria constitutiva hasta la superficie celular donde puede ser reconocido por linfocitosTcitotxicosCD8+queeliminaneficazmentelaclulainfectada. PROCESAMIENTODEANTGENOSPRESENTADOSPORMHCDECLASEIACTL.

Introduccin

CITOSOL

Clulainfectada

RE Protena DRiPs MHC/pptido sustratos poliubicuitinilados

GOLGI CTL TCR vasecretoria constitutiva

D
Proteasoma MHCI 2m

A B
TAP

C
ERAPs

pptidos< 8aa

pptidos 8aa Eptopos Precursores deeptopos

Aminopeptidasas

precursor extendido enamino

MEDIO EXTRACELULAR

Figura1.LavaclsicadeprocesamientoypresentacindeantgenoporMHCdeclase IaCTL.
En la va clsica de procesamiento de antgeno los pptidos presentados a CTL derivan de la actividad degradativa del proteasoma en el citosol. Los sustratos del proteasoma estn ubicuitinados, y son mayormente productos ribosomales defectivos (DRiPs) o protenas endgenas. Los productos del proteasoma son principalmente pptidos de menos de 8 aa, pero tambin se generan pptidos de 8 o ms aa que pueden incluir eptopos o sus precursores. Los pptidos producidos por el proteasoma son sustrato de aminopeptidasas citoslicas (A). Los pptidos citoslicos de ms de 8 aa son transportados al RE por los transportadores TAP (B). En el RE las aminopeptidasas ERAPs recortan precursores extendidos en el extremo amino generando eptopos, aunque tambin puede destruirlos (C). Con la ayuda de chaperonas de RE el eptopo final se ensambla en un complejo trimolecular estable con la cadena pesada de MHC de clase I y la protena 2m (D). El complejo de MHC de clase I cargado con el eptopo (MHC/pptido) es exportado por la va secretoria constitutiva hasta la superficie celular para su presentacin a CTL. El reconocimiento de un complejo MHC/pptido cargado con un eptopo viral por un CTL especfico de ese eptopo ocurre a travs del TCR (E), y desencadena la activacindelCTLqueinducelaapoptosisdelacluladiana.

2.1.1. Elproteasoma. El proteasoma es la principal endoproteasa degradativa de las clulas. Se encuentra altamente conservado y est localizado en el citosol y en el ncleo. El proteasoma 26S es el complejo multiproteco con actividad proteoltica del sistema ubicuitinaproteasoma. El proteasoma degrada sustratos poliubicuitinilados a travs de

Introduccin

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lacascadaenzimticaconstituidaporE1,E2yE3,quetransfierenmltiplesubicuitinasa los grupos amino de las lisinas de los sustratos proteicos a degradar. El proteasoma 26S est formado por un ncleo cataltico 20S y por dos subunidades reguladoras 19S colocadas a ambos lados del ncleo [19S20S19S], que son responsables de la unin y del desplegamiento de los sustratos poliubicuitinilados. El ncleo 20S est compuesto por28 subunidadesnoidnticasqueseapilanen4anillos generandounaestructuraen forma de barril. Cada anillo externo est formado por 7 subunidades cuya funcin es impedirelpasoindiscriminadodelossustratos.Elpasodelossustratosylasalidadelos productos se producen por un cambio de orientacin de las subunidades externas del ncleo 20S al interaccionar con el complejo activador PA28 y con la subunidad reguladora19S. Los 2 anillos internos constan cada uno de 7 subunidades catalticas y sufuncinesgenerarunhuecocentraldondeserealizaladegradacindelossustratos. Lassubunidadescatalticasdelsitioactivotienendiferentesactividades,1tipocaspasa, 2 tipo tripsina y5 tipo quimiotripsina. Cualquier aminocido puede servir de sitio de corteporloqueelproteasomatienebajaespecificidaddecorte. El proteasoma es la principal proteasa que se ha implicado en la generacin de eptopos de MHC de clase I por varias razones: Primero, la inhibicin de la actividad del proteasoma con inhibidores especficos elimina casi por completo la presentacin de ciertos antgenos por MHC de clase I y afecta fuertemente, aunque de forma variable paradistintosalotipos,alaexpresindelasmolculasdeMHCdeclaseIenmembrana. Adems, la ausencia de actividad carboxipeptidasa significativa en el citosol (Reits y col. 2003; Reits y col. 2004) y en elRE de clulas derata (Powis y col. 1996) pareca implicar que el extremo carboxilo de ligandos de MHC de clase I debe ser generado por una endoproteasa. Se ha demostrado de hecho que el proteasoma genera el extremo carboxilo correcto de ciertos eptopos que se presentan a CTL (Shastri y col. 2005). La reciente descripcin de la importante implicacin de la enzima carboxidipeptidasa convertasa de angiotensina (ACE) de la va secretoria en la generacin del extremo carboxilo de ciertos eptopos (Shen y col. 2011) ha matizado el papel exclusivo del proteasomaenestafuncin. Segundo, el proteasoma genera pptidos de 3 a 22 residuos de los cuales un 15% presenta una longitud entre 810 aa, ideal para unirse a molculas de MHC de clase I y

Introduccin

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alrededor de un 20 % presentan una longitud mayor y son precursores potenciales (Kisselevycol.1999). Tercero, la presencia de interfern (IFN) induce que se incorporen a los proteasomas nacientes tres nuevas subunidades catalticas, LMP2, MELC1 y LMP7, quereemplazanalassubunidadescatalticasconstitutivas1,2y5,respectivamente. Estos proteasomas se denominan inmunoproteasomas y se localizan constitutivamente en tejidos linfoides como el timo, el bazo o ganglios linfticos y bajo la estimulacin por IFN se expresan en otros tipos celulares. Los inmunoproteasomas tienen una especificidad de corte distinta a los proteasomas estndares, pudindose generar un subconjunto de pptidos distinto o con una eficiencia distinta (Kloetzel y Ossendorp 2004;SijtsyKloetzel2011). Laprincipalfuncindelproteasomaesladegradacindeprotenasconfallosenel plegamiento para el reciclaje de aa y el recambio de protenas que ya han cumplido su funcin.Las protenasqueaccedenalREyquenopasanelcontroldecalidaddebenser retrotranslocadas al citosol para su degradacin a travs de la ruta de degradacin asociada al RE (ERAD) en la que interviene el transportador bidireccional Sec61 o translocn (Wiertz y col. 1996). Los DRiPs, productos ribosomales defectivos, representanlaprincipal,peronolanica,fuentedepptidosquesepresentanporMHC declaseI.LahiptesisdelosDRiPsexplicalarpidapresentacindepptidosviralesen la superficie de las clulas infectadas ya que conecta la traduccin de la protena defectiva a la maquinaria de procesamiento de antgeno (Del Val y Lpez 2002; Princiottaycol.2003;YewdellyNicchitta2006;Dolanycol.2011). Bajo condiciones proinflamatorias se generan una gran cantidad de protenas oxidadas y desplegadas que sobrepasan la actividad degradativa del sistema ubicuitina proteasomaacumulndoseenlaclula.Lafuncinprincipaldelinmunoproteasomabajo estas condiciones es contribuir a mantener la homeostasis de las protenas y como resultadodelaactividaddegradativaconjuntadelproteasomaydelinmunoproteasoma puede aumentar la diversidad de pptidos accesibles para la presentacin de antgeno porMHCdeclaseI.

Introduccin

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2.1.2. Aminopeptidasas y endopeptidasas citoslicas implicadas en procesamiento antignico. Adems del proteasoma, otras proteasas participan en el procesamiento antignico.SedescribirnindividualmenteyserecogenenlaTabla1. El citosol es un medio muy agresivo en el que existen numerosas peptidasas que degradan rpidamente los pptidos. En concreto, el anlisis con pptidos marcados introducidos en clulas vivas indica que se degradan en segundos, y exclusivamentepor aminopeptidasas, ya que pptidos protegidos en el extremo amino son estables (Reits y col. 2003; Reits y col. 2004). Las aminopeptidasas citoslicas colaboran en degradar los pptidoshastaaa,unprocesocrticoparalasupervivenciacelular,peroademspueden recortar precursores extendidos en el extremo amino, bien para generar el extremo correcto de ligandos de MHC de clase I, o bien para destruirlo. A pesar de que la mayor partedelosproductosdelproteasomarequierenunrecorteproteolticoparagenerarel extremo amino correcto, se ha descrito el caso excepcional de un ligando natural de 15 aa con 6 aa extendidos en su extremo amino que no se recortan y se presenta a CTL (Saminoycol.2006). Se han descrito varias aminopeptidasas citoslicas, como por ejemplo, leucn aminopeptidasa (LAP), bleomicina hidrolasa (BH) o la aminopeptidasa sensible a puromicina (PSA). LAP es una metalopeptidasa que prefiere aa hidrofbicos en el extremo amino (Turzynski y Mentlein 1990), que se induce por IFN, y que promueve la generacindeuneptopoinvitroapartirdeunpptidoextendidoenelextremoamino (Beninga y col. 1998). PSA y BH pueden recortar extensiones en el extremo amino de pptidos largos para generar in vitro el eptopo correcto (Stoltze y col. 2000; Lvy y col. 2002). Sin embargo, tambin hay eptopos que no se benefician de estas aminopeptidasas. Los ratones deficientes en cada una de estas aminopeptidasas muestranunaexpresinnormaldemolculasdeclaseIensuperficieyunarespuestade linfocitos T CD8+ frente a distintos eptopos virales idntica a los ratones silvestres (Towne y col. 2005; Towne y col. 2007). Slo se ha observado un incremento en la expresindeMHCdeclase IenDC esplnicasderatonesdeficientesenPSA,pero nose traduceenunamejorrespuestaantiviraldelinfocitosTCD8+(Towneycol.2008).


Localizacin subcelular

Introduccin

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Vasalternativas Peptidasasyproteasas Citosol Proteasoma Leucnaminopeptidasa(LAP) Bleomicinahidrolasa(BH) Aminopeptidasasensibleapuromicina(PSA) TripeptidilpeptidasaII(TPPII) Caspasas5y10 Enzimadegradoradeinsulina(IDE) Oligopeptidasathimet(TOP) Nardilisina REyvasvesiculares ERAP Peptidasaseal(SP) Enzimaconvertasade Peptidasadelpptidoseal(SPP) angiotensina(ACE) Furina Proteinconvertasa7(PC7) Catepsinas Mecanismosdetransporte RE TAP SecuenciasealvaSec61

Vaclsica

Tabla 1. Peptidasas, proteasas y mecanismos de transporte que participan en el procesamientodeantgenosdeMHCdeclaseI.

Secomparanlasdistintasactividadesproteolticasymecanismosdetransportedelavaclsicay devasalternativas,ademsdesulocalizacinsubcelular.

La tripeptidil peptidasa II (TPPII) es una aminopeptidasa citoslica de la familia de las subtilisinas que participa en numerosos procesos celulares: divisin celular, apoptosis, o en enfermedades como obesidad o cncer. TPPII retira tripptidos del extremo amino de los sustratos a no ser que encuentre una P (Tomkinson 1999) y tiene adems actividad endoproteasa de tipo tripsina. Los pptidos de ms de 15 aa son procesados principalmente por la TPPII y no por otras aminopeptidasas por lo que podra tener un papel como peptidasa de recorte citoslica de productos largos del proteasoma (Reits y col. 2004; York y col. 2006). Se han descrito, en ensayos en cultivo con inhibidores especficos de la actividad TPPII o con ARN de interferencia, algunos eptopos que siendo insensibles a inhibidores del proteasoma son procesados por la TPPII, como un eptopo de nef del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (Seifert y col. 2003) y otro de LMP1 del virus de Epstein Barr (EBV) (Diekmann y col. 2009). Adems, la TPPII, tambin est implicada en la presentacin de otro eptopo de LMP1 y del eptopo de la nucleoprotena del virus de la gripe, NP147155, los cuales se

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potencian en presencia de inhibidores del proteasoma por lo que parecen sufrir su accindestructora(Guilycol.2006;Diekmannycol.2009). Varios grupos han examinado la presentacin de antgenos in vivo en ratones deficientesenTPPII,observndoseunligeroincrementoenlaexpresinensuperficiede MHC de clase I y en la presentacin directa de antgenos virales de LCMV (Kawahara y col. 2009) o en la presentacin cruzada del eptopo SIINFEKL de ovoalbmina (Ova) (Firatycol.2007).Portanto,elefectoglobaldelaTPPIIenlaproduccindeeptoposde MHCdeclaseIsugiereunpapelligeramentedestructordeestapeptidasa. Varios estudios describen mltiples endoproteasas que complementan la accin del proteasoma o actan de forma independiente generando eptopos presentados por MHCdeclaseI. Las caspasas son endoproteasas que forman parte de una familia de cisten proteasas citoslicas que participan en respuesta inflamatoria y en procesos de apoptosis.As,sehadescritoquelascaspasas5y10participanindependientementedel proteasomaenlaproduccindeuneptopodecitomegalovirusmurino,CMV,enclulas apptoticas infectadas con un virus vaccinia recombinante (rVACV), y slo la inhibicin de ambas proteasas y del proteasoma consigue eliminar totalmente la presentacin del eptopo(Lpezycol.2010). La enzima degradadora de insulina (IDE) es una metaloproteasa ubicua que corta la cadena de la insulina y pptidos de un peso molecular menor de 12 kD. Esta enzima reconoce la conformacin del sustrato recortando preferencialmente sustratos con estructura primaria de lmina beta. Se ha descrito una eptopo de la protena tumoral MAGE3 presentado por HLAA1 que es independiente de proteasoma y cuyo procesamientoenelcitosolseproduceporlaIDE(Parmentierycol.2010). La oligopeptidasa thimet (TOP) es una endoproteasa citoslica ubicua que es fundamentalmente degradativa de eptopos (Saric y col. 2001), pero tambin puede generar pptidos precursores (Saric y col. 2004) por ejemplo de la protena tumoral MART1 (Kessler y col. 2011). Tambin puede recortar pptidos pudiendo generar el extremo carboxilo de un ligando de MHC de clase I tras recortar 2 3 residuos del extremo carboxilo generando de forma resistente a inhibidores del proteasoma el eptopodelaprotenatumoralPRAME(Kesslerycol.2011).

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La nardilisina es una endopeptidasa citoslica que reconoce motivos dibsicos, y que participa en la generacin de pptidos precursores de laprotena tumoral PRAME y enlageneracindelextremoaminocorrectodeleptopoEBNA3C(Kesslerycol.2011). 2.1.3. Transportadoresdeantgenos. 2.1.3.1. Transportadorasociadoaprocesamientodeantgeno,TAP. En la va clsica de presentacin antignica mediada por MHC de clase I los TAP son un elemento central. TAP pertenece a la familia de transportadores ABC (ATP binding cassette) y su funcin principal es translocar pptidos, que generalmente proceden de la degradacin por el proteasoma, desde el citosol al lumen del RE. Su localizacin cannica es la membrana del RE, aunque se ha observado la presencia de TAPenERGIC(compartimentointermedioentreREyGolgi)yenelGolgi(Ghanemycol. 2010). TAP es un heterodmero formado por dos subunidades, TAP1 y TAP2, ambas necesariasparaformarunporoconundimetroquepermiteelpasodelospptidosde forma unidireccional al RE. Cada subunidad consta de varios dominios transmembrana (TM)ydeundominiocitoslicohidroflicodondeselocalizaelsitiodeuninehidrlisis del ATP. Cada una de las subunidades de TAP tiene 10 hlices en su regin TM, de las cuales las seis hlices situadas en los extremos carboxilo forman el poro central y son esenciales y suficientes para la unin del pptido y la translocacin al lumen. Las 4 hlices en los extremos amino son indispensables para la unin de la tapasina y actan como plataforma para el ensamblaje del resto de componentes del complejo de carga. La unin de ATP a cada subunidad suministra la energa necesaria para la translocacin depptidosatravsdeTAP(ParcejyTampe2010). DadoelpolimorfismodelasmolculasdeclaseI,TAPdebetenerunaespecificidad flexible de sustrato que permita suministrar un amplio rango de pptidos a todos los alotipos. TAP puede translocar pptidos con una longitud de 840 aa, lineales, ramificados o modificados. Gracias a las aminopeptidasas del RE (ERAPs) los pptidos quetienenextensionesenaminosonrecortadoshastauntamaode816aa,idealpara unirse al surco de las molculas de clase I (Saveanu y col. 2005). La especificidad de sustrato de TAP est restringida por el reconocimiento del residuo carboxilo terminal,

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bsico o preferiblemente hidrofbico, y los 3 primeros residuos amino terminales (van Endert y col. 1995; Peters y col. 2003). El TAP murino prefiere aa hidrofbicos en el extremocarboxilodelpptidoylainfluenciadelosresiduosaminoterminalesesmucho msbajaqueenelTAPhumano(Burgevinycol.2008). 2.1.3.2. MecanismosviralesdeinhibicindeTAP. En la va clsica de presentacin de antgeno, TAP es un punto clave, de ah que muchos virus hayan evolucionado adoptando estrategias que bloqueen el transportede lospptidos. Lamayoradelosmecanismosdescritosaparecenenlafamiliadelosherpesvirus. Estos virus tienen una baja tasa de mutacin pero han desarrollado mltiples mecanismos de atenuacin de la respuesta inmune para as interferir con el reconocimiento de la clula infectada. La protena citoslica ICP47 del virus herpes simplex tipo I (HSV1) acta como un inhibidor que compite con los pptidos y se une a TAPhumanoconunaafinidadnanomolar,peronoaTAPmurino(Fruhycol.1995;Hilly col. 1995; Ahn y col. 1996; Tomazin y col. 1996). Los primeros 3234 residuos de la protenasonsuficientesparabloquearlaunindelpptidoaltransportador,lahidrlisis delATPyelaccesodelospptidosalRE.Dehecho,existeunpptidosinttico,ICP471 35 que se corresponde con los 35 aa del extremo amino de la protena ICP47 y que mantiene la capacidad de bloquear TAP y disminuir la presentacin de antgenos dependientesdeTAP(Galochaycol.1997).Sehadescritotambinlautilizacindevirus recombinantes que expresan la molcula ICP47 con los que se consigue bloquear la presentacindeantgenosvirales(Snyderycol.1997). Muchos virus herpes del gnero de los varicelovirus y el virus de la varicela expresanunaglicoprotenademembrana,UL49.5,quebloqueaaTAPdeformadual.No ejerce ningn efecto en la unin del pptido ni del ATP sino que provoca que TAP se mantenga constantemente en la conformacin cerrada de transporte, evitando el paso de los sustratos. Por otro lado, UL49.5 induce la degradacin de TAP por el proteasoma (KoppersLalicycol.2005).

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La glicoprotena de membrana US6 del citomegalovirus humano, CMV, bloquea la unin del ATP a TAP actuando desde la cara luminal del RE, cara opuesta al sitio de unindelATP.Esteinhibidornobloquealaunindelpptido(Ahnycol.1997). El EBV bloquea la unin del pptido y del ATP a TAP mediante la protena citoslicaBNFL2(Croftycol.2009;Horstycol.2009). Recientemente se ha descrito por primera vez un inhibidor de TAP fuera de la familia de los herpes. Se ha identificado una protena de membrana del poxvirus de la viruela bovina (CPXV12) que inhibe la translocacin de los pptidos al lumen del RE a travsdeTAP(Alzhanovaycol.2009;Byunycol.2009)alimpedirlauninalATP. Hastalafechanosehadescritoningunaprotenadelpoxvirusvaccinia(VACV)que bloquee TAP. Sin embargo, VACV tiene una multitud de protenas que actan como inmunomoduladores (Perdiguero y Esteban 2009). Estas protenas pueden actuar interfiriendo con la accin del IFN, por ejemplo B8. Otras protenas actan capturando o interfiriendo la accin de quimioquinas o citoquinas, algunos ejemplos seran las protenas B13 y B16 que inhiben la accin de la IL1 al inhibir la caspasa 1 o al secuestrarlacitoquinarespectivamente(Kettleycol.1997;Smithycol.1997). 2.1.3.3. VasalternativasdetransportedepptidospresentadosporMHCdeclaseI. Se ha demostrado la existencia de eptopos que se presentan en la superficie celular unidos a MHC de clase I en clulas deficientes en TAP. Adems las rutas de presentacin de antgeno independientes de TAP parecen suficientes para controlar las infecciones virales in vivo ya que personas genticamente deficientes en TAP no son especialmente susceptibles a diversas infecciones, excepto algunas bacterianas, en comparacin con personas normales, y son capaces de generar CTL especficos frente a ciertos eptopos virales (Gadola y col. 2000). Tambin se han descrito varios casos de generacin de una respuesta de linfocitos T citotxicos CD8+ especficos de diversos antgenos en ratones genticamente deficientes en TAP (TAP/) (Sigal y Rock 2000; Norburyycol.2001;Medinaycol.2009).EnlosratonesTAP/sehadeterminadoqueel repertorio funcional de estos linfocitos T CD8+ muestra una diversidad normal en el uso de cadenas del TCR, lo que permite el reconocimiento de varios antgenos, con la excepcindeunareducidafrecuenciaenelusodelacadenaV5,limitandolarespuesta

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frente a Ova (Sandberg y col. 1996). Sin embargo, no se ha estimado cuantitativamente cul es la contribucin real de la presentacin independiente de TAP a una respuesta globalfrenteaunpatgenocomplejo,queesunobjetivodeestatesis. Hay muy pocos ejemplos de eptopos que no requieran de TAP pero s de un procesamiento por el proteasoma descritos en la literatura (Tabla 2). As, de los eptopos independientes de TAP en los que se ha analizado la participacin del proteasomaensuprocesamiento,msdel85%sonprocesadosporotrasproteasas.Los pocos pptidos que no requieren de TAP pero s del proteasoma requieren adems de un mecanismo de transporte del citosol al RE alternativo a TAP que les permita acceder alasmolculasdeMHCdeclaseI.As,sehanpropuestoladifusinpasiva,eltranslocn Sec61otransportadoresnoidentificados.TransportadoresendolisosomalescomoTAPL o mecanismos como la autofagia podran permitir el acceso a compartimentos vesicularesmsdistales(Lautschamycol.2003a;Mnz2010;Chemaliycol.2011).
Eptopo Proteasoma Nmero % Dependientes 2 12 Resistentesainhibidores 14 88 Suma 16 100 Desconocido 20 Total 36

Tabla 2. Participacin del proteasoma en el procesamiento de eptopos independientesdeTAP.

Se muestra el nmero de eptopos endgenos e independientes de TAP descritos en la literatura que requieren o no del procesamiento por el proteasoma. Se muestra el porcentaje relativo respecto de los que se conoce la participacin del proteasoma, deducido de la sensibilidad de su presentacin antignica a inhibidores del mismo.

(Anderson y col. 1991; Hammond y col. 1993; Zweerink y col. 1993; Gueguen y col. 1994; SchirmbeckyReimann1994;Hammondycol.1995;Elliottycol.1995;Leeycol.1996;Khannay col. 1996; de la Salle y col. 1997; Snyder y col. 1997; GilTorregrosa y col. 1998; Wood y Elliott 1998;Snyderycol.1998;Grommycol.1999;SigalyRock2000;Wlfelycol.2000;Neumeister y col. 2001; Paliard y col. 2001; Lautscham y col. 2001; Saulquin y col. 2001; Kuzushima y col. 2003; Lautscham y col. 2003b; Tiwari y col. 2007; Johnstone y col. 2008; El Hage y col. 2008; Oliveiraycol.2011).

2.1.3.4. AminopeptidasasdeREasociadasalprocesamientodeantgeno. Comparado con el citosol, el RE presenta una baja actividad proteoltica. Adems de las endoproteasas peptidasa seal (SP) y peptidasa del pptido seal (SPP), en el RE

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hay aminopeptidasas residentes, que pueden eliminar residuos flanqueantes en el extremoaminodelpptidoantignico. Las aminopeptidasas del RE pertenecen al grupo de las metalopeptidasas que unen zinc. Esta subfamilia tiene 3 miembros en el ser humano que son relevantes para procesamiento antignico: las enzimas ERAP1, ERAP2 e IRAP (aminopeptidasa regulada por insulina). En el ratn, ERAAP es el homlogo de ERAP1, mientras que ERAP2 no se expresa. Las enzimas ERAP son inducibles por IFN pero IRAP no. Estudios con digestiones in vitro revelan que ERAP1 recorta de forma ptima pptidos con una longitud entre 9 y 16 aa y los productos raramente tienen menos de 8 9 aa, lo que sugiere que esta aminopeptidasa de RE ha evolucionado para generar pptidos del tamao adecuado para la unin a molculas de MHC de clase I (Serwold y col. 2002; Saricycol.2002;Yorkycol.2002).Encuantoasuespecificidad,ERAP1prefiereresiduos grandes e hidrofbicos tanto en el extremo amino como en el carboxilo del precursor, mientrasqueaacargadosopequeosehidrofbicosserecortanconmuybajaeficiencia (Saveanu y col. 2005; Chang y col. 2005; Hearn y col. 2009). Esto es consistente con el tamao y la especificidad de TAP para unir y translocar pptidos al RE as como con las especificidades de los alotipos de MHC de clase I para unir pptidos. Sin embargo, ERAP1 no puede recortar pptidos con el aa P en posicin 2, de forma que estos pptidos se acumulan en el RE procedentes de precursores citoslicos ms largos, explicando el uso preferente de P en 2 como motivo de anclaje de un porcentaje considerable de alotipos de MHC de clase I, a pesar de la incapacidad de TAP de transportar estos pptidos (Serwold y col. 2001). El recorte por ERAP1 est tambin influido por las posiciones internas 2, 5 y 7, con preferencia por aa hidrofbicos o cargadospositivamente(Evnouchidouycol.2008). La determinacin de la estructura cristalogrfica de ERAP1 (Kochan y col. 2011; Nguyen y col. 2011) sugiere cambios conformacionales que explicaran la baja especificidad de sustrato y la preferencia por sustratos largos. La estructura es ms compatibleconlahiptesisdeconsideraraERAP1comounareglamolecular(Changy col. 2005) que con el modelo alternativo que postulaba su accin enzimtica sobre pptidos ya unidos al molde que proporcionara la molcula de MHC de clase I (Kanaseki y col. 2006). El modelo del molde tambin haba sido contradicho por experimentos de nuestro laboratorio con un pptido de 15 aa de HIV, que es un

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precursornaturalqueseencuentraenclulasinfectadas,yqueserecortaporERAPslo en su forma libre y no cuando est unido a la molcula de MHC de clase I murina H2Ld (Saminoycol.2006;Infantesycol.2010). Se han observado alteraciones en el repertorio de linfocitos T CD8+ del ratn deficiente en ERAP indicando que el recorte de los precursores opera ya durante la seleccin en el timo de los linfocitos T CD8+. Sin embargo, aunque este ratn tiene una reduccin en la expresin de molculas de MHC de clase I, en este estudio no se observningnefectosobrelarespuestadelinfocitosTCD8+frenteadistintoseptopos virales (Hammer y col. 2006). Diferentes estudios en cultivo utilizando ARN de interferencia han demostrado la contribucin de ERAP1 tanto a la generacin como a la destruccin de distintos eptopos para su presentacin por MHC de clase I a CTL (Serwold y col. 2002; York y col. 2002). Se han descrito tambin evidencias de que la deficiencia en ERAP compromete la presentacin cruzada de ciertos antgenos particulados(Yanycol.2006;Firatycol.2007). ERAP2 prefiere sustratos con residuos bsicos tanto en el extremo amino como carboxilo. Puede formar complejos dimricos con ERAP1 incrementando la eficacia de recortedelosprecursores(Saveanuycol.2005). La importancia de ERAP en el procesamiento antignico queda reflejada en la existencia de inhibidores en citomegalovirus (Kim y col. 2011). Adems, se ha identificado una poblacin de linfocitos T CD8+ que reconoce especficamente un pptido FL9 que slo se genera cuando la actividad ERAAP est reprimida y que es presentadoporlamolculadeMHCnoconvencionalQa1b(Nagarajanycol.2012). Varios grupos han examinado la actividad proteoltica derecorte en el citosol y en el RE. Mediante un estudio bioinformtico Schatz y col. han analizado la frecuencia de aa entre las posiciones N1 y N5, siendo N5 el residuo inicial del pptido extendido en amino, de los precursores de ms de 1500 eptopos conocidos y han identificado la existencia de un motivo de procesamiento amino terminal. Los precursores extendidosenaminotienenaacomoPoWenlasposicionesN4N5quesonrecortados inicialmenteenelcitosolyentranalREconextensionesde1a3aacomoLoMoconaa bsicos (en una baja representacin), que seran eliminados por aminopeptidasas del RE. Las especificidades relajadas de corte de las aminopeptidasas citoslicas o del RE serancompatiblesconestemotivodedegradacinaminoterminal(Schatzycol.2008).

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2.1.4. Carboxipeptidasasdelavasecretoriaasociadasalprocesamientodeantgenos. Hasta el ao 2011 se haba asumido que la actividad carboxipeptidasa en la va secretoriaerainexistenteenclulasderata(Powisycol.1996)omuydeficiente(Snyder ycol.1998)olimitandounas1000veceslaeficaciadegeneracindeeptoposenclulas murinasyhumanas(Medinaycol.2009). Existan sin embargo en clulas murinas y humanas carentes de TAP evidencias claras del recorte del extremo carboxilo de pptidos naturales tanto derivados de secuencias seales (Henderson y col. 1992; Wei y Cresswell 1992) como de protenas completas (GilTorregrosa y col. 1998). Finalmente, se ha descrito recientemente que la ACE puede generar el extremo carboxilo de eptopos desde pptidos procesados previamente por el proteasoma. La deficiencia de esta enzima en ratones genticamente modificados genera un nuevo repertorio de eptopos propios, de forma queaparecennuevoseptoposyseeliminanotros(Shenycol.2011). 2.1.5. Endoproteasas vesiculares implicadas en procesamiento endgeno de antgenos. En el apartado 2.1.2 describimos antgenos generados por vas citoslicas alternativas a la va convencional de procesamiento de antgeno por MHC de clase I. Al contrario que el citosol o que los lisosomas, la va secretoria y los compartimentos vesiculares son un medio menos degradativo. Sin embargo se han descrito distintas endoproteasas que participan en el procesamiento de antgenos de MHC de clase I (Tabla1yFigura2). La peptidasa seal es una enzima madurativa que reconoce y retira la secuencia seal de protenas que entran cotraduccionalmente en el RE. sta es una secuencia patrn que comienza en el extremo amino con 1 a 5 residuos bsicos, un ncleo hidrofbico de 7 a 15 aa, seguidos de 3 a 7 aa polares y que termina con residuos pequeos y no polares en el extremo carboxilo. Las secuencias seales cortadas son pptidos cortos que no necesitan de un gran recorte adicional para unirse a MHC de clase I. Se han descrito varios ejemplos de eptopos independientes de TAP generados

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por esta enzima (Henderson y col. 1992; Wei y Cresswell 1992; Bell y col. 2009) aunque tambindestruidos(Schlosserycol.2007). EnlosestudiosagranescaladelrepertoriodeligandosdeMHCdeclaseIrealizado mediante tcnicas de inmunoprotemica y espectrometra de masas con clulas no infectadas, se ha detectado que la secuencia seal es la principal fuente de ligandos independientes de TAP presentados por HLAA2 y HLAB51. El hecho de que HLAA2 acomode bien una alanina en la posicin carboxilo terminal explica que en la mayor partedeloseptopospresentadosporestamolculalapeptidasasealpuedagenerarel extremo carboxilo exacto del eptopo (Weinzierl y col. 2008). En otros alotipos de MHC de clase I, como Kd, HLAB51 o de clase Ib como Qa1b, es necesario el recorte del eptopo tanto en el extremo amino como en el carboxilo (Suri y col. 2006; Weinzierl y col. 2008; Oliveira y col. 2009), implicando aminopeptidasas como ERAP y carboxipeptidasascomoquizsACE. LapeptidasadelpptidosealesotraendoproteasadelREquecortaenzonasTM delasprotenasydentrodealgunospptidosseal.Estimplicadaenelprocesamiento de un eptopo favoreciendo su presentacin de forma dependiente de proteasoma y de TAP(Blandycol.2003). Dos proprotein convertasas localizadas en la red de trans Golgi, furina y proproteinconvertasaPC7sehanimplicadoenelprocesamientodeciertoseptoposen lavasecretoria. Furina es una proprotein convertasa residenteen la red del trans Golgi que media en la maduracin de muchas proproteinas como hormonas peptdicas o glicoprotenas virales. Estaenzimacortapreferencialmentetrasresiduospolibsicosdelsustrato,tiene especificidad por un motivo RXR/KR. La inhibicin de esta proteasa con el inhibidor especfico decRVKRcmk, que imita los 4 aa del motivo de unin a la proteasa, inhibe de una forma dependiente de dosis la presentacin a CTL del eptopo 9pp89 a partir de la construccin viral rVVsCA9Aen clulas deficientes en TAP T2Ld infectadas (Gil Torregrosaycol.1998;GilTorregrosaycol.2000). In vivo se ha descrito que la furina puede generar alrededor de un tercio de los complejos Kb/SIINFEKL en clulas TAP+ demostrando que contribuye a la presentacin global de antgenos en presencia de TAP. Adems se ha descrito que genera eptopos

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que son reconocidos por linfocitos T CD8+ en ratones deficientes en TAP (Medina y col. 2009).
CITOSOL Clulainfectada

RE Protena DRiPs MHC/pptido GOLGI

Furina PC7
TGN

B
TCR

CTL

MHCI

2m

vasecretoria constitutiva

TAP

ERAPs

Endoproteasas nodefinidas

C
PC7

A
Peptidasa seal SPP ACE

D
Catepsinas
LISOSOMAS MEDIO EXTRACELULAR

Figura 2. Endoproteasas vesiculares implicadas en el procesamiento de antgenos por MHCdeclaseI.

El procesamiento antignico en el RE puede ser realizado por la peptidasa seal (SP), la peptidasadelpptidoseal(SPP)oporotrasendoproteasasdelavasecretoranodefinidas(A). Dos proprotein convertasas pueden generar antgenos en ausencia de TAP: la furina localizada enlareddeltransGolgiylaPC7localizadaademsenvesculasendocticas(B,C).Lascatepsinas pueden participar en la generacin de ligandos de MHC de clase I en compartimentos endolisosomales (D). La mayora de los productos de estas endoproteasas requieren del recorte poraminopeptidasascomoERAPyporcarboxipeptidasascomoACE.Lasproteasasseindicanen azul.

La PC7 es una sernproteasa de amplia distribucin tisular que tpicamente corta sus sustratos en residuos de arginina. Se localiza en la red del trans Golgi y adems en vesculas endocticas. Se ha descrito que participa en la estabilizacin de molculas de MHC de clase I inestables en la superficie celular en compartimentos posteriores al RE, aportando un segundo punto de control de calidad para la carga de nuevos pptidos sobreMHC(Leonhardtycol.2010).

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Las catepsinas son cisten o asprticoproteasas localizadas en compartimentos endolisosomales. Se han implicado, junto a la furina, en la generacin a travs de una ruta vacuolar independiente de TAP del eptopo SIINFEKL de Ova a partir de una protena de fusin quimrica con la molcula de MHC de clase I Kb que se internaliza desdelasuperficiecelular(Tiwariycol.2007). 2.1.6. MolculasdelcomplejoprincipaldehistocompatibilidaddeclaseI. Las protenas de MHC de clase I estn codificadas por genes situados en la regin denominada complejo principal de histocompatibilidad. Los genes del MHC son los genesmspolimrficosdelosqueseencuentranenelgenomadetodaslasespeciesde vertebrados superiores. En el ser humano, el MHC se denomina HLA (Antgeno leucocitario humano) y est localizado en el cromosoma 6. Los loci principales que codifican para molculas de clase I se denominan HLAA,B yC. En ratones el MHC se llamaH2(histocompatibilidad2,porestarcercadeldenominadoantgenosanguneo2) y est en el cromosoma 17. Los loci murinos son K, D y L. El conjunto de alelos del MHC presentesencadacromosomasedenominahaplotipo. LamolculadeMHCdeclaseIesunheterodmerocompuestoporunacadenao pesada que es una glicoprotena de membrana de unos 43 kD, codificada en el MHC, unida no covalentemente a una segunda cadena de 12 kD no codificada en el MHC llamada2m. La cadena presenta tres dominios extracelulares; 1, 2 y 3 seguidos de un dominio TM y una cola citoplsmica corta. Los dominios 1 y 2 forman juntos unacavidadhidrofbicaosurcodeuninalpptidodondeseconcentranlamayorparte de los residuos polimrficos. El dominio 3 interacciona con2m. La unin del pptido al surco de la molcula de MHC de clase I se produce mediante 2 tipos de interacciones dbiles. Los extremos amino y carboxilo del pptido interaccionan con determinados residuosaltamenteconservadosentrediferentesalotiposdeMHC,porloqueeltamao de los pptidos unidos suele ser similar, entre 8 y 10 aa. Adems, en el surco de unin existen unas subcavidades formadas por zonas polimrficas especficas de cada alotipo, con las que interaccionan las cadenas laterales de los denominados residuos de anclaje del pptido. Como resultado, diferentes alotipos de MHC de clase I unen diferentes pptidos(Falkycol.1991).

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Se conocen los residuos de anclaje de los pptidos a los diferentes alotipos de MHC de clase I humanos y de ratn. Normalmente son dos residuos, situados en las posiciones 25 y en la ltima posicin del pptido. En concreto, los motivos de anclaje preferenciales de las molculas H2 Kb y Db se muestran en la Tabla 3. Esta informacin permite predecir en una determinada protena posibles eptopos presentados por un alotipo de MHC de clase I a CTL para lo que existen mltiples algoritmos, entre ellos SYFPEITHI que mide el nivel de adecuacin de un pptido a los motivos de anclaje consenso de las molculas de MHC de clase I (www.syfpeithi.de) (Rammensee y col. 1999) y BIMAS que mide el tiempo medio de disociacin de los complejos MHC:pptido (wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/) (Parker y col. 1994). Excepcionalmente, las molculas de MHC de clase I unen pptidos ms largos, usualmente anclados en los extremosaminoycarboxiloperosobresaliendoenlazonacentral(Burrowsycol.2007), obienconresiduosprotuberantesenamino(Saminoycol. 2006) oencarboxilo(Collins ycol.1994).Estetipodeeptoposnosonpredichosporestosalgoritmos.
Posicin H2Kb H2D

1 2 3 4 Y

5 F Y 5 N

7 8 L M I V 7 8

9 9 M I L

Tabla 3. Motivos principales (negrita) oauxiliares(subrayado)deanclajede los pptidos a las molculas de MHC declaseI,H2KbyDb.

1 2 3 4

 2.1.7. Elcomplejodecarga.

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La interaccin entre la molcula de clase I y el pptido debe ser muy estable. El papel del complejo de carga es favorecer los complejos ptimos y ms estables. El complejo de carga est compuesto por TAP, la tapasina, la molcula de MHC de clase I, la calreticulina (lectina dependiente de calcio) y la oxidorreductasa ERp57. El intercambio de pptidos de baja afinidad por pptidos de alta afinidad es promovido por este complejo proteico, de forma que aquellos pptidos que cumplen los requisitos se unen al surco principal de las molculas de MHC formando un complejo heterotrimrico estable junto a la protena 2m. Los complejos estables MHC/pptido salendelREhacialasuperficiecelularporlavasecretoria. Enlamayoradeloscasos,lapresentacindeloseptoposindependientesdeTAP essensibleabrefeldinaA,BFA,inhibidordeltransporteantergradoenlavasecretoria endgena (LippincottSchwartz y col. 1990). Esto se debe a que el sitio cannico para la unin de los eptopos a las molculas de MHC de clase I es el RE. Sin embargo la presentacin independiente de TAP de antgenos que son liberados por proteasas de compartimentos endosomales, sugiere que la carga de MHC de clase I con pptido podra darse en estos compartimentos, donde ocurre el reciclaje de molculas de MHC declaseI(SchirmbeckyReimann2002;Tiwariycol.2007). 2.2. TAP. Recientemente se han realizado estudios a gran escala en clulas deficientes en TAPnoinfectadasenlosquesehanaisladolospptidospresentadospor3molculasde MHC clsicas, H2Kd, HLAA2 y HLAB51, y una molcula no clsica, Qa1b. A partir del anlisis de los pptidos encontrados se han sugerido una serie de caractersticas sobre loseptoposindependientesdeTAPquelosdiferenciandelosclsicosyqueseresumen enlaTabla4(DelValycol.2011). CARACTERSTICAS DE LOS LIGANDOS DE MHC DE CLASE I INDEPENDIENTES DE

Introduccin

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1.SeadaptanmenosalosmotivosdeuninaMHCdeclaseI 2.AlgunossonligeramentemslargosytienenunaafinidaddeuninaMHCmsbaja 3.Derivandeprotenasdemembranaysecretadas 4.Inesperadamente,muchosdeellosderivandeprotenascitoslicasynucleares 5.Partedeellos,enunnmeromuyvariablesegn elhaplotipo, derivandela secuencia seal 6.Sebeneficiantambindelrecorteenelextremoamino 7.Esmuyfrecuenteelrecorteenelextremocarboxilo 8.Algunossonelextremocarboxiloexactodelaprotena

Tabla 4.Caractersticas de los ligandos de MHC de clase I producidos en ausencia de TAPencomparacinconlosdependientesdeTAP.

(DelValycol.2011).

El porcentaje de ligandos independientes de TAP que derivan del dominio luminal oTMdeprotenasparentalesdemembranaesvariableyrepresentadesdeel10al 70% dependiendo del alotipo de MHC de clase I. Es decir, para algunos alotipos existe una fraccin alta (del 90 al 30%) de ligandos que derivan de protenas citoslicas, nucleares, mitocondriales o del dominio citoslico de protenas de membrana (Figura 3a). Cuando se compilan los 4 alotipos estudiados, el 75% de los ligandos independientes de TAP derivandeprotenascitoslicas(Figura3b).EnlaFigura3csemuestraquelamayorade los ligandos luminales o TM (el 90%) derivan de glicoprotenas de tipo I, siendo variable la fraccin de eptopos que derivan de la secuencia seal de la protena parental (20% para Kd, 25% para Qa1b, 80% para HLAB51 y 90% para HLAA2). La peptidasa seal puede generar el extremo carboxilo exacto de aproximadamente la mitad de los ligandos (todos presentados por HLAA2), pero muchos requieren de un recorte carboxiloterminalycasitodosrequierenderecorteamino.Globalmenteel43%(3/7)de losligandosderivadosdeprotenasconregionesTMselocalizanparcialototalmenteen regiones TM. Este porcentaje baja al 7% (3/44) si consideramos todas las protenas con accesoamembrana(Figura3c,d).


Qa-1b Kd HLA-B51

Introduccin

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HLA-A2

a
MHC I Non-vesicular ligands Luminal and transmembrane ligands

c
N

Secretory and Type I membrane proteins

90% (n=39) lumen ss ss TM 10-80% C

b
N

Type II, III, IV membrane proteins

10% (n=5) TM

d
C TM

20-90%

TM

TM

TM

15 1 11 1 2 2 8 1 3

TM

Figura 3. Caractersticas de los ligandos de MHC de clase I generados en las vas secretoriasyvesiculareseidentificadosenlosestudiosagranescala.
(a) Fraccin de ligandos derivados de regiones luminales o TM de la protena parental (gris oscuro) respecto a la fraccin de ligandos derivados de la regin no vesicular (citosol, nuclear, mitocondrial) para los 4 alotipos de MHC de clase I indicados. (b) Anlisis global de los ligandos luminales o no vesiculares mostrados en a. Fraccin de eptopos que derivan de las distintas regiones de la protenas de tipo I (c) y de tipos II, III y IV (d). La lnea discontinua representa el corte por la peptidasa seal y las tijeras el recorte por exopeptidasas. Los ligandos se representan como rectngulos verdes y en su interior se indica el nmero de ligandos encontrados de ese tipo. (d) De los 3 ligandos que coinciden con el extremo carboxilo, 2 se encuentran en la regin TM y 1 en la regin citoslica de la protena parental (Suri y col. 2006; Weinzierlycol.2008;Oliveiraycol.2009).Adaptadode(DelValycol.2011).

2.3. Las clulas dendrticas (DC) migratorias muestrean los tejidos perifricos capturando antgenos potenciales y migran hacia los ganglios linfticos donde se encuentran con los linfocitos T CD8+ vrgenes. En los ganglios linfticos existen DC residentes que son especialistas en presentar antgeno y activar linfocitos T CD8+ vrgenes (Crozat y col. 2010). Estas APC profesionales presentan el eptopo viral unido a ACTIVACINDELINFOCITOSTCD8+.

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lamolculadeMHCdeclaseIensuperficie,queinteraccionaconelTCRdeloslinfocitos TCD8+vrgenesdandolugaralaactivacindelosmismos(priming),siemprequehaya adems coestimulacin mediada por la interaccin de ciertas protenas de las DC y sus correspondientesligandosenloslinfocitosT. Cuando el eptopo viral presentado resulta del procesamiento endgeno del antgeno viral sintetizado en la propia DC infectada hablamos de presentacin directa. Por otro parte, las DC convencionales que tambin expresan CD8 son especialistas en incorporarantgenosdelosrestosdeclulasinfectadascircundantesocaptarantgenos transferidosporlasDCmigratoriaseintroducirlosensuvadeprocesamientoendgena para su presentacin por MHC de clase I, mecanismo que se conoce como presentacin cruzada (crosspresentation). La estimulacin de linfocitos T CD8+ vrgenes por APC profesionales mediante presentacin cruzada se denomina activacin cruzada (cross priming). La presentacin cruzada tiene relevancia fisiolgica en circunstancias en las queporejemplounvirusnoinfectaAPC(Haeryfarycol.2005;Yewdell2010). Recientemente se ha demostrado que la presentacin directa de antgenos es suficienteparalaactivacindelinfocitosTCD8+antiVACV(Xuycol.2010),aunquepara una cepa no replicativa de VACV, MVA, se ha sugerido que slo existe presentacin cruzada(Gasteigerycol.2007).Las DCinfectadasexpresangenesdeVACVtempranos y tardos (Moutaftsi y col. 2009); sin embargo, mientras que las DC presentan de forma directaycruzadaloseptoposderivadosdeprotenastempranas,sehasugeridoquelos eptopos tardos no se presentaran de forma directa y slo aquellos que se localizan fuera de las factoras virales se presentaran de forma cruzada a linfocitos T CD8+ (Tewaltycol.2009). Tras su activacin, ya sea directa o cruzada, los linfocitos T CD8+ estimulados sufren una expansin clonal generndose un elevado nmero de CTL efectores que salen del ganglio linftico y migran hacia el sitio de infeccin donde eliminan las clulas infectadas. Los CTL activados inducen la apoptosis en las clulas infectadas diana por dos mecanismos citotxicos; una va implica la liberacin de grnulos secretorios induciendo la formacin de poros en la membrana de la clula diana por accin de la protena perforina, y la entrada de unas sernproteasas llamadas granzimas, que inducen la apoptosis en la clula infectada. La otra va citotxica depende de la interaccinentreelligandodeFas(FasL)queexisteenlasuperficiedelCTLyelreceptor

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Fas presente en la superficie de la clula infectada presentadora. Tras eliminar las clulas infectadas, se reduce sustancialmente el nmero de CTL activados que mueren por apoptosis. Algunos CTL activados no se diferencian terminalmente a CTL efectores, sino que gradualmentederivan a CTL de memoria, y son responsables de una respuesta msrpidayefectivaenelcasodeunainfeccinsecundaria. 2.4. 2.4.1. Elcicloreplicativodelvirus. El origen de VACV es an desconocido pero es el virus prototipo de laboratorio para estudiar los poxvirus como el de la viruela y es el agente utilizado como vacuna para la erradicacin de la viruela humana durante la dcada de 1970. VACV es un miembro del gnero Orthopoxvirus de la familia Poxviridae que posee un genoma de ADN de doble cadena con aproximadamente 200.000 pares de bases que codifican ms de 200 protenas. VACV realiza su ciclo infectivo en el citosol, y la progenie viral se agrupa en la fase tarda de la infeccin en los sitios denominados factoras virales. Las factoras virales se descubrieron mediante microscopa electrnica por primera vez en 1961(DalesySIMINOVITCH1961),abrindoseungrancampodeestudio.Enlosltimos 10 aos se ha descrito en profundidad su organizacin funcional y su composicin proteica (Tolonen y col. 2001; Moss 2006; Katsafanas y Moss 2007). Las factoras virales sonreascitoplasmticasdensasquecomienzanconunamembranaenformademedia luna creciente hasta formar una estructura esfrica rodeada de membrana donde los orgnuloscelularesestnexcluidos.Variosestudiossugierenqueestamembranaderiva decomponentesdelRE(Husainycol.2006;Husainycol.2007). VACV da lugar a dos tipos de viriones infecciosos: el IMV (virus maduro intracelular) est rodeado por una membrana y se mantiene en el interior celular hasta la lisis de la clula. El otro tipo de virin est rodeado por una doble membrana y es exportado por gemacin desde la clula antes de la muerte celular. Este segundo tipo agrupa a los CEV (virus envueltos asociados a la clula), que permanecen asociados a la superficie celular facilitando la diseminacin entre clulas vecinas, y los EEV (virus envueltos extracelulares), que median la diseminacin a mediolargo alcance y son ELVIRUSVACCINIA.

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especialmente relevantes en la diseminacin in vivo. El IMV es ms susceptible a anticuerposneutralizantesyalcomplemento. Figura4.CicloreplicativodeVACV.

El virus entra por endocitosis (preferencialmente en el caso de la cepa WR)oporfusinconlaclulayseliberael ncleo viral sin membrana en el citoplasma(1). El ncleo viral es transportado por microtbulosalinteriordelcitoplasma(2). Transcripcin de los ARNm tempranos y replicacindelADN(3). Emsamblaje de los IV dentro de la factora viral y maduracin a IMV, con una membrana(4). La mayora de los IMV son liberados por lisiscelular(5). Algunos IMV son envueltos por una doble membrana para formar IEV, con tres membranas, que son transportados a la superficiecelularpormicrotbulos(6). La membrana externa de los IEV fusiona con la membrana plasmtica y se expone el CEV, con dos membranas, en la superficie celular. La polimerizacin de tallos de actina bajo la superficie celular impulsa la liberacin de los CEV en forma deEEVhaciaclulasvecinas(7). (RobertsySmith2008). IV: Virin inmaduro, IMV: Virin maduro intracelular, IEV: Virin envuelto intracelular, CEV: Virin envuelto asociado a la clula, EEV: Virin envuelto extracelular

ElciclodereplicacinviraldeVACV(Figura4)comienzaconlauninalacluladel CEV o EEV, la eliminacin de la membrana y la fusin directa a la membrana celular. El IMV,traslaunin,puedeentrarenlacluladedosformas:mediantefusindirectacon la membrana celular o por endocitosis. El nucleoide o core es transportado por microtbuloshacialareginperinucleardelaclulaycontieneelADNcompactadoylas enzimas necesarias para comenzar la replicacin del ADNyla transcripcin de los genes tempranos (Figura 4). Tras la desencapsidacin, la replicacin del ADN comienza de

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forma temprana unas horas despus de la infeccin y es seguida de la expresin gnica tarda. A

Figura5.CategorafuncionalytemporaldelosgenesdeVACV.
A)SemuestraelnmerodegenesdeVACVasociadosaunafuncinespecficaquepertenecena cada categora temporal descrita (Yang y col. 2010). B) Se muestra la fraccin de genes de VACV de cada categora funcional y su expresin temporal (Yang y col. 2011). Las categoras temporales E1.1 y E1.2 de A se engloban en la categora early de B. La categora PR (post replicativa)deAenglobaalascategorasintermediateylatedeB.Lascategorasfuncionales TranscriptionyDNAreplicationseenglobanmsadelanteenlacategoraregulacinviral.

La expresin gnica en cascada se ha clasificado y subclasificado de diversas maneras, y recientemente se han agrupado en 3 categoras temporales: tempranos, intermedios y tardos (Yang y col. 2011), estas dos ltimas se incluan en la categora de postreplicativos anteriormente descrita por el mismo grupo (Yang y col. 2010). El 50 % de los genes de VACV son tempranos y la mayora de las protenas expresadas son

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factores de interaccin con el husped y protenas que participan en la replicacin del ADN y en la transcripcin. Los genes intermedios y tardos codifican principalmente protenas y enzimas que participan en el ensamblaje de los viriones (Figura 5). Estos viriones intracelulares (IMV) rodeados por una membrana son transportados hasta la superficie celular donde pueden quedar asociados, CEV, o liberarse al medio extracelular en forma de EEV (Figura 4) (Condit y col. 2006; Roberts y Smith 2008). El VACV produce bajos niveles de EEV y en concreto en la cepa WR (Western Reserve) utilizadaenestetrabajolamayoradelaspartculaspermanecenasociadasalaclulaen laformaCEV(Payne1980). 2.4.2. RespuestainmunefrenteaVACV. En la respuesta inmune frente a VACV existen componentes del sistema innato y del adaptativo. Muchos tipos de clulas del sistema inmune innato se infiltran en los tejidos tras la infeccin por VACV. Estas poblaciones incluyen macrfagos, monocitos, neutrfilos o clulas NK (natural killer), todos los cuales tienen diversas maneras de combatir el virus. En concreto, los macrfagos y los neutrfilos actan en la respuesta primaria frente a VACV fagocitando las partculas virales en los fagolisosomas y liberando especies reactivas de oxgeno y nitrgeno que las inactivan. La infeccin por VACV es abortiva en macrfagos y an no est claro su papel en la eliminacin del virus in vivo. Los IFNs de tipo I son importantes para la respuesta innata frente a VACV. Sin embargo,larespuestainnataessloefectivafrentealosvirionesextracelulares,asque son necesarias otras estrategias inmunes que eliminen la infeccin, ya que VACV puede pasar directamente de clula a clula sin necesidad de exponerse al medio extracelular (Moss2006). El IFN presenta una actividad antiviral ya que la infeccin de ratones con un rVACV que expresa IFN resulta en una rpida eliminacin del virus (KohonenCorish y col. 1990). La protena B8 de VACV codifica el receptor soluble de IFN pero ste presenta una baja afinidad por el IFN murino, lo que explicara que el VACV que carece de B8 presente una virulencia similar en el ratn que el virus silvestre (Verardi y col. 2001)

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La respuesta humoral de anticuerpos es un componente importante en la respuesta antiviral frente a VACV. Para una proteccin ptima por anticuerpos es necesario generar anticuerpos frente a las distintas formas vricas de VACV (Xu y col. 2004;Motaycol.2011). LarespuestacelularestamediadaporlinfocitosTCD4+yCD8+.Tantoloslinfocitos T CD4+ como los T CD8+ requieren para su diferenciacin a linfocitos efectores del reconocimiento de complejos MHCpptido en la superficie de las APC profesionales. Tras la infeccin por VACV se acumulan localmente una gran cantidad de linfocitos T CD4+peronoparecentenerunaactividadantiviralapesardeserunafuenteimportante de IFN, que ms bien participa en la activacin de clulas del sistema innato y de linfocitos T CD8+ (Xu y col. 2004). Tras la infeccin, se produce una gran expansin de linfocitos T CD8+ antiVACV. Los esplenocitos obtenidos ex vivo de un ratn inmunizado conVACVcontienenCTLespecficosCD8+ylisanclulasinfectadasinvitroconelvirus. Existe una gran cantidad de grupos, entre ellos el nuestro, interesados en el estudio de los mecanismos de presentacin antignica a linfocitos T CD8+ y la respuesta inmunefrenteavirus(FischeryNorbury2007). 2.4.3. EptoposdeVACVpresentadosporMHCdeclaseIalinfocitosTCD8+.
Los linfocitos T CD8 de memoria pueden proteger frente a la infeccin por VACV,
+

pero en una respuesta primaria parece que no son necesarios, siendo los linfocitos T CD4+ylosanticuerposlosqueconsigueneliminarelvirus(Xuycol.2004). Sinembargo,elestudiodeestarespuestainmunedeCTLestabadificultadoporel desconocimiento de los eptopos que reconocan. Una amplia variedad de tcnicas han sido utilizadas por diferentes grupos de investigacin con el objetivo de identificar eptopos que se presentan a linfocitos T CD8+. Estas tcnicas incluyen la prediccin de eptopos basndose en algoritmos, cromatografa y espectrometra de masas, libreras de pptidos, estrategias de clonaje y expresin gnica, etc. Dado el gran polimorfismo del MHC, se han identificado eptopos de VACV presentados por distintos alotipos utilizandodiferenteslneascelulareshumanasodiferentescepasderatn. Hasta la fecha se ha conseguido identificar ms de 200 determinantes antignicos para los linfocitos T CD8+ en el contexto de 7 alotipos diferentes de HLA (Oseroff y col.

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2005; Pasquetto y col. 2005; Terajima y col. 2006) y 5 alotipos murinos. En la cepa BALB/c se han descrito 54 determinantes presentados por las molculas H2 Kd, Ld y Dd (Tscharke y col. 2006; Oseroff y col. 2008). En el contexto murino de H2Kb y Db se han descrito recientemente 49 determinantes antignicos para los linfocitos T CD8+ (Tscharke y col. 2005; Moutaftsi y col. 2006) y en este trabajo se han utilizado 30 de los 49. Estos 30 eptopos derivan de 27 protenas que constituyen un subconjunto representativo de las protenas totales de VACV. Se han descrito 9 protenas de VACV que son inmunoprevalentes, es decir, que contienen eptopos presentados por varios alotiposdeH2odeHLA,delasquehemosanalizadoenestetrabajo5. 2.4.4. LosVACVrecombinantes(rVACV)enelestudiodelarespuestainmunecelulary comovectorvacunal. VACV posee un gran genoma que permite albergar insertos grandes de ADN forneo manteniendo su infectividad. Su ciclo replicativo facilita el procesamiento y presentacin al sistema inmune de las protenas de inters. Los rVACV tienen una alta capacidad para infectar un elevado nmero de tipos celulares y alcanzar niveles elevados de sntesis proteica. Adems permite que ocurran modificaciones post traduccionales, procesamiento, secrecin y transporte acordes con la estructura primaria de la protena expresada y el tipo celular (Moss 1996; Moss 2006). Los rVACV permiten estudiar la respuesta inmune y la proteccin frente a distintos agentes infecciosos, por lo que se han utilizado ampliamente para inducir CTL especficos en animales y para generar dianas reconocidas por CTL in vitro. En etapas tardas de la infeccinporVACVaparecenlosmayoresefectoscitopticos,yseasumequeengeneral disminuye la presentacin de antgenos por MHC de clase I y la presentacin directa de algunos eptopos tardos est bloqueada (Coupar y col. 1986; Tewalt y col. 2009), por lo que se recomienda el uso de promotores tempranos o tempranos/tardos para la induccindeCTLopreparacindedianasparaCTL. Estudios in vivo con animales infectados con rVACV permiten determinar la respuesta celular o humoral a protenas especficas. Existe un gran nmero de ejemplos en los que la inmunizacin de animales con rVACV que expresan antgenos tumorales o de otros patgenos virales ha proporcionado una proteccin total o parcial contra el

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tumor o la infeccin por lo que podran utilizarse como agentes de inmunoterapia en cncer o como vacunas vivas. La seguridad en humanos se ha abordado desarrollando vectoresdeinfectividadatenuada(GarciaArriazaycol.2011)omuyrestringidaaciertos tiposcelularesociertasespecies.Entrelasposiblesdificultadeshayquetenerencuenta el problema de la eficacia debido a la existencia de una poblacin previamente inmunizadafrente a la viruela (Ramrez ycol. 2000; Fischery Norbury 2007). Adems se haobservadoquelaproporcindelinfocitosTCD8+(ydeotrosagentesinmunes)frente a los antgenos propios de VACV es mayor que la que se produce frente a los antgenos recombinantes.

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Objetivos

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3. OBJETIVOS
Con el fin de estudiar la contribucin de las vas alternativas de presentacin antignica por las molculas de MHC de clase I a la respuesta de linfocitos T CD8+ antivirales, analizamos la presentacin de antgenos de VACV en el modelo de ratn C57BL/6.Nosplanteamoslossiguientesobjetivos: Identificar la respuesta inmune especfica de linfocitos T CD8+ de ratones deficientesenTAPfrenteaantgenosdeVACV. Cuantificar ex vivo la presentacin independiente de TAP de antgenos de VACValinfocitosTCD8+deratonesC57BL/6. Analizar ex vivo la activacin de linfocitos T CD8+ de ratones silvestres o deficientesenTAPpor30eptoposdeVACV. Generar in vitro lneas de CTL policlonales y especficas para cada uno de los 30 eptopos de VACV analizados y estudiar el reconocimiento de clulas dendrticasinfectadas,todoelloencontextosilvestreydeficienteenTAP. Estudiar la contribucin global del proteasoma y de la TPPII en el procesamiento de antgenos de VACV para su presentacin a linfocitos T CD8+deratonesC57BL/6. Estudiar la contribucin del proteasoma y otras proteasas en el procesamiento de eptopos individuales de VACV, especialmente de los que sepresentandeformaindependientedeTAP. Estudiar la proteccin frente a la infeccin por VACV en los ratones deficientesenTAP.

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Materialesymtodos

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4. MATERIALESYMTODOS
4.1. 4.1.1. Mediosdecultivo DMEM: medio Eagle modificado por Dulbecco (Biowhittaker) suplementado con glutamina(Biowhittaker)4mMysuerobovinofetal(SBF)al10%. RPMI 1640: medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (Biowhittaker) suplementado con glutamina 2 mM, mercaptoetanol (Merck) 5 x 105 M, y SBF al 10% paraelcultivodelneascelularesoSBFal5%inactivadoparaensayosfuncionales. MEM: medio esencial mnimo (Gibco) suplementado con glutamina 8 mM, mercaptoetanol 5x105M, penicilina (Biowhittaker) 100 U/mL, estreptomicina (Biowhittaker)100U/mL,kanamicina(Sigma)10g/mL,anfotericina(Sigma)2,5g/mL, ySBFinactivadoal10%. TripsinaEDTA: tripsina (Biowhittaker), 0,25% EDTA (Merck) al 0,02% (p/v) en PBS. Seutilizparasubcultivarlasclulasadherentes. PBS: solucin salina tamponada con fosfato: NaCl 137 mM, KH2PO4 1,5 mM, Na2HPO48mM,KCl2,7mM. 4.1.2. Productosqumicos. Lassalesinorgnicas,cidos,basesycompuestosorgnicos(metanol,etanol,etc.) fueron suministrados en su mayora por Merck, as como la sacarosa y la seroalbmina bovina(fraccinV). ElparaformaldehdofuesuministradoporElectronMicroscopySciences. Sigma fue el proveedor del dimetilsulfxido, el mercaptoetanol, el cristal violeta ylabrefeldinaA(BFA). En los ensayos de citotoxicidad se utiliz Na51CrO4 suministrado por Amersham PharmaciaBiotech. REACTIVOS

Materialesymtodos

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Se utilizaron distintos inhibidores de proteasas: los inhibidores del proteasoma, lactacistina (LC) y epoxomicina, fueron suministrados respectivamente por E. J. Corey (Harvard University, Cambridge, MA, EE.UU.) y por Calbiochem; el leucintiol, que inhibe metaloaminopeptidasas (sobre todo de tipo microsomal) (Weiss y col. 1988; Serwold y col. 2001), y la decanoilpeptidilclorometilcetona (decRVKRcmk), que inhibe especficamente a la endoproteasa furina localizada en el trans Golgi y a otras protein convertasasdelamismafamilia(StienekeGroberycol.1992),fueronsuministradospor Bachem.
Inhibidor BFA LC Epoxomicina Leucintiol decRVKRcmk Concentracin Inhibe enuso 10M TrnsitoporelaparatodeGolgi 10M Proteasoma(menoslaactividadde caspasa) 12M Proteasoma(principalmenteactividad quimiotrtica) 30M Metaloaminopeptidasas(sobretodo microsomales) 50M Protenconvertasas Reversibilidad Reversible Irreversible Irreversible Reversible Irreversible

Tabla5.Inhibidoresutilizadosenestatesis.
Se indica la concentracin en uso durante las infecciones virales, el proceso o proteasa que inhibenysureversibilidad.

La interleuquina 2 (IL2) recombinante humana fue generosamente suministrada porelNCIPreclinicalRepositorydelosNationalInstitutesofHealthdeEE.UU. ElkitIntraStainparacitometra(Dako)contieneunreactivoAfijadoryunreactivo B permeabilizador. Como alternativa utilizamos una solucin fijadora que contiene PBS con paraformaldehdo al 4% y una solucin permeabilizante que contiene PBS con paraformaldehdoal4%,saponinaal0,1%yseroalbminabovinaal1%. El yoduro de propidio, fluorocromo que se intercala en los cidos nucleicos y permite distinguir clulas permeables al paso de molculas, fue suministrado por BD Pharmingen. El factor estimulador de macrfagos y granulocitos, GMCSF, de Peprotech, se utilizparadiferenciarencultivolosprecursoresdelamdulaseaaDCinmaduras.

 4.1.3. Productosinmunoqumicos.

Materialesymtodos

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El anticuerpo monoclonal (mAb) de rata conjugado con isotiocianato de fluorescena(FITC)antiCD8murino(clnKT15)fueproporcionadoporProimmune.Se utilizenelensayodetincinintracelulardecitoquinas(ICS)diluido1/300. El mAb de rata conjugado con Alexa Fluor 647 antiCD3 murino (clon 17A2) y el mAb de rata conjugado con ficoeritrina antiIFN murino (clon XMG1.2) fueron suministrados por Becton Dickinson. Se utilizaron en el ensayo de ICS diluidos 1/300 o 1/200respectivamente. Los linfocitos T CD8+ se purificaron a partir de esplenocitos por seleccin negativa con el kit II de aislamiento de clulas T citotxicas CD8+ murinas (MACS, Miltenyi Biotech). 4.1.4. Pptidos. Los pptidos fueron sintetizados en un sintetizador de pptidos Applied Biosystems (modelo 433A) y purificados. La identidad se confirm mediante espectrometra de masas en un equipo de MALDITOF de Brcker Daltonics (modelo REFLEX) por el Dr. D. Lpez (Unidad de Protemica, Centro Nacional de Microbiologa, Instituto de Salud Carlos III, Madrid). Se comprob la homogeneidad de todos los pptidos mediante cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa en un equipoBIOCAD(Applera). El eptopo F8593, de secuencia KYKNAVTEL, procede de los aa 8593 de la protena F de la cepa Long del virus respiratorio sincitial (RSV) y se presenta por H2Kd murino(Changycol.2001). Los pptidos sintticos de VACV se corresponden con la secuencia descrita del correspondiente eptopo viral (Moutaftsi y col. 2006). Se nombraron indicando el nombredelgendeorigen.Cuandoseanalizaronvarioseptoposcontenidosenlamisma protena se indica con un nmero la posicin del primer aa del pptido en la secuencia de la protena. Se emplea el cdigo de una letra para los aa. Las caractersticas de los eptopos y de las protenas de las que derivan se resumen en la Tabla 22 y en la Tabla 23.

 EleptopoSIINFEKLderivadelosaa257264deOva. 4.1.5. Lneascelularesyclulasprimarias.

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Clulas 293Ld, 293Kd y 293Kb: fibroblastos embrionarios humanos derivados de la lnea celular HEK 293 transfectados con los alelos de MHC de clase I murinos Ld, Kd y Kb respectivamente y tratados con geneticina. Fueron cedidos por el Dr. J. W. Yewdell y el Dr. D. C. Tscharke (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EE.UU.). Son adherentesysecultivaronenDMEM. Clulas HeLaKd: clulas de adenocarcinoma epitelial humano transfectadas con el alelodeMHCdeclaseImurinoKdytratadascongeneticina.FueroncedidasporelDr.J. W.Yewdell.SonadherentesysecultivaronenDMEM. ClulasCV1:fibroblastosadherentesderindemonoverdeafricano(ATCC:CCL 70).SonadherentesysecultivaronenDMEM. Clulas MEFs: fibroblastos embrionarios de ratn C57BL/6. Son adherentes y se cultivaronenDMEM. Clulas dendrticas murinas derivadas de medula sea (BMDC): se generaron a partirdeprecursoresprocedentesdelamdulaseaextradadelosfmuresderatones sanos. Se crecieron en medio RPMI al 10% de SBF suplementado con antibiticos y con 200U/mLdeGMCSF,quesereaaditras3y6dasdecultivo.Ada7serecogieronlas clulasnoadherentes(Lutzycol.1999;Medinaycol.2009).LamaduracindelasBMDC se realiz mediante la adicin de 0,5g/mL de lipopolisacrido bacteriano (LPS) a da 7 de cultivo. Las BMDC generadas con GMCSF son fenotpicamente similares a las DC inflamatorias que se diferencian in vivo a partir de monocitos reclutados en el sitio de inflamacin o de infeccin. Son clulas fciles y reproducibles de obtener y se usan ampliamenteenestudiosdepresentacindeantgeno. Todas las clulas se crecieron a 37C en una atmsfera con 98% de humedad. Las clulascultivadasenRPMI1640secrecieronenunaatmsferacon5%deCO2,mientras que las clulas cultivadas en otros medios de cultivo se crecieron en una atmsfera con 9%deCO2. Las clulas adherentes se subcultivaron desprendindolas con una solucin de tripsinaversenotraslavarconPBS.

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Para almacenarlas, las clulas se resuspendieron en SBF con un 10% de dimetilsulfxidoysecongelaronennitrgenolquido. Todas las clulas estaban libres de micoplasmas. Se realizaron controles regulares deausenciademicoplasmasporreaccinencadenadelapolimerasa,PCR. 4.1.6. Virusvaccinia. LosvirusutilizadosenestatesisseresumenenlaTabla21. 4.2. PERMEABILIZACIN REVERSIBLE DE CLULAS CON ESTREPTOLISINA O Y

SAPONINA. La estreptolisina O (SLO) es una toxina producida por la bacteria Streptococcus pyogenes.Esunaprotenade69kDconcapacidaddegenerarporosenlamembranade las clulas sobre las que acta de forma reversible. El poro creado permite el paso de molculas de hasta 100 kD hacia el interior del citosol. La permeabilizacin con SLO de las clulas adherentes se realiz mediante incubacin a distintos tiempos a 37C en un tampn de permeabilizacin (KCl 130 mM, NaCl 10 mM, EGTA 2 mM, MgCl2 2 mM, ditiotreitol (DTT) 2 mM, y HEPES 5 mM, pH 7,3). El DTT de este tampn salino activa la SLO. Las clulas se lavaron dos veces a 4C con el tampn de sellado, que es el tampn descritoperosinDTTyconCaCl21mM(Walevycol.2001),yseanalizelporcentajede permeabilizacin. La saponina es un agente permeabilizante que se utiliza en protocolos de tincin intracelular con anticuerpos previa fijacin de las clulas. Tambin se han descrito ensayos funcionales con clulas no fijadas y permeabilizadas con bajas concentraciones de saponina (Johnson y col. 1996). El proceso de permeabilizacin se realiz a temperaturaambienteentampndepermeabilizacin(PBSconMgCl25mMysin Ca2+) empleando una concentracin de 107 clulas/mL. Las clulas se lavaron 2 veces en el tampn de sellado a 4C (PBS con MgCl2 5 mM y CaCl2 1 mM) y se mantuvieron en el mismo durante un tiempo de recuperacin entre 30120 min, tras lo cual se transfirieronamediodecultivo.

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El porcentaje de clulas permeabilizadas se determin inmediatamente tras los lavados, por microscopa ptica mediante tincin con azul tripano o por citometra mediantetincinconyodurodepropidio. 4.3. 4.3.1. Produccin,purificacinytitulacindevirus. Todos los virus se crecieron en monocapas de clulas CV1. Los extractos celulares fueron purificados por ultracentrifugacin en colchn de sacarosa (Johnstone y col. 2004). La titulacin de los virus o de los ovarios de animales infectados (tras ser homogeneizado mediante mtodos mecnicos y 5 series de congelacin y descongelacin) se realiz mediante dilucin seriada, inoculacin sobre clulas CV1 y tincinconcristalvioletaalas24h.Elttuloviralseexpresaenunidadesformadorasde placas(u.f.p.). 4.3.2. Infeccionesviralesycoinfecciones. Las diferentes lneas celulares se infectaron con rVACV siguiendo protocolos descritos (Eisenlohr y col. 1992) con algunas modificaciones. Las clulas adherentes se infectaronen200lalam.o.i.indicadaaunadensidadcelularde8x105clulas/pocillo de 4,5 cm2. Las BMDC se infectaron con VACV a una m.o.i. de 510 a una concentracin de 107 clulas/mL. La adsorcin viral se realiz durante 1 h a 37C con PBS con 0,1% seroalbmina bovina. El inculo viral se lav dos veces con PBS al 2%SBF, y la infeccin se desarroll en medio de cultivo entre 4 y 16 h, salvo que se indique otra diferente, a unaconcentracinaproximadade106clulas/mL. En el caso de coinfecciones y triples infecciones, los virus eran aadidos de forma simultnea durante la adsorcin a la m.o.i. indicada siguiendo el mismo protocolo que eninfeccionessimples. La adsorcin en presencia de inhibidores se realiz desde 20 min antes de la infeccin a una concentracin del inhibidor 5 veces superior a la concentracin en uso INFECCIONESVIRALES.

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durante el resto del proceso. Durante los lavados y la infeccin se utiliz la concentracinestndar(Tabla5). 4.4. Seutilizaronlassiguientescepasderatones: C57BL/6osilvestres(haplotipoH2b) BALB/c(haplotipoH2d). DeficientesenTAP1(TAP1/)B6.129S2Tap1tm1Arp/J(haplotipoH2b),(vanKaer ycol.1992),(Jackson,nmerodecatlogo002944). Deficientes en TPPII (haplotipo H2b). Fueron cedidos por la Dr. Gabrielle Niedermann. Aunque presentan una esperanza de vida corta, alteraciones degenerativas y una senescencia inmunohematopoytica (Huai y col. 2008), se han utilizadoenestudiosdepresentacindeantgeno(Firatycol.2007). Todas las cepas se criaron en la colonia del Centro Nacional de Microbiologa del Instituto de Salud Carlos III (Madrid, Espaa). Los ratones deficientes en TAP se criaron siempreenmicroaisladoresindependientes. De forma general los ratones se infectaron intraperitonealmente (i.p.) con 106 u.f.p. de VACV. Para determinar la respuesta en los ganglios poplteos se infectaron en las almohadillas plantares con 5 x 105 u.f.p./pata. Para el establecimiento de lneas de CTL policlonales los ratones se infectaron i.p. y de 3 a 4 semanas tras la infeccin se administr una dosis de recuerdo, y a partir de 3 4 semanas ms tarde se sacrificaron losratonesparaobteneresplenocitos. Losratonessesacrificaronenunaatmsferacondixidodecarbono. 4.5. 4.5.1. PurificacindelinfocitosTCD8+apartirdeesplenocitosobtenidosexvivo. La purificacin de linfocitos T CD8+ a partir de una preparacin de esplenocitos se llevo a cabo mediante seleccin magntica negativa con una mezcla de anticuerpos frente a CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, antiMHCclase LINFOCITOST. INMUNIZACINDERATONES.

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II, y Ter119 conjugados con biotina, empleando bolitas magnticas conjugadas a anticuerpo antibiotina. Los linfocitos T CD8+ no marcados se recuperan por elucin a travs de una columna imantada. El proceso de purificacin alcanza un rendimiento del 95%yseconsiguelaeliminacindeDCcontaminantes,entreotras. 4.5.2. Obtencin y mantenimiento de lneas de CTL policlonales monoespecficas de eptopos. Las lneas de CTL especficas se generaron in vitro de forma estndar a partir de esplenocitos de ratones BALB/c o C57BL/6 infectados con distintos VACV segn protocolosyadescritos(LpezyDelVal1997).LaseleccindeCTLespecficosdeunsolo eptopo se llev a cabo durante 5 das en presencia del pptido sinttico especfico, y al quinto da se aadi IL2 hasta 25 unidades/mL. La expansin y mantenimiento se realiz mediante reestimulacin semanal con esplenocitos pulsados con pptido y con IL2. EnconcretolalneadeCTLespecficosfrentealeptopoF8593delaprotenaFde lacepaLongdeRSVsegenerapartirdeesplenocitosderatonesBALB/cinfectadoscon VVF(Johnstoneycol.2004). Las condiciones particulares de generacin de las lneas de CTL monoespecficas de eptopos de VACV derivadas de ratones C57BL/6 y deficientes en TAP se explican en detalleenlosapartadosderesultados5.3.2y5.3.4. 4.5.3. EnsayosfuncionalesdepresentacindeantgenoaCTL. Los ensayos funcionales de presentacin antignica a CTL realizados son ensayos de tincin intracelular de citoquinas, ICS, en los que se detecta el efecto sobre la activacin de CTL, o ensayos de citotoxicidad, en los que se observa el efecto sobre la cluladiana.

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4.5.3.1. EnsayodeICSconlinfocitosTobtenidosexvivoyconlneasdeCTL. Los ensayos de ICS se realizaron segn mtodos ya descritos (Chen y col. 2000; Johnstone y col. 2004). Las clulas del lavado peritoneal (PECs), de ganglios linfticos o los esplenocitos obtenidos ex vivo o los linfocitos T CD8+ purificados a partir del bazo se incubaron con un exceso de pptido (106 M) o 3 x 105 clulas infectadas a una relacin efector: diana (E:D) 1:6 salvo que se indique otra diferente, durante 2 h sin BFA y en presencia de 10 g/mL de BFA durante 4 h ms. Las lneas de CTL monoespecficas (105 clulas)seincubaronconclulasinfectadasoconclulaspreincubadasconpptido(108 a109M)durante416haunarelacinestndarE:D1:5enpresenciadeBFA.Mediante ICS se cuantifica por citometra el IFN sintetizado por linfocitos T CD8+ activados y acumulado intracelularmente debido a la presencia de BFA en el cultivo. Tras la activacin, las clulas se marcaron con el mAb conjugado a FITC antiCD8 (y en algn caso con antiCD3), y tras la fijacin y permeabilizacin, con el mAb conjugado a ficoeritrina (PE) antiIFN. Las clulas marcadas se adquirieron en el citmetro de flujo FACSCanto (BD Biosciences) y se analizaron utilizando el programa informtico FACS DIVA(BDBiosciences).Losresultadosseexpresaroncomo elporcentajedeclulasCD8+ activadas que producen IFN del total de clulas CD8+, es decir, % IFN+CD8+/CD8+. El porcentaje de activacin neto se calcul tras restar el obtenido con los controles. En ensayos con inhibidores, el nivel de inhibicin se calcul mediante la frmula: 100 (% activacinnetoconinhibidorx100/%activacinnetosininhibidor). 4.5.3.2. Ensayosdecitotoxicidad. Los ensayos de citotoxicidad se basan en realizar una incubacin de CTL y clulas dianaquepresentanlosantgenosdeinters,lascualeshansidopreviamentemarcadas con el istopo radioactivo 51Cr, lo cual permite cuantificar la liberacin del istopo al sobrenadante del cultivo al ser lisadas las dianas por los CTL especficos (Brunner y col. 1968). Los ensayos de citotoxicidad se realizaron mediante procedimientos estndar ya descritos (Del Val y col. 1988). Para medir la radiactividad se utiliz un contador de radiacin gamma Packard Cobra II. Las determinaciones se realizaron por triplicado y se calcul la media. El porcentaje de lisis especfica de cada muestra se calcul a partir de

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la media dela lisis espontnea de las clulas diana en ausencia de CTL (Espontneas), la media de la lisis de la muestra (Muestra), y la media del valor mximo de radiactividad correspondiente al total de clulas marcadas (Mximas). Los valores de liberacin espontnearespectoalosdeliberacinmximafueronsiempreinferioresal20%. %LisisEspecfica=100x[(MuestraEspontneas)/(MximasEspontneas)] 4.6. Los resultados de varios ensayos se expresan como valores promedio y el error estndar de la media (SEM). Las diferencias estadsticas entre las medias de grupos experimentales se determinaron usando un test T de Student no pareado; se indica *, p < 0,05, **, p < 0,01, ***, p < 0,001. Mediante un anlisis estadstico de ROC (Receiver Operating Characteristic) se determin el valor sobre el cual aceptamos los valores como positivos. El anlisis estadstico de ROC genera una lista de distintos valores de corte que permiten una clasificacin dicotmica (positivos o negativos) de los valores del estudio segn sean superiores o inferiores al valor elegido en funcin de 2 propiedades operativas: la sensibilidad, que es la fraccin de verdaderos positivos, y la especificidad, que es igual al resultado de restar a uno la fraccin de falsos positivos (ZweigyCampbell1993).Ennuestroestudioseleccionamoscomoniveldecorteelvalor conunaespecificidaddel86%yunasensibilidaddel72%. La hidrofobicidad de los eptopos se calcul mediante la escala OMH (Optimal MatchingHydrophobicity)(SweetyEisenberg1983). LainformacinrelativaalasprotenasdeVACVydeloseptoposquecontienense obtuvo de las bases de datos Poxvirus Bioinformatics Resource (www.poxvirus.org) y UniProt Knowledgebase (www.uniprot.org)). La prediccin de una secuencia seal se analiz con el servidor SignalP 4.0 server (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) y la prediccin de regiones TM en las protenas de VACV con el servidor TMHMM Server 2.0 (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/). ANLISISESTADSTICOSYBASESDEDATOS.

Resultados

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5. RESULTADOS
5.1. 5.1.1. PermeabilizacindeclulasconestreptolisinaOysaponina. La protenaICP47 del virus HSV1 tiene la capacidad de bloquear selectivamentea los TAP humanos con una alta especificidad pero no a los murinos. Con el objetivo de conseguir un sistema de inhibicin de TAP que permita disminuir la presentacin de diferentes antgenos en diferentes lneas celulares y para distintos virus, se prob a bloquear TAP mediante ICP47 soluble. Para introducir este pptido en las clulas es necesario conseguir un mtodo de permeabilizacin que permita llevar a cabo ensayos depresentacinantignica. Se probaron 2 mtodos diferentes de permeabilizacin, con SLO y con saponina. Se probaron en clulas 293Kd distintas concentraciones de SLO y de saponina durante distintos tiempos de incubacin (5, 10 y 15 min). Transcurrido este tiempo, se lavaron en el tampn de sellado e inmediatamente se analiz el porcentaje de clulas permeabilizadas.Comosemuestraenla Figura 6A, tras 10 min de incubacin con SLO no se consigui permeabilizar las clulas 293Kd. Tampoco se observ un efecto de SLO en las clulas tras 5 y 15 min de incubacinytampocoenensayossobreclulasHeLaKd(datosnomostrados). Sinembargo,elporcentajedeclulaspermeabilizadassaumentabaamedidaque se incrementaba la concentracin de saponina. As, a partir de una concentracin de saponina superior a 0,02% conseguimos permeabilizar ms del 80% de las clulas en 10 min,determinadotantopormicroscopacomoporcitometra( Figura 6). Tras el tiempo de sellado (120 min), las clulas se pusieron en cultivo durante 23 das para controlar el crecimiento y la viabilidad celular. Las clulas 293Kd tratadasconsaponinanoseadheranalaplacaquedandoensuspensinysincapacidad de crecimiento, indicando que la permeabilizacin provocaba un dao celular irreversible. INHIBICINDETAPMEDIANTEICP47.

 A
%de clulas permeabilizadas 19 20 22 18 %de clulas permeabilizadas 18 35 83 96 99 100
10 0 102

Resultados

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B
8%

SLO(ng/ml) 0 20 100 500 Saponina(%) 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

0%saponina

31%

0,01% saponina

85%

0,02%saponina

104

106

Figura6.Lasclulas293KdsepermeabilizanconsaponinaperonoconSLO.
(A) Clulas 293Kd se incubaron con las concentraciones indicadas de SLO o saponina durante 10 min. Inmediatamente tras el lavado, se analiz la permeabilizacin de las clulas mediante tincin con azul de tripano por microscopa. (B) Clulas 293Kd se incubaron con saponina durante 10 min y tras el lavado se analiz el porcentaje de clulas permeabilizadas mediante tincin con yoduro de propidio por citometra de flujo. En el grfico se indica el porcentaje de permeabilizacin para cada concentracin de saponina. Se muestra un experimento representativo.

Aunque el dao celular era irreparable en trminos de capacidad de proliferacin, quisimos analizar si las clulas permeabilizadas podan ser infectadas y presentar eptopos a CTL en ensayos cortos de presentacin de antgeno. Las clulas 293Kd se incubaronprimeroconsaponinayluegoconelpptidosintticoF8593,oseinfectaron con el virus VVFsig. Mediante ensayos de ICS, se analiz la presentacin a CTL especficos del eptopo F8593 de la protena F por estas clulas permeabilizadas. En la Figura 7 se observa que las clulas tratadas con saponina presentaban tanto el pptido sinttico como el eptopo viral; sin embargo, el porcentaje de CD8+ que sintetizan IFN disminuaamedidaqueaumentabalaconcentracindesaponina.

Resultados

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Figura 7. Activacin de CTL por antgenos presentadosporclulaspermeabilizadas.

Mediante ICS se analiz la presentacin a CTL especficos del eptopo F8593 por clulas 293Kd permeabilizadas con saponina durante 10 min a las concentraciones indicadas e infectadas con VVFsig durante 3 h a m.o.i. 3 8 (columnas blancas) o incubadas con 10 M del pptido sinttico (columnas negras). Se indica el porcentaje de permeabilizacin celular obtenido para cada porcentaje de saponina. Se muestra un experimento representativo.

Sospechbamos que slo podan infectarse y presentar antgenos a CTL las clulas nopermeabilizadas.Estahiptesisseconfirmmediantetincinconyodurodepropidio de clulas permeabilizadas con saponina e infectadas con un rVACV que expresa una variante de la protena verde fluorescente (VVGFPJaw1Ova). Las clulas permeabilizadas con 0,02% y 0,03% de saponina (teidas con yoduro de propidio) no se infectaban ya que no expresaban la protena verde (datos no mostrados), mientras que s se infectaban el pequeo porcentaje de clulas no permeabilizadas. Estos datos demuestran que la permeabilizacin con saponina no permite la infeccin y la posterior presentacindeantgenoaCTL. 5.1.2. Efecto de la inhibicin de TAP en la presentacin antignica empleando un rVACVqueexpresaICP47. ConelobjetivodeconseguirunsistemaalternativoparabloquearTAPseutilizun rVACV que expresa la molcula ICP47, con el cual infectamos lneas celulares humanas. Este sistema nos permitira estudiar la presentacin independiente de TAP a linfocitos T CD8+ de mltiples antgenos virales presentados por diversas molculas de MHC de clase I, coinfectando las clulas con varios rVACV que expresasen el antgeno y la molculapresentadoradeinters. Se coinfectaron clulas humanas HeLa con 3 rVACV: el rVACVICP47, el VVFsig que expresa la protena Fsig que contiene el eptopo F8593, y el rVACVKd que expresa la molcula de MHC de clase I presentadora. La protena Fsig es la protena F de RSV

Resultados

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perosinsecuenciaseal,ysueptopoF8593sepresentaslodeformadependientede TAP.Traslainfeccin,lasdianassemarcaroncon51CryseenfrentaronaCTLespecficos deF8593enunensayodecitolisis(Figura8).NingunodelosrVACVdeformaindividual provocaba la lisis de las clulas por los CTL (datos no mostrados), como era esperable. Sin embargo, la triple infeccin con el rVACVICP47 provoc una inexplicable potenciacindelapresentacindeleptopoF8593.Portanto,noobservamosunefecto inhibidorespecficoderVACVICP47sobreTAPylapresentacindelantgenoF8593.

Figura 8. rVACVICP47 no inhibe la presentacin dependiente de TAP en un sistema de infeccintriple.

Clulas HeLa se coinfectaron durante 3 h de forma simultnea con diferentes combinaciones de los rVACV que expresan respectivamente: Kd (m.o.i. 3), la protena Fsig (m.o.i. 3) e ICP47 (m.o.i. 10)segnseindica.Traslainfeccin,lasclulasseincubaroncon51Crysecocultivaron103dianas marcadas con CTL especficos de F8593 a diferentes relaciones E:D. Se muestra un experimento representativo.

A continuacin, se ensay un sistema de doble infeccin, analizando la presentacin del antgeno F8593 a CTL especficos por clulas 293Kd humanas coinfectadas con el virus VVFsig y con rVACVICP47 (Figura 9). No se observ una disminucin especfica en la presentacin de F8593 al coinfectar con rVACVICP47 respecto a la presentacin total del eptopo a partir de Fsig. Se obtuvieron los mismos resultadosenensayosde3hy6hdecoinfeccin(datosnomostrados).Concluimosque el rVACVICP47 no es til como mtodo para bloquear la presentacin de eptopos dependientesdeTAPmedianteunsistemadedobleotripleinfeccin.

Resultados

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Figura 9. rVACVICP47 no inhibe la presentacin dependiente de TAP en un sistemadedobleinfeccin.

La lnea de CTL F8593 se estimul con clulas 293Kd coinfectadas durante 1 h con el virus VV Fsig (m.o.i. 3) y con rVACVICP47 (m.o.i. 2040) enunsistemadedobleinfeccinsegnseindica. MedianteICSsedeterminlaproduccindeIFN como medida de la activacin de los linfocitos T CD8+. Datos obtenidos de 2 ensayos independientes.

5.1.3. Efecto de la inhibicin de TAP en la presentacin de un eptopo propio de VACV empleandoelrVACVqueexpresaICP47. El rVACVICP47 deriva de la misma cepa que el VACV WR excepto que expresa la molcula de interferencia ICP47. Mediante un protocolo de infeccin simple, clulas 293Kb se infectaron con WR o rVACVICP47 y se realizaron ensayos de presentacin del eptopo de VACV dependiente de TAP, B8R, presentado por H2Kb a CTL especficos. ICP47bloquetotalmentelapresentacindeleptopoB8Renlasclulashumanas293Kb infectadas con rVACVICP47. Como control las dianas infectadas con rVACVICP47 e incubadas con el pptido sinttico B8R s eran capaces de activar los CTL especficos (Figura 10A). Adems, se control la presentacin del eptopo B8R por fibroblastos murinos embrionarios, MEF, infectados con rVACVICP47, en los que ICP47 no se une a TAP (datos no mostrados). Estos datos indican que la protena ICP47 era funcional en el rVACVICP47 ya que bloquea TAP y disminuye la presentacin endgena de eptopos dependientes del transportador mediante un sistema de infeccin simple, en el que el antgenoeICP47sonexpresadosporelmismorVACV. Estos datos nos llevaron a analizar de nuevo un sistema de coinfeccin con la diferencia de que el antgeno y la molcula de interferencia se localicen en el mismo rVACV.Serealizaronensayossimilaresconclulas293transfectadasconelaleloLd(que no presenta el eptopo B8R) coinfectadas con rVACVKb y con rVACVICP47 y se observ de nuevo una inhibicin especfica de la presentacin del eptopo B8R (Figura 10B). Concluimos que el rVACVICP47 expresa ICP47 y que es capaz de inhibir la presentacin

Resultados

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de eptopos virales dependientes de TAP que se expresan de forma simultnea por el mismovirusrecombinante,tantoenunsistemadeinfeccinsimplecomoenunsistema decoinfeccin.

Figura 10. rVACVICP47 inhibe la presentacin del eptopo B8R cuando se expresa de formasimultneaconICP47.
SeanalizmedianteICSlapresentacindeleptopoB8RenA)unsistemadeinfeccinsimplede clulas 293Kb con WR o con rVACVICP47 durante 4 h a m.o.i. 10 o B) un sistema de coinfeccin de las clulas 293Ld con rVACVKb (m.o.i. 3) y con rVACVICP47 (m.o.i. 10) durante 4 h que se enfrentaron a CTL especficos antiB8R. Como control, las clulas infectadas se incubaron con el pptidoB8R108M.SeindicaelporcentajedelinfocitosTCD8+queproducenIFNcomomedida delaactivacin.Semuestraunexperimentorepresentativoencadacaso.

Mientras tenamos las dificultades descritas para desarrollar un sistema verstil para analizar mediante ICP47 la presentacin de antgenos independiente de TAP, decidimos probar con el modelo de ratn genticamente deficiente en TAP. Dados los buenosresultadosobtenidos,elrestodeltrabajoexperimentalserealizenesesistema ysedescribeenlassiguientesseccionesdeestamemoria.

 5.2.

Resultados

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IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE LA PRESENTACIN INDEPENDIENTE DE

TAPDEANTIGENOSDEVACV. 5.2.1. Respuesta primaria especfica de linfocitos TCD8+ deficientes en TAP frente a clulasinfectadasporVACV. Se acepta generalmente que la principal fuente de antgenos presentados por MHC de clase I son pptidos citoslicos que acceden al RE a travs del transportador TAP. Sin embargo, se han descrito tanto vas de presentacin de antgenos que no requieren TAP, como la presencia de linfocitos T CD8+ especficos de algunos antgenos en ratones y seres humanos genticamente deficientes en TAP. El objetivo de nuestro trabajo es estudiar la relevancia de rutas alternativas de presentacin de antgenos de VACV por MHC de clase I. Como parte principal de nuestro trabajo, analizamos la contribucindelasrutasindependientesdeTAP. Para ello, estudiamos la respuesta inmune global de linfocitos T CD8+ frente a la infeccin por VACV en el modelo de ratn deficiente en TAP. Para detectar la respuesta serealizaronensayosdeICSexvivoenlosqueanalizamossiPECs,esplenocitosoclulas de los ganglios linfticos se estimulaban por antgenos presentados por BMDC TAP+ o TAP infectadas con el virus, ya que se ha descrito que las BMDC infectadas con VACV pueden activar de forma directa a linfocitos T CD8+ (Yates y AlexanderMiller 2007; Xu y col.2010). Tras la infeccin i.p. y en las almohadillas plantares detectamos a los 7 d.p.i. una poblacin de linfocitos TCD8+ en el peritoneo, en los ganglios poplteos y en el bazo de los ratones deficientes en TAP, que se activaban al reconocer las clulas infectadas por VACV, tal como se muestra en la Figura 11A. A pesar de que los ratones deficientes presentan una reduccin aproximadamente de 10 a 20 veces enel nmero de linfocitos TCD8+ respecto a los ratones C57BL/6, aproximadamente un tercio de los linfocitos TCD8+ del peritoneo de los ratones deficientes en TAP y un 3% del bazo se activaron tras la estimulacin (Figura 11B). Las BMDC TAP infectadas estimulaban el mismo porcentaje de linfocitos TCD8+ que las BMDC TAP+ infectadas, sugiriendo la existencia de eptopos independientes de TAP e indicando que se procesan aproximadamente con la misma eficiencia en ambos tipos de clulas presentadoras (Figura 11B). Observamos

Resultados

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el mismo porcentaje de activacin de linfocitos TCD8+ en el bazo o en el peritoneo de ratones deficientes en TAP cuando se infectaron nicamente por va i.p. As, todos los ensayosposterioresserealizaronconratonesinmunizadosexclusivamenteporvai.p.

Figura 11. La infeccin por VACV induce en los ratones deficientes en TAP una respuestaespecficadelinfocitosTCD8+quereconocenclulasinfectadasconelvirus.
Se analiz la respuesta aguda primaria de linfocitos T CD8+ 7 das tras la infeccin i.p. con 106 u.f.p. y 5 x 105u.f.p./pata con VACV. Mediante ensayos de ICS ex vivo se analiz la produccin de IFN por las clulas de lavado peritoneal, bazo y ganglios drenantes extrados de ratones deficientes en TAP e infectados, tras ser cocultivadas con BMDC TAP+ o TAP infectadas. A, poblacin de linfocitos TCD8+ de diferentes rganos de un ratn deficiente en TAP e infectado representativo estimulado con ambos tipos de BMDC infectadas. En el cuadrante superior derechosemuestraelporcentajedelinfocitosTCD8+queseactivan.B,Lasgrficasrepresentan la media y el SEM de los porcentajes de IFN producidos por los linfocitos TCD8+ especficos frenteaclulasinfectadasTAP+oTAPen6ensayos.n.s.,nosignificativo.

5.2.2. Respuesta primaria especfica de linfocitos TCD8+ silvestres frente a clulas deficientesenTAPeinfectadasporVACV. Paraanalizarsiloseptoposprocesadosdeformaindependientedeltransportador en las clulas infectadas eran capaces de activar linfocitos TCD8+ de ratones silvestres,

Resultados

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se realizaron ensayos similares de ICS ex vivo. As, tras la infeccin con VACV, detectamos tambin en el peritoneo y en el bazo de ratones C57BL/6 una poblacin de linfocitos TCD8+ que producan IFN tras la estimulacin con ambos tipos de BMDC infectadas (Figura 12A). La activacin de los linfocitos TCD8+ silvestres era mayor cuando se enfrentaban a BMDC TAP+ infectadas que cuando se presentaban a dianas infectadasquecarecandeTAPperoaproximadamenteunterciodeloslinfocitosTCD8+ que se activaban en respuesta a clulas infectadas con VACV lo hacan de forma independiente de TAP (Figura 12B). Por tanto, aunque los ratones silvestres respondan mejor a clulas que pueden realizar la ruta clsica de presentacin de antgeno dependiente de TAP, parecen existir vas que no requieren TAP y que activan linfocitos TCD8+. Estas vas independientes de TAP seran las que activan tambin a linfocitos T CD8+enlosratonesdeficientesenTAP.

Figura 12. Los linfocitos TCD8+ de ratones silvestres reconocen BMDC deficientes en TAPeinfectadasconVACV.
LarespuestaprimariadeloslinfocitosTCD8+deratonessilvestresfrentealainfeccinporVACV fueanalizadacomoenlaFigura11.SedeterminmedianteICSexvivolaproduccindeIFNpor lasPECoporlosesplenocitosfrenteaBMDCinfectadasTAP+oTAP.EnA,semuestraunensayo representativo de la activacin de los linfocitos TCD8+ detectado en un ratn silvestre. Los nmerosenloscuadrantesrepresentanelporcentajedelinfocitosTCD8+queproducenIFN.La cuantificacin del porcentaje de linfocitos TCD8+ especficos frente a BMDC TAP o TAP infectadas se representa en B. Datos obtenidos de 6 experimentos con esplenocitos y 3 experimentosconlavadoperitoneal.

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En ratones C57BL/6, slo el 3040% de las PECs o el 1015% de los esplenocitos son linfocitos T CD8+. Entre las clulas restantes hay APC profesionales, que podran interferir con los resultados cuando estas poblaciones se enfrentan a clulas infectadas que carecen de TAP. Por ejemplo, las APC TAP+ podran fagocitar las BMDC TAP infectadas y hacer presentacin cruzada a los linfocitos T CD8+ TAP+ de los ratones C56BL/6. OtraposibilidadesquevirusinfecciosoresidualoproducidoenlasBMDCTAP infectadas pudiese infectar secundariamente a las APC TAP+ y as presentar antgenos viralesdeformadirectaydependientedeTAPaloslinfocitosTCD8+TAP+delosratones C56BL/6(Figura13).

Virus

BMDC TAP+

Infeccin secundaria BMDC TAP-

Linfocito T CD8+ Fagocitosis

Figura 13. Posibles rutas de presentacin directa y cruzada de antgenos de VACV a linfocitosTCD8+ennuestrosistema.
El objetivo experimental es detectar la presentacin directa e independiente de TAP por BMDC TAP infectadas (negro) a linfocitos T CD8+ del bazo de un ratn silvestre previamente infectado. Sinembargo,ennuestrasmuestraspodanocurrirotrassituaciones:LaBMDCTAP+existentesen los esplenocitos se infectaran de forma directa con virus residual o de forma secundaria con virus liberado de las BMDC TAP infectadas. Estas clulas procesaran de forma endgena y dependiente de TAP el antgeno viral y lo presentaran a linfocitos T CD8+ de forma directa. Por otro lado, las BMDC TAP+ podran incorporar por fagocitosis los restos de BMDC TAP infectadas circundantesypresentarlosdeformacruzadaalinfocitosTCD8+.

Quisimos controlar si la activacin de los linfocitos TCD8+ observada en nuestros ensayos se produca por la presentacin directa e independiente de TAP de antgenos por las BMDC TAP infectadas. Para ello, se realizaron ensayos de ICS ex vivo en los que enfrentamosesplenocitosobtenidosderatonesC57BL/6(conhaplotipoH2b)conBMDC singnicasinfectadas(dehaplotipoH2b)TAP+oTAPoconBMDCderatonesalognicos

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BALB/c (con haplotipo H2d) infectadas con el virus. Sorprendentemente, los linfocitos TCD8+ de la mezcla de esplenocitos se activaban inespecficamente frente a las BMDC alognicasH2dinfectadasdeformasimilaraloqueseobservabaenpresenciadeBMDC singnicas TAP infectadas (Figura 14A). Por ello, purificamos los linfocitos T CD8+ medianteseleccinnegativaapartirdelaspoblacionescelularesurganosexvivo. En la Figura 15 se muestran poblaciones representativas de linfocitos T CD8+ purificados, demostrando que son viables para ensayos de presentacin de antgeno. Tampoco observamos ninguna alteracin morfolgica ni funcional de los linfocitos T CD8+ purificados y stos expresaban niveles de IFN similares a los linfocitos TCD8+ no purificados. El hecho de que l % de linfocitos activados observado sea mayor cuando utilizamos esplenocitos puede deberse a que las APC presentes en ellos podran disminuir la relacin E:D respecto a la que se mantiene durante el cocultivo con los linfocitospurificados.EnlaFigura15semuestraunexperimentorepresentativo,yenla Figura 14B la media de 6 experimentos con los linfocitos T CD8+ purificados, observndose que la activacin inespecfica por las BMDC H2d infectadas desapareca, mientras que se mantena el reconocimiento singnico de las BMDC infectadas de haplotipoespecficoH2b,incluidaslasBMDCTAPinfectadas. Figura 14. La purificacin de linfocitos T CD8+ efectores es un paso necesario para identificar la poblacin que se activa especficamente al reconocer ligandos unidos a H2b que no requierenTAP.
Los esplenocitos (A) o los linfocitos TCD8+ purificados del bazo (B) de ratones C57BL/6 infectados con WR, seestimularoncon3x105BMDCH2b TAP+, H2b TAP o con BMDC TAP+ con haplotipo H2d, infectadas en todos los casos con VACV. La produccin de IFN como medida de la activacin se determin mediante ICS ex vivo. Los datos obtenidos se muestran como mediade6experimentos.

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Figura 15. Los linfocitos T CD8+ purificados son viables y permiten realizar ensayos de presentacindeantgeno.
Se muestra una poblacin representativa de linfocitos T CD8+ purificados del bazo de ratones C57BL/6infectadosconWRyreestimuladoscon3x105BMDCH2bTAP+,H2bTAPoconBMDC TAP+conhaplotipoH2d,infectadasentodosloscasosconVACV.Sedeterminlaproduccinde IFNmedianteICSexvivocomomedidadelaactivacin.

Como control, se observ que los esplenocitos y linfocitos TCD8+ purificados del bazo de ratones BALB/c infectados se activaban con BMDC H2d infectadas indicando la capacidadpresentadoradeantgenosviralesdeestasltimas(Figura16). Figura16.Controldepresentacin de antgeno por BMDC infectadas a linfocitos T CD8+ en el haplotipo H2d.
Esplenocitos o linfocitos T CD8+ purificados del bazo de ratones BALB/c infectados con WR, se estimularon con 3 x 105 BMDC derivadas de la misma cepa de ratn sin infectar o infectadas con el virus (tal y como se describe en las figuras 14 y 15). Se determin la produccin de IFN mediante ICS ex vivo como medidadelaactivacin.

Estos resultados indican que cuando habamos utilizado esplenocitos de los ratones C57BL/6, las APC presentes en ellos, haban interferido con la interpretacin de losresultados.Concluimosquetenamosevidenciasclarasdeunapresentacindirectae independiente de TAP pero que para realizar una cuantificacin ms exacta era necesariopurificarloslinfocitosTCD8+.

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5.2.3. Cuantificacin global de la presentacin directa e independiente de TAP de antgenosdeVACV. Con el fin de cuantificar de una forma ms exacta la contribucin de la presentacin de antgeno directa e independiente de TAP a la respuesta global de linfocitos TCD8+ silvestres frente a VACV, analizamos la activacin de los linfocitos TCD8+ purificados del bazo de ratones silvestres infectados tras la estimulacin con distintascantidadesdeBMDCTAP+oTAP(Figura17B)medianteensayosdeICSexvivo. SeusaronBMDCH2dinfectadasparacontrolarlaausenciadeactivacininespecfica.El mismoensayoserealizconlosesplenocitostotales(Figura17A).

Figura 17. Cuantificacin de la respuesta especfica de linfocitos T CD8+ frente a antgenosdeVACVquesiguenvasindependientesdeTAP.

Los esplenocitos (A) o los linfocitos T CD8+ purificados del bazo (B) de ratones C57BL/6 infectados con WR, se estimularon con BMDC de haplotipo H2b derivadas de ratones C57BL/6 (crculos) o deficientes en TAP (tringulos) o con BMDC de haplotipo H2d derivadas de ratones BALB/c (cuadros), infectadas con VACV, como clulas presentadoras de antgenos. Se analiz la respuesta primaria (7 das tras la infeccin) midiendo la produccin de IFN por ICS a diferentes relaciones E:D. Los grficos representan la media y el error estndar de 6 experimentos distintos.

En los ratones deficientes en TAP no se realiz la purificacin de los linfocitos T CD8+. Los bazos de estos ratones tienen tan solo un 12% de CD8+, por lo que es difcil aislarlos por seleccin negativa, obtenindose slo un 3040% de pureza tras la

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purificacin. Este problema metodolgico impidi discriminar si la activacin de los linfocitos T CD8+ de los ratones deficientes se deba a antgenos presentados de forma directa por las APC que carecen de TAP, o por la presentacin cruzada de antgenos, sin embargo,encualquieradeloscasosseranmecanismosindependientesdeTAP. Los linfocitos T CD8+ H2b silvestres no reconocen antgenos presentados por las clulasH2dinfectadasaningunarelacinE:D,sinembargosreconocenantgenosenla superficiedeBMDCH2binfectadas.Comparandoporcentualmentelarespuestafrentea BMDC TAP infectadas respecto a la respuesta total (representada por la respuesta frente a BMDC TAP+ infectadas) se estima que aproximadamente un 13% de los linfocitosTCD8+querespondenfrenteaVACVseactivanporantgenospresentadospor vasindependientesdeTAP(Figura17ByFigura18). Figura 18. Extensin de la respuesta de linfocitos T CD8+ activados por antgenos de VACV que no requieren TAP para su presentacin.
En el grfico se muestra la contribucin de las vas independientesdeTAPalarespuestaglobalfrentea antgenos de VACV de linfocitos T CD8+ en un ratn C57BL/6. Resumen de los datos obtenidos de 6 experimentos.

5.3. IDENTIFICACIN DE LOS EPITOPOS DE VACV QUE SE PRESENTAN DE FORMA

INDEPENDIENTEDETAP. 5.3.1. Respuesta primaria de linfocitos TCD8+ especficos frente a eptopos individualesdeVACV. Habiendo demostrado que una parte de los linfocitos TCD8+ silvestres responden ex vivo a antgenos que se presentan de forma independiente de TAP, quisimos ver si esta respuesta se deba a la presentacin de algn eptopo dominante o la combinacin de varios de similar fortaleza. Se han descrito recientemente 49 eptopos de VACV restringidosporH2bmurino(Tscharkeycol.2005).Ordenamosloseptoposdemayora menorsegnelvalordeICSdescritooensudefectoelvalordeELISPOT(Tscharkeycol. 2005) y elegimos los 25 primeros eptopos. Seleccionamos tambin el eptopo A19L del

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que se haba descrito previamente activacin in vivo de linfocitos TCD8+ (Moutaftsi y col. 2006). Elegimos adems otros 3 eptopos que derivan de protenas de membrana y 1 que deriva de una protena citoslica, por razones diversas. Los eptopos seleccionados dan cuenta de ms del 90% de la respuesta global frente a VACV en el contextodeH2b. ConelobjetivodeestudiarlarespuestaprimariadelinfocitosTCD8+frenteacada uno de los eptopos individuales seleccionados, se cultivaron las PECs de ratones C57BL/6 o deficientes en TAP infectados i.p. 7 das antes con VACV y se estimularon ex vivo con cada uno de los pptidos sintticos correspondientes. La produccin de IFN por los linfocitos TCD8+ activados se midi mediante ensayos de ICS. Los 30 pptidos analizados activaban linfocitos TCD8+ procedentes de ratones C57BL/6 infectados con VACV y, de manera interesante, 12 de estos inducan adems la respuesta en ratones deficientesenTAPeinfectados(Figura19). Los eptopos L2R53, A19L, F5L y A38L activaban un % de linfocitos TCD8+ similar en ambos ratones y curiosamente el eptopo J3R pareca ms eficiente en los ratones que carecen de TAP. Los eptopos G8R, A8R189, A6L, A23R, A25L, F13L y E8R activaban un % de CD8+ mayor en los ratones silvestres. En la Figura 20 podemos observar el patrn de respuesta frente a los 12 eptopos independientes de TAP de cada uno de los ratones analizados de forma individual. La jerarqua de inmunodominancia en los ratones deficientes en TAP es claramente diferente a la que aparece en ratones silvestres, siendo J3R el eptopo inmunodominante en la respuesta de los ratones deficientesenTAP(Figura21).

Figura 19. La infeccin por VACV induce en los ratones deficientes en TAP una respuesta especfica de linfocitosTCD8+quereconocen almenos12eptoposvirales.
Se analiz la respuesta aguda primaria de linfocitos T CD8+ derivados de ratones C57BL/6 (blanco) o deficientes en TAP (negro) infectados con WR frente a 30 eptopos de VACV. Mediante ICS ex vivo se determin la produccin de IFN en 12 x 106 clulas del lavado peritoneal estimuladas con los 30 pptidos sintticos (106 M). Las columnas muestran el valor promedio del porcentaje de linfocitos T CD8+ que se activan frente a cada eptopo. Se analizaron un mnimo de 3 ratones por grupo y poreptopo.Elvalorapartirdelcual sedancomopositivoslosvalores,se calcul mediante un estudio de ROC yseindicaconunalneanegra.

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Figura 20. Respuesta individual de ratones infectados C57BL/6 y deficientes en TAP frente a los 12 eptopos de VACV que no requierendeTAP.
La produccin media de IFN de los linfocitos T CD8+ est mostrada en la Figura 19. El grfico muestra la respuesta individual de produccin de IFN de los linfocitos T CD8+ de los ratones C57BL/6 (crculos) y deficientes en TAP (tringulos) infectados con WR tras la estimulacin con los 12 pptidos sintticos. Como control se muestra alaizquierdalarespuestafrentea3 eptoposdependientesdeTAP(B8R, A47L y K3L). Las lneas horizontales indican los valores medios de cada grupo.

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Figura 21. La jerarqua de inmunodominancia en los ratones deficientes en TAP es diferente a la observada enratonessilvestres.
Las columnas muestran el valor promedio del porcentaje de linfocitos T CD8+ que se activan frente a cada eptopo en PECs que derivan de ratones deficientes en TAP infectados.Elordenjerrquico se establece en base a los datosdelaFigura19.

5.3.2. Establecimiento in vitro de lneas de CTL especficas frente a eptopos de VACV derivadasderatonesC57BL/6yreconocimientodeBMDCinfectadas. Hemos demostrado que varios pptidos de VACV pueden activar linfocitos TCD8+ en ratones que no expresan TAP. Para analizar si estos eptopos pueden ser procesados y presentados en las BMDC infectadas nos propusimos generar in vitro lneas de CTL monoespecficas de cada uno de los 30 eptopos analizados para realizar ensayos de presentacinantignicaencultivocelular. LamayoradelaslneasdeCTLsegeneraronapartirdeesplenocitosobtenidosde ratones infectados con WR oB8R y que estaban ya en un estado de memoria tras una infeccinsecundaria.ElvirusmutanteB8Rseutiliz,enlamayoradeloscasos,parala inmunizacin secundaria, para intentar reducir la expansin de CTLs especficos para el eptopo B8R, inmunodominante y dependiente en TAP, generado en la respuesta primaria frente a WR. Algunas lneas de CTL se obtuvieron tambin a partir del bazo de ratones inmunizados con WR en el periodo de respuesta aguda primaria (7 d.p.i.). De forma general, se utilizaron concentraciones de pptido sinttico entre 108 M y 1010 M paraestimularlaslneasyseseleccionlaptimaencadacaso(Tabla6).


Agentedela primera inmunizacin WRoB8R WR WR B8R/ mDCA38L WR WR B8R B8R B8R WRoB8R/ mDCA8R189 B8R/ mDCA8R70 B8R WR WR WRoB8R WR WRoB8R WRoB8R/ mDCD1R282 B8R B8R WRoB8R/ mDCE8R WRoB8R/ mDCF13L B8R B8R B8R WRoB8R B8R WR WR WRoB8R/ mDCL2R61 rganode b origen Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazoo mdulasea Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazo Bazoo mdulasea Bazo Bazo Bazoo mdulasea Bazo

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Eptopo A19L(4755) A23R(297305) A25L(261274) A38L(203210) A3L(270277) A42R(8896) A47L138146 A51R(7885) A6L(265272) A8R(189196) A8R(7077) B16R(275283) B1R(9299) B2R(5462) B6R108116 B8R(2027) C4L(125132) D1R(282290) D1R(578586) E7R(130137) E8R(141150) F13L(307315) F1L(200207) F5L(279287) G8R(3441) J3R(289296) J6R(9931000) K3L(615) L2R(5361) L2R(6169)

Estado memoria aguda1 aguda1ymemoria memoria/ aguda2 memoria memoria memoria memoria memoria aguda1ymemoria/ aguda2 memoria/ aguda2 memoria memoria memoria aguda1ymemoria memoria aguda1 memoria/ aguda2 memoria memoria memoria/ aguda2 memoria/ aguda2 memoria memoria memoria aguda1ymemoria memoria memoria aguda1ymemoria memoria/ aguda2

Concentracin c depptido 109M 108M 109M 108M 109M 109M 109M 109M 109M 109M 108M 109M 109M 108M 109M 109M 108M Noespecfica 109M 109M Noespecfica 1010M 109M 1010M 108M 109M 109M 109M 109M Noespecfica

Tabla 6. Lneas de CTL derivadas de ratones C57BL/6 generadas para realizar ensayos depresentacinantignica.
Las lneas de CTL monoespecficas se nombraron como el eptopo frente al cual se generan. El a agente utilizado en la mayora de las inmunizaciones secundarias fue B8R. La respuesta aguda primaria (1) se refiere a 7 d.p.i. tras la primera inmunizacin, la agudasecundaria (2) se

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refierea6d.p.i.traslasegundainfeccinyladememoriaserefierea3semanastraslasegunda infeccin. b Las lneas derivadas de clulas de mdula sea proceden siempre de un estado de memoria tras la infeccin secundaria. c Se indica la concentracin de pptido ptima utilizada durantelareestimulacin.

La especificidad de cada lnea de CTL generada se comprob mediante la deteccin del IFN intracelular producido por los CTL en respuesta a la estimulacin por BMDC cargadas con 108 M del pptido sinttico. Consideramos que las lneas de CTL eran especficas cuando como mnimo un 6580% de los linfocitos TCD8+ se activaban deformaespecficafrentealpptidosinttico.As,partiendodeesplenocitosderatones C57BL/6 infectados con VACV conseguimos generar lneasde CTL especficas para27 de lospptidosanalizados. No conseguimos obtener lneas de CTL especficas para los eptopos L2R61, D1R282 ni E8R a partir de ratones C57BL/6. Por el contrario s obtuvimos una lnea de CTLespecficafrenteaE8RapartirdelbazodeunratndeficienteenTAP(verapartado 5.3.4). Para obtener algunas lneas de CTL concretas se probaron distintos agentes de inmunizacin,odistintosrganosdeorigen.Comoalternativaalaprimerainfeccincon el virus, se prob la inmunizacin con BMDC maduradas con LPS y cargadas con el pptidoespecficofrentealquequeramosgenerarlarespuesta.Tras14daslosratones fueron infectados con el virusB8R. Este procedimiento se prob con las lneas de CTL frente a A8R189, D1R282, L2R61, A8R70, F5L, F13L, A38L y E8R. Slo se obtuvieron lneasespecficaspara4eptopos:A8R189,A8R70,F13LyA38L. En la mdula sea se acumulan linfocitos T CD8+ de memoria (Becker y col. 2005), porloquenospropusimosgenerarlneasespecficasdeCTLapartirdeclulasderivadas de mdula sea obtenidas de ratones infectados con WR oB8R y que estaban en un estado de memoria tras una infeccin secundaria. Se obtuvieron lneas de CTL para A8R189,J3RyL2R53altamenteespecficasysensibles.Sinembargo,esteprocedimiento nofuereproducible.

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5.3.3. Reconocimiento de clulas infectadas por lneas de CTL especficas frente a eptoposdeVACVderivadasderatonesC57BL/6. El siguiente objetivo fue determinar si estos eptopos se presentan en las BMDC TAPinfectadasconVACV.Serealizaronensayosinvitrodepresentacindeantgenoen los que se enfrentaron BMDC TAP+ o TAP infectadas con VACV con cada una de las lneasdeCTLgeneradasderatonesC57BL/6. En la Figura 22 se representa el porcentaje de activacin frente a ambos tipos de BMDC infectadas de una lnea monoespecfica de CTL representativa para cada uno de los 27 eptopos. Todas las lneas de CTL reconocan el eptopo en BMDC TAP+ infectadas y 8 lneas de CTL (A8R189, A6L, L2R53, A19L, J3R, F5L, F13L y A38L,) eran capaces adems de reconocer el eptopo en BMDC sin TAP infectadas. El nivel de activacin de las lneas de CTL A8R189, A6L, L2R53, A19L, J3R y A38L era mayor cuando se cocultivaban con BMDC silvestres infectadas que cuando se enfrentaban a clulas infectadas que no tienen TAP. Esta observacin podra indicar que estos 6 eptopos siguen 2 vas de procesamiento en las BMDC, una va dependiente del transportador y otravaquenorequieredeTAP.Sinembargo,laslneasdeCTLF5LyF13Lseactivaronal mismo nivel en respuesta a ambos tipos celulares, aunque el porcentaje de linfocitos TCD8+activadoseramenordel20%.Portanto,paraestosdoseptoposqueseprocesan por una va independiente de TAP no tenemos evidencia de que tambin sigan una va dependientedeTAP. Los pptidos G8R, A23R y A25L haban sido reconocidos ex vivo por linfocitos T CD8+deratonesdeficientesenTAP(Figura19).Sinembargo,lascorrespondienteslneas de CTL generadas en ratones C57BL/6 no se activaron cuando se cocultivaron con las BMDC infectadas TAP, quiz porque tambin se activaban menos de un 20% en respuesta a BMDC silvestres infectadas. En los ensayos de ICS ex vivo se utilizaron concentracionesdepptidosintticoenexceso(106M).Elhechodequeestaslneasde CTL reconozcan dbilmente a las clulas TAP+ infectadas podra deberse a que en ellas se presente una cantidad muy limitante del eptopo, que podra ser aun ms baja en el casodelasBMDCTAPinfectadassieleptoposeprocesasepor2vas.

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Estos resultados indican ms fuertemente que al menos 8 eptopos virales son procesadosporvasindependientesdeTAP,seunenamolculasdeMHCdeclaseIyse presentanenlasuperficiedeclulasinfectadasalinfocitosTCD8+. Figura22.LaslneasdeCTLderivadas de ratones C57BL/6 reconocen BMDCinfectadasconVACV.
Las lneas de CTL monoespecficas y policlonales derivadas del bazo de ratones C57BL/6 se estimularon con BMDC TAP+ (blanco) o TAP (negro) infectadas con VACV. La activacin de los linfocitos T CD8+ se midi mediante la produccin de IFN mediante ICS. Se muestra el porcentaje de activacin de una lnea de CTL representativa de cada eptopo.

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5.3.4. Establecimiento in vitro de lneas de CTL especficas frente a eptopos de VACV derivadasderatonesdeficientesenTAPyreconocimientodeBMDCinfectadas. Hemos mostrado que tras la infeccin los ratones deficientes en TAP generan linfocitos TCD8+ especficos frente a antgenos de VACV y que reconocen clulas infectadas por el virus (Figura 11 y Figura 19). Para estudiar la presentacin antignica de estos antgenos individuales en clulas infectadas in vitro, intentamos generar lneas de CTL especficas derivadas de los ratones deficientes en TAP para cada uno de los eptopos reconocidos en los ensayos ex vivo (excepto para el eptopo A25L). A partir de esplenocitos de ratones deficientes en TAP infectados con WR y que se encontraban en un estado de memoria conseguimos generar lneas de CTL especficas para 7 de los 11 eptopos probados: A8R189, L2R53, A19L, J3R, F13L y A38L y adems se consigui generar por primera vez una lnea especfica frente a E8R. Todas las lneas se generaron al menos 2 veces para cada eptopo aunque no se trabaj en la optimizacin de la concentracin de pptido. No conseguimos establecer ninguna lnea para los eptopos G8R, A6L, A23R y F5L, hecho que no podemos explicar. Algunas lneas de CTL se obtuvieron tambin mediante otras condiciones de inmunizacin u rgano de origen (Tabla7).
Agentedela Eptopo primera inmunizacin A19L(4755) WR A38L(203210) WR/mDCA38L A8R(189196) WR/mDCA8R E8R(141150) WR F13L(307315) WR/mDCF13L J3R(289296) WR L2R(5361) WR Estado memoria memoria/aguda2 memoria/aguda2 memoria memoria/aguda2 memoria memoria
a

rganodeorigen Bazo Bazo Bazoomdulasea Bazo Bazo Bazoomdulasea Bazo

Concentracin c depptido 108M 108M 108M 108M 108M 108M 108M

Tabla7.LneasdeCTLderivadasderatonesdeficientesenTAP.
Las lneas de CTL monoespecficas se nombraron como el eptopo frente al cual se generan. El a agenteutilizadoenlamayoradelasinmunizacionessecundariasfueB8R. Larespuestaaguda (2) se refiere a 6 d.p.i. tras la segunda infeccin y la de memoria se refiere a 3 semanas tras la b segunda infeccin. Las lneas derivadas de clulas de mdula sea proceden siempre de un c estadodememoriatraslainfeccinsecundaria. Seindicalaconcentracindepptidoutilizada durantelareestimulacin.

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SedeterminmedianteICSlaproduccindeIFNtraslaestimulacindelaslneas de CTL con BMDC incubadas con su pptido sinttico 108 M o con un control (datos no mostrados)ysecomprobquetodaslaspoblacionesdeCTLerantotalmenteespecficas para el pptido frente al que se generaron. Para estudiar si estas lneas reconocan el antgenoviralenclulasinfectadas,seenfrentcadalneadeCTLderatonesdeficientes en TAP a BMDC TAP infectadas con VACV y se analiz la produccin de IFN como medida de la activacin. Las 7 lneas de CTL derivadas de ratones deficientes en TAP reconocan su eptopo viral en las clulas TAP infectadas (Figura 23). Este resultado indica que al menos para estos 7 pptidos la cantidad de eptopo viral que se procesa y presenta en las clulas TAP infectadas es suficiente para activar a los linfocitos TCD8+ deficientesenTAP.Parecedetectarseunafuertetendenciaaunamayoractivacindela lneadeCTLporlospptidosmshidrofbicos(datosnomostrados).Aunqueesyamuy improbable, dada la evidencia acumulada para estos eptopos, no se excluye la posibilidaddequeenalgunodeloscasoselreconocimientodelasclulasinfectadaspor laslneasdeCTLespecficasdepptidosearesultadodeunareaccincruzada. Figura 23. Las lneas de CTL derivadas de ratones deficientes en TAP reconocen BMDC TAP infectadas con VACV.
Las lneas de CTL monoespecficas y policlonalesderivadasdelbazoderatones deficientes en TAP se estimularon con BMDC TAP infectadas con VACV. En la grafica se representa el porcentaje de linfocitos T CD8+ activados que producen IFN. Se muestran los datos de una lnea representativadecadaeptopo.

Adems,lageneracinapartirderatonesdeficientesenTAP,empleandopptidos individuales, de lneas de CTL quereconocen BMDC TAP infectadas en cultivo, confirma que en los ratones deficientes en TAP e infectados existe efectivamente una presentacin independiente de TAP de antgenos virales capaz de activar a linfocitos T CD8+vrgenes.

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Por tanto, en conclusin, de los 12 eptopos virales independientes de TAP, la evidencia ms fuerte es para 7 de ellos: J3R, L2R53, A38L, A8R189, A19L, F13L y E8R, pues, adems de manifestarse como independientes de TAP en los otros ensayos, incluso se generan lneas de CTL a partir de ratones deficientes en TAPque reconocen a clulas TAP infectadas (Figura 23). Para dos de los 12 eptopos, F5L y A6L, la evidencia es tambin importante, pues las lneas de CTL generadas en ratones silvestres reconocenaclulasTAPinfectadas(Figura22).Porltimo,para3delos eptopos,G8R, A25L y A23R, la evidencia se basa slo en la deteccin ex vivo de linfocitos T CD8+ especficosapartirderatonesdeficientesenTAPeinfectados(Figura19). 5.4. CARACTERIZACIN DE LAS VAS DE PROCESAMIENTO ANTIGNICO DE LOS

EPTOPOSDEVACV. 5.4.1. Papel global del proteasoma en el procesamiento antignico en clulas infectadasporVACV. En la va clsica, los pptidos antignicos derivan del procesamiento por el proteasoma en el citosol de protenas endgenas. Los productos del proteasoma, que puedenincluireptopososusprecursores,sontransportadosalREatravsdeTAP. Hemos demostrado que un 13% de los linfocitos T CD8+ de ratones silvestres infectados se activan por antgenos cuyo procesamiento y presentacin en la superficie celular no dependen de TAP como mecanismo para acceder a la va secretoria. Con el objetivo de caracterizar la contribucin del proteasoma en el procesamiento de los antgenos de VACV, se realizaron ensayos de cuantificacin como los descritos en el apartado5.2.3(Figura16).SeanalizlarespuestadelinfocitosTCD8+purificadosfrente a BMDC TAP+ infectadas en presencia o ausencia del inhibidor LC (Figura 24). El VACV queseutilizfueelrecombinantesCOvaCquepresentaeleptopoSIINFEKLdelaOva de forma independiente de TAP y de proteasoma (Medina y col. 2009) y, que sirve por tantodecontrolinterno(datosnomostrados).

Resultados

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Figura 24. La LC inhibe la presentacin de antgenosdeVACVenBMDCTAP+.

Los linfocitos T CD8+ purificados derivados de ratones C57BL/6 infectados con sCOvaC (7 d.p.i.), se estimularon con diferentes cantidades de BMDC TAP+ infectadas en presencia o ausencia de LC. La activacin de los linfocitos T CD8+ se cuantific mediante ICS. Se control con CTL especficos que la LC bloqueaba al proteasoma e inhiba un 65% la presentacin del antgeno B8R en las mismas clulas infectadas. El posible efecto txico de la LC provoca un 21% de inhibicin de la presentacin del pptido SIINFEKL en las mismas clulas infectadas. Datos deunensayo.

Comparando porcentualmente los datos de la Figura 24 se estim una reduccin del70%enlaactivacindeloslinfocitosTCD8+frenteaantgenosdeVACVenpresencia deLC.Aproximadamenteel40%deloseptoposdeVACVenH2bprocedendeprotenas que se expresan en la fase intermedia o tarda de la infeccin (Yang y col. 2011), cuya sntesis se bloquea por la LC (Satheshkumar y col. 2009; Teale y col. 2009) Por lo tanto, lapresentacindeestoseptoposseinhibiradeunaformanorelacionadaconelefecto directo de la LC sobre el proteasoma. Por otra parte, los inhibidores del proteasoma no son 100 % eficaces, ni in vitro (GarciaMedel y col. 2011) ni en nuestras condiciones en cultivo celular donde la LC tiene una eficacia estimada de un 75% (Tabla 8A). Teniendo en cuenta estas dos consideraciones, los datos de la Figura 24 sugieren que existe una fuerte contribucin del proteasoma, que as sera la principal proteasa en el procesamiento de los antgenos tempranos del virus VACV. Sin embargo, estos datos tambin sugieren que podra haber linfocitos T CD8+ que reconozcan antgenos tempranosresistentesaestetratamientoconLC. 5.4.2. PapelglobaldelaTPPIIenelprocesamientoantignicoenclulasinfectadaspor VACV. Quisimos estudiar si la TPPII, otra proteasa citoslica, participaba en el procesamiento de los antgenos virales resistentes a LC. Se realizaron ensayos de presentacin de antgeno estimulando a los linfocitos T CD8+ purificados de ratones

Resultados

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C57BL/6 infectados con VACV 7 das antes con cantidades decrecientes de BMDC infectadas derivadas de ratones deficientes en TPPII (Firat y col. 2007) o de ratones silvestres. La activacin de los linfocitos T CD8+ fue similar con ambos tipos de dianas (Figura25).LosmismosensayosserealizaronenpresenciadeLCytampocoobservamos un efecto de la TPPII en el procesamiento de antgenos de VACV en ausencia del proteasoma. Aunque parece que la ausencia de TPPII pudiese favorecer ligeramente la presentacin de los antgenos, lo que implicara un papel destructor de la proteasa, las diferencias no son significativas. Por tanto, no tenemos evidencia de que la TPPII tenga unpapelenelprocesamientodelosantgenosdelvirusVACV.

Figura25.LaTPPIInoparticipaenelprocesamientodeantgenosdeVACV.
Los linfocitos T CD8+ purificados derivados de ratones C57BL/6 infectados con sCOvaC (7 d.p.i.), se estimularon con distintas cantidades de BMDC silvestres (crculos) o deficiente en TPPII (tringulos) infectadas con sCOvaC en ausencia (izquierda) o presencia de LC (derecha). Se analiz la respuesta de los linfocitos T CD8+ midiendo la produccin de IFN por ICS. Se representa el porcentaje de linfocitos T CD8+ activados. Los datos son media de 2 experimentos independientes.

5.4.3. IdentificacinyanlisisdeloseptoposdeVACVresistentesaLC. Una fraccin de los linfocitos T CD8+ se activan por vas resistentes al tratamiento con LC (Figura 24) y quisimos identificar los eptopos de VACV que reconocen. Para ello se realizaron ensayos de presentacin antignica a lneas de CTL monoespecficas utilizando BMDC silvestres infectadas en presencia o ausencia del inhibidor LC. Como control de inhibicin por LC se analiz la presentacin del eptopo SIINFEKL de Ova en clulas silvestres infectadas con el virus que expresa la construccin cCOva a una lnea

Resultados

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deCTLespecficadeesteeptopo.Enestaconstruccin,eleptoposepresentadeforma dependiente de TAP y es procesado por el proteasoma (Medina y col. 2009). Adems, como controles adicionales, analizamos 6 eptopos derivados de protenas que se expresan en la fase intermedia de lainfeccin, cuya sntesis bloquea la LC (Tabla 8A). La inhibicin media de estos 6 eptopos intermedios en nuestras condiciones en cultivo celular fue alrededor del 75%, de acuerdo con datos in vitro que muestran que los inhibidores del proteasoma no bloquean totalmente su actividad (GarciaMedel y col. 2011). La inhibicin mnima fue del 40%, valor que establecimos como umbral para definirlasensibilidadaLCennuestrosistema. A continuacin analizamos el efecto de la LC en la presentacin de 15 eptopos tempranos, entre los que haba 3 independientes de TAP (Tabla 8B) y 12 eptopos que requieren de la presencia de TAP para su presentacin. La presentacin de los 3 eptopos analizados independientes de TAP y de expresin temprana, A8R189, L2R53, y A23R, se bloque en presencia de LC, lo que implica la participacin del proteasoma. Como hemos comentado anteriormente, en las clulas silvestres infectadas estos 3 eptoposparecenpresentarsepor2vas;unadependienteyotraindependientedeTAP. En presencia de LC, la presentacin se bloquea fuertemente sugiriendo que el proteasoma podra actuar en ambas vas. Esta conclusin se reforz cuando se analiz posteriormente la implicacin del proteasoma exclusivamente en la va de presentacin independiente de TAP de estos eptopos (ver apartado 5.4.4). Futuros experimentos aadiendo la LC a 4 h tras la adsorcin viral, cuando ya ha tenido lugar la expresin de las protenas intermedias o tardas de VACV, permitir aclarar la sensibilidad o resistenciadeestasltimasaLC. Delos12eptoposdependientesdeTAPydeexpresintemprana,identificamos9 eptopos cuya presentacin se inhiba en presencia de LC, indicando que siguen una va clsica de presentacin de antgeno dependiente del proteasoma y de TAP. Los dos eptoposanalizadosdelamismaprotena,A8,fueronambossensiblesaLC.


A Eptopos A19L* A38L A3L A42R A6L* E7R B Eptopos A23R* A47L A51R A8R189* A8R70 B1R B2R B6R B8R C4L D1R578 F1L J6R K3L L2R53* Expresin %Inhibicin EfectodeLC temporal 612 S I 955 S I 834 S I 403 S I 8016 S I 8613 S I %Inhibicin EfectodeLC Expresin temporal 6213 S E 638 S E 245 R E 778 S E 888 S E 86 S E 15939 R/PT E 667 S E 854 S E 76 S E 116 R E 99 S E 415 S E 818 S E 835 S E S E iTAP x x

Resultados

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x iTAP x x x

SIINFEKL(cCOva) 961

Tabla 8. Efecto de la LC en la presentacin a CTL de eptopos individuales de VACV de expresinpostreplicativa(A)otemprana(B)enBMDCTAP+.

Se realizaron ensayos de presentacin antignica a CTL utilizando BMDC silvestres incubadas o no con LC e infectadas con el virus cCOva. Se indica el porcentaje de inhibicin de la presentacindecadaunodeloseptoposanalizadoscomolamediaSEMen26experimentos. Lapresentacindeloseptoposseconsidercomosensible(S)cuandolainhibicinporLCfue > 40%, como resistente (R) si fue menor de este valor, y como potenciada (PT) si fue negativa. Se sombreanengrisloseptoposRyPT.Expresintemporal:intermedia(I)otemprana(E).*Todos los eptopos independientes de TAP (iTAP), salvo A38L, podran seguir tambin una va de procesamientodependientedeTAP,segnsesugieredelosdatosdelaFigura22.

Adems, identificamos 3 eptopos dependientes de TAP y tempranos, cuyo procesamiento en las BMDC silvestres infectadas era resistente a LC: A51R, B2R y D1R578. Incluso, la presentacin del eptopo B2R por Db se potenciaba 2,5 veces en presencia de LC. Esto podra indicar que este eptopo es destruido en parte por el proteasoma. Estos eptopos que no son inhibidos por LC podran ser procesados por

Resultados

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otrasproteasascitoslicas,distintasdelproteasoma.Anteriormentehemosdemostrado que la TPPII no tena un papel detectable en la presentacin global de antgenos de VACV (Figura 25) pero quisimos analizar si participaba en el procesamiento concreto de estos 3 eptopos tempranos y dependientes de TAP que no se inhiban por LC. Se realizaron ensayos de presentacin de antgeno in vitro estimulando las lneas de CTL correspondientes con BMDC derivadas de ratones silvestres o deficientes en TPPII e infectadas, llevando como control los CTL frente a SIINFEKL y B8R (Figura 26). No se observaron diferencias en la activacin de los CTL tras enfrentarlas a ambos tipos de BMDC infectadas. As, la presencia o ausencia de TPPII no tiene ningn efecto en la presentacin de estos eptopos a CTL. Concluimos que la generacin de los eptopos A51R, B2R y D1R578 probablemente no requiera ni del proteasoma ni de la peptidasa TPPII,loqueimplicaquesuprocesamientopuededependerdeotraspeptidasas. Figura26.LaTPPIInoesnecesaria para el procesamiento de los eptopos resistentes a LC: B2R, D1R578yA51R.
Las lneas de CTL especficas se estimularon con BMDC silvestres (negro) o deficientes en TPPII (blanco) infectadas con sCOvaC. Mediante ICS se determin la produccin de IFN por los linfocitos T CD8+ como medida de la activacin. En la grafica se representa el valor promedio y el error del porcentaje de linfocitos T CD8+ activados de 2 ensayos independientes.

5.4.4. Caracterizacin del procesamiento de los eptopos de VACV independientes de TAPenclulasdeficientesenTAP.Efectodedistintosinhibidores. En nuestro objetivo de caracterizar la relevancia de las rutas alternativas de presentacin de antgeno por MHC de clase I, describimos en el apartado anterior los eptopos que no requieren del proteasoma. Pasamos a continuacin a estudiar en ms detalle los que no requieren TAP. De los 12 eptopos virales que se presentan de forma independientedeTAPalinfocitosTCD8+,establecimospara9deelloslneasdeCTLque

Resultados

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reconocan BMDC TAP infectadas (Figura 22 y Figura 23). Siete de estas lneas especficas que reconocan BMDC TAP infectadas, J3R, F5L, L2R53, A38L, A8R189, A19L, y A6L nos permitieron iniciar la caracterizacin de las vas de procesamiento que siguen estoseptoposenlasclulasinfectadas.Paraanalizarlanaturalezaendgenaoexgena de la presentacin independiente de TAP de cada uno de estos eptopos se realizaron ensayos de ICS con BMDC deficientes en TAP, incubadas o no con BFA durante la infeccin con VACV. Obtuvimos resultados de inhibicin por BFA para los 7 eptopos, concluyendoquesupresentacinindependientedeTAPesendgena(Tabla9). Para estudiar la implicacin del proteasoma en la va de presentacin independiente de TAP de estos eptopos, realizamos ensayos de presentacin a CTL con BMDC deficientes en TAP incubadas o no con LC e infectadas con VACV. Como control de no toxicidad del inhibidor, las BMDC TAP se infectaron con el VACV que expresa la construccin sCOvaC, en la que el eptopo SIINFEKL se presenta a CTL especficos en presencia de LC. Comoanteriormente, no se pueden sacarconclusiones del efecto de la LC sobre la presentacin de los eptopos intermedios, ya que la LC inhibe la sntesis de sus protenas de origen. Se observa que la presentacin independiente de TAP a CTL especficosdelos6eptoposanalizadosseinhibaenpresenciadeLC,sugiriendoquelos eptopos tempranos J3R, L2R53 y A8R189 son procesados por el proteasoma (Tabla 9). Se realiz tambin un ensayo con otro inhibidor del proteasoma, la epoxomicina, obtenindose los mismos resultados, adems de una inhibicin especfica de la presentacin deleptopo de expresin temprana F5L. Los datos de la Figura 22 sugeran que los eptopos tempranos J3R, L2R53 y A8R189 se presentaran por 2 vas: una va dependiente de TAP y una va independiente de TAP. Como explicamos en el apartado 5.4.3, la presentacin global de estos 3 eptopos en clulas con TAP era sensible a LC (Tabla8B),resultadoqueconfirmamosconestosdatosparalavaindependientedeTAP deestoseptopos(Tabla9). Estos resultados sugieren que al menos 3 eptopos, J3R, L2R53 y A8R189, se presentan de forma endgena por 2 vas: una va clsica, que depende de TAP y del proteasoma, y otra va independiente de TAP que tambin requiere de la participacin del proteasoma. En el caso de F5L, podra tratarse de una nica va independiente de TAPydependientedelproteasoma.


Eptopos J3R F5L L2R53 A38L A8R189 A19L A6L SIINFEKLsCOvaC Expresin temporal E E E I E I I E BFA % Efecto Inhibicin 869 S 95 S 58 S 991 S 993 S 8510 S 992 S 826 S LC % Inhibicin 829 n.d. 5111 826 931 874 841 1010

Resultados

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Epoxomicina % Efecto Efecto Inhibicin S 92 S n.d. 64 S S 58 S S n.d n.d. S 74 S S n.d n.d. S 89 S R 6 R

Tabla9.EfectodelaBFAydeinhibidoresdelproteasomaenlasvasdeprocesamiento independientesdeTAPdeeptoposdeVACVenBMDCTAP.
Se realizaron ensayos de presentacin antignica a CTL utilizando BMDC TAP incubadas o no con los distintos inhibidores e infectadas con el virus sCOvaC. Se resume el efecto de cada inhibidor y se indica el porcentaje de inhibicin de la presentacin de cada uno de los eptopos analizados. Se sombrean en gris los resultados con inhibidores del proteasoma de eptopos intermedios por la dificultad de su interpretacin. S: Sensible, R: Resistente, n.d.: no determinado,E:Temprano,I:Intermedio.

Para estudiar la participacin principal o accesoria de otras proteasas en la va de procesamiento de los eptopos independientes de TAP realizamos ensayos de presentacin a las lneas de CTL de BMDC TAP infectadas en presencia o ausencia de dos inhibidores, leucintiol, que inhibe metaloaminopeptidasas (sobre todo de tipo microsomal) y decRVKRcmk, que inhibe especficamente a la endoproteasa furina localizadaeneltransGolgiyaotrasprotenconvertasasdelamismafamilia. LosresultadosobtenidossemuestranenlaFigura27yenlaTabla10seresumeel efecto de cada inhibidor analizado sobre la presentacin de cada eptopo. Los 3 eptopos de 8 aa y derivados de protenas citoslicas analizados, J3R, A8R189 y A6L, requeran del corte por metaloaminopeptidasas (probablemente microsomales), mientras que ninguno de los 2 eptopos de 9 aa analizados ni ninguno de los 2 eptopos estudiados que derivan de regiones TM de protenas de membrana las requirieron. Por otroparte,ningunodeloseptopos analizadosrequirilafurinaparasuprocesamiento. Sinembargo,lapresentacinaCTLdeleptopoA19Lderivadodeunaprotenacitoslica aumentaldobleenpresenciadelinhibidor,loquepodraindicarquelafurinafavorece sudestruccin.

Resultados

82

Figura 27. Los eptopos independientes de TAP pueden ser procesados por proteasasdistintasdelproteasoma.
Se realizaron ensayos de presentacin a CTL especficosconBMDCTAPincubadasconlos inhibidores decRVKRcmk y leucintiol e infectadas con sCOvaC. Se representa el porcentaje de inhibicin de la presentacin endgena de cada uno de los eptopos analizados. Datos de un ensayo representativo.

Eptopos J3R F5L L2R53 A38L A8R189 A19L A6L E E E I E I I Expresin temporal Nmero deaa 8 9 9 8 8 9 8 Localizacin subcelular citoplasma membrana membrana membrana citoplasma citoplasma citoplasma Leucintiol S n.d. R R S R S decRVKRcmk R n.d. n.d. R R PT R

Tabla 10. Efecto de distintos inhibidores sobre la presentacin independiente de TAP deeptoposdeVACV.
S:Sensible,R:Resistente,PT:Potenciado,n.d.;nodeterminado,E:Temprano,I:Intermedio.

En resumen, de los 12 eptopos que siguen una va de procesamiento independiente de TAP encontramos que los 7 analizados en mayor detalle (J3R, F5L, L2R53, A38L, A8R189, A19L, y A6L) siguen una va endgena sensible a BFA, que 2 de ellos requieren la accin del proteasoma (F5L y L2R53), mientras que otros 2 requieren delproteasomaydemetaloaminopeptidasasprobablementederecorte(J3RyA8R189) yqueA19Lesprobablementesensiblealaaccindestructoradeproteasasdelafamilia delafurina.

Resultados

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Eptopos J3R G8R F5L L2R53 A38L A8R189 A19L A6L A25L A23R F13L E8R

iTAP si si si si si si si si si si si si

Tipode Metalo protena Endgena Proteasoma aminopeptidasas Furina citoplasma s s s no membrana membrana s s membrana s s no membrana s no no citoplasma s s s no citoplasma s no Destructora citoplasma s s no membrana citoplasma s* citoplasma membrana

Tabla 11. Resumen de las proteasas que pueden participar en el procesamiento de los eptoposindependientesdeTAP.
iTAP: independiente de TAP. Las casillas vacas indican que no ha sido determinado; en general, se trata de eptopos ms subdominantes cuyo anlisis es tcnicamente ms complicado. *Solo se ha comprobado la dependencia del proteasoma en el procesamiento de este eptopo en clulasTAP+.

5.5. Con el objetivo de identificar alguna propiedad intrnseca que pudiese explicar el procesamiento por rutas alternativas de los eptopos de VACV, analizamos diferentes caractersticas de las protenas de VACV estudiadas y de los ligandos de MHC de clase I quederivandeellas. 5.5.1. Caractersticasdelasprotenasdeorigendeloseptopos. En cuanto a su expresin temporal, en torno al 40% de las protenas de VACV estn reguladas por promotores intermedios o tardos durante la infeccin (Yang y col. 2011). En torno al 40% de los ligandos de MHC de clase I derivan de protenas post replicativas que engloban a las expresadas en la fase intermedia y tarda y el subconjunto de los 30 eptopos que hemos analizado derivan de protenas de expresin intermedia. Sin embargo, ms de la mitad de los eptopos independientes de TAP derivan de protenas intermedias mientras que los eptopos dependientes de TAP derivanmayoritariamentedeprotenastempranas(Figura28). ANLISISDELASCARACTERSTICASDELOSEPTOPOSDEVACV.

Resultados

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La funcin de aproximadamente el 30% de las protenas de VACV es an desconocida. De todas las protenas de VACV de las que se conoce su funcin (Yang y col. 2010; Yang y col. 2011), la mayor parte estn asociadas al virin, seguidas en nmero por las implicadas en regulacin viral (factores de transcripciny de replicacin delADN)(Tabla12yFigura28).Lasprotenasestructuralescontienensignificativamente ms eptopos de linfocitos T CD8+ que otras de tamao mayor (DiezRivero y Reche 2012). Sorprendentemente, a pesar de existir un 25% de protenas que actan como factoresdevirulenciaoqueinteraccionanconelhusped,nohemosencontradoningn eptopoindependientedeTAPderivadodeellas. Regulacin viral
Totalprotenas ProtenasconeptoposH2btotales ProtenasconeptoposH2banalizados EptoposH2btotales EptoposH2banalizados EptoposH2biTAP 44(31%) 12(43%) 7(39%) 14(44%) 9(43%) 4(44%)

Interaccin conel husped

35(25%) 6(21%) 4(22%) 6(19%) 4(19%) 0

Asociacin alvirin
62(44%) 10(36%) 7(39%) 12(37%) 8(38%) 5(56%)

Tabla12.ClasificacindelacategorafuncionaldelasprotenasdeVACV.
De los eptopos presentados por H2b, se muestra el porcentaje de eptopos totales, analizados, independientesdeTAP(iTAP),ascomoelporcentajedeprotenasqueloscontienenrespectoal total de protenas de VACV. Hay 2 protenas que contienen 2 eptopos cada una. Las categoras funcionales Transcription y DNA replication de la Figura 5A se engloban aqu en la categora regulacinviral.

Dos tercios de las protenas que contienen eptopos presentados por H2b analizados son citoslicas mientras que el tercio restante son protenas de membrana integrales (con regiones TM) o secretadas que pueden acceder al RE co traduccionalmente. La mitad de los eptopos independientes de TAP derivan de protenas integrales de membrana (Figura 28). Ninguna de las 2 protenas secretadas contiene un eptopo independiente de TAP y slo un 33 % de las protenas citoslicas danlugartrassuprocesamientoauneptopoindependientedeTAP. Durante la morfognesis de VACV existe una gran reorganizacin de membranas que van a participar en la formacin de factoras virales donde tiene lugar la transcripcin intermedia y tarda de los genes del virus, la replicacin del ADN y el

Resultados

85

ensamblajedelosnuevosviriones. Lamitad(14)delasprotenasdeVACVanalizadasse localizan en estas factoras virales (Chung y col. 2006; Resch y col. 2007) y el 75% de los eptoposindependientesdeTAPderivandestas(Tabla13yFigura28).
P
118

E
28

e
19

dTAP
14

iTAP
5

Temprana

25% 53 18% 38 44

34%

16 37% 11 9 22% 4 5

58% 7

Intermedia Tarda

6% 3 14

4 Regulacinviral 0 Interaccinconelhusped

35 6 44% 62 38% 12 38% 8 20 4 25% 4 56% 3 14

5 Asociadasalvirin 6

Citosol

2 27% 8 13 2 11% 2 10

50%

Secretada 6 Membrana
3

Otraslocalizaciones

57% 17

75% 44% 8 9 Factorasvirales

Figura 28. Caractersticas de los eptopos de VACV presentados por H2b y de las protenasdelasquederivan.
Se clasifican las protenas y los eptopos en base a su cintica de expresin, su papel en el ciclo de replicacin viral, su localizacin subcelular y su localizacin durante la morfognesis. Se analizan protenas totales de VACV (P), eptopos totales (E), eptopos analizados (e), eptopos dependientesdeTAP(dTAP)yeptoposindependientesdeTAP(iTAP).Cadabarrarepresentade 0%a100%lasdistintascaractersticasindicadasaladerechadelafigura.Seindicaelnmerode eptopos(aladerechadelasbarras)yelporcentajedealgunascategoras(dentrodelasbarras). Las categoras funcionales Transcription y DNA replication de la Figura 5A se engloban aqu enlacategoraregulacinviral.


Citosol Membrana Secretadas Orgnulos Factoraviral Virinextracelular Desconocida dTAP K3 B8,B16 F1 A3,A42,B1,D1*,J6 E7 A47,A51,B2,C4,B6 iTAP

Resultados

86

A38 A6,A8*,A19,A23,E8,G8,J3,L2*,A25 F13 F5

Tabla 13. Distribucin subcelular de las protenas de VACV de las cuales derivan eptoposestudiadosenestetrabajo.
Independiente de TAP (iTAP). * Protenas que adems contienen otro eptopo dependiente de TAP(dTAP).

En resumen, mientras que los eptopos analizados constituyen una muestra representativa de los eptopos totales y de las protenas totales de VACV, existe una marcada diferencia entre los eptopos dependientes e independientes de TAP. As, la mayor parte de los eptopos dependientes de TAP derivan de protenas de expresin temprana, con funciones de regulacin viral e interaccin con el husped y citoslicas, mientrasquelamayoradeloseptoposindependientesdeTAPderivandeprotenasde expresin postreplicativa, asociadas al virin, de membrana y localizadas en factoras virales. 5.5.2. HidrofobicidaddeloseptoposdeVACV. En primer lugar, analizamos la hidrofobicidad de los 30 eptopos estudiados de VACV(Tabla23).ComoseobservaenlaFigura29A,loseptoposindependientesdeTAP son significativamente ms hidrofbicos que los eptopos que dependen de TAP y que siguen la va clsica. A pesar de que la molcula de MHC de clase I Kb une pptidos ms hidrofbicos que la molcula Db, nosotros no hemos observado diferencias entre la hidrofobicidad de los pptidos presentados por Kb y Db en nuestro subconjunto. Sin embargo, cuando slo analizamos los eptopos presentados por la molcula H2Kb la diferencia de hidrofobicidad es ms notable an entre los eptopos dependientes e independientes de TAP, incluso se observa la misma tendencia, cuando analizamos por separado los eptopos Kb que derivan de protenas citoslicas y los que derivan de protenasdemembrana(Figura29B).

Resultados

87

Figura29.LoseptoposindependientesdeTAPsonmshidrofbicosquelos eptoposdependientesdeTAP.
Se indica el ndice de hidrofobicidad de los eptopos dependientes de TAP (crculos) e independientes de TAP (tringulos) para el conjunto de los 30 eptopos analizados (A) o slo aquellos que son presentados por la molcula de MHC de clase I Kb (B). Se resaltan en color negro aquellos eptopos que derivan de protenas transmembrana o secretorias. La lnea horizontalindicaelvalorpromediodecadagrupo.

No se observaron diferencias significativas en la hidrofobicidad de los eptopos localizados en regiones TM o en dominios citoslicos o luminales de la protena de origen, ni en el conjunto de los 30 eptopos analizados ni en el subconjunto de los 12 independientes de TAP (Figura 30). Por tanto, parece que la hidrofobicidad no depende ni de la molcula de MHC de clase I presentadora ni de la localizacin del eptopo en la protena de origen, pero de forma relevante la hidrofobicidad s parece explicarlaindependenciadeTAP. Figura 30. La alta hidrofobicidad de los eptopos independientes de TAP no est relacionada con su localizacin en la protenadeorigen.
Se indica el ndice de hidrofobicidad de los eptopos independientes de TAP clasificados segn su localizacin en la protena de origen. La lnea horizontal indica el valor promedio de cadagrupo.

Resultados

88

No se encontr correlacin de la hidrofobicidad de los eptopos con la implicacin onodelproteasomaodeotrasproteasas(datosnomostrados). 5.5.3. MotivosdeanclajepreferencialesaMHCdeclaseI. Los30eptoposdeVACVanalizadossonpresentadosporlasmolculasdeMHCde claseIKbyDb.Analizamoslaproporcindeeptoposdependienteseindependientesde TAPquesepresentanporcadamolculadeMHCdeclaseIynoobservamosdiferencias entreambosgrupos(Tabla14).
MHCdeclaseI DependientesdeTAP IndependientesdeTAP Total

Kb 12 8 20

Db 6 4 10

Tabla 14. Eptopos de VACV analizados. Se desglosan segn la molcula de H2b presentadora y su mecanismorespectoaTAP.

Analizamos los motivos preferenciales de anclaje descritos de los pptidos dependientes e independientes de TAP a la molcula de MHC de clase I Kb y observamos que los eptopos independientes de TAP parecen tener un uso sesgado del residuodeanclajeenlaposicincarboxiloterminaldelpptido( Tabla15).NingunodeloseptoposindependientesdeTAPtieneVenestaposicin mientras que un tercio de los eptopos dependientes de TAP si tienen este residuo. Adems en los eptopos independientes de TAP aparecen I y M que no aparecen en los eptopos dependientes de TAP. En cuanto al residuo de anclaje a Kb en posicin 5 del pptido,noseobservarondiferenciasentrelosdosgruposdeeptopos( Tabla 15). No se observ tampoco ninguna tendencia a un uso diferencial de motivosdeanclajeaDbenfuncindeladependenciadeTAP( Tabla15). Empleando los algoritmos de prediccin de eptopos SYFPEITHI y BIMAS calculamos la puntuacin de los eptopos dependientes e independientes de TAP y no encontramos diferencias significativas entre sus puntuaciones promedio ni para Kb ni para Db (datos no mostrados), al contrario de lo encontrado para las molculas HLAA2 yHLAB51(Weinzierlycol.2008).


MHCdeclaseI Residuocarboxilopreferencial DependientesdeTAP IndependientesdeTAP Total Kb (n=20) L V 8 4 5 0 13 4 Kb (n=20) F Y 7 4 5 12 3 7 Db (n=10) I L 3 1 2 2 5 3 Db(n=10) N S 3 4 7 2 0 2

Resultados

89

I 0 2 2

M 0 1 1

M 1 0 1

V 1 0 1

MHCdeclaseI Residuopreferencialenposicin5 DependientesdeTAP IndependientesdeTAP Total otros 1 0 1 I 1 0 1

Tabla15.MotivosdeanclajepreferencialesdeloseptoposdeVACValasmolculasH 2KbyDb.
SemuestraelnmerodeeptoposdeVACVanalizadosquetienenlosresiduospreferencialesde anclajealasmolculasdeH2benlasposicionescarboxiloy5delasecuencia.

5.5.4. Localizacindeloseptoposenlasprotenasdeorigen. Delas9protenasdemembranaanalizadas,7sonintegralesdemembranay2son secretadas, pero no hemos identificado ningn eptopo independiente de TAP que derivedeningunadelas2protenassecretadasestudiadas.Delas7protenasintegrales demembranaderivan8eptopos.Deellos,slo2nosonindependientesdeTAP;unoes el eptopo L2R61 que tiene 3 aa localizados en la regin TM de la protena y el resto en unlazoluminaldesta(L.MaruriAvidal,comunicacinpersonal);laotraexcepcinesel eptopo B6R, localizado en el dominio citoslico de una protena de membrana. Los restantes 6 eptopos derivados de protenas integrales de membrana son independientes de TAP, de los cuales 5 (G8R, F5L, L2R53, A38L, E8R) tienen un nmero variable de aa localizados en alguna regin TM de la protena y slo uno, el eptopo A25L, se localiza en la regin luminal de la protena (Tabla 16 y Figura 31). Por tanto, existe una marcada tendencia a que los eptopos derivados de protenas integrales de membrana deriven de regiones TM y sean presentados de forma independiente de TAP (Figura32).

Resultados

90

Dominiocitoslico DominioTM EptoposH2 analizados 21 6 EptoposH2bdTAP 15 1 b EptoposH2 iTAP 6(29%) 5(83%)

b

Dominioluminal 3 2 1

Total 30 18 12

Tabla16.Localizacindeleptopoenlaprotenadeorigen.
Se muestra el nmero de eptopos presentados por H2b analizados, de eptopos dependientes de TAP (dTAP), y de eptopos independientes de TAP (iTAP) y su localizacin en los dominios de laprotenadeorigen.DeloseptoposquederivandeldominiocitoslicooTMdesuprotenade origen,seindicaencadacasoelporcentajequesoniTAP(independientesdeTAP).

Estos resultados podran indicar la existencia de algn mecanismo (distinto de la hidrofobicidad de los eptopos (Figura 30)), que favoreciese el procesamiento alternativo a TAP de protenas con acceso a la va secretoria o de sus eptopos localizadosenregionesTMynoeneldominioluminal.

Figura 31. La mayora de los eptopos que derivan de regiones TM de la protena de origensonindependientesdeTAP.
Se muestra el nmero de aa localizados en la regin TM de protenas integrales o secretadas de loseptoposdependientesdeTAP(dTAP)oindependientesdeTAP(iTAP).

Resultados

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TipoI

C N N N

TM TM TM TM C B6R

ss

F5L C A25L C G8R

TipoII

TipoIII

TM

ss

N A38L

Lumen

Citosol

TM TM TypeI TM N N ss ss C B8R C B16R

TipoIV

TM TM TM C EptopoindependientedeTAP L2R EptopodependientedeTAP N E8R

N C

TM TM

Figura32.LocalizacindeloseptoposenlasprotenasdemembranadeVACV.
SemuestralaorientacinmsprobabledelasprotenasdemembranadeVACVylalocalizacin de las regiones TM. Se representa la posicin de los eptopos independientes de TAP (verde) o dependientesdeTAP(blanco)enlaprotenadeorigen.

5.5.5. Caractersticas de los eptopos de VACV independientes de TAP asociadas a la inmunodominanciaenratonesdeficientesenTAP. Observamos una correlacin significativa entre el orden de la puntuacin de los eptopos independientes de TAP empleando el algoritmo SYFPEITHI y la jerarqua de inmunodominancia de los eptopos presentados por Kb en los ratones C57BL/6 (Figura 33), as como entre la puntuacin BIMAS y la jerarqua de inmunodominancia de los eptopospresentadosporDbenlosratonesdeficientesenTAP(Figura34).Sinembargo, la significancia biolgica de estas dos correlaciones es cuestionable, ya que no hay correlacinenningunadelasotrasposiblescombinaciones.

Resultados

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En segundo lugar, indicamos los factores que apuntaban una asociacin con la inmunodominancia en animales deficientes en TAP. Las tendencias no fueron estadsticamente significativas, posiblemente por el pequeo tamao muestral, pero se detallan por su posible inters para estudios con un mayor nmero de pptidos (Figura 35); Parece existir una tendencia a que los eptopos presentados por Db sean menosdominantesquelospresentadosporKb. Curiosamente, los 5 eptopos que presentan F como residuo en la posicin 5 de anclaje a Kb son ms hidrofbicos y ms inmunodominantes en el ratn deficiente en TAP que el resto que poseen Y en dicha posicin. No ocurre lo mismoconelconjuntodeloseptoposreconocidosporlosratonessilvestres.

Figura 33. La inmunodominancia en ratones C57BL/6 de los eptopos presentados por Kb correlaciona con su adecuacin al motivo definido por el algoritmoSYFPEITHI.
p=0,03

Figura 34. La respuesta de linfocitos T CD8+ en ratones deficientes en TAP frente a los eptopos presentados por Db correlacionaconlapuntuacinBIMAS.
p=0,003

Por ltimo, el anlisis de diversos factores de los eptopos independientes de TAP nosindicqueningunodeelloscorrelacionabaenabsolutoconlainmunodominanciani enratonesC57BL/6nienratonesdeficientesenTAP.Setratadelossiguientesfactores: Localizacinsubcelulardelaprotenadelaquederivaeleptopo. Cinticadeexpresintemporaldelaprotenadelaquederivaeleptopo.

 Categorafuncionaldelaprotenadelaquederivaeleptopo.

Resultados

93

Localizacinenfactorasviralesdelaprotenadelaquederivaeleptopo. NmeroderegionesTMdelaprotenadelaquederivanloseptopos. Nmero de aa del eptopo localizados en regiones TM de la protena de origen.

Tamaodeleptopo Hidrofobicidaddeleptopo

Figura 35. Anlisis de correlacin entre la hidrofobicidad y la inmunodominancia en ratonesdeficientesenTAP.

Anlisis de correlacin entre el porcentaje de linfocitosTCD8+queproducenIFNcuandoson activados por cada uno de los eptopos independientes de TAP y su correspondiente valor de hidrofobicidad. El crculo seala los eptopos presentados por Kb que tienen F en posicin5.

5.6. ESTUDIO DE LA RESPUESTA INMUNE Y DEL CONTROL DE LA INFECCIN POR

VACVTRASLAVACUNACINENELMODELOMURINODEFICIENTEENTAP. 5.6.1. La inmunizacin con dos pptidos que se presentan de forma independiente de TAP aument la respuesta especfica de linfocitos TCD8+ frente a una infeccin posteriorconVACVderatonesC57BL/6odeficientesenTAP. Los mecanismos exactos por los cuales la vacuna de la viruela funcion no se han aclarado an. Sin embargo, los linfocitos TCD8+ de memoria pueden tener un papel en la proteccin frente a la infeccin por VACV (Xu y col. 2004). Queramos estudiar si los eptopos que accedan a vas independientes de TAP y activaban linfocitos TCD8+ inducanunarespuestaprotectoraindependientedeTAPfrentealainfeccinporVACV. La infeccin por VACV induca una respuesta especfica de linfocitos TCD8+ frente a varios eptopos virales en ratones deficientes en TAP (Figura 20). De los 12 eptopos descritos en esta tesis elegimos 2 eptopos representativos para los ensayos de

Resultados

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vacunacin:A8R189,derivadodeunfactordetranscripcintempranocitoslicoyA38L, derivado de parte de la zona TM de una glicoprotena de membrana que se expresa de forma intermedia. Respecto a la inmunodominancia en los ratones deficientes en TAP, estos eptopos se localizan en una posicin intermedia (Figura 21) y tampoco destacan porsuhidrofobicidad(Tabla23). Ratones silvestres o deficientes en TAP fueron vacunados mediante procedimientosyadescritos(Badovinacycol.2005)conBMDCmaduradasenpresencia de LPS e incubadas con los pptidos A8R189 y A38L. Tras 14 das los animales se infectaron i.p. con VACV. A los 6 das se sacrificaron y se analiz en el bazo la respuesta secundaria, midiendo la produccin de IFN de los linfocitos TCD8+ especficos frente a A8R189 y A38L. La vacunacin previa con los pptidos indujo linfocitos TCD8+ especficosparaestoseptopos(datosnomostrados),queademssepotenciarontrasla infeccin con el virus (Figura 36). La frecuencia de linfocitos TCD8+ especficos para estos eptopos aument 812 veces en los ratones deficientes en TAP vacunados respecto a la respuesta primaria frente a VACV de los animales no vacunados, de manerasimilarosuperioraloobtenidoenratonessilvestres. Figura 36. La vacunacin con los eptopos A8R189 y A38L induce una respuesta de linfocitos T CD8+ de memoria frente a la infeccin porVACV.
Los ratones C57BL/6 (blanco) o deficientes en TAP (negro) se inmunizaron i.p. con 5 x 105 mBMDC incubadas(blanco)ono(negra)conlos pptidos A8R189 y A38L. Tras 14 das se infectan con 106 u.p.f de WR. Se determin la respuesta secundaria frente a los pptidos en el bazo, 6 das tras la infeccin. Se representa el porcentaje de linfocitos T CD8+ que producen IFN frente a cada pptido. Datosde2ensayosindependientes.

Este resultado indica que, a pesar de que los ratones deficientes en el transportadortenganquizsmenornmerodelinfocitosTCD8+yunrepertoriodistinto,

Resultados

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tras la vacunacin generan una respuesta secundaria de linfocitos T CD8+ de memoria comparablealaqueseobservaenunratnsilvestre. 5.6.2. La vacunacin con los pptidos que se presentan de forma independiente de TAPcontrollainfeccinposteriorconVACVenratonesC57BL/6odeficientesenTAP. Para estudiar si la respuesta inmune de linfocitos TCD8+ inducida por la vacunacincontribuaaunadisminucindelacargaviral,seanalizelttulodevirusen losovariosdelashembrassilvestresydeficientesenTAPvacunadasysecomparconel de los controles no vacunados. A da 6, las hembras deficientes en TAP no vacunadas tenan una carga viral en el ovario alrededor de 107 u.f.p. mientras que en las hembras vacunadas el ttulo viral se reduca aproximadamente unas 30 veces. En las hembras silvestres no vacunadas se observaban unos resultados similares y la reduccin de la cargaviraltraslavacunacinerade24veces(Figura37). Figura37.Reduccindelacarga viral en el ovario tras la vacunacin con los pptidos A8R189yA38L.
Se analiz el ttulo viral en los ovarios de las hembras C57BL/6 (izquierda) o deficientes en TAP (derecha) sin vacunar o tras la vacunacin con A8R189 y A38L e infectadas como se indica en la Figura36.

Estos datos demuestran que la vacunacin con los eptopos que se presentan de formaindependientedeTAPessuficienteparagenerarunarespuestaprotectorafrente a la infeccin viral en el ratn deficiente en TAP, similar a la proteccin que se obtiene en un ratn silvestre, y confirma la relevancia fisiolgica de la presentacin independientedeTAP.

Discusin

96

6. DISCUSIN
6.1. Para evaluar la contribucin de las vas de presentacin de antgeno que no dependendeTAPenlarespuestaantiviral,intentamosinhibirTAPconlaprotenaICP47 de HSV1 en cultivo celular mediante la utilizacin del pptido soluble ICP47 en clulas previamente permeabilizadas, siguiendo mtodos descritos para ensayos de unin y transporte de pptidos a travs de TAP (Lauvau y col. 1999; van Hall y col. 2007). Aunque permeabilizamos un alto porcentaje de las clulas con saponina, el sistema no nos funcion, probablemente porque los ensayos de infeccin precisan que la clula mantengatotalmentesuintegridadestructuralyfuncional. A continuacin intentamos reproducir protocolos similares previamente publicados (Snyder y col. 1997), basados en coinfecciones o triples infecciones con distintos rVACV que expresan el antgeno, la molcula de MHC de clase I presentadora, e ICP47, pero no conseguimos detectar la accin de ICP47 sobre la presentacin de antgenos dependiente de TAP. La ruta clsica desde el proteasoma hacia TAP funcionaba, ya que la presentacin se inhibi por LC. Una hiptesis que podra explicar este resultado es que no consiguisemos coinfectar todas las clulas, de forma que hubieseclulasquerecibiesensloelvirusexpresandosloelantgenoyqueescapasen alainhibicinporICP47. Slo cuando hicimos ensayos de presentacin antignica del eptopo B8R del propio VACV con clulas infectadas con WR o con rVACVICP47 pudimos ver el efecto rotundo de ICP47 sobre la presentacin dependiente de TAP. Esto demuestra adems que rVACVICP47 es funcional y mantiene la capacidad de bloquear TAP, incluso en un sistema dedoble infeccin con un rVACV que exprese la molcula deMHC declase I Kb. El resumen de las ventajas y desventajas de cada combinacin de rVACV se muestra en laTabla17. El hecho de que ICP47 bloquee la presentacin de Ag dependientes de TAP slo cuando estos se expresan por el mismo rVACV pone de manifiesto la necesidad de generar rVACV que expresen a la vez ICP47 y el antgeno de inters, lo cual resta SISTEMADEINHIBICINDETAPMEDIANTEICP47.

Discusin

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versatilidad al sistema. Sin embargo, en clulas humanas infectadas en paralelo con los virus WR y rVACVICP47 s se podra estudiar la presentacin independiente de TAP de antgenospropiosdeVACV,locualabreunnuevocampodeinvestigacin.
rVACV ICP47 ICP47 Sistema No Ag MHCI inhibe No Ag inhibe Inhibe MHCI Inhibe Ventajas Granversatilidad Versatilidad media Permite estudiar varioshaplotipos Desventajas NecesidadtransfeccinestableconMHCI. NecesidadtransfeccinestableconMHCI. ICP47yAgenelmismovirusrecombinante. ICP47yAgenelmismovirusrecombinante.

ICP47+Ag ICP47+Ag

Tabla17.SistemasdeinhibicindeTAPmedianterVACVICP47.
SeresumenlosrVACVylasventajasydesventajasdecadasistema.

6.2. ANLISIS GLOBAL DE LA PRESENTACIN DE ANTGENOS DE VACV POR VAS

ALTERNATIVAS. Hasta ahora ningn estudio haba evaluado la contribucin global de las vas de presentacin de antgeno independientes de TAP en la respuesta inmune frente a un virus, objetivo de esta tesis. As, elegimos a VACV, un poxvirus del cual se han descrito recientemente 49 eptopos que activan a linfocitos T CD8+ in vivo en la cepa de ratn C57BL/6 (Tscharke y col. 2005; Moutaftsi y col. 2006), de la que deriva el ratn deficienteenTAP. Nosotros hemos demostrado que tras la infeccin con la cepa silvestre WR de VACV,losratonesdeficientesenTAPgeneranlinfocitosTCD8+quereconocenantgenos propios de VACV. El reconocimiento con la misma eficiencia de BMDC deficientes o no en TAP e infectadas con el virus podra sugerir que los mismos eptopos independientes de TAP son procesados con una eficiencia comparable en presencia o ausencia de TAP. Los linfocitos T CD8+ de ratones C57BL/6 infectados con VACV tambin reconocen antgenos de VACV de forma independiente de TAP, aunque con marcada menor eficienciaquecuandoseutilizanclulasconTAP. Aunque la va clsica que requiere de TAP es la va de presentacin de antgeno que genera mayor nmero de linfocitos T CD8+ en ratones que poseen TAP, parece que

Discusin

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las vas independientes de TAP contribuyen de forma significativa a la activacin de linfocitos T CD8+ frente a VACV in vivo, pues una octava parte (13%) de los linfocitos T CD8+ del bazo de un ratn C57BL/6 infectado con VACV se activan ex vivo frente a antgenoscuyapresentacinnorequieredeTAP. De la misma manera analizamos ex vivo la contribucin del proteasoma y de la proteasa citoslica TPPII al procesamiento global de antgenos de VACV en ratones silvestres. Nuestros datos indican que el proteasoma participa de forma importante en el procesamiento de antgenos de VACV, pero tambin son compatibles con una cierta presentacin resistente al inhibidor usado, LC. No se pudo llegar a datos cuantitativos porque la LC no bloquea totalmente la actividad del proteasoma (GarciaMedel y col. 2011), y porque los inhibidores del proteasoma bloquean la sntesis de protenas de expresin postreplicativa, es decir intermedias y tardas (Satheshkumar y col. 2009; Teale y col. 2009). Sera muy interesante estudiar la contribucin del proteasoma al procesamiento antignico en ratones deficientes en TAP e infectados, pero por el momento no es posible tcnicamente purificar adecuadamente sus pocos linfocitos T CD8+. Por otra parte, la presencia o ausencia de TPPII en las BMDC infectadas no tiene ningnefectoglobalsobrelapresentacindelosantgenosdeVACValinfocitosTCD8+, datoqueapoyaqueelproteasomasealaprincipalproteasacitoslicaqueprocesaralos eptoposdeVACV. 6.3. IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE LOS EPTOPOS DE VACV QUE SE PRESENTANPORVASALTERNATIVASALINFOCITOSTCD8+. 6.3.1. Identificacin y caracterizacin del procesamiento antignico alternativo de los eptoposdeVACV. 6.3.1.1. EptopospresentadosporlavaclsicadependientedelproteasomaydeTAP. Cuando analizamos la contribucin individual de 30 eptopos descritos de VACV (Moutaftsi y col. 2006) a la respuesta de linfocitos T CD8+ frente a VACV, encontramos respuesta ex vivo de los ratones silvestres infectados frente a todos ellos. Nuestra jerarqua de inmunodominancia es algo distinta de la descrita por Moutaftsi y col. en el

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bazo, aunque B8R se mantiene como el eptopo inmunodominante en la respuesta frente a VACV en el contexto H2b. Se han descrito diferencias en la jerarqua de inmunodominancia de los eptopos presentados por H2d tras distintas rutas de inmunizacin en ratones BALB/c (Oseroff y col. 2008). En nuestro caso utilizamos la misma va de inmunizacin, por lo que nuestras diferencias pueden deberse a razones como la diferente calidad de los pptidos sintticos, los distintos tejidos analizados u otras. A partir de ratones silvestres, conseguimos generar in vitro lneas de CTL especficas frente a 27 pptidos sintticos de VACV, que reconocan clulas TAP+ infectadas. Se probaron distintos agentes de inmunizacin previamente descritos (Badovinac y col. 2005) o distintos rganos de origen (Becker y col. 2005) para generar algunas lneas de CTL concretas pero estas son menos estables en cultivo o menos reproducibles que las anteriores. Por las dificultades tcnicas encontradas con los antgenos ms dbiles de los estudiados, no parece tcnicamente factible el anlisis detalladodelos19eptoposdescritosrestantes. Sehadescritoqueunmimotopoesunpptidosintticoqueescapazdeestimular in vitro a una lnea de CTL activada por otro pptido in vivo (Belz y col. 2001; Yewdell 2005; Yuen y col. 2010). Estos mimotopos suelen ser pptidos que presentan una secuencia o conformacin similar pero no idntica a la del eptopo original. Nuestros 27 pptidosdeVACVtestadosactivanexvivoeinvitroaCTLyademslaslneasdeCTLson activadas por BMDC TAP+ infectadas por VACV, lo que hace muy improbable que en algncasosetratedemimotopos. El papel del proteasoma se pudo analizar tan slo en los eptopos de expresin temprana. Nueve de los doce eptopos tempranos y dependientes de TAP analizados siguen una va clsica de presentacin de antgeno dependiente del proteasoma. Siete deellosderivandeprotenascitoslicas.B8RyB6R,quederivandeprotenasdirigidasal RE, podran acceder al proteasoma bien durante su sntesis en forma de DRiPs citoslicos, o bien siguiendo la va de degradacin de protenas del RE, o ERAD, tras su retrotranslocacinposttraduccionalalcitosol. En la Figura 38 se muestra un esquema de todos los eptopos analizados, clasificadossegnsuvadeprocesamiento.

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6.3.1.2. Eptopos cuya presentacin es dependiente de TAP pero resistente a inhibidoresdelproteasoma. Una fraccin de los linfocitos T CD8+ se activan por vas resistentes al tratamiento con LC en BMDC silvestres. Identificamos 3 eptopos tempranos derivados de protenas citoslicas y dependientes de TAP (A51R, B2R y D1R578) que son resistentes a LC y que podranexplicarelanteriorresultado.Elprocesamientodeestoseptoposrequerirpor tanto de otras proteasas distintas del proteasoma, quizs de las descritas (Tabla 1). Su contribucinsepodraestudiarempleandoBMDCdeanimalesdeficientesenalgunasde ellas (Towne y col. 2005; Towne y col. 2007; Towne y col. 2008; Huai y col. 2008), como hemos hecho cuando hemos descartado la implicacin de la TPPII en su procesamiento, obieninhibidoresqumicososiRNAespecficos. Por otra parte, el eptopo B2R podra ser destruido por la accin del proteasoma ya que se presenta mejor a CTL en presencia de LC, comportndose as como otros eptoposdeMHCdeclaseIdescritosconanterioridadtantoenhumanoscomoenratn derivados de protenas por ejemplo del virus de la gripe (Vinitsky y col. 1997; Yellen Shaw y col. 1997; Luckey y col. 1998) o de HIV (Anton y col. 1998; Sewell y col. 1999; Seifertycol.2003)ytambindeprotenastumorales(Valmoriycol.1999). 6.3.1.3. EptopospresentadosindependientementedeTAP Es llamativo que los linfocitos T CD8+ de ratones infectados y deficientes en TAP sean capaces de reactivarse por 12 eptopos distintos de los 30 ensayados. As, la respuesta global independiente de TAP de linfocitos T CD8+ frente a VACV no se debe a la presentacin de un nico eptopo, sino al reconocimiento de varios eptopos subdominantesodemenorfortalezaqueeleptopoB8R. Es ms, el hecho de que el conjunto de los 30 eptopos seleccionados de cuenta slo del 90% de la respuesta frente a VACV sugiere que no necesariamente hemos identificadolatotalidaddeloseptoposindependientesdeTAP. La jerarqua de inmunodominancia en los ratones deficientes en TAP es claramente diferente que la que aparece en ratones C57BL/6, siendo el eptopo J3R inmunodominante en estos ratones deficientes. Incluso, este eptopo J3R activa con

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mayor eficiencia a los linfocitos T CD8+ de los ratones deficientes en TAP que a los silvestres. Sin embargo, esto no se explicara por la falta de presentacin del eptopo inmunodominante B8R en ausencia de TAP, ya que se ha descrito que la delecin de este eptopo en MVAB8R no es compensada por una respuesta mayor de linfocitos T especficos frente a otros eptopos subdominantes (Kastenmuller y col. 2007; Gasteiger ycol.2007),hechoquehemosconfirmadoconWRB8R(datosnomostrados). Lainmunodominanciajuegaunpapelimportanteenlacapacidadparamontaruna respuesta inmune especfica. Hay diferentes factores que interaccionan entre s y que contribuyen a la inmunodominancia. Entre ellos se encuentran factores relacionados con la cantidad de antgeno como por ejemplo el sitio de infeccin, la abundancia de la protena viral o la cintica de expresin de las protenas virales. Son factores clave tambin la eficacia de procesamiento del antgeno, la afinidad del pptido por MHC de clase I y la cantidad y estabilidad de los complejos MHC/pptido. Entre los factores relacionados con las clulas T es importante el repertorio de linfocitos T o la frecuencia de precursores nave CD8+ con el TCR apropiado para reconocer un pptido (Akram y Inman 2012). Sin embargo, un anlisis somero de los ratones deficientes en TAP revela un repertorio de linfocitos T CD8+ funcionales similar al de ratones C57BL/6 (Sandberg y col. 1996), por lo que este factor quizs no contribuira al cambio en la inmunodominancia. En ausencia de TAP la eficacia de procesamiento del antgeno por vas alternativas puede ser menor (Sigal y Rock 2000), lo cual unido a lamenor cantidad de molculas de MHC de clase I disponibles podra favorecer a distintos eptopos, comparando con los ratones silvestres. Tambin podra ocurrir que se afectase diferencialmente la estabilidad de los complejos al unir pptidos con mayor hidrofobicidadqueenC57BL/6, ocondistintaafinidad,comolosugierelaligeraventaja de los eptopos con fenilalanina en posicin 5 de anclaje a Kb. Por ltimo, la posible distorsin de la va secretoria en las clulas infectadas (ver discusin en apartado 6.3.3) podra favorecer la formacin de complejos en distintos compartimentos, alterndose lasposibilidadesdeunoseptoposfrenteaotros. Ocho de las lneas de CTL obtenidas de ratones silvestres (J3R, L2R53, F5L, A38L, A8R189, A19L, A6L y F13L) fueron activadas tanto por BMDC TAP+ como TAP infectadas por el virus indicando que estos eptopos pueden procesarse y unirse a MHC de clase I en ausencia de TAP. No obstante, la va mayoritaria de presentacin de 6 de estos

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eptopos es la va dependiente de TAP. En esta lnea, nuestro grupo ya haba descrito previamente que la ruta secretoria independiente de TAP mediada por furina era minoritaria, aunque generaba aproximadamente un tercio de los complejos MHC/pptido que aparecen en la superficie de clulas TAP+ (Medina y col. 2009). Se ha descrito que un mismo eptopo puede presentar varias vas de procesamiento (Johnstone y col. 2008), lo que hemos observado en la mayor parte de los eptopos independientesdeTAP. La excepcin la constituyen los eptopos F5L y F13L, que se presentan con la misma eficiencia en ambas clulas infectadas, sugiriendo que estos eptopos pueden tenerunasolavadepresentacindeantgeno,laindependientedeTAP,comotambin sehadescritopreviamenteparaotroantgenoviral(Johnstoneycol.2008). Para 3 de los eptopos independientes de TAP (G8R, A25L, A23R), la cantidad de eptopo procesado en la BMDC TAP infectada parece estar por debajo del lmite de sensibilidad de los CTLs, y tcnicamente no ha sido posible la generacin de CTL monoespecficasapartirdelosratonesdeficientesenTAP,deformaquelaevidenciade supresentacinindependientedeTAPsebasasloenlosensayosexvivo.Estosensayos revelan muy claramente la respuesta independiente de TAP al eptopo G8R, mientras que la respuesta a los otros 2 es menos intensa. En cambio, podemos concluir firmemente que los otros 9 eptopos (J3R, L2R53, F5L, A38L, A8R189, A19L, A6L, F13L y E8R) se presentan independientemente de TAP a linfocitos T CD8+, ya que para la mayorainclusosegeneranlneasdeCTLdeanimalesdeficientesenTAPquereconocen aBMDCinfectadasdeficientesenTAP. ResultadosnomostradosindicanquelasAPCTAPdelbazodeanimalesinfectados podran mediar procesos de presentacin cruzada o de infeccin secundaria, que no pudimosdiferenciar,deltipodelosquenosllevaronapurificarloslinfocitosTCD8+para poder cuantificar correctamente la contribucin de la presentacin independiente de TAP en los animales silvestres (Figura 13). Nuestro diseo experimental ha estado dirigido al estudio de la presentacin directa por las BMDC infectadas, ya que hemos infectado >99% de las clulas y hemos realizado todos los ensayos de presentacin tras tan slo 56 h de infeccin. Es por tanto improbable, aunque no se puede excluir del todo, que haya presentacin cruzada de algn eptopo, es decir, que clulas infectadas fagocitasen a otras clulas infectadas y fuesen todava funcionales para presentar

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antgenosdeformacruzadayactivaralinfocitosTCD8+.Encualquiercaso,siestefuese el caso para los eptopos independientes de TAP, se tratara de presentacin cruzada independiente de TAP, de la que slo se han descrito algunos casos (Shen y col. 2004; Merzouguiycol.2011). 6.3.1.4. Eptopos cuya presentacin es independiente de TAP pero mediada por el proteasoma. De los 12 eptopos independientes de TAP, 5 son tempranos, por lo que se pudieron estudiar empleando LC. El procesamiento de todos ellos est mediado por el proteasoma. De ellos, 3 derivan de protenas citoslicas: J3R, A8R189 y A23R. La presentacindeA8R189dependedelproteasomatantoenclulasTAP+comoTAP.Para J3R, solo tenemos constancia en clulas TAP. Para el eptopo A23R slo lo hemos podido demostrar por razones tcnicas en clulas TAP+, por lo que la evidencia de esta vaindependientedeTAPperomediadaporelproteasomaesmenospotente. Los otros 2 eptopos tempranos, independientes de TAP y dependientes del proteasoma, L2R53 y F5L, derivan de protenas de TM. Su procesamiento desde DRiPs o por ERAD podra explicar su acceso al procesamiento citoslico por el proteasoma. En particular el eptopo F5L parece seguir una nica va independiente de TAP y dependiente del proteasoma. Tras su procesamiento por el proteasoma, estos 5 eptopos podran acceder de nuevo a compartimentos vesiculares por un mecanismo alternativoaTAP. El estudio de la implicacin del proteasoma en el procesamiento de eptopos individuales independientes de TAP (Tabla 2) prcticamente slo se ha acometido en la bibliografa cuando estos eptopos derivan de protenas de membrana, probablemente porque se tenda a pensar que estos eptopos seguan vas totalmente alternativas, es decir, simultneamente independientes tanto de TAP como del proteasoma. El proteasoma participa en el procesamiento de slo 2 de ellos, ambos derivados de la reginTMdelaprotenademembranaLMP2deEBV(delaSalleycol.1997;Lautscham y col. 2001; Lautscham y col. 2003b). El 88% restante de los eptopos publicados (Tabla 2) se procesa por otras proteasas desconocidas, o bien por proteasas del RE o vesiculares, como por ejemplo, la peptidasa seal, la peptidasa del pptido seal, la

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furinaocatepsinas.Porello,setiendeapensarqueloseptoposindependientesdeTAP en general no requieren del proteasoma para generarse, suponiendo que el acceso de las protenas de membrana al RE les permite el acceso a otras proteasas. Sin embargo, enmarcadocontraste,todosloseptoposindependientesdeTAPderivadosdeprotenas de VACV que hemos podido analizar en este trabajo, y que incluyen a 3 citoslicas y a 2 demembrana,dependendelproteasoma(Tabla18). Tabla 18. Participacin del proteasoma en el procesamiento de eptopos independientesdeTAPdeVACV.
Eptopos Proteasoma Nmero % Dependiente 5 100 Resistenteainhibidores 0 0 Desconocido 7 Suma 12

Se muestra el nmero de eptopos endgenos e independientes de TAP analizadosenestetrabajoquerequierendel procesamiento por el proteasoma o que son resistentes a inhibidores del mismo. Se muestra el porcentaje relativo respecto de los que se conoce la participacin del proteasoma. Para comparar con los resultados previamente publicados, vase Tabla2.

En conclusin, sugerimos que en las descripciones individuales de eptopos independientesdeTAPdelabibliografaexisteunsesgohacaprotenasdirigidasalava secretoria, con una preponderancia de vas resistentes a inhibidores del proteasoma. Por el contrario, cuando hemos analizado globalmente las vas naturales de procesamiento antignico de eptopos independientes de TAP, el proteasoma adquiere unpapelmsdestacado. Todos los resultados obtenidos sobre la dependencia o no de TAP y del proteasoma demuestran que existe una alta prevalencia de rutas alternativas en la presentacin de antgenos de VACV, que llevan a la generacin de al menos la mitad de los eptopos estudiados (Figura 38). Los datos parciales empleando otros inhibidores de proteasas auxiliares, como las metaloaminopeptidasas, confirman esta gran diversidad derutasdeprocesamientodeantgenosvirales.


Resistentesa inhibicin delproteasoma
A51R B2R D1R578

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L2R61 D1R282 B16R A3L A42R E7R

3
E8R F13L G8R A25L A19L A38L A6L

dTAP
A47L A8R70 B1R B6R B8R C4L F1L J6R K3L

7
iTAP

9 5
J3R A8R189 A23R L2R53 F5L

Dependientes deproteasoma

Vaclsica

Vasalternativas

Figura38.PrevalenciaderutasalternativasenlapresentacindeantgenosdeVACV.
Se muestra el nmero de eptopos de VACV respecto a su dependencia de TAP (crculo interno) o del proteasoma (crculo externo). En gris claro se indican los eptopos cuya dependencia del proteasoma no se ha analizado. El rectngulo engloba todos los eptopos que siguen vas alternativas.

6.3.2. Anlisis de las caractersticas de los eptopos de VACV que siguen vas alternativasdeprocesamientoypresentacinantignica. Las caractersticas y vas de procesamiento de los ligandos de MHC de clase I descritos en la bibliografa han sido previamente revisadas por nuestro grupo (Johnstone y Del Val 2007; Del Val y col. 2011) y se resumen en la Tabla 4. Se basan en gran nmero de estudios de presentacin de antgeno a CTL y en los ltimos aos en estudios de espectrometra de masas a gran escala de clulas no infectadas, que han permitido obtener unagran coleccin de eptopos independientes de TAP sobre los que analizarcaractersticasquepuedanexplicarsuprocesamientoalternativo.

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Un gran nmero de eptopos independientes de TAP, incluyendo los primeros descritos (Wei y Cresswell 1992; Henderson y col. 1992), son presentados por HLAA2, un alotipo que preferiblemente selecciona pptidos hidrofbicos. Por ello, los ligandos de HLAA2 frecuentemente derivan de la secuencia seal de protenas de membrana. Sinembargo,estapreferenciatanmarcadanoseextiendeaotrosalotipos(DelValycol. 2011). Nuestro trabajo no contribuye a este punto, ya que ninguno de los 49 eptopos descritospreviamenteenVACV(Moutaftsiycol.2006)derivadesecuenciasseal. En general los eptopos independientes de TAP descritos en la bibliografa se adaptan menos a los motivos de unin a MHC de clase I y tienen una afinidad de unin baja ya que algunos son ligeramente ms largos. Nuestro trabajo no aporta datos nuevos sobre este tema, ya que los eptopos de VACV se han predicho utilizando algoritmos basados en los motivos de unin y en la afinidad a MHC. Adems son eptopos de 8, 9 y 10 aa, por lo que no hemos analizado pptidos extendidos. Sin embargo, s se observ cierto uso diferencial del residuo del extremo carboxilo del pptidodeanclajeaKbentreloseptoposdependientesylosindependientesdeTAP( Tabla 15), as como cierta tendencia a mayor inmunodominancia entre los eptoposindependientesdeTAPsegnelresiduoenlaposicin5deanclajeaKb(Figura 35). Estas observaciones podran sugerir que los pptidos independientes de TAP accedan quizs a una poblacin distinta de molculas de MHC de clase I, bien por su localizacin celular distinta del RE o bien por el conjunto de pptidos al que estn expuestas. LoseptoposindependientesdeTAPquederivandeprotenascitoslicas,ascomo aquellos que an siendo independientes de TAP requieren del proteasoma citoslico, requieren de un mecanismo para acceder a los compartimentos vesiculares y unirse a las molculas de MHC de clase I. Se ha descrito una buena correlacin entre la hidrofobicidad de los eptopos y la independencia de TAP (Lautscham y col. 2001; Lautscham y col. 2003a), sugiriendo que los pptidos pueden tener la habilidad de atravesar las membranas por difusin pasiva, a pesar de que se requieren grandes cantidades de pptido para que difunda al RE (Ratnikov y col. 2002). Nosotros tambin hemos observado que los eptopos independientes de TAP de VACV, incluso los derivados de protenas citoslicas, son ms hidrofbicos que los dependientes de TAP. Lautschamycol.yademostraronquelaindependenciadeTAPdeuneptopoTMdeEBV

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con alta hidrofobicidad se mantena cuando se cambiaba su localizacin a una protena nuclear. As la hidrofobicidad y no la localizacin celular explicara quizs por qu estos pptidostienenunprocesamientoalternativo. Otros mecanismos posibles que podran explicar su transporte alternativo a TAP seran Sec61, si funcionase en direccin antergrada, adems de la descrita en retrotranslocacin de pptidos al citosol (Koopmann y col. 2000), u otros transportadores no definidos. La autofagia se ha propuesto recientemente como un potencial mecanismo para que pptidos citoslicos accedan a compartimentos vesiculares donde hay molculas de MHC de clase I recicladas desde la membrana (CrotzeryBlum2009;Englishycol.2009;Mnz2010;Chemaliycol.2011). 6.3.3. Anlisis de las caractersticas de las protenas de VACV de las que derivan los eptopos. Con el fin de encontrar alguna propiedad que pudiese explicar el procesamiento alternativo de los eptopos de VACV hemos analizado varias caractersticas de las protenas de origen, como por ejemplo: la expresin temporal, su papel en el ciclo de replicacin viral, su localizacin subcelular y su localizacin durante la morfognesis viral. El subconjunto de eptopos analizados es una muestra representativa de los eptopos de VACV totales descritos en el contexto de H2b y de las protenas totales de VACV. Sin embargo, s hemos detectado diferencias entre los eptopos que se procesan deformadependienteoindependientedeTAP.Mientrasqueloseptoposdependientes de TAP derivan en su mayora de protenas citoslicas, de expresin temprana y con funciones de regulacin viral e interaccin con el husped, existe una clara tendencia a que los eptopos independientes de TAP deriven de protenas de membrana, de expresin postreplicativa, localizadas en factoras virales y asociadas al virin (Figura 28). Estaobservacinpodraindicarquelareorganizacindemembranasderivadasdel RE que tiene lugar en la formacin de las factoras virales y en la morfognesis de los virionesprogenieenlafasepostreplicativadelainfeccin(Husainycol.2006;Husainy col.2007)podrafavorecerelprocesamientoindependientedeTAPdelasprotenasy/o el acceso de los eptopos a molculas de MHC de clase I en localizaciones no cannicas.

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Tambin es posible que una posible baja eficacia del procesamiento independiente de TAP (Sigal y Rock 2000) se beneficie del generalmente elevado nivel de sntesis de las protenasqueseexpresanenlafaseposterioralareplicacindelDNAviral. Se ha publicado que protenas modelo que se expresen de forma tarda por VACV no seran presentados de forma directa en DC infectadas, al ser muy limitada su expresin (Tewalt y col. 2009). Sin embargo, otros autores detectan expresin viral tarda tanto en DC maduras (Yates y AlexanderMiller 2007) como en la lnea dendrtica DC2.4 (Moutaftsi y col. 2009). Adems, se ha detectado tanto expresin proteica como presentacin antignica intermedia en clulas DC2.4 (D. Tscharke, comunicacin personal). Los nicos 3 eptopos tardos descritos se encuentran entre los menos inmunodominantes de los 49 descritos (Moutaftsi y col. 2006). Slo por ello, no se encuentran entre los seleccionados para nuestro estudio, que slo incluye a protenas de expresin temprana e intermedia, todas las cuales se presentan por MHC de clase I enDCinfectadas,deacuerdoconelsegundogrupodeautores. Tambin se ha sugerido con antgenos modelo por el mismo grupo de Norbury que los eptopos derivados de protenas tardas secuestradas en factoras virales no podran siquiera acceder a rutas de presentacin cruzada por DC. Si accederan, en cambio, los derivados de protenas de membrana o que forman parte de viriones maduros que salen de las factoras (Tewalt y col. 2009). Nosotros hemos estudiado 11 eptopos que derivan de protenas de transcripcin intermedia, que como las tardas se expresan tras la replicacin del DNA viral. De ellas, todas escaparan de este secuestro, salvoquizslaprotenaA19,conuneptopoindependientedeTAP,protenaparalaque losdatossoninsuficientesenlaliteratura.Lapotencialdiscrepanciaconlapropuestade Norbury podra explicarse por una potencial diferencia entre protenas intermedias y tardasencuantoapresentacinantignica,peroespocoprobable,yaqueladiferencia entreellasnoestantotemporalnidelocalizacinsubcelular,sinomsbiendebidaalos factores de transcripcin implicados en la expresin de los respectivos genes. Quiz se explique mejor porque su hiptesis se ha generalizado a partir de datos obtenidos con una protena modelo (Tewalt y col. 2009). Sera interesante en cualquier caso determinar si in vivo hay contribucin de clulas infectadas que no sean APC profesionales (Thomas y col. 2007) a la induccin de linfocitos T CD8+ frente a los pocos eptoposderivadosdeprotenassecuestradasenfactorasvirales.

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En la fase postreplicativa de la infeccin por VACV, se inicia la formacin de las factoras vrales reclutando gran cantidad de membranas, parte de las cuales proceden del RE. En estas factoras tiene lugar la sntesis de la prctica totalidad de las protenas de la clula, que ya son casi exclusivamente protenas virales. Las protenas virales de membrana sintetizadas en esta fase no se glicosilan y van directamente del RE a las factoras. De hecho, las pocas protenas glicosiladas de VACV, que migran del RE al TGN o a la membrana plasmtica, son de expresin temprana. En estas condiciones post replicativas, sera de esperar que el complejo de carga de MHC de clase I se nutra principalmentedepptidosderivadosdeprotenasvirales,aunquedadaslaspotenciales baja sntesis de novo de MHC de clase I y desconexin con la va secretoria constitutiva es posible que la presentacin de antgeno convencional no sea plenamente funcional. Sera interesante determinar si los antgenos presentados en esta fase, especialmente pero no slo los independientes de TAP, acceden a compartimentos subcelulares diferentesdondeunirseamolculasdeMHCdeclaseIquizdereciclaje,osiaccedena rutasalternativascomolapresentacincruzadaolaautofagia(Tewaltycol.2009;Teyy Khanna2012). Nueve de las protenas de VACV se han denominado inmunoprevalentes, por dar lugar a varios eptopos presentados por diversos alotipos de MHC de clase I (Oseroff y col. 2008). De ellas hemos analizado 5, que contienen 6 eptopos, y slo 1 (A25L) es independiente de TAP en el contexto de H2b. Es frecuente que una misma protena contenga varios eptopos y que unos requieran de TAP mientras que otros se presentan de forma independiente de TAP (Hammond y col. 1993; Hammond y col. 1995; Lautschamycol.2001),comoocurreconnuestrasprotenasL2yA8. Existe un buen nmero de estudios en los que se analiza individualmente la presentacin a CTL especficos de eptopos derivados de protenas virales o tumorales que se presentan de forma independiente de TAP. La mayora (72%) de estos eptopos endgenos e independientes de TAP de los que se conoce su localizacin en la protena derivan del procesamiento de protenas de membrana (Tabla 19). Aunque hay una proporcin semejantedeprotenasdiseadasdelocalizacincitoslica odemembrana, entre estas ltimas todas las diseadas estn dirigidas intencionadamente al RE mediantelaadicindeunasecuenciasealquenocontienealeptopo,deformaquela mayoradeloseptopossonluminales.Sinotenemosencuentaestesesgo,loseptopos

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derivados de estas protenas de membrana estn localizados ms o menos con igual frecuencia en regiones luminales, en la secuencia seal (la mayora presentados por HLAA2),yenregionesTM(todosellosdeunasolaprotenaviral,laLMP2deEBV). Individuales
Protena Citoplasmtica % 28% Citosol Lumen Secuenciaseal TM Suma Localizacindeleptopo Nmero 10 15 5 6 36 % 28% 42% 14% 17% 100% 4diseadas 8diseadas 3deHLAA2 6deLMP2deEBV

Membrana

72%

Tabla 19. Anlisis publicados de eptopos individuales independientes de TAP: localizacindeloseptoposenlaprotenadeorigen.

Se muestra el nmero y porcentaje de eptopos endgenos e independientes de TAP descritos en la literatura, clasificados segn su localizacin en la protena de origen. En 3 casos, de trata deconstruccionesnonaturalesconeptoposluminalesydotadasdeunasecuenciasealquelas dirigealRE.BasadaenlasmismasreferenciasquelaTabla2.

En los estudios a gran escala de espectrometra de masas de ligandos independientes de TAP derivados de protenas de membrana en clulas no infectadas (Figura 3 y Tabla 20) se detectan un 30% de eptopos derivados de la zona luminal, y un 65% de ligandos derivados de secuencias seal, aunque la inmensa mayora son presentados por HLAA2, debido a la amplia utilizacin de lneas celulares con este alotipo, que acomoda bien una alanina en la posicin carboxilo terminal del pptido, residuo que la peptidasa seal frecuentemente genera en el carboxilo terminal. Sin embargo, curiosamente, tan solo 3 ligandos provienen de regiones TM. Nuestros datos tan slo identifican 1 eptopo luminal, y no aportan informacin sobre la secuencia seal, pues ninguno de los eptopos descritos est localizado en esta regin de las protenas. Sin embargo, nuestros datos apoyan fuertemente los datos obtenidos con la protena viral LMP2 respecto a la localizacin en la regin TM de sus 6 eptopos independientes de TAP. Excepto en 1 caso, todas nuestras protenas con regiones TM contienen un eptopo independiente de TAP localizado en alguna regin TM de la protena. Sera interesante averiguar si esta tendencia a la presentacin tan frecuente de regiones TM por vas independientes de TAP es una caracterstica asociada a las infecciones virales. Para ello, sera necesario un anlisis semejante al de esta Tesis con

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otro virus grande y con muchos eptopos definidos, como por ejemplo CMV murino (Munksycol.2006). Granescala
Protena Citoplasmtica Membrana % 72% 28% Citosol Lumen Secuenciaseal TM Suma Localizacindeleptopo Nmero 126 15 31 3 175 % 72% 9% 18% 2% 100%

24deHLAA2

Tabla 20. Anlisis publicados de ligandos independientes de TAP en clulas no infectadas, identificados por espectrometra de masas a gran escala: localizacin de losligandosenlaprotenadeorigen.
Se muestra el nmero y porcentaje de eptopos endgenos e independientes de TAP descritos en la literatura, clasificados segn su localizacin en la protena de origen. Datos de (Wei y Cresswell 1992; Luckey y col. 1998; Lorente y col. 2011) junto con los compilados en (Del Val y col.2011).

Recientemente se ha descrito que las regiones TM, cuando se deslocalizan de su sitio natural en la membrana durante el proceso de ERAD y son enviadas al citosol, sirven como motivo de degradacin preferente para el procesamiento por el proteasoma, favoreciendo as el aporte de pptidos a MHC de clase I (Huang y col. 2011). Durante una infeccin la clula, que esta sintetizando de forma masiva protenas virales, est sometida a un estrs de plegamiento y a una reduccin de la cantidad de chaperonas disponibles pudindose quizs generar una gran cantidad de regiones TM deslocalizadas. Por medio de ERAD, las regionesTM deslocalizadas de las protenas F5 y L2 podran ser una seal de degradacin que las enviase al proteasoma, aunque no se explicara su independencia de TAP. En este contexto, sera interesante estudiar si el proteasoma est tambin implicado en el procesamiento de los otros 4 eptopos derivados de regiones TM e independientes de TAP, que no se ha podido hacer por derivardeprotenasdeexpresinpostreplicativa. Finalmente, ninguna de las 2 protenas de membrana secretadas analizadas contieneuneptopoindependientedeTAP,perosubajonmeronopermitereflexionar sobresusignificancia.

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Por otra parte, en la bibliografa se encuentran pocos ejemplos de eptopos citoslicos y nucleares que se presenten a CTL de forma independiente de TAP (Tabla 19). Por el contrario, los estudios a gran escala de espectrometra de masas de clulas no infectadas revelan sorprendentemente que la mayora de los ligandos de MHC de clase I independientes de TAP, el 72%, derivan de protenas citoslicas (Figura 3) (revisado en (Del Val y col. 2011)). Nuestros resultados muestran que la mitad de los eptopos de VACV independientes de TAP derivan de protenas de membrana y la otra mitad de protenas citoplsmicas. Igual que los estudios a gran escala de clulas no infectadas (Suri y col. 2006; Weinzierl y col. 2008; Oliveira y col. 2009), nuestros anlisis hansidorealizadosdemaneranosesgada,sinideaspreviassobrequprotenaspodran ser procesadas de manera independiente de TAP. Quiz por ello, la distribucin membrana/citosol de nuestros eptopos independientes de TAP se acerca ms a la de estos estudios a gran escala, y cuestiona la idea preconcebida de que si la protena sorteaTAPyentraalavasecretoriahaymsprobabilidadesdequelohagaeleptopoy su presentacin sea independiente de TAP. Es un hecho notable que nuestros datos confirmanquelasvasdeproduccindeligandosparaMHCdeclaseIindependientesde TAPtambinmuestreanampliamentelasprotenasqueseencuentranenelcitosoldela clula infectada, y no slo en compartimentos vesiculares, contrariamente a lo comnmenteasumido. En la Figura 39 proponemos distintas vas de procesamiento y de transporte alternativos a TAP que podran utilizar los eptopos de VACV para acceder a los compartimentosdondepuedenunirseamolculasdeMHCdeclaseI.

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A
Protenas citoslicas DRiPs

A51R B2R D1R578 Otrasproteasas

TAP
TCR 7

CTL

Proteasoma

TAP
Vasecretoria

J3R A23R A8R189

Sec61/ERAD Difusin Transportador Retculo endoplasmtico Autofagia Lisosomas /Compartimentos endolisosomales Golgi

Citosol

B
Protenasde membrana

DRiPs B8R

Sec61/ERAD

Vasecretoria TCR

CTL

F5LL2R53B6R

Transportador Difusin
B8RB6R Proteasoma

TAP
Retculo endoplasmtico

Golgi

Citosol

Autofagia Lisosomas /Compartimentos endolisosomales

Figura39.VACVutilizadiferentesrutasenelprocesamientodesusantgenos.

A)Lasprotenascitoslicas(colorazul)osusDRIPspuedenserprocesadosporelproteasoma(7 pptidos) o de forma alternativa por otras proteasas citoslicas (A51R, B2R y D1R578) y ser transportados al RE a travs de TAP. En clulas deficientes en TAP, varios mecanismos hipotticos (flechas moradas discontinuas) permitiran que las protenas y pptidos citoslicos como J3R, A23R y A8R189 accedan tras su procesamiento por el proteasoma a compartimentos vesiculares y secretorios: difusin pasiva a travs de membrana, transporte a travs de Sec61 u otro transportador desconocido o bien mecanismos de autofagia a travs de transportadores endolisosomales. B) Las protenas de membrana (color naranja) acceden al RE de forma cotraduccional y pueden seguir la va secretoria. Hay ejemplos como la protena con secuencia

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seal B8 que sigue la va clsica proteasomaTAP, por lo que su eptopo, o bien se origina en el citosolapartirdeDRIPseneliniciodesutraduccin oapartirde protenasmadurasque deben ser retrotranslocadas al citosol. Este mismo mecanismo de acceso al proteasoma podra ser utilizado para el procesamiento de las protenas con regiones TM, F5, L2 y B6; sin embargo, tras su procesamiento citoslico los 2 primeros eptopos requieren de un transporte alternativo a TAP (flechas moradas) para acceder a las molculas de MHC de clase I. Las protenas localizadas en la va secretoria tambin podran acceder a molculas de MHC de clase I de reciclaje en los compartimentosendolisosomales.

6.4. VACV fue el agente vacunal utilizado frente a la viruela humana. Sin embargo, no se conoce a fondo cul es el mecanismo de accin de esta vacuna con la que se consigui finalmente erradicar la enfermedad en el ao 1977. Existe un gran inters en el estudio y empleo de VACV como vector vacunal para el desarrollo de vacunas contra patgenos y tumores. Actualmente se han propuesto diferentes lneas atenuadas de VACV como MVA (Sutter y col. 1994), Copenhague (Tartaglia y col. 1992), NYVAC o mutantes de delecin seleccionados (GarciaArriaza y col. 2011). Recientemente se ha descrito que la protena CPXV12 de una nica cepa del virus cowpox bloquea TAP e inhibe la translocacin de pptidos al lumen del RE (Byun y col. 2009; Alzhanova y col. 2009). Dado que en las primeras inmunizaciones frente a la viruela se supone que se utilizabacowpoxcomoagentevacunal,seraposiblequeloseptoposindependientesde TAPpudiesenhabercontribuidonotablementealainmunizacinyproteccinfrenteala viruela. LospacientesdeficientesenTAPtienenreducidalaexpresindemolculasdeHLA de clase I en superficie y sufren de infecciones bacterianas recurrentes sobre todo del tracto respiratorio superior y de lesiones en la piel (granulomatosis necrotizante). Sin embargo,nosonespecialmentesusceptiblesainfeccionesviralesoporotrospatgenos y tienen niveles de anticuerpos normales frente a varios virus (Gadola y col. 2000). Respectoasurepertoriodelinfocitosensangre,presentanunaexpansindeclulasNK ylinfocitosTperounnmerobajodelinfocitosTCD8+(delaSalleycol.1994).No obstante, los linfocitos T CD8+ citotxicos son capaces de reconocer antgenos virales y desencadenar una respuesta especfica frente a ellos (de la Salle y col. 1997). Por tanto, las vas de presentacin de antgeno independientes de TAP posiblemente son relevantesenelcontroldemuchasinfeccionesysonporellolabasedenuestroestudio. RELEVANCIAFISIOLGICADELAPRESENTACININDEPENDIENTEDETAP.

Discusin

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Previamente se han descrito casos de proteccin frente a patgenos como VACV (Snyder y col. 2004) o Listeria monocytogenes (Rolph y Kaufmann 2000) o frente a tumores deficientes en TAP (van Hall y col. 2007) mediante la vacunacin con eptopos independientes de TAP. Nosotros hemos mostrado que la vacunacin con DC incubadas con pptidos que se presentan de forma independiente de TAP protege a ratones silvestres y deficientes en TAP de una manera similar, disminuyendo significativamente lacargaviralenelovariodehembrasinfectadas.Estoindicaquelasvasindependientes de TAP tambin son operativas en clulas normales del organismo, como las del ovario, ynosloenclulaspresentadorasdeantgenoprofesionales,comolasDC Concluimos que los eptopos que se presentan por va alternativas a la va clsica contribuyenalarespuestaprotectoradelinfocitosTCD8+frentealainfeccinconvirus como VACV. Es importante seguir caracterizando las propiedades de estos eptopos e identificandolasrutasalternativasqueparticipanensuprocesamientoparaeldiseode nuevasvacunasrecombinantesbasadaseneptopos.

Conclusiones

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7. CONCLUSIONES
1. De los linfocitos T CD8+ antivirales que se activan en la respuesta primaria en ratonesinfectadosporVACV: el 13% reconoce antgenos que se presentan de forma independiente de TAP porMHCdeclaseI, lamayorareconoceantgenosprocesadosporelproteasoma, nosedetectalacontribucindeantgenosprocesadosporTPPII.

2. Se identifican 12 eptopos de VACV que se presentan independientemente de TAP in vivo, 9 de los cuales se confirman en clulas dendrticas infectadas en cultivo, empleandolneasdeCTLmonoespecficasdecadaeptopo. 3. Los12eptoposviralesindependientesdeTAPsonmshidrofbicosquelos18que dependen de TAP y con mayor frecuencia derivan de protenas de expresin post replicativa en el ciclo viral, asociadas al virin, de membrana y localizadas en factorasvirales. 4. Los 6 eptopos independientes de TAP que derivan de protenas virales de membrana estn localizados parcial o totalmente en la regin TM de la protena excepto en un nico caso. Los otros 6 eptopos independientes de TAP se localizan en protenas virales citoslicas, contrariamente a lo comnmente asumido en el campo. 5. Delos24eptoposviralesanalizadosendetalle,sorprendentementelamayora(15) siguen vas de procesamiento y presentacin antignica distintas de la va clsica, puesonorequierenTAP(12)osonresistentesalainhibicindelproteasoma(3). 6. En contra de lo que se ha descrito mayoritariamente en la bibliografa, los 5 eptopos independientes de TAP de VACV que hemos podido analizar se procesan por el proteasoma, incluso aquellos derivados de protenas de membrana, por lo que requieren de algn mecanismo posterior de transporte a compartimentos vesicularesparasuaccesoaMHCdeclaseI. 7. Los linfocitos T CD8+ de memoria activados por la vacunacin con 2 eptopos independientes de TAP son igualmente eficientes en el control de la infeccin por VACVenratonesC57BL/6queenratonesdeficientesenTAP.

117

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VIRUSVACCINIA(VACV) Nombre WR vB8R Caractersticas CepasilvestreWesternreserve MutantededelecinquenoexpresalaprotenaB8R VIRUSVACCINIARECOMBINANTES,rVACV Nombre rVACVICP47 VVF VVFsig rVACVK rVACVK VVGFPJaw1Ova* cCOva* sCOvaC*
b d
#

Referencia (Verardiycol.2001)

Protenafornea ICP47deHSV1 FdeRSV Fsig deRSV K K GFPJaw1Ova cCOva sCOvaC

b d

Eptopo F8593 F8593 SIINFEKL SIINFEKL SIINFEKL

CepaVACVdeorigen WR WR(vRB12) WR(vRB12) WR WR WR Copenhague Copenhague

Promotor 7,5K 7,5KSinttico 7,5KSinttico 7,5K 7,5K 7,5KSinttico 7,5KSinttico 7,5KSinttico

Caractersticas tk tk tk tk tk tk tk tk
+ +

Referencia (Snyderycol.1997) (Bembridgeycol.1998) (Bembridgeycol.1998) (Bacikycol.1994) (Bacikycol.1994) (Prlicycol.2005) (Medinaycol.2009) (Medinaycol.2009)

Tabla21.Virusutilizados.
Elpromotor7,5Ksintticoesunpromotortemprano/tardooptimizadoapartirdelpromotor7,5Knatural. EleptopoF8593sepresentaporKdporlava clsica dependiente del proteasoma y de TAP a partir del virus VVF. Por el contrario, F8593 se presenta independientemente del proteasoma e independientementedeTAPapartirdelvirusVVFsig .*EleptopoSIINFEKLsepresentaporlavaclsicadependientedelproteasomaydeTAPapartirde los virus GFPJaw1Ova y cCOva. Por el contrario, SIINFEKL se presenta independientemente del proteasoma e independientemente de TAP a partir del virussCOvaC.
a #

118


Protena Longitud Expresin (aa) temporala A19 78 Intermedio A23 A25 A3 A38 383 725 643 278 Temprano Intermedio Intermedio Intermedio Localizacinsubcelularb Citoplasma Citoplasma Membrana Citoplasma Membrana Factoraviral Factoraviral Factoraviral Factoraviraly core Membrana celulary microsomas Factoraviral Secuencia Dominios Categora funcional a seal TM Desconocido Si 1 5 Transcripcin Asociacinalvirin Asociacinalvirin Asociacinalvirin Funcin Protenahipottica8,3kD

119

Subunidadde45kDdelfactordetranscripcinviral intermedio3(VITF3) ProtenaasociadaalamembranadelMV.Protena deinclusintipoAtruncada Precursorp4bdelaprotena4bdelcore Glicoprotenade32kDsimilaraprotenasasociadas aintegrinas.Promueveelflujodecalcioextracelular enclulasinfectadas Homlogodeprofilina Desconocida Protenahipotticade31,7kDnoesencial Protenadelcore delvirinesencialparala morfognesis Subunidadde32kDdelfactordetranscripcinviral intermedio3(VITF3) Ser/Thr quinasa ReceptorsolubledeIL1 Desconocida Protenatipoanquirina ReceptorsolubledeIFN AntagonistadelreceptordeIL1

A42 A47 A51 A6 A8d B1 B16 B2 B6 B8 C4

134 253 335 372 289 301 327 220 173 273 316

Intermedio Temprano Temprano Intermedio Temprano Temprano Intermedio Temprano Temprano Temprano Temprano

Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Lumen,secretada Citoplasma Membrana Lumen,secretada Citoplasma

Asociacinalvirin Desconocido Desconocido Asociacinalvirin Transcripcin ReplicacindelADN Interaccinconel husped Desconocido Desconocido Interaccinconel husped Interaccinconel husped

Factoraviraly core Factoraviral Factoraviral

Si Si

119

120

D1d

845

Temprano

Citoplasma

Factoraviral

Transcripcin

E7

167

Intermedio

E8 F1 F13

274 227 373

Intermedio Temprano Intermedio

Citoplasma (asociadaa membrana) MembranaRE Citoplasma Mitocondria Citoplasma (asociadaa membranaTGN) Membrana Membrana Citoplasma

EEV

Desconocido

Subunidadgrandedelaenzimadecappingdel ARNm.Factordeterminacindelatranscripcin VTF ProtenamiristoiladadelEEV

Factoraviraly core Mitocondria EEV

Asociacinalvirin Interaccinconel husped Asociacinalvirin

Protenademembrana asociadaconelcoreyconIV eIMV Inhibelaapoptosisinterfiriendolaliberacindel citocromoC Protenapalmitoiladavp37delamembranadelEEV

F5 G8 J3

323 261 334

Temprano Intermedio Temprano

Si Factoraviral Factoraviraly core Factoraviral

1 1

Desconocido Transcripcin Transcripcin

Desconocida FactordetranscripcindelosgenestardosVLTF1 Multifuncional:subunidaddelapoliApolimerasa, capmetiltransferasayfactordeelongacindela transcripcin Subunidadrpo147delapolimerasadeARN dependientedeADN Resistenciaainterfern,inhibidordePKRsimilara eIF2. Formacinyelongacindelamembranacrecientey devirionesinmadurosc

J6 K3 L2d

1288 89 87

Temprano Temprano Temprano

Citoplasma Citoplasma Membrana

Transcripcin Interaccinconel husped Desconocida

Factoraviral

Tabla22.ResumendelascaractersticasdelasprotenasdeVACV.
InformacinobtenidadePoxvirusBioinformaticsResourceyUniProtKnowledgebase. (Yangycol.2010), (Chungycol.2006;Reschycol.2007) (Maruri Avidal y col. 2011). Protenas con 2 eptopos analizados en este trabajo. Las protenas resaltadas en gris contienen un eptopo independiente de TAP. Las categorasfuncionalestranscripcinyreplicacindelADNseenglobanenlacategoraregulacinviralenlaFigura28.
d a b c

120


ICSexvivo a %IFN+CD8+/CD8+ Eptopo J3R(289296) G8R(3441) F5L(279287) L2R(5361) A38L(203210) A8R(189196) A19L(4755) A6L(265272) A25L(257264) A23R(297305) F13L(307315) E8R(141150) L2R(6169) B16R(275283) A3L(270277) D1R(282290) B8R(2027) A51R(7885) J6R(9931000) A8R(7077) C4L(125132) E7R(130137) B6R(108116) A47L(138146) K3L(615) A42R(8896) WT 2,3 10,0 2,2 4,0 1,6 5,2 2,4 4,1 2,1 2,7 1,7 1,4 3,2 1,7 9,6 3,5 20,0 8,3 8,0 2,8 1,9 1,9 1,1 5,1 4,3 1,7 Deficiente enTAP1 4,4 3,0 2,5 2,5 1,7 1,6 1,5 1,1 0,9 0,6 0,6 0,5 0,3 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Ordende inmunodominancia WT 19 2 20 12 27 7 18 11 21 17 25 28 14 24 3 13 1 4 5 16 22 23 30 8 10 26 Deficienteen TAP1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hidrofobicidad OHM 5,50 7,50 0,44 8,26 6,47 8,11 4,01 5,25 4,67 6,71 0,41 4,42 3,07 3,56 4,66 6,22 1,23 4,34 5,25 5,91 2,32 0,77 5,54 2,82 1,71 4,06
b

121

Tamao (aa) 8 8 9 9 8 8 9 8 8 9 9 10 9 9 8 9 8 8 8 8 8 8 9 9 10 9 MHC (H2) Kb Kb Db Kb Kb Kb Kb Kb Kb Db Db Db Kb Db Kb Db Kb Kb Kb Kb Kb Kb Kb Kb Db Db

Secuencia SIFRFLNI LMYIFAAL SAPMNVDNL VIYIFTVRL KVFSFWLL ITYRFYLI VSLDYINTM YTLIYRQL SIYQYVRL IGMFNLTFI FTIQNNTKL FWFKNTQFDI LVSRNYQML ISVANKIYM KSYNYMLL LGYIIRYPV TSYKFESV RISRFANL INFEFVCL IHYLFRCV LNFRFENV STLNFNNL LMYDIINSV AAFEFINSL YSLPNAGDVI YAPVSPIVI
c

Posicindeleptopoenla d protena Citoplasma 5aaTM+3aacitoplasma 1aaTM+8aaluminal 9aaTM 6aaTM+2aacitoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Luminal Citoplasma Citoplasma 3aaTM+7aacitoplasma 3aaTM+6aaluminal Luminal Citoplasma Citoplasma Luminal Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma

121

122

D1R(578586) B2R(5462) B1R(9299) F1L(200207)

3,1 7,7 4,4 1,2

0,0 0,0 0,0 0,0

15 6 9 29

3,95 1,86 4,24 0,80

9 9 8 8

Db Db Kb Kb

SMYCSKTFL YSQVNKRYI INVEYRFL STREYLKL

Citoplasma Citoplasma Citoplasma Citoplasma

Tabla23.ResumendelascaractersticasdeloseptoposdeVACVWRpresentadospormolculasdeH2b.
Informacin obtenida de Poxvirus Bioinformatics Resource y de UniProt Knowledgebase. Porcentaje de linfocitos T CD8+ peritoneales activados tras la reestimulacincon108Mdelcorrespondientepptidosinttico. SeutilizlaescalaOMH. SesubrayaelmotivodeanclajealamolculadeMHCdeclase I en posicin 5 del pptido. Se indica la posicin predicha segn TMHMM Server v. 2.0. Se resaltan en gris los eptopos que se presentan de forma independientedeTAP.
d b c a

122

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